补骨脂酚类化合物的应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101088498 B (45)授权公告日 2011.09.07 CN 101088498 B *CN101088498B* (21)申请号 200610027643.0 (22)申请日 2006.06.13 A61K 31/05(2006.01) A61K 31/085(2006.01) A61P 25/04(2006.01) A61P 25/06(2006.01) A61P 25/08(2006.01) A61P 25/14(2006.01) A61P 25/18(2006.01) A61P 25/20(2006.01) A61P 25/22(2006.01) A。

2、61P 25/24(2006.01) A61P 3/04(2006.01) (73)专利权人 和泓生物技术 ( 上海 ) 有限公司 地址 201203 上海市浦东张江高科园区居里 路 1 号 (72)发明人 郭礼和 赵刚 王雪松 (74)专利代理机构 中原信达知识产权代理有限 责任公司 11219 代理人 罗大忱 CN 101217968 A,2008.07.09, 权利要求 19. 商亚珍 . 补骨脂中 1 种单萜对线粒体脂 质过氧化的抑制作用 .国外医学中医中药分 册 .2001, 第 23 卷 ( 第 5 期 ),295-296. CECILIA LABBE et al.BAKUCHIO。

3、L DERIVATIVES FROM THE LEAVES OF PSORALEA GLANDULOSA.Phytochemistry .1996, 第 42 卷 ( 第 5 期 ),1299-1303. (54) 发明名称 补骨脂酚类化合物的应用 (57) 摘要 本发明公开了补骨脂酚类化合物在制备治疗 精神性疾病和神经性疾病药物中的应用。本发明 所提供的补骨脂酚类化合物， 通过体外实验以及 动物体内实验的研究证明， 该类化合物能选择性 抑制多巴胺转运蛋白、 去甲肾上腺素转运蛋白和 5- 羟色胺转运蛋白， 而对 - 氨基丁酸转运蛋白 和 L- 谷氨酸转运蛋白活性均没有影响， 并且该类 化合物对。

4、细胞没有毒性 ； 同样剂量下， 补骨脂酚 类化合物抗抑郁药效显著好于目前临床抗抑郁药 物盐酸安非他酮。 因此， 该类化合物将为临床治疗 精神性疾病和神经性疾病提供新的药物选择， 具 有良好的市场前景。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 孔越 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 4 页 CN 101088498 B1/1 页 2 1. 如下化学结构式的 13- 羟基补骨脂酚作为唯一活性成分在制备治疗抑郁症的药物 中的应用， 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 活性成分在药物中的重量含量为 0.1-99.。

5、9。 3. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 活性成分在药物中的重量含量为 0.5-90。 权 利 要 求 书 CN 101088498 B1/8 页 3 补骨脂酚类化合物的应用 技术领域 0001 本发明涉及补骨脂酚类化合物的新用途， 具体涉及补骨脂酚类化合物在制备药物 中的应用。 0002 技术背景 0003 精神性疾病和或神经性疾病已严重地影响着全球数百万人的健康。 抑郁症是其中 一种情绪低落、 心情郁郁寡欢、 悲观、 消极， 严重可伴有自杀倾向的精神类疾病， 是当今危害 人类身心健康最常见的精神疾病， 其发病率占世界人口的 11左右。世界卫生组织不久前 公布的年度报告显示 。

6、： 抑郁症目前已位居世界十大疾病之第四， 预计到 2020 年， 将排在心 血管病之后癌症之前， 成为危害人类健康缩短寿命的第二大病症。其它常见的精神性疾病 和神经性疾病还包括 ： 焦躁症 (anxiety disorders)、 情感困绕症 (mooddisorders)、 精神 分裂症(schizophrenia)、 人格障碍(personality disorders)， 性心理障碍(psychosexual disorders)、 药物滥用和依赖 (drug abuse anddependence) 等。这些疾病持续时间从几周 到数十年不等， 严重影响着各年龄段人们的生活。 0004 。

7、随着神经生物学和分子生物学的发展， 人们逐渐了解引起精神性疾病和神经性疾 病的一些生化因子的作用。研究发现在精神性疾病和神经性疾病中， 多巴胺 (dopamine， DA)、 去甲肾上腺素 (norepinephrine， NE)、 5 羟色胺 (5-hydroxytryptamine， 5-HT) 这些重 要的单胺类神经递质起到了关键的生理作用。 0005 多巴胺是哺乳动物大脑中主要的单胺类神经递质， 它控制着运动， 认知， 情感， 正性强化， 摄食， 内分泌调节等许多功能。在我们的身体和心理健康方面， 多巴胺发挥着 关键的调节作用。多巴胺的主要失活机制在于突触前膜上的多巴胺转运蛋白 (do。

8、pamine transporter， DAT) 重新摄入多巴胺。DAT 是位于突触前膜具有钠离子、 氯离子依赖的十二 跨膜区域结构蛋白， 是终止多巴胺作用和维持胞外多巴胺浓度平衡的基础物质。因此， 多 巴胺转运蛋白主要功能为介导多巴胺再摄取， 降低突触间隙多巴胺浓度， 在时程上和强度 上调节多巴胺神经信号传导， 是调节和维持多巴胺神经功能稳态的最重要的因子 (Giros et al.Nature1996， 379， 696)。多巴胺转运蛋白已是一些治疗精神性神经性疾病药物 (methylphenidate， pemoline， bupropion) 的作用靶点。 0006 去甲肾上腺素是哺乳。

9、动物大脑中重要的单胺类神经递质， 同时也是一种生理激 素。作为一种激素， 它能增加生物体在紧张情况下血压升高、 血管扩张、 心跳加快等。作为 神经递质， 去甲肾上腺素主要调控觉醒、 情感、 梦等活动。它广泛存在于节后交感神经和中 枢神经系统内。神经活动中， 去甲肾上腺转运蛋白 (NET) 可以将释放到突触间隙的 NE 主动 摄入前神经元， 从而决定了肾上腺能神经元的功能， 而且 NET 还是一大类神经药物的作用 位点。 0007 5羟色胺广泛分布在动物和植物体内。在人体内， 5羟色胺的作用主要是传递 神经信息。5- 羟色胺可以直接影响人的心理功能和生理功能， 比如人的喜怒哀乐、 睡眠、 食 欲。

10、等。当 5- 羟色胺浓度过高时， 人会产生过度兴奋现象 ； 如果 5- 羟色胺浓度过低， 又会产 生一系列精神和心理上的病态， 比如焦虑， 惊恐， 震颤麻痹、 偏头痛、 苯酮尿症、 类风湿关节 说 明 书 CN 101088498 B2/8 页 4 炎， 最主要的是抑郁情绪， 从而引发恐怖症、 强迫症等。在体内， 5HT 迅速从嗜铬细胞或 5羟色胺能神经中释放出来， 但行使完职能的 5HT 必须要靠一种叫做 5羟色胺转运体 (SERT) 的蛋白运输才能再回到嗜铬细胞或 5羟色胺能神经细胞中， 终止神经冲动讯号。 因此， SERT 的对维系 5HT 的浓度有重要调控作用， 进而保证人体功能正常。。

11、 0008 在近几十年来， 通过对精神性神经性疾病发病机理和过程的认识， 人们开发出了 一些药物， 它们通过调控多巴胺、 去甲肾上腺素、 5羟色胺的功能活性， 来达到治疗目地。 精神性神经性疾病如抑郁症， 它的主要病理改变表现在中枢神经系统， 突出表现为单胺类 神经递质的活性低下有关， 特别是去甲肾上腺素 (NE) 和 5羟色胺 (5-HT)， 近年来， 多巴 胺 (DA) 的活性在抑郁发病中的作用也渐渐受到人们的关注 (Pardon MC et al BrainRes， 2003， 971(1) ： 55-65 ； Jentsch J D et al Prog Brain Res， 2000。

12、， 126 ： 433-453)。因此， 抗抑郁的药物主要是通过干预脑内以上 3 种神经递质的活性， 来达到治疗目的。目前临 床抗抑郁药主要为第 2 代抗抑郁药 ( 即新型抗抑郁药 )， 包括选择性 5- 羟色胺 (5-HT) 再 摄取抑制剂 (SSRI)， SSRI 代表药为氟西汀 (Fluxetine)、 帕罗西汀 (Paroxtine)、 舍曲林 (Sertraline)、 西酞普兰 (Citalopram)、 氟伏沙明 (Fluvoxamine)， 它们具有共同的药理作 用 ： 抑制突触前膜的 5-HT 转运蛋白再摄取， 进而提高突触间隙的 5-HT 浓度， 达到抗抑郁作 用。 但是研。

13、究发现， 现有的药物对许多精神性神经性疾病患者没有作用， 例如临床调查表明 30多的抑郁症患者服用已有药物没有疗效。 另外一些上市的神经性药物存在无法忍受的 副作用， 如 SSRI 药物对单胺类神经递质受体选择性作用导致治疗中产生副反应， 主要不良 反应是胃肠道功能紊乱， 部分病人有失眠、 焦虑、 性功能障碍。 0009 因此， 为了更好地治疗精神性疾病和神经性疾病， 开发毒副作用小、 有效的新药是 十分必要的。 0010 补骨脂酚类化合物是从传统中药补骨脂中分离得到一类化合物， 在体外能抑制金 黄色葡萄球菌等生长， 主要用于抑菌药物等。由于该物质来源于天然物质， 毒性和副作用 小， 能否将其。

14、用于治疗精神性疾病和神经性疾病， 将具有十分重要的临床价值。 发明内容 0011 本发明需要解决的技术问题是公开补骨脂酚类化合物在制备治疗精神性疾病和 或神经性疾病药物中的应用， 以拓展补骨脂酚类化合物的应用范围， 满足临床治疗精神性 疾病和神经性疾病的需要。 0012 本发明再一个需要解决的技术问题是公开补骨脂酚类化合物的药学上可接受的 盐 ； 0013 本发明另一个需要解决的技术问题是公开补骨脂酚类化合物的以酯、 氨基甲酸酯 或其他常规的前体药物的形式 ； 0014 本发明另一个需要解决的技术问题是公开一种治疗精神性疾病和神经性疾病的 方法。 0015 本发明所说的补骨脂酚类化合物的结构通。

15、式为 ： 0016 说 明 书 CN 101088498 B3/8 页 5 0017 其中， R1为氢、 酰基或卤族。 0018 R2、 R3、 R4、 R5分别为氢或卤族。 0019 R1 优选 C1 C8的酰基 ； 0020 上述 C1 C8的酰基是指具有 1 8 个碳原子的支链或支链羧酸的酰基， 例如甲酰 基、 乙酰基、 丙酰基、 异丙酰基、 丁酰基、 叔丁酰基、 戊酰基、 新戊酰基、 已酰基、 庚酰基和辛酰 基等。 0021 上述的卤族是指氟、 氯、 溴或碘原子， 优选氯原子。 0022 本发明还涉及补骨脂酚类化合物的药学上可接受的盐， 所说的药学上可接受的盐 包括无机酸盐或有机酸盐，。

16、 优选的为盐酸盐、 硫酸盐、 硝酸盐、 磷酸盐、 乙酸盐、 草酸盐、 丁二 酸盐、 酒石酸盐、 甲磺酸盐、 马来酸盐、 碱金属盐或碱土金属盐 ； 0023 本发明还涉及补骨脂酚类化合物的以酯、 氨基甲酸酯或其他常规的 “前体药物” 的 形式， 当以这种形式给药时， 在体内可转化成活性部分 ； 0024 最优选的盐选自补骨脂酚类化合物的盐酸盐或补骨脂酚类化合物的乙酸盐 ； 0025 优选的补骨脂酚类化合物为 13- 羟基补骨脂酚 ( 在本文中也叫 B310) 0026 0027 或其衍生物。 0028 上述的 13- 羟基补骨脂酚衍生物是指以 13- 羟基补骨脂酚为先导化合物， 对其 进行进一步。

17、的结构修饰和改造， 而得到对精神性疾病和神经性疾病具有疗效的化合物。 本发明所涉及的精神性疾病和神经性疾病为焦躁症 (anxiety disorders)、 情感困绕症 (mood disorders)、 精神分裂症 (schizophrenia)、 人格障碍 (personality disorders)， 性心理障碍 (psychosexualdisorders)、 成瘾疾病 (addiction)、 抑郁症 (depression)、 Alzheimer s 病 (Alzheimer s disease)、 精神分裂症 (schizophrenia)、 Parkinson s 病(Par。

18、kinsons disease)、 失眠症(sleeping disorders)、 药物滥用和依赖(drugabuse and dependence)、 呕 吐 (emesis)、 肠 易 激 综 合 征 (irritable bowelsyndrome)、 更 年 期 综 合 症 (menstrual dysphoria syndrome)、 Wilson s 症 (Wilson s disease)、 舞 蹈 症 (Chorea)、脱 髓 鞘 疾 病 (Demyelinatingdisorders)、狂 躁 症 (mania)、强 迫 症 (obsessive-compulsive di。

19、sorder)、 注意缺陷多动症 (ADHD)、 双相障碍 (bipolar disorder)、 慢性疼痛 (chronicpain)、 头痛性癫痫 (migraine epilepsy)、 多发性硬化症 (multiple sclerosis)、 脑卒 (stroke)、 肥胖 (obesity)、 发作性睡病 (narcolepsy) 或 Tourette s 综合征 (Tourette s syndrome)、 震颤麻痹、 偏头痛。优选抑郁症。 说 明 书 CN 101088498 B4/8 页 6 0029 所 说 的 补 骨 脂 酚 类 化 合 物 可 以 采 用 文 献 公 开 。

20、的 方 法 (Cecilia L et alPhytochemistry1996， 42(5) ： 1299) 进行制备或采用市售产品 ； 0030 补骨脂酚类化合物的药学上可接受的盐(Cecilia L et al Phytochemistry1996， 42(5) ： 1299) 进行制备或采用市售产品 ； 0031 补骨脂酚类化合物的以酯、 氨基甲酸酯或其他常规的 “前体药物” 的形式可以采用 文献公开的方法进行制备 ； 或采用市售产品， 如 Sigma 公司的产品 ； 0032 试验证明， 本发明所说的补骨脂酚类化合物或其盐， 以及补骨脂酚类化合物的以 酯、 氨基甲酸酯或其他常规的 “。

21、前体药物” 的形式是五羟色胺转运蛋白、 多巴胺转运蛋白和 去甲肾上腺素转运蛋白多重抑制剂 ； 0033 本发明所提供的补骨脂酚类化合物能选择性抑制多巴胺转运蛋白、 去甲肾上腺素 转运蛋白和 5- 羟色胺转运蛋白， 使突触间隙中内源的单胺类递质恢复至正常范围内， 从而 达到治疗精神性和或神经性疾病的效果。 0034 试验同时证明， 本发明的补骨脂酚类化合物或其盐， 以及补骨脂酚类化合物的以 酯、 氨基甲酸酯或其他常规的 “前体药物” 的形式毒性较小 ； 能有效地治疗精神性疾病和神 经性疾病， 尤其是在治疗抑郁症方面， 药效优于现有临床抗抑郁药物如盐酸安非他酮。 0035 可以将补骨脂酚类化合物或。

22、其盐， 以及补骨脂酚类化合物的以酯、 氨基甲酸酯或 其他常规的 “前体药物” 的形式与医药学上可接受的载体以组合物的形式， 施加于需要治 疗的患者， 补骨脂酚类化合物的剂量没有特别限制， 可用任何合适的剂量， 一般的剂量为 0.1 300mg/ 公斤体重天， 具体可根据患者的年龄、 病情等进行变化。 0036 所说的载体是指药学领域常规的药物载体， 如稀释剂、 赋形剂如水等， 填充剂， 如 淀粉、 蔗糖等， 粘合剂， 如纤维素衍生物明胶、 聚乙烯吡咯烷酮等， 润滑剂， 如滑石粉等。 0037 本发明的补骨脂酚类化合物或其盐， 以及补骨脂酚类化合物的以酯、 氨基甲酸酯 或其他常规的 “前体药物”。

23、 的形式与上述载体构成的组合物， 可以通过口服、 鼻吸、 静脉注射 或皮下注射的形式施加于需要这种治疗的患者。 0038 用于口服时， 可以将其制备成为常规的片剂、 粉剂或口服液 ； 0039 用于注射时， 可以将其采用本领域常规的方法， 制备成为注射液 ； 0040 本发明的补骨脂酚类化合物或其盐， 以及补骨脂酚类化合物的以酯、 氨基甲酸酯 或其他常规的 “前体药物” 的形式的各种制剂， 可以采用药学领域常规的方法进行制备 ： 可用于配制本发明口服剂型的、 具体的药学上可接受的载体和赋形剂例子， 在美国专利 No3,903,297(1975 年 9 月 2 日授予 Robert) 中有描述。。

24、用于制造本发明的有用剂型的技 术和组合物， 在下列文献中有描述 ： 7 种现代制剂 (7Modern Pharmaceutics) 第 9 和 10 章 (Banker & Rhodes编辑， 1979) ： Lieberman等人， 药物剂型:片剂(Pharmaceutical Dosage Forms ： Tablets)(1981) ； 和 Ansel， 药 物 剂 型 导 论 (Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms)2 版 (1976)。 0041 制剂中， 补骨脂酚类化合物或其盐， 以及补骨脂酚类化合物的以酯、 氨基甲酸酯或 其他常规。

25、的 “前体药物” 的形式的重量含量为 0.1 99.9， 优选的含量为 0.5 90。 0042 本发明还包括一种治疗精神性疾病和神经性疾病的方法。所述方法包括 ： 给予需 要治疗的对象有效量的补骨脂酚类化合物或其盐的组合物。优选的， 所述的补骨脂酚类化 合物为 13- 羟基补骨脂酚或其衍生物。 说 明 书 CN 101088498 B5/8 页 7 0043 根据不同的需要， 本发明的补骨脂酚类化合物或其盐的组合物还可与其它疗精神 性疾病和神经性疾病的药物联合应用。 0044 本发明所提供的补骨脂酚类化合物， 通过体外实验以及动物体内实验的研究证 明， 该类化合物能选择性抑制多巴胺转运蛋白、。

26、 去甲肾上腺素转运蛋白和 5- 羟色胺转运蛋 白， 而对 - 氨基丁酸转运蛋白和 L- 谷氨酸转运蛋白活性均没有影响， 并且该类化合物对 细胞没有毒性 ； 同样剂量下， 补骨脂酚类化合物抗抑郁药效显著好于目前临床抗抑郁药物 盐酸安非他酮。因此， 该类化合物将为临床治疗精神性疾病和神经性疾病提供新的药物选 择， 具有良好的市场前景。 附图说明 0045 图 1 13- 羟基补骨脂酚 (B310) 对多巴胺转运蛋白的摄取活力的抑制作用。 0046 图2 13-羟基补骨脂酚(B310)对去甲肾上腺素转运蛋白的摄取活力的抑制作用。 0047 图 3 13- 羟基补骨脂酚 (B310) 对 5- 羟色胺。

27、转运蛋白的摄取活力的抑制作用。 0048 图 4 13- 羟基补骨脂酚 (B310) 对 - 氨基丁酸转运蛋白的摄取活力的作用。 0049 图 5 13- 羟基补骨脂酚 (B310) 对谷氨酸转运蛋白的摄取活力的作用。 0050 图 6 13- 羟基补骨脂酚 (B310) 对 CHO 细胞的毒性。 0051 图 7 13- 羟基补骨脂酚 (B310) 对大鼠突触体多巴胺转运蛋白影响。 0052 图 8 13- 羟基补骨脂酚 (B310) 对行为绝望模型动物的作用。 具体实施方式 0053 实施例 1 体外筛选模型的建立 0054 本发明涉及常规分子生物学的实验方法， 在所属领域中已是广泛已知，。

28、 并在诸 如 Molecular Cloning ： a laboratory Manual 第 3 版， Sambrook 等人编辑， Cold Spring Harbor laboratory Press， Clod Spring Harbor， N.Y.， 2001 及 Current Protocols in Molecular Biology， Ausubel等编辑等方法参考书有详细的介绍。 以五羟色胺、 去甲肾上腺 素、 多巴胺、 - 氨基丁酸四种神经转运蛋白 (5-HTT、 NET、 DAT、 GAT-1) 为靶标的活性筛选细 胞系的建立。 通过将大鼠的5-HTT、 NET、 D。

29、AT、 GAT-1全长编码序列(cDNA序列来源于PnbMed 网站上 GeneBank) 克隆于 pCDNA3 载体 ( 美国 invitrogen 公司 ) 上， 用电穿孔方法转染导 入中华仓鼠卵巢细胞 (CHO) 细胞， 48 小时后用含 G418 的 1640 培养基培养。10 天后对照组 细胞全部死亡， 而实验组形成许多细胞克隆。挑取克隆培养一周后， 待细胞铺满孔底， 吸去 培养基， 同上用胰酶消化。每孔中的细胞分别接种于两块 96 孔平板的相应的孔中 . 待细胞 长满孔底后， 其中一块板用于同位素流量测定 . 将对应的另一块板中转运活性高的孔中的 细胞逐级扩大培养， 每一级都进行同。

30、位素流量测定后选取转运活力较高细胞株培养， 最后 选取转运活力最高的细胞克隆 ( 分别命名为 S6， NET， D8， GAT-1 细胞 ) 保种， 建立永久表达 五羟色胺、 去甲肾上腺素、 多巴胺、 - 氨基丁酸四种神经转运蛋白的 CHO 细胞系。 0055 实施例 2 13- 羟基补骨脂酚选择专一性的测定 0056 分别培养 S6、 NET、 D8、 GAT-1 细胞于 48 孔板 (Costar) 至平板铺满 ( 大约每孔 6 万细胞 )。弃培液， 用 PBS 洗涤一次， 吸去 PBS 溶液， 每孔加入 90ul HBS(10mM Hepes， 100mM NaCl， PH8.0)， 2。

31、5温育10分钟， 每孔加入10ul HBS反应液。 实验组及阳性对照药加入80ul 说 明 书 CN 101088498 B6/8 页 8 HBS， 10ul不同浓度的13-羟基补骨脂酚(B310)及阳性对照药安非他酮(BPR)， 及10ul3H标 记的底物 (S6 采用 3H-5-HT ； NET 采用3H-NE ； D8 采用3H-DA)， 100M 维生素 C 和 100M 帕 吉林。25温育 20 分钟， 用冰浴的 PBS 溶液洗涤三遍， 用裂解液裂解 60 分钟， 吸取各孔的 裂解液加入到 1.2ml 的闪烁液中， 放入液闪计数仪 (Beckman LS5000TA) 中检测 DMP。

32、 值， 以 此来衡量 13- 羟基补骨脂酚对五羟色胺转运蛋白、 去甲肾上腺素转运蛋白、 多巴胺转运蛋 白的活性。对于 GABA 转运蛋白检测， 方法类似于多巴胺转运蛋白， 50nM3H-GABA(Amersham Pharmacia Biotech)取代了反应体系中的 3H-DA或NE或5-HT和维生素C及帕吉林。 对谷氨 酸转运蛋白摄取活性的影响采用COS-7细胞为筛选模型， 3H-Glutamic Acid和3H-Asparate Acid代替上述反应中的同位素， 以1mM Glutamic Acid和Asparate Acid为阴性对照， 其他 方法不变。 0057 结果见图 1 ： 1。

33、3- 羟基补骨脂酚 (B310) 在 0.1M-10M 浓度下， 对多巴胺转运 蛋白 (DAT) 也显示很强的抑制活力。在 0.1uM 浓度下可抑制 21.9， 1M 浓度下可抑 制 62.5， 10uM 浓度下可抑制 88.7.1。在 1M 浓度下， B310 对 D8 细胞多巴胺摄取 活力的抑制效果与阳性对照药物安非他酮 (BPR) 相当 (P0.05)， 在 0.1M-10M 浓度 范围内取 7 个浓度点， 经半对数曲线相关性分析， 计算 B310 对多巴胺摄取活性的 IC50 为 8.33414.5702M。 0058 B310 在 0.1M-10M 浓度下， 对去甲肾上腺素转运蛋白的。

34、摄取活力有显著抑制 作用 (P0.05)， 见图 2。 0059 在0.1M-10M浓度范围内取7个浓度点， 经同位素标记去甲肾上腺素摄取活力 的检测， 通过半对数曲线相关性分析， 得出 B310 的 IC50 为 0.97240.443M。 0060 B310 对 5- 羟色胺转运蛋白的摄取活力有显著抑制作用， 100M 浓度时可抑制 70， 与阳性对照药物安非他酮 (BPR) 比较， 对 5- 羟色胺转运蛋白的摄取活力的抑制作用 更强 (P0.05)。见图 4， 图 5。 0062 上述结果表明13-羟基补骨脂酚(B310)对多巴胺转运蛋白、 去甲肾上腺素转运蛋 白和 5- 羟色胺转运蛋白。

35、均有抑制活性， 其中对 5- 羟色胺转运蛋白的摄取活力的抑制作用 强于阳性对照药物安非他酮 (BPR)， 而对 - 氨基丁酸转运蛋白和谷氨酸转运蛋白活性均 没有影响。因此， 13- 羟基补骨脂酚 (B310) 对单胺类神经递质转运蛋白的抑制作用具有选 择性。 0063 实施例 3 13- 羟基补骨脂酚细胞毒性实验 0064 CHO 细胞于 1640 培养基 ( 含 10小牛血清 ) 培养， 待长满培养皿后， 胰酶消化， 接 种于 48 孔细胞板中， 继续培养待细胞数量达到 105左右， 分别处理如下 ： 换液后， 对照组加 10l 对照液 ( 含 1 DMSO 的 HBS)， 药物不同剂量组分。

36、别加 10l 不同浓度的 13- 羟基补 骨脂酚， 使其终浓度分别为 1mM， 0.1mM 和 0.01mM。继续培养 24 小时， 在第 20 小时加 MTT， 使终浓度为 0.5mg/ml。反应结束后， 吸去培养液， 加 100 DMSO， 37温育 10 分钟。转移至 96 孔板， 在 570nm 波长下用酶标检测仪测每个孔 OD 值。 说 明 书 CN 101088498 B7/8 页 9 0065 结果 ： 在分别含有 100M、 10M 和 1M13- 羟基补骨脂酚 (B310) 的 1640 培养液 环境下， 经24小时培养的CHO细胞的生长能力与对照组细胞无显著性差异， 见图6。

37、。 这表明 100uM 浓度以内的 13- 羟基补骨脂酚无细胞毒性作用。 0066 实施例 4 13- 羟基补骨脂酚对大鼠突触体多巴胺转运蛋白影响 0067 清洁级雌性SD大鼠2只， 体重210-240g， 10水合氯醛麻醉。 断头后， 立即剥离脑 组织， 取双侧纹状体， 用预冷的含0.32M蔗糖PBS缓冲液冲洗数次， 称取重量。 按10:1(W:V) 加 0.32M 蔗糖 PBS 缓冲液， 放入预冷的匀浆器中， 手动匀浆 15 次， 4下， 1000G 离心 20 分 钟。取上清液， 4下， 15000G 离心 15 分钟， 倒掉上清液。将沉淀加入组织重量 15 倍体 积的预冷 KRH 缓冲。

38、液 ( 含 NaCl120mM， KCl4.7mM， CaCl22.2mM， Hepes25mM， MgSO41.2mM， KH2PO41.2mM， glucose10mM.)， 用枪头吹打混匀制成混悬液。取混悬液 10l， 冷 KRH 缓冲 液 70l， 不同浓度 (1mg/ml， 100ug/ml， 10ug/ml) 的 13- 羟基补骨脂酚 (B310) 溶液 10l， 1.136M3H-Dopamine(含100M维生素C和100M帕吉林)10l， 混匀后， 37孵育5分 钟。加入预冷的 Li-KRH 缓冲液 (KRH 缓冲液 NalL 用 LiCl 替代 )1ml， 4下， 1500。

39、0G 离心 10 分钟。倒掉上清液， 用 Li-KRH 缓冲液 1ml 洗涤一次。加 0.4N NaON 溶液 100l 裂解 30 分 钟， 加闪烁液， 在液闪记数仪检测。同时以 10uM GBR12935 作为阳性药物对照， 1 DMSO 的 KRH 缓冲液作为空白对照。 0068 结果 ： 13- 羟基补骨脂酚 (B310) 对大鼠突触体多巴胺转运蛋白有明显抑制活力， 并具有浓度依赖特性， 10M13- 羟基补骨脂酚 (B310) 对大鼠突触体多巴胺转运蛋白的活 性有显著的抑制作用 (P0.05) ； 阳性对照药物 GBR12935(10M) 对大鼠突触体多巴胺转运 蛋白的活性的抑制作用。

40、更为显著 (P0.01)， 见图 7。 0069 实施例 10 13- 羟基补骨脂酚对行为绝望模型动物的作用效果 0070 清洁级雄性 Balb/c 小鼠 21 只， 体重 20 24g， 购于上海生命科学院实验动物中 心。自由饮食饮水， 饲养一周。将小鼠随机分为三组 ： 对照组 7 只， 含 10 DMSO 的生理盐 水， 与治疗组药物等体积腹腔注射 ； 阳性对照组 7 只， 盐酸安非他酮 ( 溶解于 10 DMSO 的 生理盐水中 )10mg/Kg 体重， 腹腔注射 ； 治疗组 7 只， 13- 羟基补骨脂酚 ( 溶解于 10 DMSO 的生理盐水中 )10mg/Kg 体重， 腹腔注射。检。

41、测方法 ： 各组动物在药物或者对照溶液处理半 小时后， 将小鼠尾用胶布固定在一敞口容器上端的横杆中间， 使其头部下垂， 两个记录员同 时每只动物 6 分钟不动时间 ( 绝望时间 )。挣扎和绝望判断方法 ： 挣扎表现四肢身体不停 纽动， 绝望主要表现动物身体不动， 两前肢蜷缩， 偶尔后肢有轻微活动。将两个记录员记录 数据平均作为每只动物的不动时间 ( 张均田主编 . 现代药物学研究方法， 北京医科大学和 协和医科大学出版， 1998， 第一版 )。 0071 结果 ： 在 10mg/kg 剂量下， 13- 羟基补骨脂酚 (B310) 组小鼠悬尾不动时间 ( 绝望 时间 ) 均低于空白对照组 (P。

42、0.01) ； B310 组动物不动时间显著低于盐酸安非他酮组动物 (P0.05)。以上表明 B310 可显著改善小鼠绝望状态， 与盐酸安非他酮比较， 药效更好， 提示 13- 羟基补骨脂酚具有很好的抗抑郁作用， 见图 8。 0072 实施例 11 13- 羟基补骨脂酚注射液的制备 0073 将 5000mg13- 羟基补骨脂酚用， 溶于 1000mg 水中制成水溶液， 加热溶解。混合均 匀， 分装成 10mg/2ml/ 支浓度的注射液装入药瓶中密封， 消毒制成产品。 0074 实施例 12 13- 羟基补骨脂酚片剂的制备 说 明 书 CN 101088498 B8/8 页 10 0075 取 100g13- 羟基补骨脂酚、 560g 微晶纤维素、 380g 无水乳糖、 200g 硬脂酸镁、 30g 氧化硅， 取上述配方中除硬脂酸镁外所有成分混合 25-30 分钟， 再筛入硬脂酸镁， 继续混 匀， 然后冲压成片。 说 明 书 CN 101088498 B1/4 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101088498 B2/4 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101088498 B3/4 页 13 图 5 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 101088498 B4/4 页 14 图 8 说 明 书 附 图 。