一种内壁具有取向性结构的多孔人工神经导管的制备方法技术领域
本发明属于可植入人体中的医用生物材料领域，具体涉及一种用于修复神经损伤的组织工程神经导管及其制备方法。
背景技术
在我国，周围神经损伤患者数量呈逐年增多的趋势。尽管周围神经具有一定的自我修复功能，但难以实现完全自我修复（特别是长距离神经缺损），因此需要借助于各种神经桥接物进行修复。虽然自体同源支架是修复周围神经缺损的金标准，但是却面临着供体来源有限，尺寸不匹配以及会给取材部位造成永久伤害等问题。目前，人们主要借助由具有较好生物相容性和生物降解性的天然或合成生物材料制备而成的各种组织工程神经桥接物来实现神经修复。但这些人工神经移植物促进周围神经再生的速度仍然难以满足临床需要，特别是难以修复较长距离（>3cm）的神经缺损，因此，开发能较快促进周围神经再生并能实现较长距离神经缺损修复的新型神经移植物，同时揭示材料跟神经再生之间的相互作用关系和内在分子机制，对于指导新一代周围神经移植物的设计及临床应用具有非常重要的科学意义。
材料表面微图形化技术可以构建出具有规则图形化分布的表面，并能精确控制图形的宽度和深度，具有较高的可控性和可重复性，对于解决上述问题提供了很好的思路。研究发现，二维平面上构建的生物材料表面微图形有利于体外研究图形对细胞的调控及相关机制。如沟脊状图形分布的人工神经移植物能够有效诱导和调控神经细胞的取向性生长和加速神经再生，沟脊的宽度和深度影响神经细胞的取向性以及细胞-细胞通信。而柱状和圆台等其它图形分布则可以有效调控神经细胞的分化。申请人在研究中发现，条纹状图形化的壳聚糖可以较好地诱导和调控施万细胞的迁移和取向，并且不会影响细胞原有的生理功能。因此，上述研究表明，微图形化技术对于调控神经再生过程和加速周围神经缺损的修复具有重要理论和应用意义。
从三维空间结构上设计和构建具有不同拓扑结构的人工神经移植物（支架/导管），使其具有对神经细胞和神经再生过程进行生物调控的能力近年来成为周围神经再生植入装置的研究热点和难点。如采用冻干模塑法和静电纺丝技术将材料加工成管状结构为神经再生提供适当的空间和引导作用，但是，由于普通的神经导管内壁没有任何修饰，管内也没有促神经修复的填充物，其修复周围神经缺损的功能受到很大限制。因此，必需对导管的内部结构进行更为合理的设计（如取向性内壁），以构建出能更好地诱导神经细胞生长和促神经再生的微环境。近十几年来，采用各种理化方法改变神经导管内壁结构（如内壁取向性，多通道型）或者添加管内填充物（如内置纤维支架、内置凝胶或各种因子和细胞），以增强导管自身生物功能性从而更好地促进神经再生已成为研究热点。如采用模塑法制备的具有多通道的PCL/胶原神经导管能明显促进施万细胞的粘附和活性，且具有较好的力学性能。随后将层连蛋白修饰过的胶原纤维束填充到PCL/胶原导管腔中，成功实现了狗的较长距离坐骨神经缺损的修复。而各种促神经细胞生长迁移的纤维束或者丝状物也被填充进导管中以促进神经修复。另外，也有研究者联合采用微图形技术和静电纺丝的方法首先电纺出具有取向性的PHBV-PLGA纤维，然后再用由同样的材料制备的表面微图形化的PHBV-PLGA膜包裹取向性纤维，最后将管壁侧面缝合成为内壁具有取向性并同时具有取向性纤维填充的神经导管，该导管在快速实现神经损伤修复方面具有潜在应用价值。由此可见，导管及管内填充物的合理设计可以更好地促进神经修复。然而，具有特定空间形态（取向性）的导管内壁的构建仍存在一定困难。尽管模塑法容易制备导管，但难以获得内壁具有取向性的导管，主要是因为剥离困难。静电纺丝法可以制备取向性排列的纺丝纤维膜，再将膜进行卷曲即可形成内壁具有取向性的导管，但导管侧面需要通过缝合或者粘接的方法实现闭合，从而会增加炎症发生的几率；另外还可以直接将纺丝纺到圆柱状的接收装置上，但由于所制备的导管跟模具结合比较紧密，在剥离的时候导管内壁容易损坏。微图形技术可以很方便的构建表面具有取向性的二维生物材料表面，然后可将材料卷曲成导管状，但导管侧面也需要通过缝合或者粘接的方法来实现闭合，同样增加了炎症发生的几率。
发明内容
从材料设计和导管生物学功能优化的角度出发，为了进一步提高人工神经导管促神经再生的能力，开发内壁具有取向性拓扑结构且能快速诱导神经细胞粘附和生长的无需缝合或粘接的人工神经移植物（导管/支架）对于周围神经损伤患者的神经损伤修复具有非常重要的理论和应用意义。针对这一问题，目前，申请人创造性地将微图形技术和冻干模塑法相结合，提供一种有利于神经细胞粘附、生长的人工神经导管，该导管内壁具有取向性条纹结构，导管壁呈疏松多孔结构，使用时无需对导管侧壁进行缝合或粘接。为了制备该神经导管，本发明还提供一种简单易行、适合规模生产的制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种内壁具有取向性结构的多孔人工神经导管，其特征在于：所述导管内壁表面具有取向性条纹结构，所述条纹结构由沟和脊组成，沟的表面为凹面，脊的表面为凸面，沟的宽度5-50微米，脊的宽度为5-50微米，沟的表面与脊的表面之间的垂直距离为1-10微米。
所述导管的导管壁呈疏松多孔结构。
所述导管的制备材料含有天然生物材料或合成生物材料中的至少一种，其中所述天然生物材料包括壳聚糖、胶原中的至少一种，所述合成生物材料包括PCL、PLGA、PLA中的至少一种。
所述导管还可含有生物分子或生长因子，所述生物分子或生长因子包括层连蛋白、纤连蛋白、透明质酸、多肽序列、NGF，BDNF，GDNF中至少一种。
所述导管的内径为1-5毫米，导管壁厚为1-2毫米。
所述导管长度为10-80毫米。
所述导管侧壁无需人工缝合或粘接。
本发明还提供上述人工神经导管的制备方法，该方法包括：
在金属箔片上构建微米尺寸的沟脊微图案，然后将箔片卷成圆筒，此时圆筒的内壁具有沟槽微图案，然后将聚二甲基硅氧烷（PDMS）浇筑入圆筒内，PDMS固化成型后剥离金属箔片，切割后获得外壁具有沟槽微图案的PDMS圆柱体，然后在PDMS圆柱体外加一同心圆形外套筒，封闭其中一端，在PDMS圆柱体和外套筒之间加入溶有导管材料的溶液，冷冻干燥后剥离圆形外套筒和PDMS圆柱体，获得内壁具有取向性结构的人工导管。
所述的金属箔片可以是钛箔、铝箔、金箔，优选钛箔。
所述的沟脊微图案，沟的宽度5-50微米，脊的宽度为5-50微米沟，沟的表面为凹面，脊的表面为凸面，沟的表面与脊的表面之间的垂直距离为1-10微米。
所述的圆筒内径为1-10微米。
所述的PDMS溶液由体积比为10:1的二甲基硅氧烷单体和交联剂配制而成。
所述导管的制备材料含有天然生物材料或合成生物材料中的至少一种，还可含有生物分子或生长因子，其中所述天然生物材料包括壳聚糖、胶原中的至少一种，所述合成生物材料包括PCL、PLGA、PLA中的至少一种，，所述生物分子或生长因子包括层连蛋白、纤连蛋白、透明质酸、多肽序列、NGF，BDNF，GDNF中至少一种。
本发明的制备方法和制备的导管具有以下优点：
1、所述人工神经导管无需对导管壁进行缝合或粘接；
2、内壁具有规则完整的条纹图案，有利于神经细胞粘附、生长；
3、导管壁为疏松多孔结构，利于营养物质的运输和细胞的新陈代谢物的交换，另外也为负载促神经再生的各种生长因子提供了很好的平台；
4、导管容易剥离，制备方法简单易行、适合规模生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
（1）微图形尺寸的设计和纯钛箔片母板的制备
图形尺寸：沟/脊宽度为5um/5um,10um/10um,20um/20um,30um/30um，50um/50um,图形深度为1um,2um,4um,6um,10μm。采用激光微雕刻法在纯钛箔片上雕刻出上述图形尺寸的沟脊状微图案，雕刻面积为10cm×10cm。
（2）外壁具有取向性图形的PDMS圆柱体弹性印章的制备和表征
沿条纹取向将纯钛箔片卷曲成内壁具有微图形的不同内径（1mm，3mm，5mm，7mm，10mm）的圆筒，将室温下配制好的PDMS（单体：交联剂=10：1（体积比））浇铸到具有一定微图形尺寸的纯钛箔片导管模具中（微图形在纯钛箔片导管内壁），然后将其放入真空干燥箱中抽真空排除气泡，并进行干燥固化，最后进行固化后剥离即得到外壁具有沟脊状微图形分布的不同直径的PDMS圆柱体弹性印章。采用扫描电镜对PDMS圆柱体弹性印章的沟脊图形尺寸和深度进行检测。
（3）侧壁无需缝合且内壁具有取向性微图形的多孔神经导管的制备
采用微图形技术和冻干模塑法制备侧壁无需缝合且内壁具有取向性微图形的多孔神经导管。首先配制一定浓度的壳聚糖/胶原混合溶液，然后将该溶液填充到具有外壁沟脊状图形化分布的PDMS圆柱体弹性印章组成的导管模具中，抽真空去除气泡，冷冻干燥后，可以将导管完整剥离获得侧壁无需缝合且内壁具有取向性微图形的多孔人工神经导管，且管壁完整无损坏。
（4）负载生物活性分子的内壁具有取向性微图形的多孔壳聚糖/胶原神经导管的制备
室温下，将一定浓度的（5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL）具有促进神经再生功能的生物分子（层连蛋白、纤连蛋白、透明质酸、多肽序列（YIGSR，IKVAV）或促神经生长的各种因子（NGF，BDNF，GDNF等）先跟壳聚糖/胶原混合溶液充分共混反应2小时，然后采用微图形技术和冻干模塑法将共混后的溶液制备成表面沟脊状微图形分布的薄膜；或者采用接枝的方法（共价结合或静电作用）直接将一定浓度的生物活性分子固定到表面微图形化的多孔薄膜上，从而分别实现生物活性分子在导管内壁的取向性分布以及导管多孔结构中的固定。