本发明涉及包含保留免疫原性的灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)的干 燥固体或高粘性液体制剂的免疫原性组合物。本发明也包括包含IPV 的干燥固体或高粘性液体制剂的疫苗。本发明的另一方面是保存灭活 脊髓灰质炎病毒(IPV)为干燥固体或高粘性液体的方法。该方法包含 通过在稳定剂溶液中悬浮或溶解IPV和细菌多糖制备样品，并使所述 样品经受导致溶剂从所述样品丧失的温度和压力条件。维持或调节压 力和温度条件以便除去溶剂并干燥所述样品形成固体或高粘性液体。 上述制剂在使用前可重配或直接使用。
众所周知，IPV作为疫苗的一种成分，但是，其配制为液体，例 如为Infanrix penta。业已证实IPV冷冻干燥处理与抗原性的损失有 关，所以难以配制包含IPV干燥形式的有效疫苗。已知干燥的疫苗制 剂，特别是在细菌多糖存在下。b型流感嗜血菌(Haemophilus influefzzae b)(Hib)的PRP多糖经常配制为干燥固体，例如为Infanrix hexa(WO99/48525)。
IPV干燥制剂的有利之处有几方面原因。干燥制剂具有良好的贮 藏特性，并能增加含有IPV的疫苗的保存期限。干燥的IPV也可能使 IPV成为更具灵活性的疫苗成分，并使之配制为之前所不可能存在的 新的联合疫苗。某些含有液体和固体成分的疫苗，仅在给药前混合(例 如Infanrix hexa)。Infanrix Hexa含有干燥的Hib成分，仅在使用前 与DTPa-HepB-IPV重配。IPV通过与Hib一起配制为干燥固体，就可 能向疫苗的液体成分中添加更多成分，除非所述成分可能与IPV不相 容。
本领域公知几种用于干燥疫苗成分的技术。从传统上来说，使用 冷冻干燥方法业已达到该目的，在该方法中制备物质溶液并冷冻样 品。在初步干燥阶段中，在减压条件中通过冰升华除去大部分水分， 形成了多孔的‘蛋糕’。通常跟随着二次干燥阶段，当压力和温度改 变时，水分就从固体“蛋糕”中蒸发出来。与液体制剂比较，所产生 的冻干样品具有改良的稳定性。但是，冷冻干燥过程冗长，会成为生 产过程中的限速步骤。
当大量样品在大的干燥器设备中分批冻干时，产物差异性也是一 道难题。冷冻干燥器搁板上的条件在不同的位置是不同的，导致了样 品在不同条件下以不同的速率冻干。对于某些诸如活病毒的生物材料 而言，在冷冻干燥过程中活性损失相当大(Pikal(1994)ACS Symposium 567：120-133)。许多冻干的物质在环境温度下仍然不稳定(Carpenter 等(1994)ACS Symposium 567；134-147)。
通过使用诸如多羟基化合物的冷冻保护剂可在一定程度上防止冷 冻过程所导致的损伤。在该过程中通过避免冷冻样品以及通过沸腾除 去水分，也已获得对冻干方法的进一步改良(WO96/40077； US63063450)。该方法包括在合适的溶剂中制备玻璃基质成形材料与 要保存样品的混合物，从该混合物中蒸发大量溶剂以获得浆状物，将 浆状物暴露于足够引起该浆状物沸腾的压力和温度下，并除去残留的 溶剂。
类似方法描述于US 5,766,520中，其中所述方法包括部分除去水 分以形成粘性液体，进一步对浆状物抽真空以引起‘沸腾’，接着在 基本上低于100℃的温度下干燥。该方法仍然遇到某些传统的冻干难 题。当在大的冷冻干燥器中进行该方法时，取决于它们在搁板上的位 置样品会以不同的速率干燥，其导致了在干燥过程中，不同样品损失 不同数量的活性。其导致了在一批产物中一致性的缺乏。
迄今为止，没有制备保持高水平抗原性和/或免疫原性的IPV干燥 固体疫苗制剂的成功实例的报道。
因此，本发明公开了一种包含IPV和稳定剂的免疫原性组合物， 配制为干燥组合物或高粘性液体，在重配后能产生抗脊髓灰质炎病毒 的免疫应答。稳定剂的存在对于抗原的保存是至关紧要的，多羟基化 合物被证明是有效的稳定剂。在细菌多糖存在下IPV更适合干燥，可 使原始抗原保留更高比例的抗原性和/或免疫原性。本发明包括保存包 含IPV的组合物的方法，优选存在多羟基化合物和细菌多糖，其中IPV 的抗原性和/或免疫原性得到保留。与IPV单独冻干相比，在多糖存在 下，IPV的冻干导致改良的IPV抗原保持率。此外，通过与IPV一起 配制为干燥固体或高粘性液体，Hib的免疫原性也得到增强。具体而 言，当用DTP疫苗(如下所述)即时重配时，本发明人业已发现Hib 滴度没有因DTP疫苗的氢氧化铝成分所减少，与不存在IPV的情况一 样。
所使用的干燥方法也能影响IPV抗原性和/或免疫原性的保持率。 对于干燥IPV而言，发泡干燥方法较常规的冷冻干燥技术在保留IPV 的抗原性方面更有效。令人惊奇的是，在发泡干燥方法中包含冷冻步 骤并不导致抗原性损失，反而更能促进快速和有效的保存方法的发 展。本发明另一种优选的方法保留了高水平的IPV抗原性和/或免疫原 性，通过干燥含有IPV的样品，无需冷冻或发泡，形成干燥制剂，优 选高粘性液体制剂。
本发明提供了一种IPV的干燥制剂，其具有贮藏稳定性的优点。 所述干燥制剂可就在给药前快速且容易地重配。在使用优选的发泡干 燥方法情况下，由于所述蛋糕的巨大表面积，发泡的蛋糕特别容易重 配。
IPV和Hib干燥固体或高粘性液体制剂的额外好处包括Hib成分 增强的免疫原性。众所周知在多成分疫苗中，疫苗制剂的其它成分可 引起对Hib免疫原性的干扰(WO96140242，WO97/00697)。在干燥 制剂中包含IPV和Hib可减轻该问题，特别是在给药前将干燥的 IPV-Hib组合物与白喉、破伤风和百日咳成分混合。
虽然在细菌多糖存在下，有可能使用常规的冷冻干燥方法冻干 IPV，但优选使用发泡干燥技术或不包括冷冻或发泡的温和的干燥方 法。这些方法导致了在IPV中甚至更多的抗原性和/或免疫原性保持 率，所形成的蛋糕也更容易且更快速地重配。较标准的冷冻干燥技术 而言，所述方法也具有更快速和更高能效的优点。因为在疫苗生产中 冻干步骤通常是限速步骤，所以使用优选的方法可产生更高量级的疫 苗产物，而无需对设备进行额外投资。在优选的发泡干燥方法中引入 冷冻步骤也产生了改良的分批重复性。
附图说明
图1-含有在发泡干燥方法不同阶段的保存样品的管形瓶的照片。
A-显示了以液体制剂进行冷冻干燥时保存样品的外观。
B-显示了当压力减小到1.5毫巴时保存样品的外观。基于每个管形 瓶不同的条件，样品开始以稍有差异的速率冷冻。
C-显示了在0.1毫巴下保存样品的外观，其中所有样品已经变为完 全冷冻。
D-显示了当压力增加到0.8-3.5毫巴时保存样品的外观。当保存样 品发泡和溶剂蒸发时，形成了泡沫玻璃。
图2-在倒置的管形瓶中高粘性液体的照片。
发明详述
本发明的免疫原性组合物
本发明包括免疫原性组合物，配制为干燥固体或高粘性液体，包 含IPV和稳定剂，其中IPV的抗原性和/或免疫原性在重配后得到保 留。IPV的干燥固体或高粘性液体制剂能产生免疫应答，优选是保护 性免疫应答，抗脊髓灰质炎病毒，优选在重配和接种后。
IPV定义为灭活的脊髓灰质炎病毒(优选包含在疫苗领域中认为 是标准的1、2和3型，最优选Salk脊髓灰质炎疫苗)。IPV的疫苗剂 量包含20-80、优选40或80D-抗原单位的1型(Mahoney)，4-16、 优选8或16D-抗原单位的2型(MEF-1)和20-64、优选32或64D- 抗原单位的3型(Saukett)。
当通过本发明的方法干燥时，优选1、2或所有3种1、2和3型脊 髓灰质炎病毒的抗原性得到保留；更优选1型；2型；3型；1型和2 型；1型和3型；2型和3型的抗原性得到保留；或1型、2型和3型 保留至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的参比样 品的抗原性水平，所述参比样品没有接受干燥处理。在干燥固体或高 粘性液体在水溶液中重配后，通过任何合适的方法包括通过ELISA， 其使用了抗1、2和/或3型脊髓灰质炎病毒的多克隆和/或单克隆抗体， 可测量抗原性。
当通过本发明的方法干燥时，优选1、2或所有3种1、2和3型脊 髓灰质炎病毒的免疫原性得到保留；更优选1型；2型；3型；1型和2 型；1型和3型；2型和3型的免疫原性得到保留；或1型、2型和3 型保留至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的参比 样品的免疫原性水平，所述参比样品没有接受干燥处理。在干燥固体 或高粘性液体在水溶液中重配后，通过任何合适的方法可测量抗原 性。在一种优选的方法中，所述干燥制剂在水溶液中得到重配，并给 动物接种，优选大鼠。在合适的一段时间后，从接种的动物中收集抗 血清并测试血清转化。优选地，与未干燥的参比样品比较，达到至少 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9的相对功效。
干燥固体组合物是一种通过冻干、升华、蒸发或干燥除去溶剂的 制剂，所述冻干、升华、蒸发或干燥使得溶剂残留小于或等于15％、 12％、10％、7％、5％、4％，优选3％、2％或更优选1％。术语“干 燥固体”包含玻璃、橡胶或具有固体外观的结晶固体。任一上述方法 可用于制备所述干燥固体。通过升华、沸腾或蒸发，优选通过蒸发除 去溶剂。
高粘性液体定义为具有溶剂含量小于或等于15、12、10，优选8、 5、4、3、2或1％的物质。高粘性液体具有足够低的溶剂含量，使得活 性剂在4℃下以稳定态保存至少3、6、9、12或24个月，在这段时间 后，容许活性剂保留至少40、50、60，优选70、80、90、95％的其抗 原性和/或免疫原性。高粘性液体并不暴露于涉及泡沫形成的起泡形成 物。优选地，高粘性液体具有除了玻璃之外的固体外观，在几天后， 优选几星期，更优选几个月后，能非常缓慢地流动。
本发明的免疫原性组合物配制为干燥固体或高粘性液体，包含IPV 和稳定剂以及优选细菌多糖。所述稳定剂是任一下述组合物。所述细 菌多糖包含源自任何细菌的荚膜多糖，所述细菌优选一种或多种脑膜 炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、b型流感嗜血菌(Haemophilus influenzae b)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、A组链球 菌、B组链球菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或表皮葡 萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。
优选b型流感嗜血菌(Haemophilus influenzae b)的PRP荚膜多 糖存在于干燥固体或高粘性液体中。在另一个优选的实施方案中，所 述免疫原性组合物包含荚膜多糖的干燥固体或高粘性液体制剂，所述 荚膜多糖源自一种或多种脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis) 的血清组A、C、W-135和Y(脑膜炎球菌多糖)。另一个优选的实施 方案包含源自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)荚膜多糖的干 燥固体或高粘性液体制剂。所述肺炎球菌荚膜多糖抗原优选选自血清 型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、 17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F(最优选自血清型1、3、 4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。另一个优选的实施方案 包含金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的5型、8或336型荚 膜多糖。另一个优选的实施方案包含表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的I型、II型或III型荚膜多糖。另一个优选的实施方案 包含B组链球菌的Ia型、Ic型、II型或III型荚膜多糖。另一个优选 的实施方案包含A组链球菌的荚膜多糖，优选进一步包含至少一种M 蛋白和更优选包含多种类型的M蛋白。
在本发明的一个实施方案中，所述细菌多糖是全长的，纯化的天 然多糖。在本发明的一个可选的实施方案中，所述多糖按大小排列在 2-20倍之间，优选2-5倍、5-10倍、10-15倍或15-20倍之间，所以多 糖大小排列越小就越易于处理。在优选的实施方案中使用了寡糖。寡 糖通常具有2-20个重复单位。
本发明进一步包括作为干燥固体或高粘性液体的包含一种以上细 菌多糖和IPV的免疫原性组合物。优选地，IPV与一种或多种Hib(b 型流感嗜血菌)PRP多糖和/或脑膜炎球菌A、C、W和/或Y多糖和/ 或肺炎球菌多糖组合。最优选地，所述活性剂包含IPV和Hib；IPV 和MenC；IPV和Hib及MenC；IPV和MenA及C；IPV和Hib及 Men A和C；IPV和Hib及Men A和C和Y；或IPV和Hib及Men C 和Y。
上述列举的活性剂也包含一种或多种如下所述的肺炎球菌荚膜多 糖。
在上述组合物中使用了多糖，也可以用寡糖(如上所定义)。
虽然这些组合物可以使用佐剂(如下所述)，但是它们优选不使 用佐剂或优选不包含铝盐。
优选地，所述多糖或寡糖结合于包含T-辅助表位的肽或载体蛋白 (如下所述)。
存在于本发明免疫原性组合物中的荚膜多糖是未结合的或结合于 诸如破伤风类毒素、破伤风类毒素片段C、白喉类毒素、CRM197、肺 炎球菌溶血素、蛋白D(US6342224)的载体蛋白。破伤风类毒素、白 喉类毒素和肺炎球菌溶血素任一通过遗传突变和/或优选地通过化学处 理解毒。本发明优选的实施方案含有结合于破伤风类毒素的Hib。
在本发明的免疫原性组合物中存在一种以上结合的多糖，所述多 糖结合于相同的载体蛋白或不同的载体蛋白。本发明优选的实施方案 包含结合于载体蛋白的脑膜炎球菌多糖。在结合的Hib和脑膜炎多糖 存在下，它们结合于相同的载体蛋白或不同的载体蛋白。
可通过任何公知的偶联技术制备所述的多糖结合物。在一种优选 的偶联技术中，所述多糖经硫醚键偶联。该结合方法依赖于多糖与四 氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓(CDAP)的活化作用以形成氰酸 酯。因此，活化的多糖可直接或通过间隔基与载体蛋白上的氨基偶联。 优选地，使用包括形成硫醚键的异种连接(heteroligation)化学反应， 将氰酸酯与己二胺偶联以及将氨基衍生的多糖结合于载体蛋白。上述 结合物描述于Uniformed Services University的PCT公开申请 WO93/15760中。
所述结合物也可通过直接还原性胺化方法制备，所述方法描述于 US 4365170(Jennings)和US 4673574(Anderson)中。其它方法描述 于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中。
另一种方法包括将己二酸酰肼(ADH)衍生的溴化氰活化的多糖 通过碳二亚胺缩合与蛋白载体偶联(Chu C.等Infect.Immunity，1983 245 256)。
掺入本发明免疫原性组合物中作为其一部分的多糖可不吸附在佐 剂上或吸附在佐剂上，所述佐剂优选铝盐(磷酸铝或氢氧化铝)，最 优选磷酸铝。
本发明的免疫原性组合物包含了在干燥过程中能有助于防止损害 的稳定剂。任一稳定剂描述如下，包括可掺入免疫原性组合物的玻璃 形多羟基化合物，无论是使用本发明的方法所制备的干燥固体、发泡 玻璃或是高粘性液体组合物。优选的稳定剂包括蔗糖、山梨糖醇、乳 糖和海藻糖。
所述优选的化合物，通过本发明的方法干燥，在联合疫苗中可与 其它抗原组合，所述疫苗是干燥的或用于重配干燥成分的液体制剂。
额外成分
掺入了IPV和稳定剂的本发明的干燥固体或高粘性液体制剂可另 外与另一种疫苗成分配制。包含IPV干燥固体或高粘性液体制剂和细 菌多糖的优选的疫苗可与包含额外疫苗成分的液体制剂混合。在固体 成分与液体成分重配后，完整的疫苗通过注射施用。
额外成分包括源自一种或多种脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、A组链球 菌、B组链球菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或表皮葡 萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的荚膜多糖。在一个优选的实施 方案中，所述免疫原性组合物包含源自一种或多种脑膜炎奈瑟氏球菌 (Neisseria meningitidis)的血清组A、C、W-135和Y的荚膜多糖。 另一个优选的实施方案包含源自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)荚膜多糖。所述肺炎球菌荚膜多糖抗原优选选自血清型 1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、 17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F(最优选自血清型1、3、 4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。另一个优选的实施方案 包含金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的5型、8或336型荚 膜多糖。另一个优选的实施方案包含表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的I型、II型或III型荚膜多糖。另一个优选的实施方案 包含B组链球菌的Ia型、Ic型、II型或III型荚膜多糖。另一个优选 的实施方案可包含A组链球菌的荚膜多糖，优选进一步包含至少一种 M蛋白和更优选包含多种类型的M蛋白。
本发明的免疫原性组合物可与蛋白抗原配制。优选的肺炎球菌蛋 白抗原是那些暴露于肺炎球菌外表面的肺炎球菌蛋白(在肺炎球菌生 活周期的至少一部分中能为宿主免疫系统所识别)，或是为肺炎球菌 所分泌或释放的蛋白。最优选地，所述蛋白是毒素、粘附素、二元信 号转导蛋白或肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的脂蛋白，或 它们的片段。具体优选的蛋白包括但不限于：肺炎球菌溶血素(优选 通过化学处理或突变解毒的)[Mitchell等.Nucleic Acids Res.1990 Jul 11；18(13)：4010“Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.”，Mitchell等.Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23；1007(1)：67-72“Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli：rapid purification and biological properties.”，WO 96/05859(A.Cyanamid)，WO 90/06951(Paton等)，WO 99/03884 (NAVA)]；PspA及其跨膜缺失变体(US 5804193-Briles等.)；PspC 及其跨膜缺失变体(WO 97/09994-Briles等)；PsaA及其跨膜缺失变 体(Berry和Paton，Infect Immun 1996 Dec；64(12)：5255-62“Sequence heterogeneity of PsaA，a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae”)；肺炎球菌胆碱结合蛋白及 其跨膜缺失变体；CbpA及其跨膜缺失变体(WO 97/41151；WO 99/51266)；甘油醛-3-磷酸酯-脱氢酶(Infect.Immun.1996 64：3544)； HSP70(WO 96/40928)；PcpA(Sanchez-Beato等.FEMS Microbiol Lett 1998，164：207-14)；M样蛋白，(EP 0837130)和粘附素18627， (EP 0834568)。另一种优选的肺炎球菌蛋白抗原是公开于WO 98/18931中的那些，特别是在WO 98/18930和PCT/US99/30390中所选 择的那些。
与本发明免疫原性组合物配制的优选的奈瑟氏球菌属蛋白包括 TbpA(WO93/06861；EP586266；WO92/03467；US5912336)、TbpB (WO93/06861；EP586266)、Hsf(WO99/31132)、NspA(WO96/29412)、 Hap(PCT/EP99/02766)、PorA、PorB、OMP85(也已知为D15) (WO00/23595)、PilQ(PCT/EP99/03603)、PIdA(PCT/EP99/06718)、 FrpB(WO96/31618参见SEQ ID NO：38)、FrpA或FrpC或与两者 共有至少30、50、100、500、750个氨基酸的保守部分(WO92/01460)、 LbpA和/或LbpB(PCT/EP98/05117；Schryvers等Med.Microbiol.1999 32：1117)、FhaB(WO98/02547)、HasR(PCT/EP99/05989)、lipo02 (PCT/EP99/08315)、MItA(WO99/57280)和ctrA(PCT/EP00/00135)。 奈瑟氏球菌属蛋白可以作为纯化的蛋白或部分外膜泡囊制备物添加。
免疫原性组合物优选与提供抗一种或多种白喉、破伤风和百日咳 博德特氏菌(Bordetella pertussis)感染保护的抗原配制。所述百日咳 成分可灭活，是全细胞百日咳博德特氏菌(B.pertussis)(Pw)或优 选是非细胞百日咳(Pa)，所述非细胞百日咳含有来自PT、FHA和 69kDa百日咳博德特氏菌粘附素的至少一种抗原(优选两种或所有三 种)，某些其它非细胞疫苗也包含凝集原，例如Fim2和Fim3，在本 发明中也考虑使用这些疫苗。一般来说，提供了抗白喉和破伤风保护 的抗原是白喉毒素和破伤风毒素。所述毒素是化学灭活的毒素，例如 随后用甲醛处理的，或通过导入一种或多种点突变灭活的毒素。
可选地，本发明的免疫原性组合物可以药盒提供，在一种容器中 含有所述干燥固体、发泡玻璃或高粘性液体以及在另一种容器中含有 液体DTPa或DTPw。上述药盒可例如，包含双室注射器，在上述注射 器的不同室中含有所述干燥固体和液体成分。然后，在注射前立即用 液体疫苗重配所述干燥成分，作为单一疫苗。因此例如，用液体DTPa 或DTPw疫苗重配本发明的干燥固体、发泡玻璃或高粘性液体(优选 即时地)并以单一疫苗施用。所述DTPa或DTPw疫苗通常至少部分 地用铝盐作为佐剂，如磷酸铝和/或氢氧化铝(例如GlaxoSmithKline Biologicals s.a.的Infanrix和Tritanrix疫苗)。
所述免疫原性组合物任选地与能保护宿主抗无法测定类型(non- typeable)德流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、RSV的一种或多 种抗原，和/或能保护宿主抗流感病毒的一种或多种抗原配制。优选的 无法测定类型德流感嗜血菌(H.influenzae)蛋白抗原包括Fimbrin蛋 白(US 5766608)和包含来自OMP26、P6、蛋白D、TbpA、TbpB、 Hia、Hmw1、Hmw2、Hap和D15中的肽的融合蛋白(如LB1融合蛋 白)(US 5843464-Ohio State Research Foundation)。
优选的流感病毒抗原包括全、活或灭活病毒，分裂流感病毒、在 鸡蛋或MDCK细胞中生长的，或非洲绿猴肾异倍体细胞(Vero cells) 或全流感病毒小体(如R.Gluck，Vaccine，1992，10，915-920所描述) 或它们纯化的或重组的蛋白，例如HA、NP、NA或M蛋白，或它们 的组合。
优选的RSV(呼吸道合胞病毒)抗原包括F糖蛋白、G糖蛋白、 HN蛋白、M蛋白或其衍生物。
包含DTP-Hib的联合疫苗为本领域公知。但是存在着与某些制剂 相关的难题，所述制剂涉及Hib与其它抗原的简单混合。除非谨慎地 配制，否则由于疫苗其它成分的干扰，增加的抗Hib成分的抗体滴度 可能低于通过单独接种相同剂量Hib所引起的那些。即使该难题为本 领域众所周知，且业已通过各种方法来解决，对于该难题，其中Hib 和IPV一起配制为干燥固体或高粘性液体的本发明的免疫原性组合物 提供了一种可选的解决方案。
本发明的免疫原性组合物可组成为疫苗药盒的一部分，其中IPV 和Hib以药盒的一种成分形式存在，另一种成分，如上所述，以第二 成分形式存在，举例来说，如本文中所描述的双室注射器。仅在施用 所述疫苗前将两种成分一起混合。在上述制剂中，包含IPV和Hib的 成分优选干燥固体、发泡玻璃或高粘性液体，即使其被任选地配制为 液体。该制剂引起的抗Hib成分的抗体滴度是临床上可接受的，以提 供抗b型流感嗜血菌病原体的保护。一般来说，联合疫苗中的抗体滴 度是单价Hib疫苗中相同剂量Hib所引起的滴度的至少85％、90％， 优选约100％或更多。
本发明的疫苗
上述本发明的免疫原性组合物优选配制为疫苗。优选地，所述疫 苗包含足够增强对免疫原的免疫应答的适量佐剂。合适的佐剂包括但 不限于，诸如氢氧化铝和磷酸铝的铝盐、角鲨烯混合物(SAF-1)、胞 壁酰肽、皂苷衍生物、分枝杆菌细胞壁制备物、单磷酰脂质A、分枝 菌酸衍生物、非离子嵌段共聚物表面活性剂、Quil A、霍乱毒素B亚 基、polphosphazene及衍生物、和免疫刺激复合物(ISCOMs)，如那 些为Takahashi等.(1990)Nature 344：873-875所描述的。对于兽医 使用或用于在动物中产生抗体而言，可使用弗氏佐剂的促有丝分裂成 分。
本发明的疫苗制剂优选在使用前重配。重配涉及将疫苗的液体成 分与本发明的干燥固体、发泡玻璃或高粘性液体制剂混合。本发明也 涉及一种具有防水内表面的容器，所述容器含有本发明免疫原性组合 物或疫苗。使用该容器是有利的，因为其使得干燥组合物置于试管底 部，以更易于重配的形式存在。
在保存样品中掺入有色染料的有利之处在于以便容许本发明的干 燥组合物更易显现。在重配过程中其是特别重要的，可确保在使用前 干燥固体或高粘性液体充分重配。优选地，所述有色染料在中性pH下 保持其颜色，且与注入患者的注射剂相容。最优选的有色染料是酚红。
当使用所有的免疫原性组合物或疫苗时，免疫原的免疫有效量应 通过经验确定。应当考虑的因素包括免疫原性，无论免疫原与佐剂或 载体蛋白或其它载体是复合的或是共价连接的，给药途径和所要施用 的免疫剂的用量。上述因素为疫苗领域所公知，且进行该决定完全为 免疫学家之技能而无需过度实验。
在本发明的免疫原性组合物中物质可以不同浓度存在。一般而 言，物质的最小浓度是必需达到其预期用途的数量，而最大浓度是可 保留在溶液中或均匀悬浮在最初混合物中的最大数量。例如，治疗剂 的最小数量优选可提供单一治疗有效剂量的数量。如果在结晶前形成 发泡玻璃，也可使用过饱和溶液。对于生物活性物质而言，最小浓度 是重配时对于生物活性所必需的数量，最大浓度是均匀悬浮无法保持 时所处的浓度。在单剂量单位情况下，所述数量是单一治疗应用的数 量。通常来说，预计每一剂量可包含1-100ug的蛋白抗原，优选5-50ug 以及更优选5-25ug。优选的细菌多糖剂量是10-20ug、10-5ug、5-2.5ug 或2.5-lug。但是，各种物质之间不同物质的优选数量是很容易为本领 域技术人员所确定。
本发明的方法
本发明的方法是用于保存包含IPV和稳定剂组合物，产生了其中 IPV的抗原性得到保留的组合物。优选地，在所述样品中掺入的细菌 多糖应当是干燥的。
在一个实施方案中，本发明的方法涉及干燥IPV并包含步骤：
·通过在稳定剂溶液中悬浮或溶解IPV制备保存样品；优选地所 述保存样品中存在细菌多糖和/或玻璃形多羟基化合物；
·使所述保存样品经受下述的温度和压力条件，即溶剂从保存样 品中丧失的条件；和
·除去溶剂直至所述保存样品干燥形成固体或高粘性液体，其中 IPV的抗原性和/或免疫原性得到保留。
在一个优选的实施方案中，所述保存样品装入至具有防水内表面 的容器中进行干燥。
本发明的另一种方法涉及发泡干燥，包含步骤：
·通过在稳定剂溶液中悬浮或溶解IPV制备保存样品；优选地所 述保存样品中存在细菌多糖和/或玻璃形多羟基化合物；
·使所述保存样品经受下述的温度和压力条件，即所述保存样品 形成泡沫的条件；和
·除去溶剂直至所述泡沫干燥形成固体，其中IPV的抗原性和/或 免疫原性得到保留。
本发明的一种优选的发泡干燥方法使用了具有防水内表面的容 器，包含步骤：
·通过在稳定剂溶液中悬浮或溶解IPV和优选地细菌多糖制备保 存样品；
·将所述保存样品装入具有防水内表面的容器中；
·使所述含有保存样品的容器经受下述的温度和压力条件，由所 述温度和压力条件使所述保存样品形成泡沫；
·除去溶剂直至所述泡沫干燥形成固体，其中IPV的抗原性和/或 免疫原性得到保留。
上述本发明的发泡干燥方法任选地包含冷冻步骤。所述保存样品 可以全部或部分冷冻。因此本发明的某些方法包含步骤：
·通过在稳定剂溶液中悬浮或溶解IPV和优选地细菌多糖制备至 少部分冷冻的保存样品，以及冷冻所述混合物；
·使所述至少部分冷冻的保存样品经受下述的温度和压力条件， 即所述保存样品形成泡沫的条件；和
·除去溶剂直至所述泡沫干燥形成固体，其中IPV的抗原性和/或 免疫原性得到保留。
上述方法的冷冻步骤优选使用急冷冷冻的处理，其中通过蒸发减 压是导致冷冻的原因。其导致样品快速冷冻，使得抗原损失较少。因 此本发明的一种方法包括步骤：
·通过在稳定剂溶液中悬浮或溶解IPV和优选地细菌多糖制备保 存样品；
·使所述保存样品经受减压，使得所述保存样品成为至少部分冷 冻的；
·使所述至少部分冷冻的保存样品经受下述的温度和压力条件， 即所述保存样品形成泡沫的条件；和
·除去溶剂直至所述泡沫干燥形成固体，其中IPV的抗原性和/或 免疫原性得到保留。
本发明另一种优选的方法是用于保存IPV，包含步骤：
·通过在稳定剂溶液中悬浮或溶解IPV制备保存样品：
·使所述保存样品经受下述的温度和压力条件，即所述保存样品 通过蒸发作用释放溶剂，并不起泡形成泡沫和优选地无需冷冻；
·除去溶剂直至所述样品干燥形成高粘性液体，其中IPV的抗原 性和/或免疫原性得到保留。
本发明的方法生产的IPV制剂能经受长期贮藏，在贮藏过程中IPV 的抗原性和/或免疫原性得到保留。优选地，在4℃下贮藏至少3、6、9、 12、24个月后，IPV保留了至少40、50、60、70，优选地80、90、95％ 的其最初抗原性和/或免疫原性。在IPV重配后，在合适的水溶液中并 使用合适的方法，例如那些上述的方法来测定抗原性和免疫原性。
无需冷冻或发泡的干燥方法特别适用于要被干燥的活性剂，其中 所述活性剂在干燥过程中，由于暴露于冷冻或泡沫形成相关的起泡中 而易于损失活性和/或抗原性。其也特别适用于其中较低浓度的玻璃形 多羟基化合物是有利的和/或其中优选较短干燥过程的。
稳定剂
用于本发明方法中的稳定剂可优选包含玻璃形多羟基化合物。合 适的物质包括但不限于，所有的多羟基化合物，包括糖类和非糖类多 羟基化合物。优选地，所述稳定剂能使活性剂得到贮藏，通过变性、 聚集或其它方法基本上不损失活性。特别合适的原料包括糖类、糖醇 类和糖类衍生物。优选地，所述玻璃形多羟基化合物是糖类或其衍生 物，包括葡萄糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖、乳果糖、蔗糖、麦芽糖、 乳糖、异麦芽糖、麦芽糖醇、乳糖醇、益寿糖(palatinit)、海藻糖、 棉子糖、水苏糖、松三糖或葡聚糖，最优选海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、 棉子糖、甘露醇、乳糖、乳糖醇或益寿糖。
细菌多糖作为稳定剂，以及本发明优选的实施方案掺入细菌多糖 作为所述稳定剂的成分。在该实施方案中所述细菌多糖扮演着稳定剂 和免疫原的双重角色。
糖类包括但不限于，单糖、二糖、三糖、寡糖和它们相应的糖醇 类、诸如糖类衍生物和化学修饰的糖类的多羟基化合物、羟乙基淀粉 和糖类共聚物。天然和合成的糖类皆适合于使用。合成的糖类包括但 不限于，具有为硫醇或碳键所取代的糖苷键的那些。D和L型糖类皆 可使用。所述糖类可以是非还原的或还原的。其中使用还原糖类时， 优选添加麦拉德反应(Mailard reaction)的抑制剂。
适合于本发明使用的还原糖类是本领域公知的那些，包括但不限 于，葡萄糖、麦芽糖、乳糖、果糖、半乳糖、甘露糖、麦芽酮糖和乳 果糖。非还原糖类包括但不限于，选自糖醇类和其它直链多羟基化合 物的多羟基化合物的非还原苷类。其它有用的糖类包括棉子糖、水苏 糖、松三糖、葡聚糖蔗糖、纤维二糖、甘露二糖和糖醇类。所述糖醇 苷类优选单糖苷类(monoglycosides)，具体而言是通过还原诸如乳糖、 麦芽糖、乳果糖和麦芽酮糖的二糖类而获得的化合物。
特别优选的糖类是海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、 益寿糖和吡喃葡萄糖基-1→6-甘露醇。
氨基酸可作为稳定剂并可单独使用和优选地与多羟基化合物联合 使用。虽然所有的氨基酸、或氨基酸的组合、肽、水解蛋白或诸如血 清白蛋白的蛋白可作为稳定剂，优选的氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、 精氨酸、赖氨酸和谷氨酰胺。
优选地，所述保存样品可含有能抑制本发明干燥固体或高粘性液 体中结晶形成的成分。盐类和包括氨基酸和酚红的其它分子抑制结晶 形成。
在本发明方法中使用的稳定剂的浓度可在1％-50％w/v，优选在 1-5％、5-10％、5-10％、15-20％、20-25％或25-50％，最优选小于25％ (w/v)。所需的稳定剂的数量与存在的盐类的数量成比例。因此，尽 管3％-10％的稳定剂水平是优选的，但是具有高盐含量的干燥样品可 能需要10％-25％(w/v)较高浓度的稳定剂水平。
容器
不同和混合物和各种容器外形及尺寸可同时进行加工。理想地， 所使用的容器尺寸是足够用于容纳最初混合物且能向其形成的干燥制 剂提供容量。一般来说，其由玻璃形材料的质量、所述容器的表面积 和决定了是否发生发泡的温度及压力条件所确定。玻璃形成材料的质 量应足以形成粘性浆状物，任选地发泡，事实上转变为每容器表面每 单位面积的最小质量。该比率随混合物和所使用的容器的不同而改 变，但其易于为本领域技术人员通过如下本文中所列出的方法可凭经 验确定。任何上述可使用的容器包括Wheaton结晶器和管截短的管形 瓶。
本发明的方法优选使用具有防水内表面的容器。通过在内表面上 被覆疏水组合物可达到该目的，例如通过硅化作用。可通过本领域技 术人员众所周知的方法完成硅化作用。在一种方法中，所述容器通过 用硅树脂乳液充满(rising)容器内部而得到硅化处理，接着通过烘箱 高温处理，通常在350℃。可选地，所述防水内表面可通过由防水组合 物制备的容器而实现。
所述容器的防水内表面可更适于发生发泡并具更多重现性。其容 许在保存样品中使用较低浓度的多羟基化合物，能依次减少干燥样品 所需的时间长度、减少麦拉德反应(Mailard rections)的影响或与损 害活性剂的多羟基化合物的其它相互作用。如果保存样品包含疫苗， 由于较低数量的多羟基化合物存在，所产生的发泡玻璃可快速及容易 地重配，以及所产生的疫苗溶液具较低的粘性，更便于施用。所述防 水内表面容许更容易地重配干燥固体或高粘性液体，因为其促使样品 保持在容器底部使得其更易于有效重配。
尽管单一类型可用于本文中，但是可以存在一种以上的稳定剂， 一种以上的添加剂和一种以上的物质。这些成分的有效量容易为本领 域技术人员所确定。
溶剂
通过在水中溶解/悬浮IPV和稳定剂以制备水溶液而获得所述保存 样品。优选地，水以5-98％体积水平存在于保存样品中，更优选80-98％ 体积，最优选85-98％体积。
溶剂的体积可改变，并取决于稳定剂和所要掺入的物质以及所有 的添加剂。所需的最小体积是必需用于溶解各种成分的数量。但是， 也可使用所述物质均匀分散的悬浮液。在特定实施方案中成分的合适 数量容易为本领域技术人员按照本文所提供的实施例所确定。
各种添加剂可放入所述保存样品中。一般来说，添加剂增强发泡 和/或干燥处理和/或有助于物质的溶解。可选地，添加剂有助于在固体 中掺入的物质的稳定性。可存在一种或多种添加剂。
作为一个例子，在泡沫玻璃中添加挥发性/发泡盐类容许更大初始 体积并产生更高的表面积，因此能达到较好的起泡和更快速地干燥。 在本文中使用的挥发性盐类是在用于产生泡沫玻璃的条件下挥发的盐 类。合适的挥发性盐类的例子包括但不限于，醋酸铵、碳酸氢铵和碳 酸铵。分解产生气体产物的盐类也能达到增强发泡和更快速干燥的目 的。上述盐类的例子是碳酸氢钠和偏亚硫酸氢钠。优选地，所述挥发 性盐类以约0.01-5M的数量存在。高达5M的浓度适合在本文中使用。 所产生的泡沫玻璃具有相同的泡沫构象，且与其中未使用挥发性/发泡 盐类的泡沫玻璃比较明显更干燥。
另一种合适的添加剂是泡沫稳定剂，其可与挥发性盐或分解盐结 合使用。其可以是诸如两亲性分子(即，例如磷脂和表面活性剂)的 表面活性成分或可增加发泡浆状物的粘性的试剂，例如诸如瓜尔胶的 及其衍生物增稠剂。
另外的添加物是麦拉德反应(Maillard reaction)的抑制剂。优选 地，如果所述物质和/或玻璃基质成形材料包含羰基和氨基、亚氨基或 胍基，所述组合物进一步包含至少一种生理学上可接受的麦拉德反应 (Maillard reaction)的抑制剂，以有效基本阻止在所述组合物中氨基 和活性羰基缩合的数量存在。所述的麦拉德反应(Maillard reaction) 的抑制剂可以是本领域任何公知的抑制剂。所述抑制剂以足够阻止或 基本上阻止氨基和活性羰基缩合的数量存在。一般来说，所述物质提 供了氨基以及玻璃基质成形材料提供了羰基，或相反。然而，在所述 物质或糖类中氨基和羰基可存在于所述物质和碳水化合物分子内。
已知多种类型的化合物显示对麦拉德反应(Maillard reaction)起 抑制作用，因此可用于本文所述的组合物中。这些化合物通常是麦拉 德反应(Maillard reaction)的竞争性或非竞争性抑制剂。竞争性抑制 剂包括但不限于，氨基酸残基(D和L)、氨基酸残基和肽的组合。特 别优选的是赖氨酸、精氨酸、组氨酸和色氨酸。赖氨酸和精氨酸是最 有效的。存在着许多已知的非竞争性抑制剂。这些包括但不限于，氨 基胍及其衍生物及两性霉素B。EP-A-0 433 679也描述了合适的麦拉德 (Maillard)抑制剂，其包括4-羟基-5，8-二氧喹啉衍生物。
活性剂
本发明的方法被用于保存灭活脊髓灰质炎病毒(IPV-优选地包含 在疫苗领域中作为标准的1、2和3型，更优选Salk脊髓灰质炎疫苗)。 IPV包含1型的20-80、优选40或8D-抗原单位(Mahoney)，2型的 4-20、优选8或16D-抗原单位(MEF-1)和3型的20-64、优选32或 64D-抗原单位(Saukett)。所述IPV疫苗制剂在水溶液中重配后适于 注射，其优选含有额外的疫苗成分。
掺入本发明方法中的细菌多糖是例如源自一种或多种脑膜炎奈瑟 氏球菌(Neisseria meningitidis)、b型流感嗜血菌(Haemophilus irafluenzae b)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、A组链球 菌、B组链球菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或表皮葡 萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的荚膜多糖，优选流感嗜血菌 (Haemophilus irafluenzae)的PRP荚膜多糖。优选的荚膜多糖也包 括源自一种或多种脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的血清 组A、C、W-135和Y的那些。另一种优选的荚膜多糖源自肺炎链球菌 (Streptococcus pneumoniae)。所述肺炎球菌荚膜多糖抗原优选选自 血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、 15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F(最优选自血清型 1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。另一个优选的实 施方案包含金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的5型、8或336 型荚膜多糖。另一种优选的多糖包括表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的I型、II型或III型荚膜多糖，B组链球菌的Ia型、Ic 型、II型或III型荚膜多糖。另一种优选的多糖包括A组链球菌的荚膜 多糖，优选进一步包含至少一种M蛋白和更优选包含多种类型的M蛋 白。
使用本发明方法可保存的优选的活性剂组合包含IPV。优选地， IPV与细菌多糖结合，所述细菌多糖包含一种或多种Hib PRP多糖和/ 或脑膜炎球菌A、C、W和/或Y多糖和/或肺炎链球菌多糖。优选的组 合包括IPV和Hib；IPV和MenC；IPV和MenA及C；IPV和Hib及 MenC或IPV、Hib、MenA和C。每种细菌多糖可以1-5μg、5-10μg、 10-20μg或20-40μg的剂量存在。
细菌多糖是未结合的或结合于诸如破伤风类毒素、破伤风类毒素 片段C、白喉毒素、CRM197、肺炎球菌溶血素或蛋白(US6342224的 载体蛋白。
所述多糖结合物可通过本领域任何公知的偶联技术制备。优选的 结合方法依赖于多糖与四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(CDAP) 的活化作用以形成氰酸酯。活化的多糖可直接或通过间隔基与载体蛋 白上的氨基偶联。优选地，使用涉及形成硫醚键的异种连接化学反应， 将氰酸酯与己二胺偶联以及将氨基衍生的多糖与载体蛋白结合。上述 结合物描述于Uniformed Services University的PCT公开申请 WO93/15760中。
所述结合物可任选地通过直接还原性胺化方法制备，所述方法描 述于US 4365170(Jennings)和US 4673574(Anderson)中。其它方 法描述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中。
另一种方法涉及将己二酸酰肼(ADH)衍生的溴化氰活化的多糖 通过碳二亚胺缩合与蛋白载体偶联(Chu C.等Infect.Immunity，1983 245 256)。
干燥处理
在一个实施方案中，本发明的方法涉及在稳定剂存在下干燥IPV， 优选在细菌多糖存在下。在该方法中，保存样品经受降低的温度和压 力条件。所述温度降低至小于20℃或0℃，优选小于-10℃或-20℃，更 优选-40℃或-60℃。所述压力降低至小于1毫巴，或优选地小于0.5、 0.1毫巴的压力为，更优选0.05或0.01毫巴。所述降低的温度和压力 条件维持至少10、12、16、20小时，优选24、36小时，更优选48或 72小时。除去溶剂直至所述保存样品干燥形成固体。
在本申请全文中，固体包括形成为干燥样品的玻璃、橡胶和晶体。 上述固体优选保留10-20％或5-10％的水含量，优选5-6％、4-5％或3- 4％或2-3％的水含量，更优选1-2％或0-1％(w/w)的水含量。
发泡干燥
本发明一种优选的方法涉及使保存样品经受这样的压力和温度条 件，以便所述样品开始起泡，形成泡沫。
由于蒸发过程的吸热性，所述保存样品内部的温度可不同于该样 品外部的温度。参比温度是保存样品外部环境的温度，例如，在使用 大的工业冷冻干燥器的地方，为搁板的温度。其通常相应于冷冻干燥 器温度设定值。
本发明一个优选的实施方案通过降低压力同时维持温度条件以获 得起泡。所述压力调节为或低于8、7、6，预选5、4、3，更优选2、 1.5、1，最优选0.8或0.5毫巴，同时维持温度设定值于高于0℃的温度， 优选在10℃-15℃；15℃-20℃；20℃-25℃；25℃-30℃或30℃-37℃。维 持这些条件至少1、2、3、4、5、8、10、12、16或24小时。
本发明的另一个实施方案通过改变温度同时维持压力条件以获得 起泡。所述温度设定值增加到20℃以上，优选在20℃-30℃；30℃-40 ℃；40℃-50℃或50℃-70℃；或所述温度设定值在10-50℃范围内，优 选在20-40℃，更优选在25-35℃。压力条件维持在减压水平或低于8、 7、6，优选5、4、3，更优选2、1.5、1，最优选0.8或0.5毫巴。维持 这些条件至少1、2、3、4、5、8、10、12、16或24小时。
除去溶剂形成泡沫玻璃
本发明随后阶段的发泡干燥方法涉及除去溶剂直至所述泡沫干燥 形成固体。在本发明的一个实施方案中，通过维持压力和温度条件于 为了获得发泡所应用的那些条件以达到该目的。例如，所述压力维持 于或低于8、7、6，优选5、4、3，更优选2、1.5、1，最优选0.8或0.5 毫巴，同时维持温度设定值高于0℃，优选在2℃-10℃，10℃-20℃； 20℃-30℃；30℃-35℃，35℃-40℃，最优选在5℃-25℃。维持这些温度 和压力条件1、2、3、4、5、6、8、10、12、18小时或更多，以便获得 具有溶剂含量小于或等于10、8、5、4，优选3、2或最优选1％(w/w) 的固体。
本发明另一个实施方案在溶剂除去过程中将温度设定值增加到较 在该方法中较早所维持的温度值更高的温度设定值。其有利之处在于 容许溶剂以较快速率离开样品，以便本发明的方法可在较短时间内完 成。举例来说，所述温度设定值增加到0℃以上，优选在2℃-10℃；10 ℃-20℃；20℃-30℃；30℃-40℃；40℃-50℃；50℃-60℃，同时维持压 力于或低于8、7、6，优选5、4、3，更优选2、1.5、1，最优选0.8或 0.5毫巴。维持这些温度和压力条件1、2、3、4、5、6、8、10、12、 18小时或更久，以便获得具有小于10、8、5、4，优选3、2或最优选 1％(w/w)水含量的固体。
本发明的另一个实施方案在溶剂除去过程中将压力设定值降低到 较在发泡过程中所使用的压力设定值更低的压力设定值。其有利之处 在于容许溶剂以较快速率离开样品，以便本发明的方法可在较短时间 内完成。举例来说，所述压力设定值减少到或低于5、4、3，优选2、 1、0.8，更优选0.5、0.1，最优选0.05或0.01毫巴，同时维持温度于或 高于0℃，优选在10℃-20℃；20℃-30℃；30℃-35℃或高于40℃。维 持这些温度和压力条件1、2、3、4、5、6、8、10、12、18小时或更久， 以便获得具有溶剂含量小于或等于5、4，优选3或2或更优选1％(w/w) 的固体。
包括冷冻步骤的发泡干燥
本发明的方法任选地包括冷冻所述样品。在发泡干燥前冷冻样品 有利于增加同一批次样品之间的重复性。这是由于所有样品从相同的 冷冻物理状态开始所述处理。保存样品可以全部或部分冷冻。
冷冻任选在通过将所述保存样品于低于0℃温度，放置以容许所述 样品冷冻的合适的一段时间，使所述样品减压前进行。优选所使用的 温度为或低于-10℃、-15℃、-20℃、-30℃、-40℃、-70℃或-140℃。样 品可在低于0℃温度持续1、2、3、4、5、8、16或更多小时以容许冷 冻发生的条件下取出。
对于某些样品而言，具体而言，样品是易于为溶剂结晶所损害的， 例如细胞制备物或其它生物学系统，优选以小于或等于0.1、0.5、1、2、 3、4、5℃每小时的速率缓慢地冷冻所述样品。其它组合物通过瞬时冷 冻可更有效地保存，例如通过在液氮中快速冷冻。该方法特别有益于 蛋白质或病毒颗粒。通过蒸发作用冷冻也导致样品的快速冷冻。
可选地，所述保存样品通过将样品减压使得所述样品发生全部或 部分冷冻而被冷冻。在大容量冷冻干燥器设备中，在搁板温度为或高 于0℃、10℃、15℃、20℃、30℃、37℃下进行上述骤冷冻。优选地， 所述搁板温度在5-35℃，更优选在10-20℃，最优选在15℃。所述压力 任选地从最初减少到200毫巴，持续5、10、20、30、60分钟或更久， 可容许抽气。为了冷冻样品，所述压力进一步减少到等于或低于2、1、 0.5、0.2、0.1毫巴的压力。维持该压力至少5、10、20或30分钟直至 样品全部或部分冷冻。
随后发泡和除去溶剂形成固体的步骤描述如上。
在本发明一个优选的实施方案中，在干燥器中样品冷冻以及起泡 的步骤在恒温下进行，优选改变压力条件。
在另一个优选的实施方案中，在干燥器中样品冷冻、发泡和除去 溶剂形成固体的步骤在恒温下进行，优选改变压力条件。
在本发明另一个实施方案中，在冷冻样品、发泡和除去溶剂形成 固体的过程中，压力和温度条件都不相同。
本发明的方法优选使用具有防水内表面的容器。通过在内表面上 被覆疏水组合物可达到该目的，例如通过硅化作用。可通过本领域技 术人员众所周知的方法完成硅化作用。可选地，所述防水内表面可通 过由防水组合物制备的容器而实现。
存在容器的防水内表面可更适于发生发泡并具更多重现性。其容 许在保存样品中使用较低浓度的多羟基化合物，能依次减少干燥样品 所需的时间长度、减少麦拉德反应(Mailard rections)的影响或与损 害活性剂的多羟基化合物的其它相互作用。如果保存样品包含疫苗， 由于较低数量的多羟基化合物存在，所产生的发泡玻璃可快速及容易 地重配，以及所产生的疫苗溶液具较低的粘性，更便于施用。
无需冷冻或发泡的干燥
本发明一种特别优选的方法包括在稳定剂，和优选细菌多糖存在 下干燥IPV，其使用了温和的方法以避免IPV暴露于冷冻或发泡过程 中，使得IPV在干燥过程中经受更低的压力且保留高水平的抗原性。
该方法特别适用于在较低浓度玻璃形多羟基化合物条件下，例如 在低于10％(w/v)的浓度条件，更优选低于5％(w/v)，其是有利的 且优选更短的干燥时间。
通过蒸发作用丧失溶剂(蒸发干燥-步骤b)
无需冷冻或发泡的干燥方法包括将样品经受这样的压力和温度条 件，以便所述保存样品通过蒸发作用丧失溶剂，无需样品冷冻或起泡 形成泡沫。
由于蒸发过程的吸热性，所述保存样品内部的温度有时可以不同 于样品外部的温度。所提及的温度是保存样品外部环境的温度，例如， 在使用大的工业冷冻干燥器情况下，为搁板的温度。其通常相应于冷 冻干燥器温度设定值。
任选地，所述保存样品抽气的预备步骤存在于本发明的方法中。 所述压力减少到或低于200毫巴，优选在200-35毫巴，在进一步减压 前持续至少5分钟。
本发明一个优选的实施方案通过减压同时控制温度条件实现蒸发 干燥。所述压力调节为或低于30、25、20，优选15、12，最优选10、 8、7、6、5、4、3、2或1毫巴，同时维持温度设定值在高于0℃的温 度，优选在4℃-37℃、4℃-10℃、10℃-15℃；15℃-20℃；20℃-25℃； 25℃-30℃；或30℃-37℃；或37℃-45℃。维持这些条件至少1、2、3、 4、5、8、10、12、16或24小时，优选持续2-4小时、4-6小时、6-8 小时、8-12小时或12-18小时。在一个特别优选的实施方案中，所述压 力维持高于2毫巴，于此温度设定值为15℃以防止样品的冷冻。在一 个优选的实施方案中，温度维持于15℃，以及压力设定在5-10毫巴， 更优选6-9毫巴，最优选约8毫巴。在使用更高温度设定值情况下，可 能较低的压力可避免样品冷冻，在使用较低温度设定值情况下，压力 应维持在更高水平以避免冷冻。优选地，维持所述条件足够时间以便 蒸发速率能减慢，使得样品的温度与样品外部的温度近似相同。
优选地，保存样品不应冷冻或沸腾形成泡沫，可丧失溶剂形成粘 性液体或高粘性液体。
除去溶剂形成高粘性液体
本发明下一阶段方法包括除去溶剂直至所述保存样品干燥形成高 粘性液体，无需发泡和优选地无需冷冻。
在本发明的一个实施方案中，通过维持压力和温度条件于应用于 最初蒸发干燥阶段的那些条件以达到目的。举例来说，压力维持于或 低于30、25、20，优选15、12，更优选10、8、7、6、5、4、3、2或 1毫巴，同时维持温度设定值高于0℃，优选在5℃-37℃、5℃-10℃、 10℃-15℃；15℃-20℃；20℃-25℃；25℃-30℃；或30℃-37℃。对于15 ℃的温度设定值而言，压力为5-10毫巴，优选6-9毫巴，最优选约8 毫巴，维持4-24小时，优选1-4、4-8、8-12或12-16小时。维持这些 温度和压力条件1、2、3、4、5、6、8、10、12、18小时或更久以便获 得具有小于或等于15、12，优选10、8、5、4、3、2或1％(w/w)溶 剂含量的高粘性液体。
本发明的另一个实施方案在溶剂除去过程中，较在该方法初期所 维持的温度，将温度设定值增加到更高的温度设定值。其容许溶剂离 开以较快速率离开样品，使得本发明的方法可在更短时间内完成。例 如，将温度设定值增加到高于0℃，更优选高于20℃，优选在5℃-37 ℃、5℃-10℃、10℃-20℃；20℃-30℃；更优选在30℃-40℃；更优选在 40℃-50℃；最优选在50℃-60℃，同时维持压力于或低于30、25、20， 优选15、12，最优选10、8、7、6、5、4、3、2或1毫巴。维持这些 温度和压力条件1、2、3、4、5、6、8、10、12、18小时或更久，以便 获得具有小于或等于15、12，优选10、8、5、4、3、2或1％的固体。 为了方法成功完成，该实施方案需要使用在所述温度下热稳定的活性 剂。
本发明一个优选的实施方案在溶剂除去(步骤c)过程中，较在该 方法(步骤b)初期所使用的压力，将压力设定值减少到较低的压力设 定值。其容许溶剂以较快速率离开样品，使得本发明的方法可在更短 时间内完成。也能使更高比例的溶剂丧失。举例来说，将压力设定值 设定在或低于7、6，优选5、4、3，更优选2、1.5、1，最优选0.8、0.5、 0.2、0.1、0.05、0.02、0.01或0.005毫巴，同时维持温度于或高于0℃， 优选在10℃-20℃；20℃-30℃；30℃-35℃或高于40℃。维持这些温度 和压力条件1、2、3、4、5、6、8、10、12或18小时或更久，以便获 得具有小于或等于15、12，优选10、8、5、4、3、2或1％(w/w)溶 剂含量的固体，优选通过Karl Fischer电量湿度分析仪测定(Eur.J. Pharm.Biopharm.(2000)50；277-284)。
优选地，步骤b)和c)应当在等于或小于18小时，更优选16、 14、12，最优选10、8、6或4小时的时间内完成。
干燥组合物是来自溶剂业已通过蒸发、沸腾或升华除去的组合 物，留下的溶剂含量小于或等于15、12、10，更优选8、5、4、3、2 或1％(w/w)，优选通过Karl Fischer方法测定。溶剂含量的优选范 围是1-3％、3-5％、5-10％或10-15％(w/w)。所述术语包括高粘性液 体及干燥的泡沫玻璃和冷冻干燥的固体。
高粘性液体定义为来自溶剂业已通过蒸发除去而无需沸腾的物 质，所留下的溶剂含量小于或等于15、12、10，优选8、5、4、3、2 或1％(w/w)，优选通过Karl Fischer方法测定。溶剂含量的优选范 围是1-3％、3-5％、5-10％或10-15％(w/w)。所述高粘性液体具有足 够低的溶剂含量，使得活性剂在4℃下以稳定态保存至少3、6、9、12 或24个月，在这段时间后，容许活性剂保留至少40、50、60，优选70、 80、90、95％的其抗原性和/或免疫原性。优选地，所述高粘性液体具 有除了玻璃之外的固体外观，在2、4或6天后，更优选在1、2、3、4、 6、7、10或12个月后，能非常缓慢地流动。所述非常缓慢地流动可通 过倒置含有该高粘性液体的容器并置于室温下直至观察到高粘性液体 流动而得到测定。在一个优选的实施方案中，所述高粘性液体在2、4 或6天后，优选在2、3或4星期后，更优选在2、4、6、8、10或12 个月后在倒置位置似乎并不流动。
粘性液体定义为溶剂除去的初始相产物，在该初始相末端大多数 溶剂业已从样品中丧失。可识别该点，因为当体积蒸发的吸热影响失 去时，蒸发速率降低使得样品温度回到环境温度。
泡沫玻璃是含有玻璃成形多羟基化合物的干燥组合物，其通过其 中将保存样品经受下述的温度和压力条件的方法而形成，所述条件即 样品剧烈地起泡或沸腾使得当样品干燥时形成泡沫。
在本专利说明书中引用的所有参考文献或专利申请在本文中并入 作为参考文献。
实施例
如下我们所采纳的实施例使用了标准的技术，除非另有详细描 述，为本领域技术人员众所周知且为常规技术。实施例是例证性的， 但并不限制本发明。
实施例1.蒸发冷冻处理
所进行的处理使用了Heto Drywinner 8-85冷冻干燥器，其中搁板 温度可在1℃范围内调节，冷凝器的终点温度是-85℃，压力用放气阀 调节，6个热电偶可用于测量产物温度。
通过向水溶液中添加稳定剂(10％海藻糖或3.5％蔗糖)和活性剂 制备保存样品。将样品置于冷冻干燥器中，搁板温度在全过程中维持 在15℃的固定温度设定值。压力最初减少到200毫巴，并在进一步减 压前在该水平上维持10分钟。在1.5毫巴处，由于蒸发冷却溶液开始 冷冻，如图1所示。压力进一步减少到0.1毫巴以容许样品变成完全冷 冻。接着将压力增加到0.8毫巴-3.5毫巴，在该处泡沫形成，水分从样 品中丧失。在该实验条件下，在仅含有水的参比样品中没有看到沸腾。 样品可通过蒸发丧失水分而不通过沸腾。在这些条件下18小时后，样 品被干燥且发泡溶液变成泡沫玻璃。
将搁板温度保持在高达37℃的其它温度设定值，成功进行了类似 的处理。
实施例2.冷冻条件的确定
通过在水中溶解蔗糖给出1％、5％、10％和20％溶液来制备样品。 将样品置于冷冻干燥器中，搁板温度在全过程中维持在15℃。压力最 初减少到200毫巴，并在进一步减压至50毫巴、5毫巴、2.5毫巴、0.75 毫巴、0.4毫巴和0.2毫巴之前在该水平上维持10分钟。在每个压力水 平上维持20分钟以容许温度达到平衡，使用热电偶读出样品的温度。 热电偶附着在具有不同蔗糖浓度的样品上，记录于表1中的温度是温 度的平均值。
结果
所有样品在1.66-1.1毫巴之间冷冻，与存在的蔗糖浓度无关。在不 同压力下测量的温度十分接近从三相点曲线所预测的那些。因此对于 不同压力下的样品温度，蔗糖的存在似乎并不具有大的影响。
在本发明一种优选方法中，必需要避免样品的冷冻。可通过维持 压力高于2毫巴，使用15℃的搁板温度来实现。在较低温度下，压力 应当维持在更高水平，反之使用更高温度时，应容许压力进一步减少， 避免样品冷冻。
表1 压力 测量温度 理论温度 液体/冷冻 1000毫巴 15℃ 液体 50毫巴 15℃ 液体 5毫巴 1℃ 1℃ 液体 2.5毫巴 -5℃ -7℃ 液体 0.75毫巴 -21℃ -21℃ 冷冻 0.4毫巴 -22℃ -27℃ 冷冻 0.2毫巴 -27℃ -32℃ 冷冻
实施例3.具有不同糖浓度的样品的发泡条件
制备含有0％、5％、10％、15％、20％、25％和50％蔗糖的保存 样品。将样品置于冷冻干燥器中，搁板温度在全过程中维持在15℃。 压力最初减少到200毫巴，并在进一步减压前在该水平上维持10分 钟。将压力进一步减少到0.1毫巴以容许样品变成完全冷冻。接着在随 后的实验中将压力增加到0.788毫巴、0.812毫巴或3.5毫巴。维持这些 条件，对于3.5毫巴和0.812毫巴的实验维持3小时，对于0.788毫巴 的实验维持6小时。评估每种样品的物理特性。
结果
如表2所示，在3.5毫巴压力下，对于可靠的发泡而言，需要50％ 的高蔗糖浓度。与之相反，在10-25％的较低蔗糖浓度下，0.8毫巴的 较低压力容许可靠的发泡。使用较低蔗糖浓度可利于例如要用于疫苗 的保存的样品。因此使用0.8毫巴和10-25％蔗糖含量的方法是优选的。
表2 压力 ％蔗糖 物理特性 3.5毫巴 20 4/5发泡，1/5粘性液体 3.5毫巴 25 2/5发泡，3/5粘性液体 3.5毫巴 50 5/5发泡 0.812毫巴 5 环状物结晶体和泡沫 0.812毫巴 10 所有都发泡 0.812毫巴 15 所有都发泡 0.812毫巴 20 所有都发泡 0.812毫巴 25 所有都发泡 0.788毫巴 5 环状物结晶体和泡沫 0.788毫巴 20 所有都发泡 0.788毫巴 25 所有都发泡 0.788毫巴 50 泡沫和浆状物
实施例4.使用硅化容器的影响
制备含有5％、10％、15％和25％蔗糖的保存样品，并装入管形瓶 中，某些管形瓶被硅化。在一次实验中，将样品置于冷冻干燥器中， 搁板温度在全过程中维持在15℃。压力最初减少到200毫巴，并在进 一步减压前在该水平上维持10分钟。将压力进一步减少到2.8毫巴， 持续3小时。在这段时间内，当所存在的水蒸气减少时，压力减少到 2.00毫巴。评估每种样品的物理特性。
在第二次实验中，将样品置于冷冻干燥器中，搁板温度在全过程 中维持在37℃。压力最初减少到200毫巴，并在进一步减压前在该水 平上维持10分钟。将压力进一步减少到2.4毫巴，持续3小时。在这 段时间内，当所存在的水蒸气减少时，压力减少到1.06毫巴。评估每 种样品的物理特性。
结果
硅化对样品的抽气有影响。在硅化的管形瓶中对样品抽气导致压 力减少到200毫巴，而在未硅化的管形瓶中则无该结果。通过样品的 起泡观察到抽气。
管形瓶的硅化也使发泡更可能产生，并具更多的重现性(表3)。 管形瓶的硅化容许在较低的多羟基化合物浓度下发泡重复出现。较低 的多羟基化合物浓度减少了干燥样品所需时间的长度，并减少了麦拉 德反应(Mailard rections)的影响或与损害活性剂的多羟基化合物的 其它相互作用。在所涉及的样品是疫苗情况下，其减少了样品的粘性 并更便于施用。
表3 温度和压力 ％蔗糖 特性 未硅化的管形瓶 特性 硅化的管形瓶 15℃，2.8毫巴 5％ 粘性液体 15℃，2.8毫巴 10％ 粘性液体 发泡 15℃，2.8毫巴 15％ 粘性液体 15℃，2.8毫巴 25％ 粘性液体 37℃，2.4毫巴 5％ 3粘性液体 2发泡 37℃，2.4毫巴 10％ 所有为粘性液体 5发泡 1粘性液体 37℃，2.4毫巴 15％ 所有都发泡 37℃，2.4毫巴 25％ 所有都发泡
实施例5.通过常规冷冻干燥或通过发泡干燥比较Hib-IPV的保存
要被保存的活性剂是b型流感嗜血菌(Hib)的PRP多糖和灭活 的脊髓灰质炎病毒(IPV)的三种毒株的混合物。通过将Hib-IPV在 3.15％蔗糖溶液或10％海藻糖溶液中溶解制备保存样品。
通过使用常规的冷冻干燥方法，样品需要在大的冷冻干燥器中冻 干3天，或通过使用实施例1所描述的发泡干燥方法来冻干样品。
样品在水中重配，使用ELISA来评估三种脊髓灰质炎病毒株抗原 性的保持率。三种多克隆抗体和三种单克隆抗体，每种抗一种毒株， 用于不同的ELISAs中。结果以未经受冷冻干燥或发泡干燥程序的样品 给定读数的百分数来表示。
通过用重配的IPV-Hib对10只一组的小鼠接种，从小鼠中抽血并 监测抗IPV和Hib多糖的抗体水平，例如通过ELISA或蛋白质印迹的 方法，来评估保存样品在体内的它们的免疫原性。在激发免疫反应的 小鼠模型中评估保护的程度。
结果
使用蔗糖或海藻糖作为多羟基化合物，与使用常规冷冻干燥比 较，使用发泡干燥技术IPV的抗原性维持得更好。
表4 干燥方法 多羟基化合物含量 ELISA-1/2/3型％ 多克隆 单克隆 冷冻干燥 3.15％蔗糖 46/49/58* 25/0/0 发泡干燥 3.15％蔗糖 85/97/106 55/68/57 冷冻干燥 10％海藻糖 47/43/58 发泡干燥 10％海藻糖 93/86/84 72/75/87
*在3.15％蔗糖存在下重复5次冷冻干燥实验，显示的结果来自一 次具有代表性的实验。
实施例6.在存在Hib多糖下冷冻干燥IPV的保护效果
制备含有3.15％蔗糖和IPV或IPV和Hib多糖混合物的保存样 品。将样品置于Heto Drywinner 8-85冷冻干燥器中，在-32℃温度设定 值下冷冻干燥40小时，接着在4℃下持续干燥16小时。
样品在水中重配，使用ELISA来评估三种脊髓灰质炎病毒株抗原 性的保持率。三种单克隆抗体，每种抗一种毒株，用于不同的ELISAs 中，与未被冷冻的参比样品比较以评估在重配、冷冻干燥样品中抗原 保持率水平。结果以未经受冷冻干燥或发泡干燥程序的样品给定读数 的百分数来表示。
结果
如表5所示，在冷冻干燥后，较当IPV单独冷冻干燥时所达到的 效果而言，含有IPV的保存样品中Hib的存在可导致IPV抗原的更高 保持率。除了具有作为稳定剂存在的蔗糖所达到的效果外，Hib多糖对 IPV抗原性的保留起作用。
表5 组合物冷冻干燥 多羟基化合物含量 ELISA-1/2/3型％ IPV 3.15％蔗糖 26/25/0 IPV-Hib 3.15％蔗糖 52/68/0
实施例7.不同稳定剂对IPV-Hib冷冻干燥的影响
制备含有IPV-Hib的保存样品，并使用3.15％蔗糖；2.5％山梨糖 醇、0.8％谷氨酰胺和0.01％HSA；MMR稳定剂和乳糖；3％甘氨酸、 2％精氨酸和4％蔗糖；或4％蔗糖和2％甘氨酸作为稳定剂。包括具有 3.15％蔗糖作为稳定剂的样品的实验使用两倍浓度的IPV-Hib。在分批 冷冻干燥器中使用常规的3天冷冻干燥周期对样品进行冷冻干燥。
将样品在水中重配，使用ELISA来评估三种脊髓灰质炎病毒株抗 原性的保持率。三种多克隆抗体和三种单克隆抗体，每种抗各自毒株， 用于不同的ELISAs中。结果以未经受冷冻干燥或发泡干燥程序的样品 给定读数的百分数来表示。
通过用重配的IPV-Hib对10只一组的小鼠接种，从小鼠中抽血并 监测抗IPV和Hib多糖的抗体水平，例如通过ELISA或蛋白质印迹的 方法，来评估保存样品在体内的免疫原性。在激发免疫反应的小鼠模 型中评估保护的程度。
结果
IPV剂量从40/8/32DU/剂增加到80/16/64DU/剂导致IPV抗原性 保持率的增加，如表6所示。稳定剂的变化也影响抗原的保持率，4％ 蔗糖/2％甘氨酸和2.5％山梨糖醇/0.8％谷氨酰胺/0.01％HAS产生了更 高的抗原保持率，如ELISA数据所示。
表6 稳定剂 多克隆ELISA结果 单克隆ELISA结果 3.15％蔗糖 50/50/70 25/0/0 2.5％山梨糖醇 0.8％谷氨酰胺 0.01％HSA 55/72/72 33/50/0 MMR稳定剂 乳糖 59/62/65 28/25/0 3.15％蔗糖 两倍剂量的IPV-Hib 84/92/120 102/138/0 3％甘氨酸 2％精氨酸 4％蔗糖 4％蔗糖 2％甘氨酸 46/62/78 25/50/15
实施例8.在冷冻干燥、发泡干燥或含冷冻步骤的发泡干燥后样品 特性的重复性。
配制保存样品，其包含IPV、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、 水痘-带状疱疹病毒、CMV、肝炎病毒、HSV1、HSV2、呼吸道合胞病 毒、登革热病毒、诸如副流感病毒、披膜病毒和流感病毒的副粘病毒， 和/或Hib作为活性剂。将活性剂在含有多羟基化合物的水溶液中溶 解。通过冷冻干燥、遵循描述于实施例1的规程使用冷冻步骤的发泡 干燥、或使用描述于实施例4的规程的没有冷冻步骤的发泡干燥保存 多种样品。样品在水溶液种重配并评估其活性。使用如实施例5所描 述的ELISA测定法完成活性评估，该测定法使用特异于天然抗原的抗 体。就活病毒而言，每种样品的滴度通过使用病毒来感染合适的宿主 细胞并通过空斑形成或通过免疫细胞化学来评估感染性而得到确定。 在免疫原性组合物或疫苗发泡干燥情况下，在动物模型中通过用发泡 干燥或冷冻干燥的疫苗免疫几组动物，并在第一次免疫后例如在第14 天和28天增强免疫应答，可测试免疫原性的保持率。在免疫接种程序 表结尾时从动物中分离血清，并使用标准测定法测试其抗疫苗的滴 度，例如通过ELISA、免疫细胞化学、蛋白质印迹、免疫沉淀反应、 血清杀菌测定或凝集反应测定。结果遵照如下：首先通过在冷冻干燥、 使用冷冻步骤的发泡干燥或不用冷冻步骤的发泡干燥之后比较活性剂 活性。其次，通过比较样品在经受三种保存方法的每一种之后的活性 范围来评估保存技术的重复性程度。
实施例9.通过冷冻干燥和发泡干燥保存的活性剂的长期贮藏
配制保存样品，其包含IPV、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、 水痘-带状疱疹病毒、CMV、肝炎病毒、HSV1、HSV2、呼吸道合胞病 毒、登革热病毒、诸如副流感病毒、披膜病毒和流感病毒的副粘病毒， 和/或Hib作为活性剂。将活性剂在含有多羟基化合物的水溶液中溶 解。通过冷冻干燥、遵循描述于实施例1的规程使用冷冻步骤的发泡 干燥、或使用描述于实施例4的规程的没有冷冻步骤的发泡干燥保存 多种样品。样品在37℃或23℃下贮藏7天得到老化，并与业已保持在 4℃下的样品比较活性。在水溶液中重配样品并评估其活性。使用如实 施例5所描述的ELISA测定法完成活性评估，该测定法使用特异于天 然抗原的抗体。就活病毒而言，每种样品的滴度通过使用病毒来感染 合适的宿主细胞并通过空斑形成或通过免疫细胞化学来评估感染性而 得到确定。结果遵照如下：首先通过在贮藏于提高的温度及贮藏于4 ℃之后比较活性剂活性。其次，通过比较样品在经受每组条件之后的 活性范围来评估保存技术的重复性程度。
实施例10.无需冷冻或发泡的干燥方法
制备含有5％、10％、15％和25％蔗糖的保存样品，并装入管形瓶 中。将样品置于冷冻干燥器中，在全过程中温度设定于15℃。压力最 初减少到200毫巴，并在该水平上维持10分钟以容许在进一步减压前 抽气。压力进一步减少到8毫巴，持续2-3小时，在该时间段内由于蒸 发冷却，插入样品的热电偶显示样品温度降低到4℃。在2-3小时后， 样品温度回到15℃，表明在这些温度和压力条件下蒸发接近完成。在 该工序阶段，样品并不沸腾形成泡沫或冷冻，使得样品内的活性剂暴 露于尽可能小的压力中。样品具有固体外观，类似于终产物。
通过进一步减少压力到0.1毫巴，同时保持搁板温度设定值于15 ℃以实现对样品的进一步干燥。维持这些条件长达10-16小时。在该阶 段中，样品温度保持于15℃，因为蒸发速率减慢了。进行进一步干燥， 所生成的样品具有固体外观。如果将样品置于搁板边上，样品含量降 低十分缓慢，在几天或几个月后才显示该样品是高粘性的液体玻璃。 图2显示了容有高粘性液体的容器可被倒置而并不引起高粘性液体的 立即流动。
实施例11.在无需冷冻或发泡的干燥后IPV免疫原性的保持率
根据实施例10的方法干燥样品，其业已无需经受与发泡或冷冻所 伴随的起泡相关的压力。当用于干燥IPV时，进行实验以确定是否该 方法产生高水平的抗原保持率。
进行三次独立的实验，其中IPV重悬浮在含有10％蔗糖或10％海 藻糖作为稳定剂的水溶液中。将样品置于硅化的管形瓶中，将管形瓶 放置于Heto Drywinner 8-85冷冻干燥器中，将温度设定于15℃。压力 最初减少到35毫巴以对样品脱气。在10分钟后，压力进一步减少到8 毫巴，并在该水平上保持2小时。在这段时间中，温度设定值保持在 15℃，并检测样品内的温度。当水分从样品中蒸发时，除了最后两小 时外温度降到4℃，当蒸发速率减慢时温度回到15℃。在这些条件下 没有出现起泡或发泡。接着将压力进一步减少到0.1毫巴，在头两次实 验中维持这些条件超过16小时，在第三次实验中超过10小时。
样品在水中重配，使用ELISA来评估三种脊髓灰质炎病毒株抗原 性的保持率。在ELISA中使用抗3型IPV的单克隆抗体，与未被冷冻 的参比样品比较，以评估重配的、冷冻干燥的样品中抗原保持率水平。 结果以未经受冷冻干燥或发泡干燥程序的样品给定读数的百分数来表 示。
结果
干燥样品具有固体外观，但是它们似乎以高粘性液体/玻璃的形式 存在，因为在几天后，如果于室温倒置容器，则干燥固体能流动。
表7通过使用单克隆抗体的ELISA测定的3型IPV抗原保持率(无需发泡或冷冻的干燥)
制剂 第一次实验 (18小时周期) 第二次实验 (18小时周期) 第三次实验 (12小时周期) 10％蔗糖 75％ 78％ 91％ 10％海藻糖 82％ 79％ 93％
这些水平的3型IPV抗原保持率与如下显示的十分低的数值的冷 冻干燥结果相比是十分有利的，当使用抗3型的单克隆抗体时，所述 十分低的数值通常得自相同的ELISA实验。
表8：通过使用单克隆和多克隆抗体的ELISA测定1、2和3型IPV抗原的保持率(冷冻干燥) 干燥方法 多羟基化合物含量 ELISA-1/2/3型％ 多克隆 单克隆 冷冻干燥 3.15％蔗糖 46/49/58* 19/25/0 冷冻干燥 10％海藻糖 47/43/58 25/0/0
*在3.15％蔗糖存在下重复5次冷冻干燥实验，显示的结果来自一 次具有代表性的实验。
实施例12.以高粘性液体/玻璃贮藏的干燥的IPV的长期贮藏稳定 性
使用实施例11中描述的方法干燥的IPV于4℃贮藏9个月。在水 中用150mM NaCl重配样品，用ELISA来评估三种脊髓灰质炎病毒株 抗原性的保持率。三种单克隆抗体，每种抗各自的毒株，用于不同的 ELISAs中来评估重配的贮藏样品中抗原保持率水平。对来自贮藏前相 同批次的重配样品业已进行类似的ELISA。所有结果与没被干燥的参 比样品比较。结果以未经受干燥程序的样品给定读数的百分数来表 示。
结果
表9.在以高粘性液体贮藏9个月后IPV抗原的保持率 处理 1型ELISA 2型ELISA 3型ELISA 干燥的/重配的 未贮藏 72％ 75％ 88％ 干燥的/重配的 4℃，9个月 70％ 94％ 90％
因此通过描述于实施例11的方法业已干燥的IPV可于4℃贮藏至 少9个月，而不损失抗原性。
实施例13.相比于未干燥的IPV，在干燥形成高粘性液体和重配 后的IPV体内免疫原性的比较
用不同稀释度的IPV接种10只一组的Wistar大鼠，使用了实施 例10公开的方法，所述IPV在10％蔗糖存在下业已干燥形成高粘性液 体，并得到重配。另外的10只一组的Wistar大鼠用IPV参比样品接 种，所述参比样品以相同方法制备，但没有被干燥。
21天后，从所有的大鼠中收集血清，在使用1型、2型和3型脊髓 灰质炎病毒的不同的免疫沉淀测定中测试上述血清。
结果示于表10中，包含：-a)对于每种IPV稀释度应答大鼠的数 量，b)ED50，其是确保50％的大鼠血清转化所必需的剂量，通过免 疫沉淀测定法评估和c)与未干燥的参比IPV相比，干燥的和重配的 IPV的相对功效。
表10.与未干燥的参比IPV(JLE097)相比，在干燥形成高粘性液体(JLE017/05)和重配后IPV的免疫原性
样品 数量 应答 ED50 RP相对 未稀释 1/1.25 1/3.125 1/7.81 功效 JLEO17 /05 1型 10 9 6 5 6.37 0.956 2型 6 4 3 3 7.14 0.825 3型 6 8 2 1 18.18 1.051 JLE097 1型 10 10 10 7 3.33 1.120 2型 8 6 5 2 3.12 0.951 3型 7 6 4 1 16.91 1.172 参比 1型 10 8 4 6.37 2型 7 5 2 2.93 3型 5 3 0 22.57
JLEO17/05是干燥形成高粘性液体并随后重配的IPV批次。 JLE097是未干燥的参比样品。
表10显示了在干燥和重配的IPV两批样品和未干燥的参比样品之 间，用每种稀释度的IPV接种的应答数量是相似的。一般来说，1型 IPV引发最好的免疫应答，2型在稍少的大鼠中引发免疫应答。3型引 发最弱的免疫应答。
干燥形成高粘性液体的过程并不损害IPV引起体内抗体的免疫沉 淀反应的能力。相对功效(RP)读数1.0表示样品与参比样品引发相 等的应答。对于所有三种脊髓灰质炎病毒而言，两种干燥样品所产生 的接近1.0的RP读数表明干燥过程并不影响样品引发免疫应答的能 力。
实施例14.使用蔗糖或海藻糖作为稳定剂干燥形成高粘性液体对 IPV引发体内免疫沉淀的免疫应答的影响
用IPV接种10只一组的Wistar大鼠，所述IPV在10％蔗糖或10％ 海藻糖存在下业已干燥，如实施例2所述，然后重配。使用相等数量 的未被干燥的，作为参比样品的IPV接种另外10只一组的Wistar大鼠。
21天后，收集所有大鼠的血清，如实施例5所述进行免疫中和测 定用于评估抗每种1型、2型和3型脊髓灰质炎病毒的免疫中和抗体的 数量，所述免疫中和抗体的数量业已提高。
通过与未干燥参比样品所引发的免疫应答相比，对每种样品计算 相对功效。
结果示于表11中。
表11.在蔗糖和海藻糖中干燥的比较 批号 存在的糖 体内相对功效 1型/2型/3型 湿度％ Karl Fischer 持续时间 (小时) Jle017 10％海藻糖 0.95/0.82/1.05 nd 7 31CO3/01 10％蔗糖 0.69/1.20/0.97 4.6％ 18 31CO3/02 10％海藻糖 0.60/0.94/0.9 11.5％ 18 03D02/01 10％蔗糖 0.74/1.05/0.96 5.9％ 12 03D02/02 10％海藻糖 0.58/0.98/1.06 10.6％ 12
当使用蔗糖作为稳定剂时，样品中残留的水分数量是较低的，大 约保留了5％湿度，相比而言，当海藻糖作为稳定剂时，通过Karl Fischer方法所测定的湿度大约为10％。
在干燥过程中，蔗糖和海藻糖都能有效地稳定IPV，使得重配的 IPV对于大多数不同类型的脊髓灰质炎病毒给出了接近1.0的相对功效 读数。对于3型脊髓灰质炎病毒而言，相对功效特别好，可相对容易 地释放其免疫原性。
实施例15：用Karl Fischer测定湿度
在Karl Fischer电量湿度分析仪(Aqua 30.00-Elektrochemie Halle)中进行分析。对样品称重并置于设定于80℃的烘箱中。用氮气 冲洗样品，接着添加hydranal试剂(Riedel de Hahn)以便通过电量分析 进行分析。