技术领域：
本发明涉及硝酸镧在制药领域中的应用，具体地，涉及硝酸镧在阻止人艾滋病毒和 其它通过生殖道传播的病原体方面的应用。
背景技术：
性传播疾病(sexually transmitted disease，STD)已经成为我国和全球的生殖健康和 卫生防疫的难题。仅以美国为例，在前十位常见疾病中，STD就有五种。每年的新病 例有1200万，仅1994年的预防开支达到170亿美元左右，由此可见它的危害。在其 他国家，特别是发展中国家(包括中国)，STD引起的危害和损失也是很大的。据我国 权威部门公布的材料，我国性病的年增长率超过30％，艾滋病和艾滋病毒感染者的增 长率，1999年比1998年分别增长105％和250％。
在20多种性传播疾病当中，危害最大的是艾滋病。到2002年底，全球已死亡艾 滋病人3000万人，仅2002年就死亡310万人，有4200万人感染上了艾滋病毒，2002 年就有500万新感染者，每天有约一万五千人新感染上艾滋病毒，其中妇女约占总数 的44％。由同性或异性性传播引起的感染者占80-90％。虽然已有高效联合疗法(鸡 尾酒疗法)可以减少发病率和死亡率，但还不能治愈。所需要的医疗费用更是绝大部 分发展中国家的患者无法承受的开支。根据消灭天花和脊髓灰质炎的经验，即使将来研 制出高效艾滋病疫苗，其他防治方法也还需要继续使用至少五十年。已有研究表明， 其它的性传播疾病会增加艾滋病毒感染的机会，所以针对杀其它STD病原体的杀微生 物剂的使用，除了直接减少这些疾病的发生之外，还会间接地阻止艾滋病毒的性传播。 因此，目前的主攻方向是研制出高效、价廉和安全的针对艾滋病毒的杀微生物剂。由 此可见，研制出实用的杀微生物剂是社会十分迫切需要的。
镧是一种稀土元素，硝酸镧的应用主要是在工业上，在农业上也只是应用于促进某 些植物的花粉萌发，有关硝酸镧在医药方面的应用至今还很少。目前还没有杀微生物 剂上市，最新研究资料证明，以表面活性剂和去污剂组成的杀微生物剂(如壬丙醇等) 会增加艾滋病毒性传播的机会，学术界已经公认这类制剂应该禁止使用。我们发现硝 酸镧对人艾滋病毒的抑制活性(治疗指数TI值)可以达到700～900，作为一种抗艾滋 病毒的一种小分子化合物，它具有价格低廉，来源丰富，而且对人体的毒副作用小等 特点。
发明内容：
本发明的目的是提供一种硝酸镧在抗HIV-1中的应用。
本发明的另一个目的是提供一种硝酸镧在抗HSV-1中的应用。
本发明的另一个目的是提供一种硝酸镧在抗白色念珠菌中的应用。
为了实现本发明上述的目的，本发明提供了下面的技术方案：
按硝酸镧与赋型剂重量比为1∶100-1∶1000000的比例加入赋型剂，制成片剂、 乳剂、胶囊或凝胶。
本发明同时提供了硝酸镧在制备阻止人艾滋病毒和其它性传播疾病病原体通过生殖 道传播的药物的应用。
为了更好地理解本发明的实质，下面用实验来说明用硝酸镧阻止人艾滋病毒和其它 性传播疾病病原体通过生殖道传播的有益效果。
1、硝酸镧体外抗HIV-1病毒活性检测的实验方法
先进行HIV-1病毒感染性的滴定，按Reed & Muench方法计算病毒的TCID50(50％ Tissue culture infectious dose)。在96孔板上，将硝酸镧溶液做系列梯度稀释，每个梯 度设置2个孔，同时设置阳性药物对照组。每孔加入适当的细胞(2×104/孔)，然后 每孔加入20μl HIV-1病毒培养上清，使每孔的终体积为200μl。于37℃，5％CO2培 养箱中培养。第三天补加新鲜完全培养基100μl，第七天在倒置显微镜下观察每孔 中病毒诱导的细胞致病变效应(Cytopathic effect，CPE)，计算每孔中合胞体数；按Reed & Muench方法计算能抑制50％病毒生长的被检样品的浓度EC50(50％ effective concentration)。用MTT方法测定被检样品对病毒感染细胞的毒性。取适量的细胞与不 同浓度的样品溶液混合，放置37℃，5％CO2培养箱中培养三天或者五天，测定被检 样品抑制50％细胞生长的浓度IC50(50％ inhibition concentration)。治疗指数TI值 (therapeutic index，)为IC50/EC50的比值。
2、用MTT法测定硝酸镧对性传播疾病病菌白色念珠菌的抑制作用
取待试样品10mg，用100μl DMSO助溶后，滴加900μl沙保氏培养基，充分混合 后，使浓度为10mg/ml，过滤除菌，置4℃保存；首先将待试样品在96孔培养板上稀释 至合适的浓度，同时设置阴性对照和空白对照。每系列孔(除空白和生长对照孔外)， 取100μl加入到下一孔，最终孔弃去100μl。用头孢菌素作阳性对照，浓度稀释方法与 待测药物相同；用沙保氏培养基把菌悬液浓度从4.5×106cfu/ml调到4.5×105cfu/ml，将 稀释好的菌液加入板中，每孔100μl，第9孔不加；接种菌液后，培养板子37℃，5％ CO2培养箱中培养24小时，观察生长情况。待阴性对照孔生长良好后，96孔培养板以 1000rpm离心10min。吸出150μl培养基。每孔各加5mg/ml的MTT(含1mM甲萘醌) 25μl，放入37℃温箱4小时，然后各孔加20％SDS-50％DMF(pH4.7)100μl；培养板37 ℃放置12小时后，用酶标仪于波长595nm，参考波长655nm下，测定OD值。通过计 算得到样品硝酸镧对细菌的抑制率。
抑制率(％)＝(1-实验孔OD值/对照孔OD值)×100
3、用PRA法测定硝酸镧对人单纯疱疹病毒(HSV)的抑制作用
将Vero细胞悬液加入到24孔板(2-4×105/well)，37℃，5％CO2培养箱中培养 24小时；待细胞单层铺满24孔板后，每孔加200μl病毒上清或培养基，轻摇，使病毒 稀释液和细胞单层充分接触，37℃，5％CO2孵育1小时；用RPMI1640培养基对药 物作两倍稀释，设置阿昔洛韦做阳性对照；小心吸出培养基，加入PBS洗板；加入未 凝的琼脂糖覆盖培养基(A(RPMI1640+2％FCS，12ml，37℃水浴保温)、B(1％琼 脂糖(现配)13ml，60℃水浴保温)混和液)，每孔加1ml。加入稀释好的待测样品液， 每孔0.5ml，但第6孔(病毒生长孔)和第12孔(细胞生长孔)不加样品液；置37℃， 5％CO2培养箱中培养三天。然后用2％甲醛固定细胞10min；加入700μl龙胆紫染液， 染色20min；用自来水轻轻洗涤3次，倒置凉干，在倒置显微镜下计数空斑。通过计算 得到样品硝酸镧对病毒的抑制率。
4、用MTT法检测硝酸镧对细胞的毒性作用
在96孔平底培养板上，将待测化合物用培养基2倍稀释。作7个稀释度，每孔100μl， 设两个重复孔。同时设置不含化合物的细胞对照组和空白组及阿昔洛韦阳性对照；离 心(1000rpm，10min)，用完全培养基重悬Vero细胞培养液后，每孔加入100μl(4×105/well) 细胞悬液；置37℃，5％CO2培养箱中培养三天。然后将96孔细胞培养板低速离心， 弃去150μl培养上清，加入25μl MTT溶液(5mg/ml)，37℃，5％CO2培养箱中孵育4小 时，加入20％SDS-50％DMF(pH4.7)，孵育过夜；用酶标仪测定各孔的OD值。通过 计算得到样品硝酸镧对细胞的存活率的影响，了解其毒性作用。
名词解释：
TCID50：(50％Tissue culture infectious dose)，即引起50％培养细胞出现CPE的 病毒上清稀释度；
IC50：对50％的宿主细胞产生毒性的样品的浓度；
EC50：对HIV-1合胞体形成抑制率达到50％的样品浓度；
治疗指数(therapeutic index，TI值)为IC50/EC50的比值，治疗指数达到100的样品 则判为对HIV-1具有抑制活性。
附图说明：
图1：硝酸镧对HIV诱导C8166细胞形成合胞体的抑制作用以及对细胞的毒性作 用。图中横坐标表示的是样品浓度的对数值(Log of concentration)，纵坐标表示的是 抑制率和存活率的百分比(％ of Inhibition and ％ of Viability)。◆表示的是抑制率 (Inhibition)；■表示的是存活率(Viability)。
图2：空斑减少法测定硝酸镧对HSV-1的抑制活性。横坐标代表硝酸镧的浓度梯 度的对数值，纵坐标代表硝酸镧对单纯疱疹病毒I型的抑制率(百分比)。
图3：MTT法测定硝酸镧对Vero细胞的毒性。横坐标代表硝酸镧的浓度梯度的对 数值，纵坐标代表Vero细胞的存活率(百分比)
图4：MTT法测定硝酸镧对白色念珠菌的抑制活性。横坐标代表硝酸镧的浓度梯 度的对数值，纵坐标代表硝酸镧对白色念珠菌的抑制率(百分比)
具体实施方式：
下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质内容，但本发明的内容并不局限 于此。
实施例1：硝酸镧体外抗HIV活性检测的实验
在96孔培养板上，将HIV-1(H9/HIV-1IIIB，由英国MRC惠赠，按常规方法复 苏，培养，收集，分装和冻存)贮存液作5倍稀释，共8梯度，每个梯度设6孔， 同时设置对照组。每孔加入C8166细胞(为T淋巴细胞系，由英国Medical Research Council(MRC)，AIDS Reagent Project惠赠)50μl(2×104/孔)，每孔终体积为200μl。 37℃，5％CO2培养。第三天补加新鲜完全培养基(RPMI-1640)100μl，第七天在倒 置显微镜下观察每孔中病毒诱导的细胞致病变效应(Cytopathic effect，CPE)，以每孔是否 有合胞体的形成来确定；按Reed & Muench方法计算病毒的TCID50(50％ Tissue culture infectious dose)，即引起50％培养细胞出现CPE的病毒上清稀释度。再将96孔细胞 培养板低速离心后，小心吸去150μl上清，然后每孔加5mg/ml MTT溶液(3，(4，5- dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)；SDS(Sodium Dodecyl sulfate)； DMF(N，N′-Dimethyl formamine)20μl，37℃，5％ CO2细胞培养箱中孵育4小时，每孔 加100μl 20％SDS-50％DMF，37℃孵育过夜，用Bio-Rad 3550 ELISA仪(测定波长 为595m；参考波长为655nm)检测。取4×105/ml C8166细胞悬液100μl与不同浓 度的样品溶液混合，置37℃，5％CO2培养箱中培养三天或五天，然后测定其细胞毒 性IC50(50％ inhibition concentration)。在96孔平底培养板上，将待测样品用培养基进 行5倍稀释，共八个稀释度，每孔100μl，设2个重复孔，同时设置正常细胞对照。对 于HIV感染的细胞。每孔加4×105/ml的C8166细胞80μl，然后每孔加入20μl HIV-1上清，每孔的终体积为200μl，置37℃，5％CO2培养箱内培养。感染后第3 天观察样品对合胞体形成的影响。在倒置显微镜下，计数HIV-1诱导C8166细胞形成 的合胞体数。EC50(50％ effective concentration)为抑制合胞体形成达50％时的样品的 浓度。得到以下的结果：
合胞体形成法测样品的抗HIV-1IIIB作用和MTT法测对C8166细胞的毒性作用 Samples EC50(μg/ml) IC50(μg/ml) TI Date 硝酸镧 2.82 2709.28 961 2002/08/06 硝酸镧 3.67 2779.96 758.42 2002/10/30
两次实验的结果表明，样品硝酸镧对细胞的毒性(IC50)的浓度分别为2709.28μ g/ml和2779.96μg/ml，样品硝酸镧对HIV感染细胞合胞体形成的50％抑制率的浓度分 别为2.82和3.67，它的治疗指数(TI值)分别为961和758(见附图1)。
实施例2：硝酸镧对HSV-1的抑制作用和对Vero细胞的毒性作用
一、PRA法测定化合物对HSV-1的抑制作用
1、将Vero细胞悬液加入24孔板(2-4×105/well)，37℃，5％CO2培养箱中培养24 小时；
2、待细胞长成致密单层，铺满24孔板板底后，然后每孔加200μl病毒上清或培养基， 轻晃板，使病毒稀释液和细胞单层充分接触，37℃，5％CO2培养箱中孵育1小时；
3、另一块板中用RPMI1640对药物作两倍稀释，用阿昔洛韦做阳性对照；
4、小心加入琼脂糖覆盖培养基(A、B混和液)，每孔1ml。及时加入稀释好的待测药 液，每孔0.5ml，6孔(病毒生长孔)和12孔(细胞生长孔)不加；
5、置37℃，5％CO2培养箱中培养三天。第三天移出培养基，并每孔加入1ml 2％甲 醛固定细胞，10min；
6、加入700μl龙胆紫染液，染色20min；
7、移出染液，用自来水轻轻洗涤3次，倒置凉干，在倒置显微镜下计数空斑。根据下 例公式计算化合物对HSV-1的抑制率：
二、MTT法检测硝酸镧化合物对Vero细胞的毒性作用
1、在96孔平底培养板上，将待测化合物用培养基进行2倍稀释。共7个稀释度， 每孔100μl，设两个重复孔。同时设置不含化合物的细胞对照组和空白组及阿昔洛 韦阳性对照；
2、离心Vero细胞(1000rpm，10min)，用完全培养基重悬后每孔加入100μl(4×105/well) 悬液；
3、置37℃，5％CO2培养箱中培养三天。第三天将96孔细胞培养板低速离心后， 吸取150μl培养上清，再加入25μl MTT溶液(5mg/ml)，37℃，5％CO2培养箱中孵 育4小时左右，加入20％SDS-50％DMF(pH4.7)，孵育过夜；
4、用酶标仪测定各孔的OD值，根据下面公式计算出细胞存活率：
得到以下的试验结果(见附图2和3)：
表1 硝酸镧对HSV-1的抑制作用和对Vero细胞的毒性作用 硝酸镧样品号 IC50 (mM) EC50 (mM) TI值 1 4.9909 1.5770 3.16 2 4.8017 1.7019 2.82 3 6.724 1.4562 4.62
实施例3：MTT法测定硝酸镧化合物对白色念珠菌的抑制作用
1、取待试药10mg，用100μl DMSO助溶后，滴加900μl沙保氏培养基，充分混合后， 使浓度为10mg/ml，过滤除菌，置4℃保存；
2、待试药使用前稀释至合适的浓度(96孔培养板)注：第8孔加不含药的沙保氏培 养基100μl，作阴性对照；
3、第9孔加200μl生理盐水，作空白对照，设三孔重复。每系列孔(除空白和生长对 照系列外)取100μl给下一孔，最终留100μl，余下的弃去。
4、用头孢菌素作阳性对照，浓度稀释同待测药物稀释；
5、用沙保氏培养基把菌悬液浓度从4.5×106cfu/ml调到4.5×105cfu/ml，将稀释好的菌液 加入板中，每孔100μl，第9孔不加；
6、接种菌液后，培养板于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时，观察生长情况。待 阴性对照孔生长良好后，把板1000rpm离心10min。吸出150μl培养基。每孔各加5mg/ml 的MTT(含1mM甲萘醌)25μl，放入37℃温箱4小时，然后各孔加20％SDS- 50％DMF(pH4.7)100μl；
7、培养板37℃放置12小时后，用酶标仪于波长595nm，参考波长655nm下， 测定OD值。根据下面公式计算出化合物对白色念珠菌的抑制作用；
8、抑制率(％)＝(1-实验孔OD值/对照孔OD值)×100。
得到以下结果(见附图4)：
MTT法测定化合物对白色念珠菌的抑制作用 药物 (化合物) MIC90(M) 1 2 3 头孢菌素 14.5166 8.6748 硝酸镧 2.7348 2.6951 M33-A ＞＞6.670 ＞＞6.670 ＞＞6.670