技术领域
本发明属于聚合物微球制备技术领域，具体涉及一种基于涡漩振荡器的PLGA微球制备方法及其应用。
背景技术
聚乳酸羟基乳酸(PLGA)具有较好的生物相容性，被视为优良的医用材料，并已被美国食品和药品管理局(FDA)批准用于临床。PLGA微球载体在生物医药领域用途广泛，如用于药物递送、抗体制备、疫苗佐剂等。基于此，PLGA微球研究一直是生物载体研究领域的热点之一。
PLGA微球的制备工艺是本领域研究人员关注的重要方面。目前，溶剂乳化挥发法是PLGA微球制备最为经典与常用的方法之一。其乳化方法通常是通过匀浆机持续机械搅拌实现溶剂的乳化分散，从而获得不同直径的PLGA微球颗粒。然而，匀浆机在搅拌过程中溶液受力很不均匀，如图1所示为常规匀浆机搅拌溶液受力示意图，溶液在搅拌过程中，主要受力面仅为转子所在的平面，导致容器中不同层面的溶液受到的机械力差异很大，使得乳化获得的PLGA颗粒异质性大，粒径均匀性差。
研究表明，粒径是决定PLGA微球性能的重要因素，PLGA微球载体的药物缓释速度、免疫原性大小等生物学功能均与其粒径大小直接相关。因此，如何获得粒径均匀的PLGA微球成为本领域研究人员关注的重要问题之一。为了获得粒径均匀性较好的PLGA微球，研究人员发展了一些新的乳化方法用于PLGA微球的制备，如喷雾干燥法、膜乳化法等。其中一些乳化方法，如膜乳化方法，获得的PLGA微球均一性较传统机械搅拌乳化法显著改善，但所涉及到的专门设备与耗材较为昂贵，制备成本高，不易推广。
公开号为CN105232474的发明专利，公开了一种简明的制备粒径均匀PLGA微球的方法，该方法通过磁力搅拌器的转子搅拌带动玻璃珠在乳化液中转动，显著促进了乳化效果，提高了制备微球的均匀性。然而，这种依靠转子机械搅拌的方法乳化程度与均匀性均相对局限，一方面由于磁力搅拌器的转子并非固定，转速过快将导致转子飞离底面而无规则运动，失去匀浆作用；另一方面，玻璃珠在乳化液中的转动是依靠转子碰撞产生的推动力，转速过快将可能碰撞力太大而导致玻璃珠破碎。由于上述局限，该方法主要是在1000rpm转速或以下实现，充分乳化需要2h，且该方法主要局限于制备2μm以上微球，更小粒径的微球产率很低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于涡漩振荡器的PLGA微球制备方法及其应用。具体技术方案如下：
一种基于涡漩振荡器的PLGA微球制备方法，包括如下步骤：
(1)PLGA溶解于有机溶剂中，得到油相；
(2)在乳化容器中加入水相，并将上述油相分散至水相中，随后加入珠子，使用涡漩振荡器震荡乳化；
(3)取出珠子，使有机溶剂充分挥发；
(4)离心收集PLGA微球，并使用蒸馏水洗涤，真空冻干，获得PLGA微球。
所述有机溶剂为二氯甲烷，油相中PLGA的质量分数为6％-20％；所述水相为聚乙烯醇水溶液，聚乙烯醇的质量分数为1％-4％；所述油相与水相的体积比为1:5-1:10。
所述珠子为玻璃珠、铁珠、铜珠或铝珠，也可以是其他适宜的材料，珠子的直径为4-6mm；每10mL油相和水相中，所述珠子的加入量为6-8颗。
步骤(2)所述乳化容器为底部圆锥形、主体部分圆柱形的容器，以利于使用涡漩振荡器震荡，如50mL离心管。
步骤(2)所述震荡乳化的振荡频率为1000-3000rpm，时间为5-20min。
步骤(4)所述离心收集的转速为1800g-2000g，时间为20min-25min。
步骤(4)所述真空冻干之前还包括步骤：用蒸馏水重悬PLGA微球，以10g离心力离心4min-6min去除沉淀的大颗粒，随后上清溶液以50g离心力离心10min-15min收集沉淀的颗粒。
上述制备方法在药物的PLGA载药微球制备中的应用。
所述药物为溶解于二氯甲烷的药物时，将药物直接溶解于油相，再进上述步骤(2)-(4)，获得PLGA载药微球。
所述药物为水溶性的药物时，将药物水溶液加入到油相中超声获得W/O初乳液，再继续进行上述步骤(2)-(4)，获得PLGA载药微球。
本发明的有益效果为：
本发明PLGA微球制备基于涡漩振荡器，容器中的玻璃珠将在涡漩作用力下绕容器中心轴快速旋转，较磁力搅拌器的安全性好，其转速可达3000rpm，且由于溶液的整体涡旋使得玻璃珠能够更均匀的分布于溶液各个层面，溶液不同层面受到的机械力较为均匀，更有效地发挥分散和分子筛作用，乳化效率显著提高，20min以内即可达到均匀的乳化效果，获得的PLGA微球均匀性进一步提高，能够以较高的产率制备1-2μm粒径的微球。该方法仅使用常规的涡漩震荡器与玻璃珠即可完成，设备简单，较机械搅拌乳化方法更为简便，乳化时间短，可推广性强。
附图说明
图1为常规机械搅拌的乳化溶液受力示意图；
图2为基于涡漩振荡器的乳化溶液受力示意图；
其中，1-乳化容器，2-受力面，3-旋转方向，4-转子，5-容器中心轴，6-玻璃珠，7-旋转振荡器。
图3为不同震荡条件下制备的PLGA微球样品扫描电镜图片；a，1500次/分震荡5分钟；b，1500次/分震荡10分钟；c，1500次/分震荡20分钟；d，3000次/分震荡5分钟；e，3000次/分震荡10分钟；f，3000次/分震荡20分钟。
图4为不同震荡条件下制备的PLGA微球样品动态光散射测定粒径分布；a，1500次/分震荡5分钟；b，1500次/分震荡10分钟；c，1500次/分震荡20分钟；d，3000次/分震荡5分钟；e，3000次/分震荡10分钟；f，3000次/分震荡20分钟。
图5为2-3μm均匀粒径PLGA微球差速离心富集示意图。
图6为PLGA微球差速离心富集前与富集后示意图；a为富集前光学显微镜观察结果，b为富集前扫描电镜观察结果，c为富集前动态光散射结果，d为富集后光学显微镜观察结果，e为富集后扫描电镜观察结果，f为富集后动态光散射结果。
图7本方法制备的利福平载药微球体外药物释放曲线。
具体实施方式
以下实施例便于更好地理解本发明。
实施例1：基于涡漩振荡器的均匀乳化方法制备不同粒径PLGA微球
(1)油相的制备：称取PLGA0.6g，溶解到10mL二氯甲烷中，配制6％的PLGA溶液；
(2)聚乙烯醇(PVA)水溶液的制备：称取2.5g PVA固体，加入到100mL蒸馏水中，加热搅拌充分溶解，配制成2.5％的PVA水溶液；
(3)震荡乳化：在50mL离心管中，每瓶加入10mL 2.5％的PVA溶液，并将1mL 6％的PLGA油相溶液分散其中，随后加入7颗4-6mm直径的玻璃珠，使用涡漩振荡器分别在1500次/分、3000次/分、3000转/分振荡频率下震荡5min、10min、20min(基于涡漩振荡器的乳化溶液受力如图2所示)；
(4)有机溶剂的挥发：通风橱中放置并缓慢搅动使二氯甲烷有机溶剂充分挥发；
(5)PLGA微球的收集：2000g离心20分钟收集PLGA微球，并使用蒸馏水洗涤多次，真空冻干获得PLGA微球。
PLGA微球的扫描电镜观察：将PLGA微球重悬于水中制备微球悬液，随后将微球悬液均匀涂在锡箔纸上，干燥后剪取其中一小片，通过导电胶粘贴在样品台上，喷金后用于扫描电子显微镜观察。结果如图3所示，微球形貌较规则，表面光滑，粒径较均匀，随着震荡速度的增加和时间延长，微球粒径减小，均匀性增加；a，1500次/分震荡5分钟；b，1500次/分震荡10分钟；c，1500次/分震荡20分钟；d，3000次/分震荡5分钟；e，3000次/分震荡10分钟；f，3000次/分震荡20分钟。
PLGA粒径测定：蒸馏水重悬PLGA微球，稀释到适当的浓度，使用动态光散射法对微球粒径进行分布。结果如图4所示，随着震荡速度的增加和时间延长，微球粒径减小，粒径分布范围更窄，表明均匀性增加；a，1500次/分震荡5分钟；b，1500次/分震荡10分钟；c，1500次/分震荡20分钟；d，3000次/分震荡5分钟；e，3000次/分震荡10分钟；f，3000次/分震荡20分钟。
实施例2：2-3μm均匀粒径PLGA微球制备与富集
(1)油相的制备：称取PLGA0.6g，溶解到10mL二氯甲烷中，配制6％的PLGA溶液；
(2)PVA水溶液的制备：称取2.5g PVA固体，加入到100mL蒸馏水中，加热搅拌充分溶解，配制成2.5％的PVA水溶液；
(3)震荡乳化：在50mL离心管中，每瓶加入10mL 2.5％的PVA溶液，并将1mL 6％的PLGA油相溶液分散其中，随后加入8颗4-6mm直径的玻璃珠，使用涡漩振荡器在3000次/分振荡频率下震荡10min；
(4)有机溶剂的挥发：通风橱中放置并缓慢搅动使二氯甲烷有机溶剂充分挥发；
(5)PLGA微球的收集：2000g离心20分钟收集PLGA微球，并使用蒸馏水洗涤多次；
(6)2-3μm PLGA微球的富集：PLGA微球溶液以10g离心力离心5min，去除沉淀的大颗粒，上清溶液50g离心力离心15min收集沉淀的颗粒(微球富集流程如图5)。
PLGA微球的显微镜观察与扫描电镜观察：为进行普通显微镜观察，将PLGA微球重悬于水中制备微球悬液，随后将微球悬液均匀涂在载玻片上，常规光学显微镜100倍物镜下观察；为进行扫描显微镜观察，将PLGA微球溶液均匀涂在锡箔纸上，干燥后剪取其中一小片，通过导电胶粘贴在样品台上，喷金后用于扫描电子显微镜观察。PLGA微球富集前后显微镜与扫描电镜观察结果如图6，a为富集前光学显微镜观察结果，b为富集前扫描电镜观察结果，d为富集后光学显微镜观察结果，e为富集后扫描电镜观察结果。
PLGA粒径测定：蒸馏水重悬PLGA微球，稀释到适当的浓度，使用动态光散射法对微球粒径进行分布。微球富集前后动态光散射结果如图6，c为富集前动态光散射结果，f为富集后动态光散射结果。
图6结果表明，富集后的PLGA微球粒径可达2-3μm，且粒径均匀。
实施例3：包裹利福平的PLGA载药微球制备
本实施例以利福平为携带对象进行载药微球制备，主要目的为说明本发明方法在制备携带油溶性药物的PLGA微球的中应用。
(1)油相的制备；称取0.6g PLGA、0.05g利福平药物，共同溶解到10mL二氯甲烷中，配制含6％PLGA、0.5％利福平的溶液；
(2)PVA水溶液的制备：称取2.5g PVA固体，加入到100mL蒸馏水中，加热搅拌充分溶解，配制成2.5％的PVA水溶液；
(3)震荡乳化：在50mL离心管中，每瓶加入10mL 2.5％的PVA溶液，并将1mL 6％的PLGA油相溶液分散其中，随后加入8颗4-6mm直径的玻璃珠，使用涡漩振荡器在3000次/分振荡频率下震荡10min；
(4)有机溶剂的挥发：通风橱中使二氯甲烷有机溶剂充分挥发；
(5)PLGA载药微球的收集：2000g离心20分钟收集PLGA微球，并使用蒸馏水洗涤多次；
(6)PLGA载药微球的富集：PLGA微球溶液以10g离心力离心5min，去除沉淀的大颗粒，上清溶液50g离心力离心15min收集沉淀的颗粒，冻干备用。
载药微球的载药量测定：使用DMSO溶解利福平，475nm条件下测定不同浓度下利福平溶液的吸光值，绘制标准曲线；取10mg PLGA载药微球，溶解于1mL DMSO，测定475nm吸光值，计算其载药量。经测定，PLGA微球对利福平载药量为40.3±0.11μg/mg。
载药微球的药物缓释功能测定：取20mg载药PLGA微球(含利福平～800μg)，分散于1mL NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(PH7.4)，置于37℃孵箱孵育，每天收集上清，并补充1mL新鲜的缓冲液，连续收集15天，测定475nm吸光值，根据标准曲线计算利福平药物释放量，绘制释放曲线，如图7所示，微球载体可以控制利福平药物的缓释长达2周以上。