大黄酸或大黄酸类化合物在制备治疗以FTO为靶点的疾病的药物中的用途.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102697762 A (43)申请公布日 2012.10.03 CN 102697762 A *CN102697762A* (21)申请号 201210197108.5 (22)申请日 2012.06.14 A61K 31/192(2006.01) A61K 31/185(2006.01) A61P 3/04(2006.01) A61P 25/28(2006.01) A61P 3/00(2006.01) (71)申请人 中国科学院上海药物研究所 地址 201203 上海市浦东新区张江祖冲之路 555 号 (72)发明人 杨财广 罗成 叶飞 陈报恩 俞璐 蒋华良 (7。

2、4)专利代理机构 北京金信立方知识产权代理 有限公司 11225 代理人 朱梅 陈国军 (54) 发明名称 大黄酸或大黄酸类化合物在制备治疗以 FTO 为靶点的疾病的药物中的用途 (57) 摘要 本发明涉及如下通式 I 所示的大黄酸或大黄 酸类化合物在制备治疗以 FTO 为靶点的疾病的药 物中的用途， 实验结果表明， 通式 I 所示的化合物 能够特异性地与 FTO 结合， 通过竞争底物结合位 点表现抑制活性。细胞内试验也表明通式 I 化合 物可以明显升高体内信使 RNA 中 N-6 位甲基化腺 嘌呤 （6meA） 的水平。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 3 。

3、页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 3 页 1/2 页 2 1.如下通式I所示大黄酸或大黄酸类化合物在制备治疗以FTO为靶点的疾病的药物中 的用途 ： 其中， R2R3、 R6R7中至少有一个为 -COOH、 -COONa、 -COOK、 -SO3H、 -SO3Na、 -SO3K ； R1 R8 其余位置为以下取代基 ： -H、 -OH、 -NH2、 卤素。 2. 根据权利要求 1 所述的用途， 其中， 在通式 I 所示的化合物中， R1 R8为选自下表中 的取代基 ： 权 利 要 求 书 CN 102697762 A 2 。

4、2/2 页 3 3. 根据权利要求 2 所述的用途， 其中， 所述通式 I 化合物为大黄酸或其钠盐或钾盐。 权 利 要 求 书 CN 102697762 A 3 1/7 页 4 大黄酸或大黄酸类化合物在制备治疗以 FTO 为靶点的疾病 的药物中的用途 技术领域 0001 本发明涉及药物学领域， 尤其涉及大黄酸或大黄酸类化合物在制备治疗以 FTO 为 靶点的疾病的药物中的用途。 背景技术 0002 肥胖相关的FTO(Fat mass and obesity-associated)基因定位于人类16号染色 体， 其蛋白产物在人体内广泛表达。FTO 基因变异和肥胖症表现出较大的关联性， 因此该基 因。

5、又被人们称为 “肥胖基因” (Frayling TM,et al.,Science,2007316(5826):889-94;Gerk en T,et al.,Science,2007,318,(5855):469-72)。 FTO和阿尔法-酮戊二酸依赖的核酸氧 化去甲基化酶 AlkB 家族蛋白具有较高的序列同源性。FTO 能催化单链脱氧核糖核酸 （DNA） 中 N-3 位甲基化胸腺嘧啶 （3meT） 和核糖核酸 （RNA） 中 N-3 位甲基化尿嘧啶 （3meU） 氧化去 甲基化。最近研究显示， 在体外实验中， 单链 DNA 和 RNA 中 N-6 位甲基化腺嘌呤 （6meA） 是 FTO 。

6、的一个主要作用底物 (Jia G， et al.,Nat.Chem.Biol.,20117(12):885-7)， 在体内， 含 有 （6meA） 的信使 RNA 是 FTO 的作用底物。 0003 至今人们对FTO的功能与疾病的关系还不清楚。 已有研究表明， FTO会对人类摄食 产生直接影响， 还可能与阿尔茨海默症、 代谢综合征等有关 (Speakman JR,et al.,Obesity 2008 16(8):1961-5;Keller L,et al.,J Alzheimers Dis.2011 23(3):461-9;Freathy RM,et al.,Diabetes 200857(。

7、5):1419)。 FTO与人类健康关系密切， 因而FTO的功能与调控 也一直是国内外研究的热点。然而， 目前未见有关于 FTO 抑制剂的报道。FTO 抑制剂的发现 将对 FTO 功能的研究以及针对 FTO 靶点的新药研发产生重大影响。 发明内容 0004 技术问题 0005 设计并验证针对 FTO 的小分子化合物抑制剂， 其具有抑制 FTO 去除 N-6 位甲基化 腺嘌呤 （6meA） 中的甲基化的生物活性。 0006 技术方案 0007 为了加速设计筛选FTO抑制剂， 发明人首先运用高通量虚拟筛选 （In silico HTS） 技术， 即通过分析蛋白质三维结构， 借助计算机程序和分析软件。

8、， 过滤掉化合物库中大部分 不满足要求的化合物， 从 28 万个化合物中筛选得到了 141 个候选化合物。 0008 通过体外 FTO 生物活性验证实验得到具有抑制活性的小分子化合物。为了排除化 合物由于破坏蛋白质二级结构而表现抑制活性， 发明人运用了圆二色谱 (CD) 技术。远紫外 CD 是研究蛋白质在溶液中二级结构的主要手段之一。阿尔法 - 螺旋结构在 222 纳米和 208 纳米处表现出两个负的特征肩峰谱带， 可以利用这两处的摩尔椭圆度 208 或 222 来估计蛋白质中阿尔法 - 螺旋的含量， 判断二级结构是否发生了剧烈变化。 0009 为了研究活性化合物是否能与 FTO 蛋白质结合，。

9、 发明人通过差异扫描荧光 （DSF） 说 明 书 CN 102697762 A 4 2/7 页 5 实验进行了验证。蛋白质的稳定性与去折叠过程中的吉布斯自由能变化 （ Gu） 具有一定 的相关性， 而且是温度依赖的。大部分蛋白的稳定性随温度而变化， 温度升高时， Gu 降 低， 在折叠与去折叠的蛋白达到平衡时， Gu=0， 此时的温度被定义为蛋白质的融解温度 （Tm） 。如果蛋白质的去折叠以可逆的双态方式进行， 那么平衡态热动力学模型将适用于这 一过程。如果化合物能够与蛋白质结合， 化合物结合的自由能变化多数情况下会导致 Gu 增加， 相应的 Tm 值升高。荧光染料 Sypro Orange 。

10、的荧光信号在水环境中被萃灭， 随着温度 的升高， 蛋白质去折叠暴露出疏水区， Sypro Orange 结合至蛋白质疏水区， 发射荧光。荧光 值对温度做曲线， 蛋白质去折叠的过渡态位置的温度定义为Tm。 研究表明， 化合物结合引起 的蛋白稳定性提高与化合物的浓度以及亲和性成正比。 0010 接着， 发明人通过生物分子相互作用分析 （BIA） 技术评价了化合物与 FTO 结合的 特异性及强度。BIA 是基于表面等离子共振 （SPR） 这一物理光学现象的生物传感分析技术。 当入射光以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将产生全反射， 且反射光强度在各个 角度上都应相同， 但若在介质表面镀上一层金属。

11、薄膜后， 由于入射光可以引起金属中自由 电子的共振， 从而导致反射光在一定的角度内大大减弱， 其中使反射光完全消失的角度称 为共振角。共振角会随金属薄膜表面通过的液相的折射率的改变而改变， 折射率的变化又 和结合在金属表面的大分子质量成正比。BIA 就是利用金属薄膜表面的折射率的改变， 引 起共振角的变化， 来推断金属薄膜表面的变化。实验时先将一种生物分子固定在传感器芯 片表面， 将与之相互作用的分子溶于溶液流过芯片表面。由于不必使用荧光标记和同位素 标记， 从而保持了生物分子的天然活性。检测器能跟踪检测溶液中的分子 （如化合物） 与芯 片表面分子 （如蛋白质） 的结合、 解离整个过程的变化。。

12、通过它能观察两种分子结合的特异 性， 能知道两种分子的结合有多强。 0011 为了进一步研究化合物与 FTO 的作用方式， 发明人运用了等温滴定量热 （ITC） 技 术。 ITC技术是近年来发展起来的一种研究生物热力学与动力学的重要方法， 它通过高灵敏 度、 高自动化的微量量热仪连续、 准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线， 原位、 在线 和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。 在单次实验中即可提供一整套有关分子相互作 用的完整信息。 ITC是表征生物分子相互作用的经典方法之一， 被广泛应用于研究小分子化 合物与生物大分子 （蛋白质、 核酸等） 的相互作用。 0012 为了阐明化合物表现抑制。

13、活性的方式， 发明人运用了荧光偏振(FP)技术。 FP的基 本原理是荧光物质经单一平面的偏振光照射后， 吸收光能跃入激发态， 随后回复至基态， 并 发出单一平面的偏振荧光。偏振荧光的强弱程度与荧光分子的大小呈正相关， 与其受激发 时转动的速度呈反相关。用荧光标记 FTO 底物 DNA， 当 DNA 与蛋白结合后， 有效荧光分子变 大， 偏振荧光增强。若化合物能够影响 DNA 与 FTO 的相互作用， 荧光强度会相应发生变化。 0013 发明人基于 FTO 晶体结构开展小分子抑制剂的虚拟筛选和作用方式研究， 首次发 现了大黄酸或大黄酸类化合物能够抑制 FTO 活性， 该类化合物的结构如以下通式 。

14、I 所示 ： 0014 说 明 书 CN 102697762 A 5 3/7 页 6 0015 其中， R2R3、 R6R7中至少有一个为 -COOH、 -COONa、 -COOK、 -SO3H、 -SO3Na、 -SO3K ； R1 R8其余位置为以下取代基 ： -H、 -OH、 -NH2、 卤素。 0016 上述通式 I 所示的大黄酸或大黄酸类化合物还包括其与碱金属形成的盐， 例如钠 盐、 钾盐等。 0017 由于通式 I 所示的大黄酸或大黄酸类化合物能够抑制 FTO 活性， 其可以用于制备 治疗以 FTO 为靶点的疾病的药物。 0018 本发明的大黄酸或大黄酸类化合物可以根据常规的方法制。

15、备。例如， 通式 I 中大 黄酸及其钠盐和钾盐可以通过如下方法制备 ： 0019 取大黄酚 6g， 加入 150ml 醋酸酐和吡啶 （1:1 体积比） 的混合液， 室温过夜， 反应物 倒入冷水中结晶， 过滤， 烘干， 加到 300ml 醋酸酐和冰醋酸 （1:1 体积比） 的混合液中， 45滴 加三氧化铬溶液， 65搅拌 8 小时， 反应物倒入水中， 结晶， 过滤， 加入 1 升 25% 碳酸钠溶液， 氯仿萃取3次， 将碳酸钠溶液煮沸， 冷却， 加入盐酸酸化， 待气体排完后， 加热煮沸1小时， 冷 却， 结晶， 抽滤， 水洗， 冰醋酸重结晶， 得 2g 大黄酸， 纯度 98% 以上。大黄酸钠盐、。

16、 钾盐分别用 NaOH 和 KOH 调 pH 至 8.0 制备。 0020 本发明的大黄酸或大黄酸类化合物还可以根据常规的方法提取制备。例如， 通式 I 中大黄酸及其钠盐和钾盐可以通过如下方法获得 ： 0021 取大黄粉 500g， 加入 5 倍量 60% 乙醇加热回流 2 次， 每次 1 小时， 合并提取液， 浓缩至约 1000ml， 加入 100ml 浓盐酸， 50水解 1 小时， 冷却， 过滤， 在沉淀中加入 1000ml 5%NaHCO3 溶液， 加热溶解， 过滤， 滤液中加乙醇至 50 90%， 过滤， 滤液用浓盐酸调 pH 至 3 以下， 过滤得黄色沉淀， 水洗至中性， 冰醋酸重结。

17、晶得大黄酸， 含量 98% 以上。大黄酸钠盐、 钾盐分别用 NaOH 和 KOH 调 pH 至 8.0 制备。 0022 有益效果 0023 发明人运用生物化学和生物物理的研究手段， 揭示了通式 I 化合物与 FTO 的作用 方式， 实验结果表明， 通式 I 所示的化合物能够特异性地与 FTO 结合， 通过竞争底物结合位 点表现抑制活性。细胞内试验也表明通式 I 化合物可以明显升高体内信使 RNA 中 N-6 位甲 基化腺嘌呤 （6meA） 的水平。 附图说明 0024 图 1 为基于结构的化合物高通量虚拟筛选图 ； 0025 图 2 为 CD 技术证明化合物不引起蛋白质二级结构显著变化图 ；。

18、 0026 图 3 为 DSF 技术证明化合物能够与 FTO 结合图 ； 0027 图 4 为 BIA 技术分析化合物与 FTO 结合的特异性及强度图 ； 0028 图 5 为 ITC 技术表征化合物与 FTO 结合的热力学和动力学图 ； 说 明 书 CN 102697762 A 6 4/7 页 7 0029 图 6 为 FP 技术证明化合物能够与核酸底物竞争结合位点图 ； 0030 图 7 为化合物能够使 BE(2)-C 细胞 mRNA 中 6meA 浓度升高图。 具体实施方式 0031 下面将参考附图描述本发明示范性的实施方式， 以帮助理解本发明。 0032 实施例 0033 实验实施例 。

19、1 ： 基于结构的化合物高通量虚拟筛选。 0034 虚拟筛选所采用的结构是结合了底物 3meT 的人源 FTO（PDB 号 ： 3LFM） ， 结构下载 自 Protein Data Bank(http:/www.rcsb.org/pdb)， 得到晶体结构后去掉分子内部的水分 子和缓冲液以及其他离子。发明人筛选了 28 万个化合物， 购买了 114 个候选化合物， 具体 筛选流程如图 1 所示。 0035 实验实施例 2 ： 生化实验检测化合物的抑制活性。 0036 pET-28a-FTO 原核表达质粒转化至 BL21(DE3)-RIL 表达菌株， 16条件下 0.5mM IPTG 诱导表达 。

20、17 小时， 收集菌体超声破碎， 15000rpm 离心 20 分钟后， 取上清液经 Ni-NTA、 MonoQ 和 Superdex200 纯化后得到 FTO 蛋白的纯度大于 95%。在 100l 的筛药体系中， 加 入底物 6meA-RNA 浓度为 10M， FTO 蛋白浓度为 1M， 加入不同浓度的待测化合物， 25孵 育 1 小时， 100 10 分钟灭活蛋白。然后用 P1 酶和碱性磷酸酶酶切反应后的 RNA， HPLC 分 析腺嘌呤 （A） 与 N-6 位甲基化腺嘌呤 （6meA） 的比例。将酶活性抑制率 （%） 达到 50% 时抑制 剂的浓度定为 IC50值。抑制率 （%） 可以根。

21、据下式计算 ： 抑制率 (%)= 实验组 6meA/ 实验组 (A+6meA)/ 对照组 6meA/ 对照组 (A+6meA)100% 0037 在 114 个候选化合物中， 经过生物学活性检测显示， 大黄酸或大黄酸类化合物具 有较好的对FTO的抑制活性。 为了进一步测试大黄酸或大黄酸类化合物对FTO的抑制活性， 本申请测试了一系列如下通式 I 所示的化合物 ： 0038 0039 其中， R2R3、 R6R7中至少有一个为 -COOH、 -COONa、 -COOK、 -SO3H、 -SO3Na、 -SO3K ； R1R8其余位置为以下取代基 ： -H、 -OH、 -NH2、 卤素。 0040。

22、 通式 I 所示结构的具体化合物如表 1 所示。这类化合物对 FTO 表现出不同程度的 抑制活性。表 2 给出了表 1 中部分化合物对 FTO 的抑制活性测试结果， 其中， 化合物 1 对 FTO 的抑制活性最好， IC50值为 21M。实验中所用化合物均为钠盐形式。 0041 表 1 ： 通式 I 结构的具体化合物 0042 说 明 书 CN 102697762 A 7 5/7 页 8 0043 说 明 书 CN 102697762 A 8 6/7 页 9 0044 表 2 ： 化合物对 FTO 抑制活性 0045 0046 a 为三组平行数据， 其 SD10% 0047 实验实施例 3 ：。

23、 FTO 为 2OG/Fe(II) 依赖的氧化酶， 目前针对 2OG/Fe(II) 依赖的氧 化酶主要为2OG的类似物或者Fe(II)的螯合剂。 针对FTO的小分子抑制剂尚未见报道。 为 了排除化合物通过络合 Fe(II) 才表现出对 FTO 的抑制活性， 本论文首先设计了如下实验。 在保持 FTO 活性不受影响的条件下， 在对照组中加入较化合物过量的 Fe(II)， 相应地， 在平 行实验组中加入 100M 化合物 1。结果表明， 化合物 1 的抑制活性不依赖于 Fe(II) 浓度的 变化而变化， 结果示于表 3。 0048 表 3 ： 不同 Fe(II) 浓度下化合物 1 对 FTO 的抑。

24、制活性 0049 0050 a 为三组平行数据， 其 SD10% 说 明 书 CN 102697762 A 9 7/7 页 10 0051 实验实施例 4 ： CD 技术证明化合物不引起蛋白质二级结构显著变化。 0052 将化合物和蛋白质按照摩尔比 50:1 和 100:1 混匀， 孵育 20 分钟后， 在 200-250nm 进行远紫外光谱数据收集， 实验设三组重复。 谱图数据分析表明， 化合物未引起蛋白质二级 结构的显著变化， 如图 2 所示。 0053 实验实施例 5 ： DSF 技术证明化合物能够与 FTO 结合。 0054 将化合物 1 与 FTO 按照摩尔比 10:1、 20:1、。

25、 40:1 混匀后， 加入荧光试剂 SYPRO orange， 在 AB 7500Fast RT-PCR 仪运行程序 ： 25 95， 升温速率为 1%， 每隔 20 秒读一 次荧光。荧光值对温度做曲线， 经 Boltzmann 拟合， 蛋白质去折叠的过渡态位置的温度定义 为 Tm值， 实验设三组重复。结果表明， 随着化合物 1 浓度升高， Tm 值增大。如图 3 所示。 0055 实验实施例 6 ： BIA 技术分析化合物与 FTO 结合的特异性及强度。 0056 将纯化得到的纯度大于 95% 的 FTO 蛋白透析至 HBS-EP 缓冲液 （0.01MHEPES pH 7.4， 150mM 。

26、NaCl， 3mM EDTA， 0.005%v/v Surfactant P20） ， 蛋白浓度为5mg/ml。 化合物1和 5 分别用透析蛋白后的缓冲液溶解为一系列浓度梯度。蛋白用乙酸钠缓冲液 （pH 4.2） 稀释 至 0.1mg/ml 后固定于 CM5 芯片。将准备好的样品放入 BIAcore 3000 收集数据， 结果表明， 化合物 1、 4、 5 的 Kd分别为 49.4M、 11.5M 和 8.3M， 如图 4 所示。 0057 实验实施例 7 ： ITC 技术表征化合物与 FTO 结合的热力学和动力学。 0058 将纯化得到的纯度大于 95% 的 FTO 蛋白透析至实验用缓冲液 。

27、（50mMTris-HCl,pH 8.0， 500mM NaCl， 10mM -Me） ， 浓度为 65M， 体积为 2mL。化合物 1 溶解在透析蛋白后的 缓冲液中， 浓度为650M， 体积为500L。 将化合物滴入蛋白样品， 每隔3min滴一次， 共25 次。对照采用同样的方法， 将化合物滴入缓冲液。结果表明， 化合物与 FTO 的结合为吸热反 应， Kd为 11， 如图 5 所示。 0059 实验实施例 8 ： FP 技术证明化合物能够与底物竞争结合位点。 0060 荧光标记 FTO 底物 DNA(5 -ATTGTCA(6meA)CAGCAGA-3 -FAM)， 当荧光标记的 DNA 与。

28、蛋白结合后， 有效分子变大， 偏振荧光增强。实验结果显示， 随着化合物浓度增加， 偏 振荧光强度逐渐减弱， 实验设三组重复， 如图 8 所示。化合物很可能与 DNA 竞争结合位点， 导致 DNA 与 FTO 解离， 荧光值逐渐减小。化合物 1 相对其它化合物具有较强的竞争能力， 这 与抑制活性结果相一致。如图 6 所示。 0061 实验实施例 9 ： 化合物 1 在神经母细胞瘤细胞 BE(2)-C 上对 FTO 的抑制作用。 0062 研究表明， FTO siRNA 处理的 HeLa 细胞 RNA 中 6meA 浓度显著升高， FTO 过表达则 显著降低 6meA 浓度。这里分别用 150M 。

29、和 300M 化合物 1 处理 BE(2)-C 细胞， HPLC 检 测 RNA 中 6meA/U、 6meA/C、 6meA/G 的比率， 细胞内 6meA 浓度显著升高， 如图 7。 0063 结果表明， 化合物 1 可以通过抑制 FTO 活性提高细胞内 6meA 浓度。 说 明 书 CN 102697762 A 10 1/3 页 11 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102697762 A 11 2/3 页 12 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102697762 A 12 3/3 页 13 图 7 说 明 书 附 图 CN 102697762 A 13 。