技术领域
本发明属于天然药物组合物，涉及组合物对一类与中枢神经疾病过程密切相关蛋白亚硝基化和硝基化的干预作用，尤其涉及淫羊藿总黄酮与三七总皂苷组合物干预脑组织(神经细胞和脑内血管)应激性蛋白亚硝基化或硝基化的作用。
背景技术
体内含有活性巯基的蛋白可被亚硝基硫醇(SNO)类分子亚硝基化修饰，生理情况下，这是内生一氧化氮(NO)的储存和运输形式。生理性蛋白亚硝基化和脱亚硝基化是一种可逆反应，不同组织中蛋白亚硝基化和脱亚硝基化的程度和速率通常恒定在一定范围内，对细胞有多重生理调节作用。在病理情况下，尤其是在严重炎症(如内毒素休克)时，组织不仅由于诱生型NO合酶(iNOS)快速表达，生成大量NO，而且催化SNO分子降解酶的活性也会同时降低，使机体处于SNO分子急剧增高的亚硝基应激状态。其中S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)是体内病理情况下，唯一的亚硝基应激分子，也是SNO分子降解酶S-亚硝基谷胱甘肽还原酶的唯一底物，病理状态下iNOS表达增加，或S-亚硝基谷胱甘肽还原酶活性降低，均可使GNSO急剧升高。已经明确GSNO的急剧升高，可使一些重要蛋白(包括某些酶)不可逆地亚硝基化，还原型谷胱甘肽(GSH)耗竭，线粒体功能损伤，导致细胞有氧代谢障碍。已有报道组织局部GSNO的急剧升高，还可通过释放过量NO，激发内生活性氧O2-增加，形成过氧亚硝酸阴离子(ONOO-)，使所在部位蛋白酪氨酸硝基化。因此体内GSNO的急剧升高，是包括心脑血管，免疫、肝脏和神经等组织疾病发生发展的重要环节。
其中脑组织(神经细胞和脑内血管)蛋白硝基化，被证实是一种导致神经退行性改变的早期分子机制，研究脑内组织亚硝基化和神经细胞/脑内血管硝基化，在多种原因引起脑部组织受损，如严重炎症导致神经退行性改变疾病(如巴金森病等)具有重要价值。海马作为脑中边缘系统整体组成元件，不仅是认知记忆的区域，更是发挥情感行为关键作用的区域之一，近来已作为抑郁研究的焦点，是用于抗抑郁药作用评价的基本部位，也是抑郁症伴痴呆样综合征药物研究的重要部位。目前已有大鼠海马片电活动作为抑郁行为综合征的模型。另一方面大脑皮层对精神活动高级整合功能与认知记忆过程也发挥了重要作用，动物实验已经证明抑郁样症状模型常呈现认知功能异常。因此包括海马和大脑皮层的神经组织蛋白亚硝基化和硝基化，为导致抑郁症状伴有认知与记忆功能下降提供了病理学基础。脑内神经细胞和脑内血管亚硝基化和硝基化作为潜在药物治疗靶标的研究将受到更大重视。
发明内容
本发明的目的是提供一种含淫羊藿总黄酮(Total flavonoids of epimedium，TFE)和三七总皂苷(Panax notoginseng saponins，PNS)的药物组合物在制备治疗脑组织(神经细胞和脑内血管)急性亚硝基应激所致抑郁症，抑郁症伴痴呆样综合征药物中的应用。主要在制备治疗由于脑内组织(神经和脑内血管)蛋白亚硝基化和硝基化继发的抑郁症状伴有认知和记忆功能下降的药物中的应用。
该组合物由TFE和PNS的提取物组成，提取的TFE含量为70％-80％，PNS含量为90％-99％(重量百分含量)，按TFE∶PNS计的重量份比值是1∶8制备组合物。
所述组合物与药用赋形剂或辅料制备成药物，其制剂形式包括液体制剂、颗粒剂、片剂或胶丸。所述药物的给药方式包括口服给药或注射给药。
本发明研究证实大鼠脑室内直接注射亚硝基应激分子GSNO，使脑室周边组织尤其是海马及周边分布血管处于亚硝基应激状态，表现为以蛋白亚硝基化和硝基化为病理损伤特征，并以继发的抑郁样症状伴认知和记忆力下降为特征(对小脑支配的前庭动能和运动协调功能无影响)。
本发明研究证实TFE+PNS在脑室内GSNO急剧增高，导致所在部位亚硝基应激时，对神经细胞和脑内血管有显著保护作用，尤其在制备改善病理情况下脑内组织(神经和血管)蛋白亚硝基化和硝基化所致抑郁症状、认知和记忆力下降方面的应用。如严重炎症(如内毒素休克)等脑部组织受损等引起的抑郁症和抑郁症伴痴呆样综合征的治疗(不包括原发性神经精神疾病)。
本发明的有益效果是：
(1)TFE+PNS组合物可显著改善脑室内注射GSNO造成亚硝基应激的大鼠强迫游泳和悬尾试验的抑郁样症状，和改善大鼠自发活动减少；同时对该模型大鼠Morris水迷宫学习和记忆障碍有显著改善作用。
(2)本复方组合物中，PNS具有调节cAMP/cGMP作用；TFE则具有抗氧化和雌激素样活性，两者合用又有显著改善由于GSNO急剧升高所致大鼠模型海马区和脑内血管内皮细胞蛋白亚硝基化和硝基化作用。
(3)脑室注射GSNO模型大鼠脑组织，用以制备体外原代培养血管内皮细胞，给TFE+PNS组合物后显著提高所获细胞存活率，显著降低乳酸脱氢酶(LDH)的释放，显著下调血管内皮细胞iNOS表达和NO生成，显著减轻线粒体伤害。用以制备体外原代培养皮层神经元显著提高细胞存活率，并保护皮层神经元突触和线粒体伤害。两种有效部位合用作用比单用其中任何一种显著。因此结合该组合物对整体动物实验结果，可在增强脑内GSNO急剧增高所致抑郁样症状，和自发活动减少；和学习和记忆障碍上的应用。如严重炎症(如内毒素休克)等脑部组织受损等处于亚硝基应激状态，引起的抑郁症状和/或痴呆症治疗的应用。
(4)本发明获得用于改善与急性亚硝基应激所致抑郁症状和/或痴呆症治疗密切相关的两种有效部位最佳配比(海马区及血管内皮细胞亚硝基化和硝基化作用)，可用于研制中药新药，拓展了单一药物的用途。
附图说明
图1是大鼠脑室内注射GSNO模型的海马组织S-亚硝酰化修饰蛋白质谱鉴定。
图2是Western Blot法检测TFE+PNS i.g.对脑室内注射GSNO模型大鼠海马NO合酶表达的影响。
图3(3-1和3-2)是免疫组化法检测TFE+PNS i.g.对脑室内注射GSNO模型大鼠海马CA1区蛋白硝基化的改善作用。
图4是免疫细胞化学法检测TFE+PNS i.g.对大鼠脑室内注射GSNO模型原代皮层神经元特异性骨架蛋白β-tublin III，胆碱乙酰基转移酶(ChAT)蛋白表达的影响。
图5是TFE+PNS i.g.对脑室内注射GSNO模型大鼠脑血管内皮细胞存活率和LDH释放量的影响。
图6是JC-1染色法和流式细胞术检测TFE+PNS i.g.对脑室内注射GSNO模型大鼠脑血管内皮细胞线粒体损伤的改善作用。
图7是WesternBlot法检测TFE+PNS i.g.对脑室内注射GSNO模型大鼠血管脑内皮细胞NO合酶表达的影响。
图8是Griess试剂法测定TFE+PNS i.g.对脑室内注射GSNO模型大鼠脑血管内皮细胞NO生成量的影响。
图9-1是荧光探针法检测TFE+PNS i.g.对脑室内注射GSNO模型大鼠脑血管内皮细胞活性氧(ROS)生成的影响。
图9-2是流式细胞术检测TFE+PNS i.g.对脑室内注射GSNO模型大鼠脑血管内皮细胞活性氧(ROS)生成的影响。
图10是免疫荧光法检测TFE+PNS i.g.对脑室内注射GSNO模型大鼠脑血管内皮细胞蛋白硝基化的改善作用。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1.淫羊藿总黄酮(TFE)和三七总皂苷(PNS)的制备方法
1.称取淫羊藿干燥地上部分(包括茎叶)，碾断使成约2cm长，以10倍量水加热提取3次，每次1小时，提取液浓缩，并用95％乙醇提取1小时，浓缩至无乙醇味，再分别用氯仿-甲醇/乙酸乙酯萃取三次，浓缩至无乙酸乙酯味。继而分离精制如下：浓缩液→DM130大孔树脂吸附→10％乙醇洗脱杂质→70％乙醇洗脱有效成分→树脂再生。70％乙醇洗脱液获淫羊藿总黄酮(TFE)含量70％-80％(其中淫羊藿苷30％-40％之间)。
2.称取三七地下块茎粉碎(过8目筛)，加10倍量70％乙醇加热回流提取3次，每次1.5小时，过滤，合并滤液，减压浓缩至一定体积(0.3g生药/ml)，离心，即得上柱溶液。吸取该溶液上大孔树脂，用水洗至流出液不显molish反应，然后用70％乙醇洗脱，吸附流速为2L/min，洗脱流速为4L/min，收集洗脱液。洗脱液减压浓缩，真空干燥，称量总固体物并测定三七总皂苷含量。三七总皂苷(PNS)含量90％-99％。
上述两种制备方法提取的TFE(含量70％-80％)(重量百分含量)，和PNS(含量90％-99％)(重量百分含量)，按TFE∶PNS计的重量份比值是1∶8。
实施例2.大鼠脑室内注射GSNO蛋白亚硝基化模型构建
1.GSNO合成
采用GSH和NaNO2在酸性条件下反应合成，利用分光光度计定量。临用前配置，合成过程避光条件下进行。
合成：400mM GSH0.4ml，加入0.2M HCL0.2ml，然后加入400mMNaNO20.2ml，混合后，室温反应15min分钟，加入40％NaOH(约3-4μl)，调整pH＝7.2，避光保存于冰浴上。
定量：取0.1ml，加入水0.9ml，混合后再取0.1ml，加入水0.9ml，混合后，取0.2ml，测定在334nm处的吸光度，用双蒸水调零点。所得吸光度值与摩尔吸光系数0.767相比，然后乘以稀释倍数，即求得合成的GSNO的浓度。将产物用PBS稀释，调整终浓度为100mM供用。临用前制备，避光。
2.大鼠脑室内注射GSNO模型与分组
Sprage-Dawley大鼠，10周龄，雌雄各半，体重290～320g。浙江省医学科学院实验动物中心，二级，动物合格证号：SCXK(浙)2003-0001。
大鼠用戊巴比妥钠(40mg/kg，ip)麻醉后，动物侧脑室进针造模，进针位置：AP0.8mm，ML1.5mm，DV3.5mm。各实验动物分别进行假造模或GSNO造模处理如下。假造模每只动物侧脑室注射2μl注射用生理盐水，GSNO模型每只动物侧脑室2μl的40μmol/L GSNO造模。
实验动物分组如下：假造模组，GSNO造模后处理如下：溶剂组、TFE+PNS组合物低、中、高剂量给药组、TFE单用组、PNS单用组，每组14只动物。根据预试所得剂量范围，按等比设置低、中、高剂量，对应TFE+PNS分别为：2.5+20、5+40、10+80mg/kg，TFE单用组5mg/kg，PNS单用组40mg/kg(用0.5％CMC-Na溶液制成混悬液)；假造模组和模型溶剂组均给于0.5％CMC-Na溶液。精神活动实验另设抗抑郁药氟西汀10mg/kg作阳性对照；认知记忆实验另设多奈哌齐1.65mg/kg作阳性对照。给药途径为ig，给药容量1ml/100g体重。所有实验均在造模手术前预给药1周，手术后连续给药2周。实验期间各组动物体重均无明显差异。
分别进行负趋地性试验，强迫游泳和悬尾试验，自发活动和Morris水迷宫试验，试验结束后，迅速处死大鼠。每组动物一半脑组织直接固定于10％福尔马林中做免疫组化用；另一半置冰块上平皿中，在解剖镜下迅速分离海马组织或大脑皮层以及直径0.1mm以上血管，分别做以下处理：(1)海马组织于液氮中保存供蛋白电泳用；或固定于10％福尔马林中做免疫组化用。(2)大脑皮层制备原代神经元培养。(3)血管制备原代内皮细胞培养。
实施例3.大鼠行为学试验检测TFE+PNS i.g.(重量比值1∶8)在改善脑室内注射GSNO模型行为与精神活动的作用
取实施例2所述脑室内注射GSNO造模各组大鼠(造模手术前预给药1周，手术后连续给药2周)，进行下述行为与精神活动试验。
1.大鼠负趋地性试验
用于评价大鼠在45°斜板上，头朝下时机体旋转180°使头朝上的所需时间。本实验主要反映由小脑控制的前庭平衡功能和运动协调功能，而与体能和心理(精神)活动相关性较小。本实验主要用以评价脑室内注射GSNO，对脑组织亚硝基化和硝基化损伤部位的相对专一性。结果提示大鼠脑室内注射GSNO，及用药与否对反映由小脑控制的前庭平衡功能和神经运动协调功能影响均不明显(表1)。
表1：TFE+PNS i.g.对脑室内注射GSNO大鼠前庭平衡及运动协调动能的影响(means±S.D.，n＝14)
2.被迫游泳试验
大鼠逐个在矩形玻璃广口瓶(30×20×32cm3，水深22cm，22-23℃恒温)中强迫游泳。首先挣扎试图逃跑，随后处于一种僵住不动的状态，表示动物“绝望行为”，为经典的抑郁动物实验模型。本实验大鼠在开始的2-3分钟有力地划动后，出现片刻静止浮在水面，当动物仍然被动浮在水面，轻微躬背直立状不动，鼻子露出水面均计为不动，用秒表纪录6分钟内僵住不动总时间。
结果提示大鼠脑室内注射GSNO，僵住不动总时间显著长于假造模组，TFE+PNS小剂量即有显著改善作用，中高剂量有极显著改善作用。TFE或PNS单用组未见显著改善作用(表2)。
3.悬尾试验
悬尾大鼠为克服不正常的体位而挣扎活动，但活动一定时间后，出现间断性顺服悬挂并完全静止，表示动物“绝望行为”，为经典的抑郁动物实验模型。本研究大鼠逐个在距尾尖约1cm处用黏胶带固定悬挂在距桌面80cm高的杠杆一侧边上，杠杆另一侧用描记笔在转筒上纪录活动。于是僵住不动时间完整纪录在转速为15cm/min转筒上。大鼠顺服悬挂并完全静止的时间记为僵住，纪录6分钟内僵住总时间。
结果提示大鼠脑室内注射GSNO，僵住不动总时间显著长于假造模组，TFE+PNS小剂量即有显著改善作用，中高剂量有极显著改善作用。TFE或PNS单用组未见显著改善作用(表2)。
表2.TFE+PNSi.g.对脑室内注射GSNO大鼠被迫游泳试验和悬尾试验影响(means±S.D.，n＝14)
##P<0.01与假造模组比较；*P<0.05，**P<0.01GSNO模型组给药组与GSNO造模溶剂组比较。
P>0.05与假造模组给予溶剂比较。
4.自发活动试验
利用敞开环境，对喜爱黑暗角落活动的鼠类对开阔场地自然厌恶回避的神经精神活动进行考察。通过其运动和探索活动，研究分析其神经精神活动差异。自发活动实验参照文献，塑料笼具(高24cm，长48cm，宽30cm)底部铺上适量木屑，将笼具用线水平分隔成两室。饲养环境光照、温度和湿度均恒定。各组预给药1周，造模后给药2周，将大鼠分别放入笼具中，观察60min内各组大鼠的垂直运动和水平运动次数。水平运动评价指标是大鼠穿越水平分割线的次数，垂直运动的评价指标是仔鼠前肢抬起，并伴有与前肢相联胸部离开笼底的起身姿势(注：大鼠前肢抓胡须抓痒等，但不伴有起身姿势均不计为垂直运动)。
各组动物60分钟内的水平运动、垂直运动次数见表3。GNSO模型对照组运动次数显著性少于假造模组。TFE+PNS预给药并在造模后连续给药2周，可以显著改善GSNO造成的大鼠自发活动减少，并明显优于单用TFE或PNS。
表3.TFE+PNS i.g.对脑室内注射GSNO大鼠自发运动影响(means±S.D.，n＝14)
##P<0.01与假造模组比较；*P<0.05，**P<0.01GSNO模型组给药组与GSNO造模溶剂组比较。
P>0.05与假造模组给予溶剂比较。
5.Morris水迷宫法试验
Morris水迷宫用于评价动物空间学习记忆能力。它由直径120cm，高度50cm的圆形水池组成(本实验采用安徽淮北正华生物仪器设备有限公司产品，DMS-2Morris水迷宫分析系统)。水池水面高度30cm，水温25±1℃。水中添加适量墨汁，使水浑浊，避免大鼠直接看见底面和平台。水池以中心点分为四个象限，圆形平台(直径9cm，高29cm)位于第III象限中心，平台低于水面1.5～2cm。水池的正上方置有一摄像仪，摄像仪连接有配套分析软件的电脑，自动记录大鼠在池内活动的全过程，并分析大鼠各种运动轨迹参数。
实验期间环境安静，光照恒定充足，房间内参照物位置保持不变。本实验程序包括两个阶段①定位航行实验：用于测量大鼠对水迷宫学习能力。该阶段实验历时4天，第一天每只大鼠适应水池120s。第二天分中午12点和下午1点两个时段，每个时段训练1次，各以第I和第II象限边缘的中点为入水点训练一次(分别计为A点和B点)，入水时将大鼠面向池壁放入。记录大鼠第一次找到平台所用时间(逃避潜伏期)，以及在水中的总游行时间。如果在120s内任意时刻找到平台，即结束该次训练，如果120s中未能找到平台，则引导至平台，停留30s。第三、四天训练同第二天。②空间探索实验：用于测量大鼠学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的能力。在定位航行训练结束后次日(实验第五天)，进行空间探索实验。在该实验中，撤去平台，同样以第I和第II象限边缘的中点为入水点评价一次(A点和B点)，将大鼠面向池壁放入水中，自动记录120s内大鼠的运动轨迹。大鼠第一次到达原平台区域所用时间为潜伏期，作为空间探索能力；以及120s总共穿越该区域的次数，作为定位航行能力。
与假造模组比较，GSNO模型组在第五天(d5)探索潜伏期显著延长、过台次数显著减少，表明其空间探索能力和定位航行能力均显著下降。TFE伍用PNS组合物的中、高剂量在训练试验第三天(d3)已经显效，作用优于TFE、PNS单用组(表4-1)。在第五天(d5)可明显缩短探索潜伏期、增加穿越平台次数，与模型组相比具有明显改善作用，而单用TFE、PNS均未体现此作用(表4-2)。说明TFE伍用PNS对脑室内注射GSNO模型大鼠有改善学习和记忆障碍作用，作用优于TFE、PNS单用组。
表4-1.TFE+PNS i.g.对脑室内注射GSNO大鼠空间学习记忆能力的影响(means±S.D.，n＝14)
#P<0.01与假造模组比较；*P<0.05，**P<0.01与GSNO造模溶剂组比较；
P>0.05与假造模组给与溶剂比较。
表4-2.TFE+PNS i.g.对脑室内注射GSNO大鼠空间学习记忆能力的影响(means±S.D.，n＝14)
#P<0.05，##P<0.01与假造模组比较；*P<0.05，**P<0.01与GSNO造模溶剂组比较；
P>0.05与假造模组给予溶剂比较。
实施例4大鼠侧脑室注射GSNO模型海马组织S亚硝基化修饰蛋白的质谱鉴定
取实施例2脑室内注射GSNO模型大鼠(造模手术前预给药1周，手术后连续给药2周)，脱臼处死后，取假造模组和GSNO造模各组海马组织，用BiotinSwitch法纯化S-亚硝酰化修饰的蛋白，方法如下：①阻断蛋白质自由巯基：采用MMTS封闭蛋白质中自由巯基，以免引起假阳性结果。避光条件下，MMTS溶解于DMF中，使其终浓度为2M，然后加入Hepes缓冲液，内含25％SDS，使MMTS终浓度为20mM，然后取1.2ml，加入上一步所得的样品中，在55℃水浴中加热20min，每隔3min振荡一次，MMTS能特异性地与蛋白自由巯基结合，而不与已经S-亚硝基化巯基发生反应。过量的MMTS在反应完成后用丙酮沉淀法去除，样品再次溶解于Hepes缓冲液中，并加入1％SDS助溶。②标记S亚硝基化修饰蛋白：将上一步所得的样品等分为二，一份为实验组，加1mM维生素C(Vc)溶液后再加生物素标记物Biotin-HPDP(4mM，溶解于DMF)，对照组加Vc溶液后再加等量DMF做溶剂对照。Vc起还原作用，能特异地将S亚硝基化蛋白还原成自由巯基，产生的蛋白自由巯基又和巯基试剂Biotin-HPDP反应，该试剂上同时带有Biotin标记，从而将S亚硝基化修饰的蛋白质转化为生物素标记。③亲和层析纯化S亚硝基化蛋白：加入固定在琼脂上的链亲和素20μl，链亲和素能与生物素特异地结合，二者的结合非常牢固，从而将生物素化的蛋白结合到固相的琼脂上。用高盐(含0.5M NaCL)缓冲液洗脱沉淀，除去与链亲和素非特异性结合的蛋白。再加入还原性缓冲液，选择性洗脱与生物素特异地结合的蛋白，这些蛋白质即为所有S-亚硝基化修饰蛋白。至此，样品中的所有S-亚硝基化修饰的蛋白就被纯化。
GSNO造模组海马组织样品以SDS-PAGE方法按常规操作，蛋白上样量为20～60μg/道，按表达丰度不同进行调整。SDS-PAGE分离后，以未给GSNO的假造模组海马组织作对照，SDS-PAGE分离纯化的S-亚硝基化修饰蛋白，电泳结束后凝胶染色，选择染色明显且边界清晰的蛋白条带，切割下来保存于1％的醋酸溶液中，立即将样品进行蛋白差异鉴定。GSNO模型组有三个蛋白条带染色最浓，分界清晰，表观分子量约为：39、35和22kDa，准确切割该三个蛋白作为进一步质谱鉴定的目标蛋白。假造模组海马组织蛋白，SDS-PAGE分离后，在相同表观分子量处，未见染色明显且边界清晰的蛋白条带，但仍然切割经Biotin Switch法纯化未见染色蛋白条带。
将蛋白胶条上的蛋白用胰酶消化，使其成为多肽片段，然后利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱技术进行肽段质量的测定，内标是胰酶的自解峰，肽段质量的获取范围是800-3000Da。蛋白的肽质量指纹谱利用Mascot方法计算，在http://www.matrixscience.com网站上进行，搜索NCBI的蛋白质数据库。Mascot得分最高的蛋白认为是阳性的鉴定。其质谱的图谱参见图1：(A)醛缩酶B，(B)I型视黄醇脱氢酶，(C)过氧化氧化还原蛋白。
经数据库检索，结合所得的Mascot评分与序列的覆盖率，初步确定三个蛋白条带的蛋白归属，见表5。
表5.大鼠侧脑室注射GSNO海马组织MALDI-TOF MS法S亚硝基化修饰蛋白质谱鉴定
上述蛋白与海马组织(神经与血管)相应的生化过程相关，主要涉及能量代谢、视黄醛生成、蛋白氧还反应和电子转移等。
实施例5.免疫印迹法检测TFE+PNS i.g.(重量比值1∶8)在改善大鼠脑室内注射GSNO模型海马诱生型NO合酶表达作用
取实施例2所获各组海马组织匀浆在4℃冰浴上加入裂解缓冲液(PH7.5Tris-盐酸20mmol/L，NaCl150mmol/L，EDTA1mmol/L，Triton X1001％，去氧胆酸钠0.5％，PMSF1mmol/L，leupeptin10μg/ml，aprotitin30μg/ml)，在冰上多次反复吹打30min，4℃13000×g离心30min获得上清即为总蛋白，Lowry试剂盒法(DC蛋白检测试剂盒)对蛋白浓度进行定量，分装后冻存备用。
SDS-PAGE，蛋白免疫印迹(Western Blot)和胶片光密度分析法按常规操作。蛋白上样量为20～60μg/道，在该范围内按表达丰度不同进行调整。SDS-PAGE后将蛋白电转膜至硝酸纤维素膜上，5％脱脂牛奶封闭1小时，一抗以1：1000稀释度加于用0.05％吐温PBS溶解的5％脱脂奶中，摇床上室温孵育2小时或4℃孵育过夜。用含0.05％吐温的PBS洗膜3次，以除去非特异性结合一抗。继续孵育二抗1-2小时，二抗稀释度为1：5000。相同条件下洗膜三次，用ECL试剂显色，暗室中用X光胶片曝光，全自动冲片机冲洗胶片。胶片上蛋白条带经扫描后进行光密度分析。本实验中以β-actin作为管家蛋白。结果显示，大鼠脑室内注射GSNO模型海马组织诱生型NO合酶(iNOS)蛋白表达较假造模组显著上调，中、高剂量TFE+PNS具有显著降低由于GSNO引起海马组织iNOS表达升高的作用，TFE+PNS合用组的作用明显优于TFE和PNS单用组(参见图2)，图中(A)假造模组，(B)GSNO模型组溶剂组，(C)单用TFE组，(D)单用PNS组，(E)TFE+PNS低剂量组，(F)TFE+PNS中剂量组，(G)TFE+PNS高剂量组。图2-2是对应图2-1的泳道对应的量化柱状图。
实施例6.免疫组化法法检测TFE+PNSi.g.(重量比值1∶8)在改善大鼠脑室内注射GSNO模型海马CA1区蛋白硝基化的作用
取实施例2所获各组海马表明与情感和记忆有关的海马组织蛋白亚硝基化、iNOS表达升高，已证实该部位确实存在亚硝基应激，但是与学习记忆密切相关的海马CA1区是否特异受影响，还要进一步论证。
本实验免疫组织化学染色：取切片，用预冷的0.01mol/L PBS洗涤3次。无水甲醇-20℃固定20min，PBS清洗后用10％正常羊血清封闭30min。第一抗体为硝基酪氨酸单克隆抗体(anti-nitrotyrosine，NT，1：2000稀释)，4℃孵育过夜。用PBS充分清洗3次，每次3min。第二抗体为羊抗鼠IgG(1：200稀释)，室温避光孵育60min，用PBS充分清洗3次，每次3min，采用DAB显色。
免疫组化结果显示，与假造模组相比，脑室内注射GSNO模型大鼠海马CA1区3-NT阳性染色(棕黄色，箭头所示)显著上调，单用TFE或单用PNS对GSNO引起的大鼠海马CA1区蛋白硝基化有所减轻(浅黄色)，而TFE+PNS合用，尤其是两药合用在中，高剂量显著降低GSNO引起的大鼠海马CA1区蛋白硝基化作用。结果参见图3-1，图中(A)假造模组，(B)GSNO模型组(溶剂组)，(C)单用TFE组，(D)单用PNS组，(E)TFE+PNS低剂量组，(F)TFE+PNS中剂量组，(G)TFE+PNS高剂量组。图3-2为大鼠海马CA1区3-NT阳性染色量化结果，图中纵坐标表示酪氨酸硝基化蛋白阳性区域蛋白(像素)，图中(A)假造模组，(B)GSNO模型组溶剂组，(C)单用TFE组，(D)单用PNS组，(E)TFE+PNS低剂量组，(F)TFE+PNS中剂量组，(G)TFE+PNS高剂量组。###P<0.001与假造模组比较；**P<0.01，***P<0.001与GSNO模型溶剂组比较。
表6.TFE+PNS i.g.对脑室内注射GSNO模型大鼠海马CA1区蛋白硝基化的改善作用(means±S.D.，n＝3)
###P<0.001与假造模组比较；*P<0.05，**P<0.01与GSNO模型组比较。
实施例7.免疫细胞化学法检测TFE+PNS i.g.(重量比值1∶8)在改善大鼠脑室内注射GSNO模型原代皮层神经元损伤的作用
取实施例2所获脑室内注射GSNO大鼠(造模手术前预给药1周，手术后连续给药2周)，脱臼处死后，无菌条件下取大脑置于4℃解剖液中。(解剖液：葡萄糖/蔗糖溶液10×储备液：葡萄糖30g+蔗糖75g加双蒸水至500ml，过滤除菌后4℃储存备用。HEPES缓冲液(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)：HEPES(MW238.3)8.38g加蒸馏水至100ml，过滤除菌后4℃储存备用。10×缓冲液：NaCl160g+KCl8g+Na2HPO4.12H2O4.8g+KH2PO40.6g加水至1000ml，过滤除菌后4℃储存备用。将上述葡萄糖/蔗糖溶液50ml，HEPES缓冲液28ml，缓冲液50ml，混合后加双蒸水至800ml，用HCl或NaOH调节PH至7.2-7.3，过滤除菌后4℃储存备用)。
解剖镜下小心剔除脑膜、嗅球、纹状体、海马和基底脑组织，分离皮层组织，用眼科剪将皮层组织剪碎(1-2mm3的组织块)，加入约10倍量0.125％胰酶在37℃、5％CO2孵箱中消化15min。用吸管吸取并弃去胰酶消化液，加入约10倍量胎牛血清中止胰酶消化，再加约10倍胎牛血清量缓冲液，用适当口径经火焰抛光的枪头吹散组织块至细胞悬液。静置，吸取上部分混悬液离心，得细胞后用种植液重悬(种植液：80％高糖DMEM，10％胎牛血清，10％马血清，1％谷氨酰胺(0.2mol/L，100×))。用血球计数板计数细胞，调整细胞密度为1.0×106/L，按不同密度要求接种到经0.1％D-多聚赖氨酸预处理的96或者6孔板中培养(96孔板，约5.0×104/孔；6孔板，约8.0×105/孔)。24小时后，将种植液换成培养液(98％NEUBASAL培养基，2％B27(50×，GIBCO)，以后每4天换液一次。在神经元培养至第5天时，加入终浓度为10μmol/L的阿糖胞苷以抑制非神经元的生长，24小时后换成新鲜的培养液继续贴壁培养。
抑郁症伴有认知和记忆损伤的发病过程及其复杂，除了文献已述及以外，尚有许多环节和病理网络联结没有阐明，本研究除考察亚硝基应激状态下，与情感、记忆有关的海马组织蛋白亚硝基化，海马CA1区硝基化外，还进一步观察与认知过程和高级思维有关的皮层神经元突触和胆碱能神经元情况。
原代皮层神经元培养7天后，用冰甲醇固定细胞15min，PBS缓冲液洗去多余甲醇；用含10％小牛血清的PBS室温下封闭2小时后洗去封闭液；加入含2％牛血清PBS配制的神经元特异性骨架蛋白β-tublin III，胆碱乙酰基转移酶(Choline acetyltransferase，ChAT)一抗，稀释比为1∶50，4℃摇床孵育过夜；充分洗去非特异性结合一抗后加入罗丹明(rhodamine)或FITC标记的IgG荧光二抗，稀释比为1∶100，室温下孵育2小时。荧光显微镜观察活性氮GSNO模型原代培养神经细胞特异性蛋白表达。并进行以下形态学分析：突触长度参照文献方法评价。参见图4，图4-1是荧光照片，图中(1)为神经元特异性骨架蛋白β-tublin III，(2)为胆碱乙酰基转移酶(ChAT)蛋白，(A)假造模组皮层神经元突触长度大于胞体直径三倍(箭头所指)，(B)GSNO模型组溶剂组(突触长度小于胞体直径)，(C)单用TFE组，(D)单用PNS组(突触长度小于或等于胞体直径)，(E)TFE+PNS低剂量组(突触长度等于或长于胞体直径，但未达胞体直径三倍)，(F)TFE+PNS中剂量组，和(G)TFE+PNS高剂量组(突触长度处大于胞体直径三倍)；图4-2是相对荧光强度量化柱状图，图中(-1)神经元特异性骨架蛋白β-tublin III，(-2)胆碱乙酰基转移酶(ChAT)蛋白，(A)假造模组，(B)GSNO模型组溶剂组，(C)单用TFE组，(D)单用PNS组，(E)TFE+PNS低剂量组，(F)TFE+PNS中剂量组，(G)TFE+PNS高剂量组。
结果显示，大鼠脑室内注射GSNO模型大鼠制备皮层原代培养神经元，在亚硝基应激状态下，与认知过程和高级思维整合有关的皮层神经元突触和胆碱能神经元受到损伤。突触模糊不清，长度显著短于假造模组，神经元特异性骨架蛋白β-tublin III和胆碱乙酰基转移酶(ChAT)蛋白表达强度也显著弱于假造模组。TFE+PNS小剂量即有显著改善作用，中高剂量有极显著改善作用。TFE或PNS单用组未见显著改善作用，参见图4。
实施例8.JC-1染色法检测TFE+PNS i.g.(重量比值1∶8)在改善大鼠脑室内注射GSNO模型原代皮层神经元线粒体损伤的作用
本实施例中采用JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位(ΔΨm)水平。JC-1是一种膜电位指示剂，这种阳离子染料能电压依赖性地聚集在线粒体中，按其聚集状态不同发出绿色(525±10nm)和红色(610±10nm)荧光。在线粒体ΔΨm较高时，JC-1聚集在线粒体基质中，形成聚合物，产生红色荧光；在线粒体ΔΨm较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，产生绿色荧光。通过红绿荧光的相对比例可以衡量线粒体ΔΨm的高低。ΔΨm改变表示线粒体功能受损，为细胞早期损伤事件，通常与细胞凋亡启动相关，是细胞凋亡的上游事件[13，14]。本研究采用JC-1染色测定原代培养皮层神经元线粒体ΔΨm。培养体系加入20mg/L JC-1染液，终浓度为10μg/ml，与神经元在37℃孵育15min后，吸弃染液，用荧光显微镜观察细胞荧光强弱。
线粒体膜电位丧失(降低)表现为红绿荧光比值改变，也表示线粒体功能受损。JC-1终浓度为10μg/ml，与神经元在37℃孵育15min后于荧光显微镜下观察拍照，以形态学和红绿荧光比值作为为评价指标。
按实施例2制备大鼠皮层神经元，用JC-1染色后，评价膜电位。结果显示，脑室内注射GSNO模型大鼠原代皮层神经元细胞经JC-1染色后大多呈现绿色，提示GSNO能显著造成皮层神经元细胞线粒体损伤。而TFE+PNS中剂量组具有显著提高由于GSNO引起的线粒体膜电位下降的作用，且TFE+PNS合用组的作用明显优于TFE和PNS单用组。结果参见表7：
表7.TFE+PNS i.g.对脑室内注射GSNO模型大鼠原代皮层神经元线粒体损伤的改善作用(means±S.D，n＝3)
##P<0.01与假造模组比较；*P<0.05，**P<0.01与GSNO模型组比较。
实施例9.TFE+PNS i.g.(重量比值1∶8)在改善GSNO造模大鼠脑血管内皮细胞的活力影响
取留作分离血管用的脑组织无菌条件下置于4℃解剖液(见实施例7)中。解剖镜下仔细分离血管制备原代内皮细胞培养。用眼科剪将分离的血管剪碎至约0.1-0.3mm3，加入0.125％胰酶约20倍体积量在37℃、5％CO2孵箱中消化15min。用吸管吸取并弃去胰酶消化液，加入约10倍体积量胎牛血清中止消化，加适量缓冲液(约为血清的10倍量)，用适当口径经火焰抛光的枪头吹散组织块至细胞悬液。静置，解剖镜下仔细吸取所有内皮细胞混悬液，弃去底层的未消化完全部分，得内皮细胞用种植液重悬(见实施例7)。用血球计数板计数细胞，调整细胞密度为1.0×106/L，按不同密度要求接种到经0.1％D-多聚赖氨酸预处理的96或者6孔板中培养(96孔板，约5.0×104/孔；6孔板，约8.0×105/孔)。24h后，测定细胞活力。
加入MTT溶液(5mg/mL)，使其终浓度为0.5mg/mL。在37℃、5％CO2培养箱中继续孵育4小时后，弃去上清，加DMSO溶解生成的甲瓒，在Beckman880多功能检测仪上测得样品490nm吸光度。
乳酸脱氢酶(LDH)水平用以表征细胞损伤状况，为检测各药物处理组细胞培养液中的LDH水平的变化，取细胞培养液适量，按照试剂盒说明书进行操作，于440nm处测得吸光度。以假造模溶剂对照组细胞吸光度为100％，计算其余各组的相对水平。
结果表明，GSNO模型溶剂组细胞生存率相对于假造模溶剂组为63.5％。给药组能显著减少细胞死亡，TEF+PNS合用中剂量组对内皮细胞保护作用最为显著，能提高细胞生存率至85％左右。而单用TEF或PNS，细胞存活率仅70～75％。参见图5-1，是内皮细胞存活率。图中(A)假造模组；(B)GSNO模型组溶剂组；(C)单用TFE组；(D)单用PNS组；(E)TFE+PNS中剂量组。##P<0.01与假造模组比较；*P<0.05，**P<0.01与GSNO模型组比较。
LDH水平检测显示，与假造模组相比，GSNO模型溶剂组细胞释放入培养液中的LDH量显著增加，用药组能显著降低LDH水平，尤其是TFE+PNS中剂量合用组下调LDH水平最为显著。参见图5-2是LDH释放量。图中(A)假造模组；(B)GSNO模型组溶剂组；(C)单用TFE组；(D)单用PNS组；(E)TFE+PNS中剂量组。##P<0.01与假造模组比较；*P<0.05，**P<0.01与GSNO模型组比较。
实施例10.JC-1染色法和流式细胞术检测TFE+PNS i.g.(重量比值1∶8)在改善大鼠脑室内注射GSNO模型大鼠脑血管内皮细胞线粒体损伤的作用
按实施例9分离收集脑血管制备原代内皮细胞培养。按实施例8中方法进行JC-1染色，同时采用流式细胞术定量测定各组线粒体膜电位高低(红绿荧光比值)。线粒体膜电位丧失表现为红绿荧光比值的减小，是细胞凋亡的上游事件，也表示线粒体功能受损。
结果显示，脑室内注射GSNO模型大鼠血管内皮细胞经JC-1染色后大多呈现绿色，提示GSNO能显著造成血管内皮细胞线粒体损伤，引起膜电位下降。而TFE+PNS中剂量组具有显著提高由于GSNO引起的线粒体膜电位下降的作用，且TFE+PNS合用组的作用明显优于TFE和PNS单用组。
通过流式细胞术定量测定了红绿荧光值，发现模型组呈现绿色荧光的细胞数量最多，即GSNO能显著引起血管内皮细胞线粒体功能受损。而TFE+PNS中剂量组呈现绿色荧光的细胞数量明显较少，提示TFE+PNS中剂量能有效改善GSNO引起线粒体膜电位的下降。结果参见图6和表8。图6是流式细胞术检测TFE+PNS i.g.对脑室内注射GSNO模型大鼠脑血管内皮细胞线粒体损伤的改善作用。图中(A)假造模组，(B)GSNO模型组溶剂组，(C)单用TFE组，(D)单用PNS组，(E)TFE+PNS中剂量组。
表8.TFE+PNS i.g.对脑室内注射GSNO模型大鼠血管内皮细胞线粒体损伤的改善作用
实施例11.免疫印迹法检测TFE+PNS i.g.(重量比值1∶8)在改善大鼠脑室内注射GSNO模型血管内皮细胞NO合酶表达作用
按实施例9分离血管制备原代内皮细胞培养。提取总蛋白，蛋白含量测定，SDS-PAGE，Western Blot法和胶片光密度分析法均按实施例5操作。
结果显示，大鼠脑室内注射GSNO模型血管内皮细胞在亚硝基应激情况下，iNOS蛋白表达显著增加，eNOS蛋白表达改变不明显。TFE+PNS中剂量组具有显著降低由GSNO引起血管内皮iNOS表达大量升高作用，TFE+PNS合用组作用明显优于TFE和PNS单用组。结果参见图7，图中(A)假造模组；(B)GSNO模型组溶剂组；(C)单用TFE组；(D)单用PNS组；(E)TFE+PNS中剂量组。#P<0.05，###P<0.001与假造模组比较；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001与GSNO模型组比较。图7-1是免疫印迹条带；图7-2是eNOS蛋白相对表达量；图7-3是iNOS蛋白相对表达量。
实施例12.Griess法测定检测TFE+PNS i.g.(重量比值1∶8)对大鼠脑室内注射GSNO模型血管内皮细胞NO生成的影响
按实施例9分离血管制备原代内皮细胞培养。细胞贴壁培养24h后，细胞吸取培养液，用Griess试剂法测定培养液中的NO2-含量。具体方法如下：100μl细胞培养液与100μGriess试剂(1％磺胺溶于5％磷酸和0.1％N-1-萘乙二胺盐酸盐1：1等体积混合)混合，放置10分钟后，以酶标仪在550nm处测吸光度。以NaNO2做标准曲线，NaNO2以三蒸水配成1、2、4、8、16、32、64μmol/L的溶液，取100μl各浓度的标准品溶液与100μl Griess混合，放置10分钟后，以酶标仪在550nm处测吸光度。
结果：血管内皮细胞培养液NO生成的改变，与假造模组比较，GSNO模型大鼠血管内皮细胞培养液中NO2-含量明显升高，而单用TFE对其含量几乎没有影响，但用PNS有一定降低NO2-含量的作用。而TFE+PNS中剂量合用后，NO2-的含量极显著降低。(参见图8)。该结果提示，GSNO脑室内注射的确可以导致NO的生成增多，结合实施例5和实施例11中iNOS表达大量升高，可知脑室内注射GSNO处于亚硝基应激状态，可进一步使NO生成大量增加。图8中(A)假造模组；(B)GSNO模型组溶剂组；(C)单用TFE组；(D)单用PNS组；(E)TFE+PNS中剂量组。##P<0.01与假造模组比较；*P<0.05，**P<0.01与GSNO模型组比较。
实施例13.荧光探针法检测TFE+PNS i.g.(重量比值1∶8)在改善脑室内注射GSNO模型血管内皮细胞活性氧生成影响
按实施例9分离血管制备原代内皮细胞培养。细胞贴壁24h后用无色PBS清洗三次，在细胞中加入含5μmol/L活性氧(ROS)特异性探针DCF-DA的新培养液，37度孵育30min，用荧光显微镜观察并记录荧光强弱。
流式细胞术：消化各组细胞成单个悬浮细胞，再分别与50μM H2DCF-DA孵育30min，无色PBS清洗三次，每次5min，立即上样机检。
H2DCF-DA为非极性化合物，它可以穿透细胞膜进入细胞浆，在穿透的过程中，H2DCF-DA在细胞酯酶的作用下，脱去DA，形成H2DCF，H2DCF与细胞内ROS反应形成DCF，DCF在波长为492-495nm激发光的作用下产生绿色荧光，荧光的强弱可以直接反应细胞内ROS的水平高低。
结果显示，脑室内注射GSNO模型大鼠血管内皮细胞ROS生成量增加(绿色荧光强度增强)，单用TFE和单用PNS能少量减少ROS的生成，TFE和PNS合用后能显著降低GSNO引起的大鼠血管内皮细胞内ROS绿色荧光强度，参见图9-1，图中(A)假造模组，(B)模型组，(C)单用TFE组，(D)单用PNS组，(E)TFE+PNS中剂量组。
流式细胞实验进一步量化验证了此结果，TFE+PNS合用中剂量组显著降低GSNO引起的大鼠血管内皮细胞内ROS生成量，参见图9-2，图中(A’)假造模组，(B’)模型组，(C’)单用TFE组，(D’)单用PNS组，(E’)TFE+PNS中剂量组。
表9.TFE+PNS i.g.对脑室内注射GSNO模型大鼠血管内皮细胞活性氧生成影响
实施例14.免疫荧光法检测TFE+PNS i.g.(重量比值1∶8)在改善大鼠脑室内注射GSNO模型大鼠血管内皮细胞蛋白硝基化的作用
按实施例9步聚分离血管制备原代内皮细胞培养。细胞样本用预冷的0.01mol/L PBS洗涤3次。无水冰甲醇-20℃固定20min，PBS清洗后用10％正常羊血清封闭30min。加入一抗硝基酪氨酸单克隆抗体(anti-nitrotyrosine，NT，1：2000稀释)，4℃孵育过夜。用PBS充分清洗3次，每次3min。加入二抗为罗丹明标记羊抗鼠IgG(1：200稀释)，室温避光孵育60min，用PBS充分清洗3次，每次3min，再加入DAPI染核后，用荧光倒置显微镜观察并拍照。
结果显示，脑室内注射GSNO模型大鼠血管内皮细胞酪氨酸硝基化阳性染色(红色荧光)显著上调，单用TFE或单用PNS未能显著改善GSNO引起的血管内皮细胞蛋白硝基化作用，而TFE+PNS合用中剂量组显著降低GSNO引起的硝基化作用(红色荧光明显下调)。参见图10和表10。图10中(A)假造模组给溶剂组，其他都是给GSNO组，(B)模型组(溶剂组)，(C)单用TFE组，(D)单用PNS组，(E)TFE+PNS中剂量组。
结合实施例5，实施例11中iNOS表达大量升高，以及施例12中NO大量生成，实施例13中ROS大量生成，因而为亚硝基应激ONOO-生成提供足够的物质基础，是导致引起血管内皮细胞硝基化蛋白增多的主要原因之一。
表10.TFE+PNS i.g.对脑室内注射GSNO模型大鼠血管内皮细胞蛋白硝基化的影响(means±S.D.，n＝3)
###P<0.001与假造模组比较；*P<0.05，**P<0.01与GSNO模型组比较。
实施例15TFE+PNS部位(重量比值1∶8)包衣片制备片剂的组成
(1)按实施例1方法制得TFE+PNS部位(重量比值1∶8)；
(2)取30g上述配比混合物，将其粉碎成细粉，加入糊精5g，混合均匀后过100目筛；
(3)在第(2)步的混合物中加入10ml95v/v％乙醇，过40目筛制成湿颗粒，烘干至其水分含量为5w/w％，依次过40目筛和80目筛，得到粒度为40—80目的干燥颗粒。
(4)以2g滑石粉和1g硬脂酸镁作为润滑剂，用单冲压片剂将干燥颗粒压成片重约0.2g的素片；
(5)取丙烯酸树脂IV号10g和羟丙基甲基纤维素2.5g，将其溶于20ml95v/v％乙醇，制成溶液1。
(6)取丙烯酸树脂IV号10g和羟丙基甲基纤维素2.5g，将其溶于20ml70v/v％乙醇，制成溶液2。混合溶液1和2，制得溶液3。
(7)取30ml混合溶液3，依次加入蓖麻油5ml，吐温—805ml，滑石粉20g，钛白粉10g，并依次过胶体磨，反复研磨混匀，制得包衣混悬液。
(8)取(4)步所得的素片100片加入包衣锅内，喷入包衣混悬液进行包衣；
(9)最后喷8ml溶液3，抛光，低温干燥，得到薄膜包衣片。
本领域技术人员可参照实施例15的方法，制得其颗粒剂；或将所得的干燥颗粒填充入胶囊，即得其胶囊剂。
以上仅为其中一种固体制剂的一种配方形式。作为含该有效部位的各种固体制剂剂型，可以适当使用适合于各种剂型的添加剂或基质，根据中国药典的记载的常规方法进行制备。
可以根据药剂学允许的制剂方法，制备液体制剂和固体制剂。固体制剂主要包括颗粒剂、片剂、胶囊、软胶丸、软胶囊、滴丸剂、栓剂。液体制剂主要包括口服液体制剂和注射液体制剂。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用。因此，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。