槐果碱或其可药用盐在制备治疗心律失常的药物中的应用
本申请是申请号为“200410089431.6”、申请日为“2004年12月10日”、发 明名称为“槐果碱在药物中的应用”的分案申请。
技术领域
本发明属于药学领域，涉及一种槐果碱的应用，特别是槐果碱或其可药用盐 在制备治疗心律失常的药物中的应用。
背景技术
槐果碱(sophoearpine)即从豆科槐属植物苦参及豆科槐属植物苦豆子中的干 燥根及其地面部分中提取的有效单体，分子式为C15H22ON2，熔点为53-54℃， 其结构式为(I)：
病毒性心肌炎的发病与肠道病毒有密切的关系，其中尤以柯萨奇B病毒 (RNA病毒)为多见。槐果碱具有明显对抗柯萨奇B病毒的功能，对柯萨奇B 病毒性心肌炎有明显的效果。关于槐果碱对抗柯萨奇B病毒及其药物的制备已经 公开在本申请人的一项已授权专利99119850.6中。此外，本申请的发明人也发现 了槐果碱可对抗冠状病毒，相关技术内容在本申请人的另一项专利申请 03151269.0中有所描述。
尽管本申请人先前已经发现了槐果碱可对抗柯萨奇B病毒、冠状病毒，但引 起心肌炎尚有其它病毒，包括以下病毒：
1、柯萨奇A病毒，常是引起婴儿心肌炎的原因。
2、埃可病毒(Echo-Virus)，其也可引起心肌炎，其中Echo 9病毒目前被认 为是COXA 23，感染后可引起阵发性房性心动过速及房室传导阻滞。
3、腺病毒(Adeno-virus)，它是一种核内复制的单一DNA病毒，近年来认 为它可能是病毒性心肌炎的重要原因之一。曾有学者报导在临床确诊的急性病毒 性心肌炎患者的心肌活检标本中用PCR的方法可检出腺病毒的病毒基因，其检出 率甚至比肠道病毒高1倍(而且仅为腺病毒，未发现其它病毒)。目前认为肠道 病毒是小儿心肌炎的主要原因，可引起非典型性肺炎或心肌炎。临床上常无症状 且更易持续感染，从而导致扩张型心肌病或心内膜弹力纤维增生症。
4、流感病毒，它是RNA呼吸道病毒，除引起呼吸道感染外，也可引起心肌 炎。这都是十分重要的。
本申请的发明人在研究中发现，槐果碱除了可对抗柯萨奇B病毒、冠状病毒 以外，对于上述的Echo病毒、腺病毒、流感病毒(流感病毒B)都是有作用的。
在病毒性心肌炎阶段，炎症细胞浸润可分为二个时相，第一时相即病毒感染 后3～7天，主要为巨噬细胞和NK细胞侵入心肌并达到高峰。第二时相即为病毒 感染后7～14天，T细胞替代巨噬细胞和NK细胞成为主要浸润细胞。NK细胞是 一类和T、B细胞和巨噬细胞具有明显不同的淋巴细胞，能识别多种抗原决定簇， 不需致敏即可直接杀伤靶细胞，而且活性不受主要组织相容性复合物(MHC)限 制，因此，NK细胞可在特异性CTL产生前发挥抗病毒作用。许多研究发现在 COXB3感染第3天时，NK细胞的非特异性细胞毒性作用增强，不仅可杀伤病毒 感染细胞，也可直接杀伤未经病毒感染的细胞，因此设想NK细胞可能参与了 COXB3诱导的心肌炎发病过程。本申请的发明人在研究中还发现，槐果碱对NK 细胞活性有双向调节作用。
发明内容
本发明所要解决的问题在于提供槐果碱或其可药用盐在制备治疗心律失常 的药物中的应用，所述槐果碱的结构式为(I)。
进一步的，所述的槐果碱的可药用盐为槐果碱的溴酸盐、或者槐果碱的盐酸 盐或者槐果碱的氟酸盐。
进一步的，所述的槐果碱的可药用盐的药物剂型为医学上认可的任何一种剂 型。
具体的，所述的药物剂型为粉剂、或者注射液、或者胶囊、或者片剂、或 者口服液。
槐果碱不但有静脉注射液，还有粉剂、口服液、胶囊以及片剂。口服制剂与 静脉用药在人体内药代动力学及生物利用度比较，二种制剂的体内过程均符合二 室模型。口服液的血液浓度Cmax较低于静脉注射液，达峰时间Tmax也相对延 长，其参数T1/2 β、K10、cLs、Auc等无显著差异(P＞0.05)，表明口服制剂及 静脉注射制剂二种剂型具有生物等效性，F为80-85％。
本发明所述的槐果碱药物的制备可参考常规的药物配制方法，在知道了所需 药物的给药剂量以后，药物的配制是本技术领域人员所熟知的。槐果碱药物的一 种配制方法可参考本申请人之前的已授权专利99119850.6。
在本发明的一个方面，本申请的发明人利用两种细胞(Hela细胞及Vero细 胞)，作了槐果碱对抗Echo病毒及腺病毒的体外及体内病毒试验，发现它对Echo 病毒及腺病毒的增殖均有对抗作用。槐果碱对抗Echo病毒及腺病毒的体外测定 结果发现，当1％槐果碱稀释至1∶8(即312μg)时，对Echo病毒发挥抗病毒作 用，直至1∶128(即19.5μg)时仍能抑制Echo病毒在Hela及Vero细胞上致病变 作用。当1％槐果碱稀释至1∶8(即312μg)时，对腺病毒发挥抗病毒作用，直至 1∶64(即39μg)时仍能抑制腺病毒在Hela和Vero细胞上的致病变作用。槐果碱 对抗Echo病毒及腺病毒的体内测定具体可见下文实施例的描述。
在本发明的另一个方面，验证了槐果碱能够对抗流感病毒，体外试验发现槐 果碱对于流感乙型病毒的增殖有抑制作用。当浓度样品在31.25ug/ml浓度时有抗 流感病毒活性，抑制率为75％，样品在15.625ug/ml浓度时有抗流感乙型病毒， 抑制率为50％，样品在7.81ug/ml浓度时有抗流感病毒活性，抑制率为25％，具 体见下面实施例中的相关描述。
在本发明的另一方面，本申请的发明人发现，槐果碱还有抗心律失常的作用。 在离体豚鼠心室乳头肌细胞动作电位的研究中，发现：第一，槐果碱能使0期上 升速度下降，并呈浓度依赖性，可能对钠通道有抑制作用；第二，槐果碱可使 APD50、APD90、APD100均延长，并呈浓度依赖性，可能有抑制钾外流作用；第 三，槐果碱可能使ERP延长，并呈浓度依赖性，这不仅与其延长动作电位时程有 关，可能也与其轻度抑制钠通道有关(Vmax下降)。第四，槐果碱与盐酸胺碘酮 相比，起效快，剂量小。
在槐果碱对兔窦房结细胞动作电位的影响的研究中，发现：第一，高浓度槐 果碱可使0期上升速度下降，提示其可能对慢钙(L)通道有抑制作用；第二， 槐果碱可使4期自动除极速率明显下降，并呈浓度依赖性；高浓度槐果碱使APD50明显延长，提示有可能抑制钾外流的作用；第三，槐果碱可使窦房结的自律性发 生放频率下降，呈浓度依赖性；第四，槐果碱与盐酸胺碘酮相比，起效快，剂量 小，且对动作电位各参数影响程度小，易恢复。
在槐果碱对冠状动脉阻塞——再灌注犬心律失常的实验中，发现在用 10mg/kg静脉注射并以维持量静脉点滴的情况下，结扎冠状动脉后1小时，打开 结扎线未见有再灌注室性颤动，说明槐果碱具有对抗冠状动脉阻塞——再灌注诱 发心律失常作用。而以生理盐水取代槐果碱后再结扎冠状动脉后1小时，打开结 扎线后——都发生再灌注室性颤动，以致死亡。
在本发明的另一方面，发现槐果碱对腺病毒所致肺部炎症有抑制作用，病毒 组小鼠在接种腺病毒后，肺泡与肺泡间的壁增厚，小支气管间及旁有很多炎症细 胞；而槐果碱治疗组在治疗后，肺泡与肺泡间的壁增厚明显减轻，炎症细胞减少。
本申请的发明人还发现，槐果碱能够调节免疫功能。病毒性心肌炎的发病原 因，除了病毒直接侵犯心肌以外，还有机体的免疫反应的参与，其中T淋巴细胞 的功能尤为重要，如CD3+、CD4+、CD8+等类型有明显表现。CD3+为总淋巴细胞， CD8+为杀伤性淋巴细胞(Ts)，它对抗原的反应是将靶细胞溶解，具有病毒抑制 和损伤心肌的双重作用。CD4+为辅助淋巴细胞(Th)，作用于B细胞能提高体液 免疫的功能。在杀伤性T细胞和巨噬细胞激活或增生过程中发挥重要作用。但两 者的活性均受主要组织相容性复合因子(MHC)所激活与限制。CD8+与MHC-I 有关，CD4+与MHC-II有关。在正常情况下二者功能趋于动态平衡。病毒感染后 则发生变化。临床所见病毒性心肌炎患者中，免疫功能低下，尤其对于反复发作 者。为此，本申请的发明人借助Balb/c小鼠COXB3m病毒性心肌炎模型，研究 感染后不同天数小鼠脾脏T细胞亚群的变化以及槐果碱对其影响，以及研究槐果 碱对感染后小鼠匀浆中COXB3m病毒增殖的抑制情况。
在本发明的一个实施方式中，通过研究槐果碱对小鼠柯萨奇B3m心肌炎模型 中Thy-1(CD3)、L3T4(CD4)、Ly-2(CD8)等T细胞免疫的调节以及对心肌内 COX3m增殖的抑制作用，进行了槐果碱对免疫功能的调节及提高方面的研究， 研究其是否有助于心肌炎的恢复。
用单克隆抗体间接免疫荧光法测定病毒感染后不同天数小鼠脾脏T细胞亚 群。结果显示：(1)病毒感染组：脾脏的Thy-1(CD3)、L3T4(CD4)及Ly-2(CD8) 细胞在感染后第3天起开始明显下降，直至第14天各点所测的值显著低于正常 组(P＜0.05～0.001)。CD4/CD8比值从感染后7天的2.08±0.97上升到14天的2.65 ±0.58，明显高于槐果碱治疗组(P＜0.01)。CD4/CD8比值的升高说明疾病在发展， (2)槐果碱的治疗组则均高于病毒感染组与正常对照组相比无差异。
还测定了槐果碱对感染后模型心肌匀浆中病毒的抑制作用。病毒组在感染不 同天数心肌匀浆中CVXB3m LogTCID50未见减少，而槐果碱治疗组从第3天开始， 第5天、7天及14天的心肌匀浆中CVXB3m LogTCID50明显减少，P＜0.001。说 明免疫功能提高后更有助于槐果碱对心肌内病毒的抑制作用。
本发明的另一方面，在COXB3病毒性心肌炎模型的基础上，探讨了槐果碱对 病毒感染小鼠的免疫调节作用。小鼠在感染COXB3病毒后，经组织证实均发生 心肌炎，但在发病过程中，NK细胞活性有动态变化，在病毒感染后3天，NK 细胞活性显著增高，继之进行性下降，12天时低于正常水平。
槐果碱对NK细胞活性有双向调节作用。本申请的发明人用10mg/kg、 20mg/kg、30mg/kg不同剂量的槐果碱治疗COXB3病毒感染的小鼠，发现在感染 后第3天，10mg/kg组不抑制增高的NK细胞活性，20mg/kg和30mg/kg组使增 高的NK细胞活性降低，在第8天时，10mg/kg组心肌坏死和炎症浸润较重。 20mg/kg和30mg/kg组心肌坏死和炎症浸润明显减轻，症状也有不同程度的改善。 因此，早期应用适当剂量的槐果碱能抑制增高的NK细胞活性，减轻了NK细胞 对心肌细胞的损伤。在以后的NK细胞活性进行性下降阶段可用槐果碱治疗，增 加NK细胞的活性，抵抗病毒的繁殖。并且，槐果碱能在心肌细胞内抑制病毒的 繁殖。
在本发明的另一方面，发现小鼠在CoxB3病毒感染后，体内干扰素(IFN) 水平增加，这可能是由于病毒的诱导所致。在测试时发现，与其它组相比，槐果 碱治疗组干扰素水平更高，且随剂量增加而显著升高。提示槐果碱在体内可诱生 干扰素，从而参与机体抗病毒作用。此外，NK细胞常常与干扰素协同作用控制 病毒感染，干扰素可能具有诱导NK细胞前体分化成为成熟的NK细胞，并促使 NK细胞释放更多的细胞因子等作用。
附图说明
图1显示了Echo病毒感染的Balb/c小鼠病毒性心肌炎模型的病理变化。其 中，(A)显示了Echo病毒模型组(10×10，HE染色)的情况，心膜外有钙化、 成片，并有少量炎症细胞浸润；(B)显示了槐果碱30mg/kg治疗组(10×10， HE染色)的情况，仅有极少量炎症细胞。
图2显示了腺病毒感染的Balb/c小鼠病毒性心肌炎模型的病理变化。其中， 图2(A)显示了腺病毒组(10×10，HE染色)的情况，管壁边缘有一炎灶，成 纤维细胞增生，心肌细胞空泡变性；图2(B)显示了槐果碱30mg/kg治疗组(10 ×10，HE染色)的情况，仅心外膜有少许炎症细胞及少许成纤维细胞。
图3(A)显示了10μM槐果碱对豚鼠心室乳头肌细胞动作电位的影响。图3 (B)显示了不同浓度的槐果碱对豚鼠心室乳头肌细胞动作电位的影响。图3(C) 显示了不同浓度槐果碱对豚鼠心室乳头肌细胞动作电位有效不应期的影响。图3 (D)显示了盐酸胺碘酮对豚鼠心室肌动作电位的影响。图3(E)显示了盐酸胺 碘酮对豚鼠心室肌动作电位的有效不应期影响。
图4(A)显示了不同浓度的槐果碱对兔心窦房结细胞动作电位的影响。图4 (B)显示了50μM盐酸胺碘酮对兔心窦房结细胞动作电位的影响。
图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11显示了槐果碱对冠状动脉阻塞 -再灌注犬心律失常的实验所测的心电图(EKG)，图12、图13、图14、图15、 图16、图17、图18、图19、图20显示了对空白对照的犬的相应实验所测的心 电图(EKG)。
图21显示了槐果碱对腺病毒所致肺部炎症的影响；其中，图21(A)显示 了病毒组小鼠(10×10，HE染色)在接种腺病毒后，肺泡与肺泡间的壁增厚， 小支气管间及旁有很多炎症细胞；图21(B)显示了30mg/kg槐果碱治疗组在治 疗后，肺泡与肺泡间的壁增厚明显减轻，炎症细胞减少。
图22显示了不同剂量的槐果碱对病毒感染后8天心肌病变的影响。
具体实施方式
实施例1槐果碱的抗Echo病毒、腺病毒、流感乙型病毒的活性
一.槐果碱注射液(在Hela及Vero细胞中)对Echo病毒及腺病毒的体外和体 内试验
Hela及Vero细胞由上海第二医科大学微生物教研室提供；Echo病毒9病毒 株由中国科学院昆明医学生物研究所赵树栋提供；腺病毒7病毒株由北京302医 院病毒研究室冒盼勇提供。
实验动物：Balb/c小鼠，3～4周龄，由上海中英合资西普尔必凯实验动物有 限公司提供。(证号：152)
1.槐果碱注射液(在Hela及Vero细胞)抗Echo病毒及腺病毒的体外试验
微量测定法测定槐果碱注射液(1％浓度)在Hela细胞上抗Echo病毒的作用 (Echo病毒100TCID50)，结果见表1。
表1
槐果碱稀释度 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512 1∶1024 病毒对照 细胞对照 细胞病变 - - - - - + + + + -
微量测定法测定槐果碱注射液(1％浓度)在Vero细胞上抗Echo病毒的作用 (Echo病毒100TCID50)，结果见表2。
表2
槐果碱稀释度 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512 1∶1024 病毒对照 细胞对照 细胞病变 - - - - - + + + + -
微量测定法测定槐果碱注射液(1％浓度)在Hela细胞上抗腺病毒的作用(腺 病毒100TCID50)，结果见表3。
表3
槐果碱稀释度 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512 1∶1024 病毒对照 细胞对照 细胞病变 - - - ± + + + + + -
微量测定法测定槐果碱注射液(1％浓度)在Vero细胞上抗腺病毒的作用(腺 病毒100TCID50)，结果见表4。
表4
槐果碱稀释度 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512 1∶1024 病毒对照 细胞对照 细胞病变 - - - ± + + + + + -
通过以上测定结果可见，当1％槐果碱稀释至1∶8(即312μg)时，对Echo 病毒发挥抗病毒作用，直至1∶128(即19.5μg)时仍能抑制Echo病毒在Hela及 Vero细胞上致病变作用。当1％槐果碱稀释至1∶8(即312μg)时，对腺病毒发 挥抗病毒作用，直至1∶64(即39μg)时仍能抑制腺病毒在Hela和Vero细胞上 的致病变作用。
2.Echo病毒性心肌炎体内模型
体内模型的制作：Balb/c雄性小鼠3～4周龄50只，腹腔内注射Echo病毒 1000TCID0.1ml，造成Echo心肌炎模型。
实验分三组：正常对照组(N＝10)、病毒感染组(N＝10)、病毒感染+药物组 (N＝30，10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg各10只，分别以0.1％、0.2％、和0.3％ 槐果碱0.1ml+生理盐水0.1ml分二次尾静脉注射，共七天)。
感染后第8天将存活小鼠无菌眼眶取血(测中和抗体)，然后拉颈致死，取心 脏做二方面实验，即心肌细胞悬液测TCID50，以及作病理切片检查。
(1)中和抗体的检测：用细胞病变法在Hela及Vero二种细胞上测三个不同 剂量槐果碱(10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg)，结果见表5和表6。
表5用Hela细胞测Echo病毒中和抗体
血清稀释度 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512 细胞对照 病毒对照 10mg/kg 20mg/kg 30mg/kg - - - - - - - - - - - - + - - + ± - + + + + + + + + + - - - + + +
表6用Vero细胞测Echo病毒中和抗体
血清稀释度 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512 细胞对照 病毒对照 10mg/kg 20mg/kg 30mg/kg - - - - - - - - - - - - + - - + ± - + + + + + + + + + - - - + + +
Echo病毒的中和抗体检测结果表现为：在Hela细胞测Echo病毒中和抗体， 第8天是10mg/kg 1∶16阳性，20mg/kg 1∶32阳性，30mg/kg 1∶64阳性。与所 用槐果碱剂量有关。
在Vero细胞上测Echo病毒的中和抗体，第8天是10mg/kg 1∶16阳性， 20mg/kg 1∶32阳性，30mg/kg 1∶64阳性。结果与Hela细胞相同，因为时间有限， 仅测8天的中和抗体，估计时间延长，抗体会更高。
(2)用TCID50实验在Hela及Vero细胞上测Echo病毒感染心肌细胞悬液中 的TCID50，结果见表7和表8。
表7
Hela细胞病变孔数 标本稀释度 总细胞孔数 10mg/kg 20mg/kg 30mg/kg Echo病毒组 正常对照组 10-2 4/4 4/4 4/4 4/4 0/4 10-3 2/4 2/4 2/4 4/4 0/4 10-4 0/4 0/4 0/4 4/4 0/4 10-5 0/4 0/4 0/4 2/4 0/4 10-6 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 10-7 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 10-8 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4
表8
Vero细胞病变孔数 标本稀释度 总细胞孔数 10mg/kg 20mg/kg 30mg/kg Echo病毒组 正常对照组 10-2 4/4 4/4 4/4 4/4 0/4 10-3 2/4 2/4 2/4 4/4 0/4 10-4 0/4 0/4 0/4 4/4 0/4 10-5 0/4 0/4 0/4 2/4 0/4 10-6 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 10-7 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 10-8 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4
Echo病毒治疗组心肌匀浆中病毒滴度为10-3，病毒对照组心肌匀浆中病毒滴 度为10-5。治疗组TCID50比病毒对照组高2个稀释度，提示槐果碱有抗Echo病 毒的作用。
(3)Echo病毒感染的Balb/c小鼠病毒性心肌炎模型的病理变化见图1(A) 和(B)。图1(A)显示了Echo病毒模型组(10×10，HE染色)的情况，心膜 外由钙化、成片，并有少量炎症细胞浸润；图1(B)显示了槐果碱30mg/kg治 疗组(10×10，HE染色)的情况，仅有极少量炎症细胞。
3.腺病毒性心肌炎体内模型
体内模型的制作：Balb/c雄性小鼠3～4周龄50只，腹腔内注射腺病毒 1000TCID0.1ml，造成腺病毒性心肌炎模型。
实验分三组：正常对照组(N＝10)；病毒感染组(N＝10)；病毒感染+药物组 (N＝30，10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg各10只，分别以0.1％、0.2％、和0.3％ 槐果碱0.1ml+生理盐水0.1ml分二次尾静脉注射，共七天)。
感染后第8天将存活小鼠无菌眼眶取血(测中和抗体)，然后拉颈致死取心脏 做二方面实验，即心肌细胞悬液测TCID50，以及作病理切片检查。
(1)中和抗体的检测：用细胞病变法在Hela及Vero二种细胞上测三个不同 剂量槐果碱(10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg)，测定结果见表9和表10。
表9用Hela细胞测腺病毒中和抗体
血清稀释度 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512 细胞对照 病毒对照 10mg/kg 20mg/kg 30mg/kg - - - - - - - - - + - - + + - + + + + + + + + + + + + - - - + + +
表10用Vero细胞测腺病毒中和抗体
血清稀释度 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512 细胞对照 病毒对照 10mg/kg 20mg/kg 30mg/kg - - - - - - - - - + - - + + - + + + + + + + + + + + + - - - + + +
腺病毒的中和抗体检测结果：在Hela细胞测腺病毒中和抗体，10mg/kg第8 天是1∶8阳性，20mg/kg 1∶16阳性，30mg/kg 1∶32阳性。与所用槐果碱剂量 有关。在Vero细胞上测腺病毒的中和抗体，10mg/kg第8天是1∶8阳性，20mg/kg 1∶16阳性，30mg/kg1∶32阳性。结果与Hela细胞相同，因为时间有限，仅测8 天的中和抗体，估计时间延长，抗体会更高。
(2)用TCID50实验在Hela及Vero细胞上测腺病毒感染心肌细胞悬液中的 TCID50，测定结果见表11和表12。
表11
Hela细胞病变孔数 标本稀释度 总细胞孔数 10mg/kg 20mg/kg 30mg/kg Echo病毒组 正常对照组 10-2 4/4 4/4 4/4 4/4 0/4 10-34/4 4/4 4/4 4/4 0/4 10-42/4 2/4 2/4 4/4 0/4 10-5 0/4 0/4 0/4 3/4 0/4 10-6 0/4 0/4 0/4 2/4 0/4 10-7 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 10-8 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4
表12
Vero细胞病变孔数 标本稀释度 总细胞孔数 10mg/kg 20mg/kg 30mg/kg Echo病毒组 正常对照组 10-2 4/4 4/4 4/4 4/4 0/4 10-3 4/4 4/4 4/4 4/4 0/4 10-4 2/4 2/4 2/4 4/4 0/4 10-5 0/4 0/4 0/4 3/4 0/4 10-6 0/4 0/4 0/4 2/4 0/4 10-7 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 10-8 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4
腺病毒治疗组心肌悬液中病毒滴度为10-4。病毒感染组心肌悬液中病毒滴度 为10-5～10-6之间。治疗组TCID50比病毒对照组高1～2个稀释度，提示槐果碱对 腺病毒有抑制作用。Hela细胞及Vero细胞相同。
(3)腺病毒感染的Balb/c小鼠病毒性心肌炎模型的病理变化见图2(A)和 (B)。图2(A)显示了腺病毒组(10×10，HE染色)的情况，管壁边缘有一炎 灶，成纤维细胞增生，心肌细胞空泡变性；图2(B)显示了槐果碱30mg/kg治 疗组(10×10，HE染色)的情况，仅心外膜有少许炎症细胞及少许成纤维细胞。
二.槐果碱的抗流感甲、乙型病毒活性
1.抗流感甲、乙型病毒活性筛选1
以MDCK(狗肾)细胞为病毒宿主，测定样品抑制病毒引起细胞病变程度 (CPE)。
选择的毒株为流感甲型病毒(济防190-15)、流感乙型病毒(济防197-13)， 在鸡胚尿囊腔内培养传代，-80℃保存。
样品处理：样品溶于DMSO，再用培养液配成适宜的初始浓度，用培养液作 3倍稀释，各8个稀释度。阳性对照药为病毒唑(RBV)，为浙江康裕药业有限公 司产品。
将MDCK细胞接种96孔培养板，置5％CO2，37℃培养24小时。MDCK细 胞分别加入流感甲型病毒10-4.3(10倍TCID50)、流感乙型病毒10-2.3(10倍 TCID50)，37℃吸附2小时后倾去病毒液，分别加入不同稀释度药物。设病毒对 照和细胞对照，37℃培养36小时。观察结果，记录CPE，计算各样品抗流感病毒 半数抑制浓度(IC50)。
测试结果见表13
表13
样品编号 TC50(μg/ml) 对流感甲型 对流感乙型 IC50(μg/ml) SI IC50(μg/ml) SI 118863 RBV 231.12 ＞1000 - 2.92 - ＞342.46 86.23 3.8 2.68 ＞263.16
注：“-”表示样品在最大无毒剂量无抗流感病毒活性；TC50表示药物半数有毒 浓度；IC50表示药物对病毒半数抑制浓度；SI表示选择指数，SI＝TC50/IC50。
结果表明，样品中118863有抗流感乙型病毒活性，IC50分别为86.23，SI分 别为2.68。
2.抗流感甲、乙型病毒活性筛选2
以MDCK(狗肾)细胞为病毒宿主，测定样品抑制病毒引起细胞病变程度 (CPE)。
选择的毒株为流感甲型病毒(济防A/济防/90-15)、流感乙型病毒(B/济防 /97-13)，在鸡胚尿囊腔内培养传代，-80℃保存。
样品处理：样品溶于DMSO，再用培养液配成适宜的初始浓度，用培养液作 2倍稀释，各16个稀释度。阳性对照药为病毒唑(RBV)，为浙江康裕药业有限 公司产品。
将MDCK细胞接种96孔培养板，置5％CO2，37℃培养24小时。MDCK细 胞分别加入流感甲型病毒10-3(10-100倍TCID50)、流感乙型病毒10-2(10-100 倍TCID50)，37℃吸附2小时后倾去病毒液，分别加入不同稀释度药物。设病毒 对照和细胞对照，37℃培养36小时。观察结果，记录CPE，计算各样品抗流感病 毒半数抑制浓度(IC50)。测试结果见表14。
表14
样品编号 TC50(μg/ml) 对流感甲型 对流感乙型 IC50(μg/ml) SI IC50(μg/ml) SI 118863 RBV 231.12 ＞2000 - 1.62 - ＞1234.57 15.656 18.97 14.79 ＞105.43
注：“-”表示样品在最大无毒剂量无抗流感病毒活性；TC50表示药物半数有毒 浓度；IC50表示药物对病毒半数抑制浓度；SI表示选择指数，SI＝TC50/IC50。
结果表明，样品在31.25μg/ml浓度时有抗流感乙型病毒活性，抑制率为75％， 样品在15.656μg/ml浓度时有抗流感乙型病毒活性，抑制率为50％，样品在 7.81μg/ml浓度时有抗流感乙型病毒活性，抑制率为25％。因此，样品118863无 抗流感甲型病毒活性，有抗流感乙型病毒活性。
实施例2槐果碱的对抗心律失常的效果
一.槐果碱对豚鼠心室乳头肌动作电位的影响
运用玻璃微电极记录豚鼠心室乳头肌动作电位，观察槐果碱对豚鼠心肌细胞 动作电位的影响。
受试药物为槐果碱注射液(200mg/2ml)，在配制时，取出注射液加入适量的 台氏液，配置成不同浓度(1μM、5μM、10μM)。对照药物为盐酸胺碘酮注射 液(0.15g/3ml)(杭州赛诺菲-圣德拉民生制药有限公司)，在配制时，取去注射 液加入适量的台氏液，配制成100μM浓度。
试验动物选用200-300克，雌雄不拘，健康成年的豚鼠，由上海第二医科 大学试验动物部提供。
豚鼠致昏后，开胸取出心脏，放在35℃台氏液中(成分mmol/L：NaCl 137； NaHCO3 23；MgCl2 0.5；KCl 5.4；CaCl2 1.8；NaH2PO4 0.4；葡萄糖10，pH7.4)， 制备右心室乳头肌标本，并将其置于肌槽内，槽内温度为34+0.5℃，用充以95 ％+5％CO2混合气体的台氏液灌流，pH7.4，灌流速度为5ml/min。标本稳定30min 后，用刺激器(SEN7103，Nihon Kohden，JAPAN)刺激，刺激强度为1.5倍阈 值，波宽1ms，刺激频率为1Hz。用内充3.0mol/L氯化钾，电极电阻为15-20MΩ 的玻璃微电极穿刺，记录动作电位。ERP的测定：每8个方波刺激后，加一个额 外的刺激，逐渐改变其与前面正常刺激的时间间隔，测定额外刺激所引起的动作 电位与前面动作电位之间的时间，以求ERP。信号通过微电极放大器(MEZ-7101， Nihon Kohden，JAPAN)放大后，分别在TEKTRONIX5a18N(USA)示波器监 视，同时输入澳大利亚AD公司的Powerlab4s记录系统进行采样。刺激30min， 待动作电位各参数稳定后开始试验。试验结果由AD公司提供的Chart5分析软件 进行数据处理。数据采用Origin统计软件(Version6)进行分析。数据以均数± 标准误表示。显著性检验方法采用配对t检验，p＜0.05即认为有显著性差异。
试验结果如下：
a.槐树碱对豚鼠心室乳头肌动作电位的影响
1)槐果碱对动作电位RP、APA、Vmax、APD50、APD90、APD100的影 响：豚鼠乳头肌细胞动作电位记录中，在灌流液内加入浓度10μM的槐果碱 后，约8min时起效应，约15min后，作用达最大。槐果碱使动作电位的平台 期延长，即APD50延长，与对照相比增加了近17.9％；同时动作电位的APD90显著延长，增加了22.3％；APD100延长28.5％；Vmax下降29％；APA略下 降，但无统计意义；RP无明显变化。再用台氏液灌洗，可使动作电位基本恢 复。图3(A)为其中一例，具体数据见表15。
表15不同浓度的槐果碱对豚鼠心室乳头肌细胞动作电位的影响
表15
control 1uM 5uM 10uM washout RP(mV) APA(mV) Vmax(V/s) APD50(ms) APD90(ms) APD100(ms) ERP(ms) ERP/APD 90.5±0.66 118.10±1.45 177.32±30.80 2O4.32±22.72 252.76±25.27 262.50±24.17 257.89±26.52 0.98±0.01 89.84±0.56 (-0.71％) 119.50±1.59 (1.21％) 164.80±28.56* (-7.41) 215.11±23.82** (5.29％) 268.44±26.98** (6.15％) 282.04±26.04** (7.44％) 275.72±27.80** (7.00％) 0.97±0.01 (1.01％) 88.70±1.24 (-1.98％) 117.50±2.22 (-0.50％) 136.44±27.26* (-24.52) 231.94±25.46** (13.62％) 290.47±28.12** (15.13％) 306.00±29.44** (16.56％) 296.93±30.56** (15.19％) 0.97±0.01 (0.97％) 89.60±1.39 (-1.00％) 115.18±2.71 (-2.43％) 121.28±17.18* (-29.38％) 240.42±26.32** (17.89％) 308.08±29.11** (22.29％) 336.50±29.49** (28.45％) 324.11±32.89** (25.99％) 0.96±0.03 (0.96％) 91.38±1.00 118.88±2.93 133.52±13.81 226.50±21.61* 273.70±22.62 286.24±20.72* 285.84±27.23 0.99±0.02
n＝5
()内为(槐果碱-control)/control×100％的变化率
*表示p＜0.05，vs control
**表示p＜0.01，vs control
2)槐果碱对动作电位不应期的影响：豚鼠乳头肌细胞动作电位记录中，在灌 流液内加入浓度为10μM的槐果碱后，8min时起效应，不应期延长，约15min 后，作用达最大。与对照相比延长25.9％，具体结果见表15。
3)槐果碱的量效关系：豚鼠乳头肌细胞动作电位记录中，在灌流液内依次 加入浓度为1μM、5μM、10μM的槐果碱后，APD50、APD90、APD100均延长， Vmax下降，以上各指标都呈浓度依赖性。具体数据见表15。图3(B)为其中一 例。在上述三个浓度中，ERP的延长也呈浓度依赖性，见图3(C)。并且随着浓 度的增加，ERP的延长程度要略小于APD100的延长的程度。
b.盐酸胺碘酮对豚鼠心室乳头肌动作电位的影响：用上述同样的方法，观察 100μM盐酸胺碘酮对豚鼠心室乳头肌动作电位的RP、APA、Vmax、APD50、APD90、 APD100和ERP的影响。该药物30分钟后起效应，35分钟后效应达到最大，APD50延长12％、APD90延长11.7％、APD100延长18％、ERP延长15.6％；Vmax下降 26.7％。图3(D)，图3(E)为其中一例。据图数据见表16。
表16盐酸胺碘酮对豚鼠心室肌动作电位的影响
control 100uM washout RP(mV) APA(mV) Vmax(V/S) APD50(ms) APD90(ms) APD100(ms) ERP(ms) ERP/APD -90.80±0.68 117.16±3.24 134.80±9.78 192.00±22.05 226.94±25.59 256.00±24.48 231.60±32.65 0.89±0.04 -89.98±0.33 (-0.79％) 105.50±1.23* (-9.70％) 98.42±5.97*** (-26.72％) 214.09±22.30** (11.97％) 252.50±25.97** (11.73％) 296.92±17.43* (17.97％) 265.56±32.99** (15.57％) 0.88±0.06 (-1.16％) -89.88±0.66 112.54±4.73 114.34±12.73* 181.74±25.29 220.70±29.90 253.90±26.76 228.86±33.14 0.89±0.04
n＝5
()内为(槐果碱-control)/control×100％的变化率
*表示p＜0.05，vs control
**表示p＜0.01，vs control
根据上述测定结果可见，(1)槐果碱可使0期上升速率下降，并呈浓度依赖 性。提示其可能对钠通道有抑制作用。(2)槐果碱可使APD50、APD90、APD100均延长，并呈浓度依赖性，提示其可能有抑制钾外流的作用。(3)槐果碱可使ERP 延长，呈浓度依赖性，这不仅与其延长动作电位时程有关，可能也与其轻度抑制 纳通道作用有关(Vmax下降)。(4)槐果碱与盐酸胺碘酮相比：起效快、剂量小。
二、槐果碱对兔窦房结细胞动作电位的影响
研究槐果碱对窦房结动作电位波形和各测量参数的影响，同时比较其与同类 药物盐酸胺碘酮作用的异同点。
测试使用的槐果碱注射液为200mg/2ml，配制时，取出注射液加入适量的台 氏液，配制成不同浓度(0.02μM、0.1μM、1μM)。同类药物盐酸胺碘酮产自 杭州赛诺菲-圣德拉民主制药有限公司，其规格为0.15g/3ml，配制时，取出注射 液加入适量台氏液，配制成50μM浓度。
实验动物选用成年家兔，雌雄不拘。
8～10周家兔，雌雄不拘，击昏后取出心脏，在35℃台氏液(成分(mmol/L)： NaCl 140，KCl 5.4，CaCl2 1.8，MgCl2 1，Hepes 5，葡萄糖10，pH7.4，通100％O2) 中制备带有部分右心耳组织的窦房结标本。标本固定于恒温(35.5±0.5℃)、恒 流(3ml/min)标本槽内，以台氏液灌流(成分同上)。待标本自律性活动稳定后， 用电阻为25MΩ的内充3mol/L KCL的玻璃微电极作窦房结细胞内穿刺，记录自律 性动作电位。记录信号经放大器(MEZ-7101，Nihon Kohden，JAPAN)放大后， 分别在TEKTRONIX5A18N(USA)示波器监视，同时输入澳大利亚AD公司的 Powerlab4s记录系统进行采样，实验结果由AD公司提供的Chart5分析软件进行 数据处理。数据采用Origin统计软件(Version6)进行分析。数据以均数±标 准误差表示。显著性检验方法采用配对t检验，p＜0.05即认为有显著性差异。
实验结果：
a.槐果碱对兔心窦房结细胞自律性动作电位的影响：兔心窦房结细胞动作电 位记录中，在灌流液中加入不同浓度(0.02、0.1、1μM)的槐果碱后，约6分钟 后起效，10分钟后效应达到最大。0.02μM槐果碱可使自律性兴奋频率(SEF) 和4期自动除级速率(SDVP4)减慢，动作电位幅度(APA)减小，而动作电位 时程(APD50)、最大复级电位(MRP)、0期最大去极化速度(Vmax)均无明显变 化。0.1μM槐果碱对APA、MRP、SEF、SDVP4均有抑制作用，APD50和Vmax无明显影响；1μM槐果碱使APD50延长，其余各指标均明显减小。再用正常台 氏液灌流后，以上指标基本可恢复，见图4(A)，具体数据见表17。
表17不同浓度的槐果碱对兔心窦房结细胞动作电位参数的变化
Control 0.02μM 0.1μM 1μM Washout APA(mV) 69.4±0.9 65.5±0.83^ 63.1±1.0* 59.6±1.1* 66.1±0.9 MRP(mV) -65.7±0.6 -63.2±1.1 -61.7±0.9* -58.4±0.6* -63.7±0.9 APD50(ms) 87.6±1.9 91.2±1.5 93.6±1.6 96.0±1.6^ 92.2±1.6 SEF(beat/m in) 120.6±2.3 112.5±1.8^ 109.8±2.1^ 97.7±0.7* 113.6±2.0 SDVP4(m V/s) 57.5±1.9 50.2±2.0^ 45.8±2.2* 35.1±1.9* 51.5±2.3 Vmax(V/s) 9.8±0.8 8.5±0.8 7.2±0.82 6.9±0.8^ 8.0±0.76
(n＝5，△P＜0.05，vs control，*P＜0.01，vs control)
b.盐酸胺碘酮对兔心窦房结细胞动作电位的影响：兔心窦房结细胞动作电位 记录中，在灌流液中加入50μM盐酸胺碘酮后，约20分钟后起效应，30分钟后 效应达到最大。该药物使APA、MRP、SEF、SDVP4、Vmax明显减小，并使APD50明显延长。再用台氏液灌流后，以上制备略恢复，见图4(B)，具体数据见表18。
表18 50μM盐酸胺碘酮对兔心窦房结细胞动作电位的影响
Control 1μM Washout APA(mV) 71.4±1.1 54.8±1.2* 61.9±1.3* MRP(mV) -67.9±1.0 -5.37±0.7* -59.6±1.2* APD50(ms) 87.2±1.7 115.6±6.6* 91.4±1.8 SEF(beat/min) 118.7±2.8 82.6±2.6* 103.9±1.3* SDVP4(mV/s) 56.0±2.6 18.8±1.8* 43.0±3.1* Vmax(V/s) 8.6±0.5 63.4±0.4* 6.0±0.5*
(n＝5，△P＜0.05，vs control，*P＜0.01，vs control)
结果表明，(1)高浓度槐果碱可使0期上升速率下降，提示其可能对慢钙(L) 通道有抑制作用。(2)槐果碱可使4期自动除极速率明显下降，呈浓度依赖性， 高浓度槐果碱使APD50明显延长，提示期可能有抑制钾外流的作用。(3)槐果碱 可使窦房结的自律性发放频率下降，呈浓度依赖性。(4)槐果碱与盐酸胺碘酮相 比起效快、剂量小、且对动作电位各参数影响程度小、易恢复。
三.槐果碱对冠状动脉阻塞——再灌注犬心律失常的实验
1、对注射槐果碱的犬1的实验
犬1体重10kg，麻醉后开胸，切开心包暴露心脏。静脉注射槐果碱10mg/kg (溶于10ml生理盐水中)，5分钟推完，继以每ml含0.1％槐果碱葡萄糖溶液每 分钟1.5ml的速度由静脉恒速推注，直至实验结束。10分钟后于14点32分结扎 冠状动脉左前降支，结扎后见心肌发紫但未见S-T段抬高反见压低。
15点28分心肌明显发紫，S-T段抬高，未见心律失常。15点37分开放被结 扎的左前降支，见到一次短室速，以后S-T短逐渐降低至正常且为室性心律。观 察至16点06分未见再灌流心律失常。
详细的实验结果见所测的心电图(EKG)，即图5、图6、图7、图8、图9、 图10、图11。
2、对空白对照的犬2的测定实验。
犬2体重9.25kg，麻醉后开胸，切开心包暴露心脏。静脉注射10ml生理盐 水，5分钟推完，继以每分钟1.5ml生理盐水的速度由静脉恒速推注，直至实验 结束。10分钟后于15点36分结扎冠状动脉前降支，见短阵室速三阵，以后S-T 短逐渐抬高，出现室早三联律，至16点11分时心肌颜色越来越紫，心脏扩大， 出现室壁瘤，心肌收缩呈矛盾运动。仍于16点18分开放结扎的冠状动脉，见室 速、室颤等再灌流心律失常致死。
详细的实验结果见所测的心电图(EKG)，即图12、图13、图14、图15、 图16、图17、图18、图19、图20。
实施例3槐果碱在制备治疗Echo病毒、腺病毒、流感乙型病毒引起的肺部感染 药物方面的应用
引起人类肺炎的病毒主要有Echo病毒、流感病毒、副流感病毒、巨细胞病 毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒RSV、鼻病毒、冠状病毒和某些肠道病毒等。腺 病毒肺炎主要发病于幼儿中，主要经呼吸道传播。本发明的槐果碱也可对抗因 Echo病毒、腺病毒和/或流感病毒引起的肺炎感染。
在本发明的实施例1中，已经详细描述和验证了本发明的槐果碱注射液在体 内和体外均具有对抗腺病毒的活性。本发明还研究了槐果碱对腺病毒所致肺部炎 症的影响，发现病毒组小鼠(10×10，HE染色)在接种肺炎后，肺泡与肺泡间 的壁增厚，小支气管间及旁有很多炎症细胞图21(A)；而30mg/kg槐果碱治疗 组在治疗后，肺泡与肺泡间的壁增厚明显减轻，炎症细胞减少(图21(B))。
实施例4槐果碱在免疫调节方面的应用
一.槐果碱对小鼠柯萨奇B3m(COXB3m)心肌模型中Thy-1(CD3)、L3T4(CD4)、Ly-2(CD8)等T细胞免疫的调节以及对心肌内COXB3m增殖 的抑制作用
受试药物为100mg/2ml的槐果碱注射液，用无小牛血清的RPMI-1640培养基 (GIBCO)稀释至1％浓度为母液，无菌低温保存。临用时用注射用水稀释至所 需浓度。病毒采用COXB3m，病毒为10-4TCID50，-80℃保存。
本例中使用的抗体为：抗小鼠淋巴细胞Thy-1(CD3)、L3T4(CD4)、Ly-2(CD8) 以及FITC标记的荧光抗小鼠IgG抗体，均由北京医科大学免疫学教研室提供。
1、槐果碱对T淋巴细胞的调节作用
1)动物分组、病毒接种及给药
正常组N＝15腹腔注射生理盐水；
病毒感染组N＝34，Balb/c小鼠腹腔注射0.1ml10-4COXB3m 10-4TCID50，于 感染2小时后及第2天开始静脉内注射生理盐水0.1ml二/天，共14天；
槐果碱治疗组N＝26，Balb/c小鼠腹腔注射0.1ml10-4COXB3m 10-4TCID50， 于感染2小时后及第2天开始从尾静脉内注射30mg/kg槐果碱(0.3％，0.1ml)， 加等量生理盐水分二次注射，共14天。
2)淋巴细胞分离
正常对照组、病毒感染组及槐果碱治疗组均于接种后第3、5、7、10和14 天小鼠，处死后均在无菌操作下打开腹腔，取出整个脾脏置于3～5ml Hanks液的 小皿中，用梅花针将其打成匀浆。经铜网过滤后，将细胞悬液收集至圆底试管中， 沿管壁缓缓注入4mlFicol-Metrizol液(比重1.088)，2000r/min离心25min，吸出 “云雾层”单个核细胞，用5％FCS-PBS液(PH7.2～7.4)洗涤两次，以台盼兰排 斥试验测定细胞活力，要求活力达到95％以上，最后用含10％FCS的RPMI-1640 液调节细胞浓度至1×107/ml。
3)T细胞亚群的测定
采用但克隆抗体间接免疫荧光法，取上述细胞悬液0.1ml于小试管中， 1000r/min离心5min，使细胞压紧，弃上清液，分别加入单克隆抗体，充分混匀 后置于4℃作用30分钟，然后用5％FSC-PBS液洗涤两次，加荧光标记二抗体 (Thy-1用抗小鼠IgM)，再置于4℃作用30分钟，用5％FSC-PBS液洗涤两次， 1000r/min离心7min，弃上清液，将细胞团打散，加滴于载波片上，在Olympas 万能显微镜荧光油镜下计算200只细胞中的荧光阳性细胞数。
COXB3m病毒感染后T细胞亚群的变化，COXB3m病毒感染后不同天数的脾 脏T细胞亚群变化见表19。
表19
T细胞 正常值 组别 小鼠感染COXB3m病毒后天数变化 3 5 7 10 14 Thy-1 总T＝CD3 N＝15 42.00±5.29 病毒对照组 槐果碱治疗组 P值 N＝7 27.29±8.16 N＝4 46.25±3.40 ＜0.005 N＝7 28.14±3.76 N＝5 45.20±4.55 ＜0.005 N＝7 33.00±6.81 N＝5 47.40±3.85 ＜0.05 N＝7 31.1±6.15 N＝6 45.33±9.64 ＜0.01 N＝6 37.17±6.18 N＝6 45.67±2.94 ＜0.05 L3T4T辅助＝CD4 26.27±5.45 病毒对照组 槐果碱治疗组 P值 17.86±2.91 27.75±2.63 ＜0.005 15.14±6.44 22.60±3.44 ＜0.005 20.71±5.54 29.80±1.92 ＜0.05 19.57±4.47 29.33±7.44 ＜0.005 21.17±7.05 31.67±3.14 ＜0.05 Ly-2 T抑制＝CD8 16.67±4.05 病毒对照组 槐果碱治疗组 P值 10.14±4.30 17.00±1.83 ＜0.01 9.29±2.99 16.40±2.88 ＜0.005 6.43±3.51 17.20±0.84 ＜0.005 8.29±2.75 22.33±6.50 ＜0.005 8.33±3.44 17.67±1.63 ＜0.01 L3T4/Ly-2 (CD4/CD8) 1.67±0.63 病毒对照组 槐果碱对照 P值 2.08±0.92 组1.65±0.31 ＞0.05 1.85±0.93 1.40±0.20 ＞0.05 3.91±1.73 1.73±0.14 ＜0.005 2.48±0.60 1.34±0.22 ＜0.01 2.68±0.58 1.80±0.23 ＜0.01
*注：P值为病毒感染组与槐果碱治疗组比较。
感染后第3天起脾脏的Thy-1、L3T4及Ly-2细胞均有不同程度的下降，与正 常小鼠比较有显著差异(P＜0.05＜0.001)。第7天以后各T细胞亚群有不同程度的 回升，其中以Thy-1以及L3T4细胞较明显，但直至第14天各T细胞亚群仍低于 正常水平。CD4/CD8比值在第7天起升高，第10天与第14天虽有下降，但与正 常小鼠比较仍偏高且有显著差异(P＜0.05)。
槐果碱治疗组对COXB3m病毒感染后小鼠脾脏T细胞亚群在第3～14天间， 在相应时期所测得的T细胞亚群均比病毒对照组为高(P＜0.05～0.005)，与正常 对照组相比无显著差异(P＞0.05)，而T4/T8(L3T4+/LY+-2)比较则从第7天起显 著低于病毒对照组，与正常对照组比较无明显差异(P＞0.05)。说明槐果碱在 COXB3m所致Balb/c病毒性心肌炎模型中能提高细胞免疫，并纠正T4/T8的比值， 使免疫系统趋于正常，有利于心肌炎病变的控制。
2、槐果碱对病毒感染后心脏中病毒抑制的影响
心肌匀浆的制备：病毒感染组与槐果碱治疗组小鼠于第3、5、7、10和14 天处死，取出脾脏后，取第3天和第5天的病毒感染组和槐果碱治疗组的心脏各 5只，取出心脏称其重量，用玻璃匀浆器将心脏碾成匀浆，每50gm心肌加MEM 1ml，反复冻融三次，8000rpm离心20min，取上清液经氯仿处理灭菌，-30℃保 存备用。
制备细胞管：将浓度为3×105/ml的Hela细胞1ml加入无菌的试管中，培养 4天。
标本稀释：将上述心肌冻融液用MEM稀释成1∶10至1∶10-6。
加样：将上述标本稀释液及原液0.1ml加入细胞管中，然后继续培养。
加样每日观察，连续观察至第5天。半数细胞发生病变的最高稀释度为病毒 滴度(用TCID50表示)。
结果见表20，以上二组相比，COXB3m病毒感染组和槐果碱治疗组小鼠心肌 内检测结果显示，病毒感染组的病毒滴度显著高于槐果碱治疗组(P＜0.001).
表20槐果碱对心肌内病毒复制的影响
感染天数 3 5 病毒感染组 槐果碱治疗组 N＝5 ≥6.00Log10 2.60±0.55Log10 N＝5 ≥6.00Log10 2.20±0.84Log10 P值 ＜0.001 ＜0.001
注：表中数字为Log10 TCID50几何平均数。
上述所示槐果碱治疗组第3天和第5天的心肌匀浆标本中CVB Log10 TCID50明显低于病毒感染对照组，说明槐果碱对感染心肌中CVB3m的增殖有明显的抑 制作用。此次试验中病毒感染组第5、7天心脏的心肌坏死和炎症细胞浸润较重， 而槐果碱治疗组心脏病变较轻。因此，槐果碱除了具有抗病毒作用外，还有纠正 感染CVB3m病毒小鼠的细胞免疫功能紊乱的作用，有利于病毒的控制。
二.不同剂量槐果碱对小鼠病毒性心肌炎模型脾脏中自然杀伤细胞(NK cell)活 性的动态变化(调节作用)
免疫功能异常是急性病毒性心肌炎的发病和转变为亚急性心肌炎或心肌炎慢 性活动期的重要原因。自然杀细胞——natural Kill cell(NK细胞)作为免疫效应 细胞，在病毒性心肌炎的发病过程中有重要作用。本例目的是借助Balb/c小鼠病 毒性心肌炎模型探讨槐果碱在病毒性心肌炎发病过程中对NK细胞活性的调节作 用观察。
本例中受试药物为槐果碱注射液，规格为200mg/2ml，用无小牛血清 RPMI-1640培养基稀释至1％的浓度为母液，无菌低温保存。临用时用注射用水 稀释至0.3％、0.2％、0.1％。
本例中使用的COXB3m病毒由上海第二医科大学微生物教研室提供，病毒为 10-6TCID50，-80℃保存。使用的Yac细胞由中国科学院上海细胞所提供。使用的 纯种Belb/c小鼠体重18～22gm，由上海西普尔必凯有限公司提供。
本例中使用的含5％FSC的PBS液是Gibco公司的产品；小牛血清由杭州四 季青生物制品所提供；LDH底物混合物包含碘硝酸氨化四氮唑(INF Fluka产品)、 吩嗪二甲硝酸盐(PMS Scrva产品)、氧化型辅酶I(NAD Sigma产品)；使用的 1％NP-40为Fluka产品。
1、动物分组以及病毒接种和用药
动物分组：将85只Balb/c小鼠随机分成5组：
正常对照组：17只；
病毒对照组：17只；
槐果碱治疗组：
10mg/kg组17只；
20mg/kg组17只；
30mg/kg组17只。
正常对照组：腹腔注射生理盐水0.1ml，二次/日。
病毒对照组：将0.1ml10-6TCID50的COXB3m病毒一次注射小鼠腹腔，1小时 后静脉注射生理盐水0.1ml以后每日二次注射相同剂量的生理盐水作为对照。
10mg/kg组：病毒接种同前，1小时后腹腔注射0.1％的槐果碱注射液0.1ml 加等量生理盐水0.1ml，混匀后分二次注射，以后每日二次注射同此剂量。
20mg/kg组：方法同10mg/kg，所不同的是槐果碱注射液的浓度改为0.2％。
30mg/kg组：方法同10mg/kg，将槐果碱注射液的浓度改为0.3％。
在第3天时各取病毒对照组、槐果碱10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg组，各取 5只小鼠处死，第8天时各处死6只，第12天时将上述各组剩余小鼠全部处死， 取出脾脏及心脏备用。
2、NK细胞测定
主要参照王长安等介绍的乳酸脱氢酶(LDH)释放法。小鼠处死后取出脾脏， 置于3～5ml Hanks液的小平皿中，用注射器针芯打成匀浆，铜网过滤，将细胞悬 液沿试管管壁缓缓加入盛有4ml淋巴细胞分离液(比重1.088)的试管中，2000rpm 离心20min，吸出“云雾层”单个核细胞，用含5％FSC的PBS液(PH7.2～7.4) 洗涤细胞2次，用台盼兰染色检测细胞活力，要求细胞活力≥95％。用10％FSC 的RPIM-1640培养液调细胞浓度至3×106ml，作为效应细胞。靶细胞用Yac细 胞，效靶细胞比例为20∶1。实验设NK测定管、自然释放管和最大释放管。用 1％NP-40破坏靶细胞作为最大程度释放。每个标本作三个复孔，按表21加样于 96孔平低板。加毕混匀，1000rpm离心5min，置37℃含5％CO2孵箱中培养4小 时，取出后每孔加冷1640培养液50ul，混匀，1000rpm离心5min，从各孔取上 清液100ul，置另一96孔平底板中，每孔加100ul 32℃预温的LDH底物混合物， 3min后加1N HCl 50ul中止反应，置酶标仪(Bio-Tek产品)中，在490nm波长 下测各孔光密度(OD)值。
表21NK细胞活性测定的加样方法
靶细胞 效应细胞 牛血清蛋白(1640) 1％NP-40 NK测定管 自然释放管 最大释放管 100ul 100ul 100ul 100ul - - - 100ul - - - 100ul
按下式计算NK细胞活性
结果发现，小鼠感染COXB3m 3天时，NK细胞活性显著增加，之后进行性 下降，槐果碱治疗组对NK活性有显著影响，剂量不同，影响程度不同。10mg/kg 槐果碱在感染第3天时对增高NK活性无影响，而20mg/kg和30mg/kg槐果碱组 有明显抑制作用。第8天时槐果碱对NK细胞活性影响不明显，至第12天时， 不同剂量的槐果碱均有增加NK细胞活性的作用。使NK细胞活性恢复正常水平， 与正常组比较无明显差异(P＞0.05)，见表22。
表22不同剂量槐果碱对小鼠感染后不同时间NK细胞活性的动态变化
感染后天数 组别 3 8 12 正常对照组 47.79±4.03
病毒对照组 槐果碱治疗组 10mg/kg 20mg/kg 30mg/kg 67.11±2.52$ 67.92±1.21 54.88±1.25### 52.90±3.80### 56.28±5.56 59.42±5.10 57.27±5.68 54.88±6.49 42.26±1.61$ 45.91±2.51# 49.37±4.07## 49.48±4.72##
注：与正常对照组相比：$P＜0.001，与对应天数病毒对照组相比，#P＜0.05， ##P＜0.005，###P＜0.001。
3、心脏组织病毒滴度测定
采用细胞致病效应(CPE)法。将小鼠处死后，无菌操作取出心脏，每只心 脏取相同重量，加入含4％FSC的1640培养液1ml，用玻璃匀浆器将心脏碾成匀 浆，1500rpm，离心15min，取上清液，-80℃保存备用，用含5％FSC的1640培 养液调Hela细胞浓度至2×105/ml，加入96孔平底板，每孔100ul，在37℃含5％CO2孵箱(Heraeus产品)中培养至细胞长成单层时，弃旧培养液，加入不同稀释度 (原液、1∶2、1∶10、1∶102、1∶104、1∶105、1∶106)的心肌匀浆，每个稀释度作3 个复孔，每孔100ul，并设细胞对照孔及病毒对照孔。在含5％CO2孵箱内继续培 养。加样后每日观察至第5天，以50％细胞病变的最高稀释度为心肌内病毒滴度。
结果发现，心肌内病毒滴度(Log10 TCID50)感染后3天心肌内病毒滴度最 高，至第12天仍呈阳性，但滴度有所下降。治疗组心肌内亦呈阳性，但比对应 天数病毒对照组明显降低，差异显著。且剂量不同，心肌内病毒滴度也不同。剂 量越大，病毒滴度越低。10mg/kg组，在第3天的心肌病毒滴度较病毒组降低， 差异有显著性(＜0.05)。在第8天和第12天时，虽亦有降低，但差异无显著性 (＞0.05)。20mg/kg和30mg/kg槐果碱组心肌内病毒滴度较对应天数病毒对照组 显著降低，详见表23。
表23不同剂量槐果碱对小鼠感染后不同天数心肌内COXB3m病毒滴度的影响
感染后天数 组别 3 8 12 病毒对照组 槐果碱治疗组 10mg/kg 20mg/kg 30mg/kg 4.56±0.88 3.44±0.88# 3.33±0.5## 3.22±0.46### 4.42±1.51 3.67±0.50 2.89±0.78# 2.56±0.88## 3.33±0.71$ 2.83±0.72 1.83±0.98## 1.19±1.33##
注：$P＜0.001与3天相比，#P＜0.05，##P＜0.005，###P＜0.001与对应天数 相比。
表23说明了槐果碱能抑制心肌细胞的CVB病毒的繁殖。
实施例5槐果碱对感染CoxB3病毒小鼠的干扰素(IFN)水平的影响
将槐果碱注射液(浓度为1％)加灭菌注射用水分别稀释为0.3％、0.2％、0.1％ 三种浓度。CoxB3病毒由上海第二医科大学微生物教研室提供，病毒原液效价为 106TCID50，-70℃冻存。Balb/c纯种雄性小鼠为8周龄，体重18～20g，购自上海 市计划生育科学研究所纯种实验动物室。
首先将动物分组，将85只Balb/c小鼠随即分为5组，正常对照组17只，病 毒对照组17只，槐果碱治疗组10、20、30mg/kg组各17只。
正常对照组用腹腔注射生理盐水0.1ml，2次/d；病毒对照组将0.1ml103TCID50的CoxB3病毒1次注射小鼠腹腔，1h后腹腔注射生理盐水0.1ml，以后2次/d注 射生理盐水作为对照；10mg/kg槐果碱组病毒注射同前，1h后腹腔注射0.1％的槐 果碱注射液0.1ml，以后2次/d注射相同剂量的槐果碱注射液；20mg/kg槐果碱组 病毒注射同前，槐果碱注射液浓度改为0.2％，其余同10mg/ml组；30mg/ml组病 毒注射同前，槐果碱注射液浓度改为0.3％，其余同10mg/ml组。第3d时，每组 各取5只小鼠处死。第8d时，再各取6只处。第12d时，将各组剩余鼠均处死。
采用细胞致病效应抑制法(CPE)进行IFN测定。无菌操作下，将小鼠眼球 摘除取血，置4℃冰箱数小时，离心取上清，以不同稀释度(原液、1∶2、1∶4、1∶8、 1∶16、1∶32、1∶64、1∶128)加入96孔平底板，每个稀释度作3个复孔，每孔50 μl。用含5％FCS的1640培养液调L929细胞浓度至4×105/ml，加入上述96孔 板，每孔50μl。在37℃含5％CO2培养箱中培养24h。弃旧培养液，加入水泡性口 炎病毒(VSV)攻击，每孔100μl。并设IFN标准品对照孔、细胞对照孔及病毒 对照孔。在37℃含5％CO2培养箱中继续培养48～72h。以能保护50％细胞存活的最 大稀释倍数的倒数作为IFN的活性单位(U/ml)。
并且，还进行了组织病理检查，将心脏用10％甲醛固定，石蜡切片，HE染色， 光镜下观察结果。
测定值以χ±s表示，采用ANOVA检验。P＜0.05为差异有显著性。
在注射相关注射液后，正常组无死亡。小鼠在病毒感染3d后开始发病，出 现松毛、食欲减退、体重减轻等征象，第5d出现死亡，死亡集中在5-7d，共死 亡5只。槐果碱治疗组小鼠征象有不同程度的改善，小鼠较活跃，皮毛较光滑， 体重无明显减轻；10mg/kg组在第5d死亡2只；20mg/kg组和30mg/kg组在第6d 出现死亡，比病毒对照组推迟1d，各死亡1只。
在CoxB3病毒感染后3d的IFN水平最高，之后逐渐下降，至感染12d时仍 高于正常对照组(P＜0.001)。槐果碱治疗组IFN水平上升更为显著，且与剂量有 关。病毒感染后3d，随槐果碱剂量增加，小鼠体内IFN水平显著增高，各剂量组 之间差异显著(P＜0.001)。在第12d时，槐果碱各剂量治疗组的IFN水平仍高于 病毒对照组(P＜0.001)，见表24。
表24不同剂量槐果碱对小鼠体内干扰素水平的影响(U/ml，χ±s)
组 感染天数 3d 8d 12d 健康 16.22±1.44 15.78±2.01 16.45±1.28 病毒感染 284.05±1.66 85.04±1.82 35.05±1.41* 10mg/kg槐果碱 317.37±2.04** 89.14±2.38** 85.04±2.04** 20mg/kg槐果碱 364.56±1.74** 90.51±2.48** 85.04±2.25** 30mg/kg槐果碱 418.77±1.56** 95.67±3.03** 76.11±1.43**
与健康组比较，*P＜0.001；同一天与病毒感染组比较，**P＜0.001。
结果可知，病毒+α-干扰素为59.09u/ml。
病理组织检测可知，感染3d时心肌内未有病变，第5d心肌内已有炎症浸润， 第8d病变最严重，心肌坏死和炎症浸润程度均较重，呈片状，第12d已有减轻。 第8d时槐果碱减轻心肌病变明显，各治疗组差异显著(P＜0.01)，不同剂量的槐 果碱对病毒感染后8d心肌病变的影响见图22。