发明领域
本发明涉及药物制剂，更具体的说涉及稳定性改进的肽和蛋 白质的药物制剂。
发明背景
以控制速度延迟传递活性剂来治疗疾病，一直是药物传递领 域的一个目标。已经采取了多种传递活性剂的方法。
这些方法涉及到使用可植入扩散系统和可植入输注泵，来例 如通过静脉内、动脉内、皮下、鞘内、腹膜内、脊髓内和硬膜外途 径传递药物。泵通常以手术方式置入到下腹部的皮下组织腔隙中。 用于疼痛管理、化疗和胰岛素传递的系统描述于BBI Newsletter，第 17卷第12期第209-211页，1994年12月。
有一种方法涉及渗透压驱动的装置，如以下各号美国专利中 描述的装置：3,987,790、4,865,845、5,057,318、5,059,423、5,112,614、 5,137,727、5,234,692和5,234,693，这些专利通过引用结合到本文中。 可将这些装置植入到动物体内，来以控制方式释放活性剂持续预定 的给药时间。一般来说，这些装置作用方式是从外部环境吸入流体 并释放出相应量的活性剂。
其它示例性可植入装置在美国专利第5,034,229号、第 5,057,318号、第5,110,596号和第5,782,396号中教导，这些专利的 内容通过引用结合到本文中。另外其它的示例性可植入装置包括调 节器类型的可植入泵，他们可提供有益物制剂的恒流、可调节流或 可编程流，可获自例如美国马萨诸塞州Codman of Raynham、美国明 尼苏达州Medtronic of Minneapolis和德国Tricumed Medinzintechnik GmbH。可植入装置的更多实例描述于美国专利第6,395,292号、第 6,283,949号、第5,976,109号、第5,836,935号和第5,511,355号，这 些专利通过引用结合到本文中。
有益物从可植入装置进行长时间控制传递具有几个潜在优 点。例如，可植入传递装置的使用通常确保受试者依从性，因为可 植入装置不容易被受试者干预，且可设计成能在数周、数月乃至数 年时间里提供有益物的治疗剂量而无需受试者进行输入。此外，由 于可植入装置在其功能寿命内可只置入一次，与需要在相对较短的 时间间隔里进行多次给药的其它胃肠外给药技术如注射相比，可植 入装置可提供如下好处：对植入部位的刺激减少，对受试者和执业 医生的职业危害更少，废物处置危害减少，成本降低和功效提高。 但是，从可植入装置提供有益物的控制传递存在着几个技术挑战， 肽、多肽、蛋白质和其它蛋白质类物质在持续不间断时间里从可植 入装置的控制传递已被证明特别困难。
为了在长时间里(即数周、数月或数年时间里)以控制速度从可 植入装置传递有益物，必须将有益物配制成在环境和生理温度下稳 定。蛋白质含水环境中天然具有活性，因此蛋白质制剂通常为水溶 液。但是，蛋白质在含水制剂中长时间往往只勉强稳定，蛋白质的 含水药物制剂常常需要冷冻，或者在环境或生理温度下显示较短货 架期。
蛋白质可通过多种机制发生降解，包括脱酰胺、氧化、水解、 二硫化物互换和外消旋作用。此外，水可充当增塑剂促进蛋白质分 子解折叠和不可逆分子聚集。因此，为了提供在环境或生理温度下 长时间稳定的蛋白质制剂，通常需要非水或基本上非水的蛋白质制 剂。
将含水蛋白质制剂减缩成干粉制剂是增加蛋白质药物制剂的 稳定性的一种方式。例如，蛋白质制剂可用多种技术来干燥，包括 喷雾干燥、冷冻干燥或者说冻干和脱水(dessication)。通过这种技术 获得的干粉蛋白质制剂显示出在环境温度乃至生理温度下长时间的 显著提高的稳定性。但是，在需要可流动蛋白质制剂的情况下，如 在可植入传递装置中，单独干粉蛋白质制剂用途有限。
为了提供稳定的可流动蛋白质制剂，有人提出使用肽在非水、 非质子极性溶剂中的溶液制剂。已证实这种制剂在高温长时间下稳 定。但是，基于溶剂的制剂并不适合于所有的蛋白质，因为许多蛋 白质在适合于胃肠外给药的溶剂中的溶解度低。由于蛋白质在溶剂 中的溶解度降低，为传递给定蛋白质剂量所需的制剂量将增加。尽 管相对较大体积的低浓度蛋白质溶液对于注射传递来说是有用的， 但由于尺寸大小上的约束，可植入传递装置通常要求能够在长时间 里以低流速传递治疗水平的蛋白质的相对较高浓度蛋白质制剂。
因此，需要开发出能提供必需的稳定性和传递特性的制剂， 以在长时间里以控制速度从可植入传递装置传递有益物(如肽和蛋白 质)。
发明概述
为了解决这个需求和其它需求，本发明提供了稳定的药物制 剂及其用途。该制剂主要包含肠降血糖素(incretin)或肠降血糖素模拟 肽如毒蜥外泌肽(exendin)、至少一种非质子极性溶剂和任选的一种或 多种稳定性赋形剂。肽在制剂中得到稳定，从而可以长期储藏和/或 在长时间里进行传递。
故此，本发明的一个方面涉及使用非质子极性溶剂如DMSO 来使肽制剂稳定化而抵抗化学和物理降解。已发现非质子极性溶剂 能改进肠降血糖素或肠降血糖素模拟肽在多种制剂条件下(包括高浓 度和高温或非冷冻温度)的总体稳定性，从而使这种肽在高温或室温 下的长期储藏成为可能，也使这种肽在长期装置(如笔式注射装置或 泵式传递装置)中的传递成为可能(长期装置若不这样就不可行)。
本发明的另一个方面涉及用合适的储器来改进治疗活性肽或 蛋白质的长期稳定性和实现其长期传递，从所述储器可以以控制速 度泵出或定量供给所配制的肽。储器可植入在皮肤下面(例如作为可 植入泵装置)，或者以连接或不连接的方式位于身体外部(例如作为笔 式注射装置或外部泵装置)。肽的配制方式使得可在生理温度下提供 稳定性持续治疗暴露期，且能持续供应治疗活性材料持续长达2年。
本发明的这些和其它方面对本领域技术人员将是显而易见 的。
概述
本发明提供了包含肠降血糖素或肠降血糖素模拟肽和至少一 种非质子极性溶剂的稳定药物制剂。肠降血糖素或肠降血糖素模拟 肽的实例为胰高血糖素样肽1(glucagon-like-peptide 1，GLP-1)、毒蜥 外泌肽和它们的衍生物。在一些实施方案中，毒蜥外泌肽是毒蜥外 泌肽-4或其衍生物。非质子极性溶剂的非限制性实例有二甲亚砜 (DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸乙酯、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、 二甲基乙酰胺(DMA)、碳酸丙烯酯和它们的混合物。在一些实施方 案中，非质子极性溶剂是DMSO。
在一些实施方案中，药物制剂可还包含至少一种稳定性赋形 剂、添加剂或溶剂。在一些实施方案中，稳定性赋形剂、添加剂或 溶剂能够将非质子极性溶剂的冰点降低至约0℃或以下。能够降低 非质子极性溶剂的冰点的稳定性赋形剂、添加剂或溶剂可以是水、 糖和糖醇。在一些实施方案中，稳定的非质子极性溶剂是DMSO， 能够降低非质子极性溶剂的冰点的稳定性赋形剂、添加剂或溶剂是 水，水和DMSO形成包含约10％w/w水(0.67摩尔分数DMSO)的共 溶剂。在一些实施方案中，稳定性赋形剂能够使肠降血糖素或肠降 血糖素模拟肽的构象稳定化。
在一些实施方案中，肠降血糖素肽包含一个或多个选自天冬 酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨 酸、酪氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸的氨基酸残基，非质子极性 溶剂、稳定性赋形剂或两者使氨基酸残基稳定免于降解。在一些实 施方案中，氨基酸残基是天冬酰胺或谷氨酰胺，非质子极性溶剂、 稳定性赋形剂或两者通过减少或预防天冬酰胺或谷氨酰胺氨基酸残 基的环状亚酰胺或其它降解产物的形成来使氨基酸残基稳定免于降 解。
在一些实施方案中，稳定的药物制剂还包含至少一种非水质 子溶剂。非水质子溶剂的实例为聚乙二醇(PEG)、丙二醇(PG)、聚乙 烯吡咯烷酮(PVP)、甲氧基丙二醇(MPEG)、甘油、四氢呋喃聚乙二醇 醚(glycofurol)和它们的混合物。
在一些实施方案中，稳定的药物制剂还包含缓冲剂。在一些 实施方案中，缓冲剂是乙酸盐缓冲剂。
在一些实施方案中，稳定的药物制剂还包含抗氧化剂。抗氧 化剂的实例包括抗坏血酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、一硫代甘油、硫 代硫酸钠、亚硫酸盐、BHT、BHA、抗坏血酸棕榈酸酯、没食子酸 丙酯和维生素E。
在一些实施方案中，稳定的药物制剂还包含螯合剂。螯合剂 的实例为EDTA、酒石酸及其盐、甘油和柠檬酸及其盐。
在一些实施方案中，稳定的药物制剂还包含糖、糖醇或非水 溶剂。非水溶剂的实例为乙醇、甘油、丙二醇和聚乙二醇。
在一些实施方案中，稳定的药物制剂还包含防腐剂。防腐剂 的实例为苄醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。
在一些实施方案中，稳定的药物制剂还包含在约30℃至约 37℃的温度下不胶凝的热响应性聚合物(thermo-responsive polymer)。
在一些实施方案中，肠降血糖素或肠降血糖素模拟肽与锌络 合形成锌络合物。一些实施方案中，锌络合物包含GLP-1或其类似 物。一些实施方案中，锌络合物包含毒蜥外泌肽或其类似物。一些 实施方案中，锌络合物包含毒蜥外泌肽-4-锌络合物。一些实施方案 中，锌络合物分散在溶剂中。
在一些实施方案中，稳定的药物制剂其粘度为约0.25cP至约 1,000,000cP。
在一些实施方案中，稳定的药物制剂其pH处在或低于肠降血 糖素或肠降血糖素模拟肽的pI。在一些实施方案中，稳定的药物制 剂其pH为约pH4.0至约pH7.5。在一些实施方案中，稳定的药物制 剂其pH为约pH4.0至约pH6.0。在一些实施方案中，稳定的药物制 剂其pH为约pH4.5。
在一些实施方案中，肠降血糖素或肠降血糖素模拟肽的存在 浓度为约0.1mg/ml直至肠降血糖素模拟肽在制剂中的溶解度极限。 在一些实施方案中，肠降血糖素或肠降血糖素模拟肽的存在浓度为 约1mg/ml至约100mg/ml。
在一些实施方案中，稳定的药物制剂还进行冻干。在一些实 施方案中，冻干制剂在临用前进行重构。
在一些实施方案中，肽从pH为约pH4.0至约pH7.5的溶液 中冻干。在一些实施方案中，肽从pH为约pH4.0至约pH6.0的溶 液中冻干。在一些实施方案中，肽从pH为约pH4.5的溶液中冻干。
本发明还提供治疗疾病(disease)、病症(condition)或紊乱 (disorder)的方法，该疾病、病症或紊乱可通过将本文描述的药物制剂 以能有效治疗、减轻或预防该疾病、病症或紊乱的量给予受试者来 进行治疗、减轻或预防。
本发明还提供本文描述的药物制剂用于治疗疾病、病症或紊 乱的用途，所述疾病、病症或紊乱可通过给予肠降血糖素或肠降血 糖素模拟肽来治疗、减轻或预防。
在一些实施方案中，所述疾病、病症或紊乱包括葡萄糖不耐 受和糖尿病。在一些实施方案中，所述疾病、病症或紊乱是糖尿病。 在一些实施方案中，所述疾病、病症或紊乱是II型糖尿病。
在一些实施方案中，所述给予是胃肠外给予。在一些实施方 案中，所述给予是连续给予。在一些实施方案中，所述给予通过使 用可植入或可附接的泵药物传递装置来实现。在一些实施方案中， 所述给予连续进行约1个月至约6个月的时间。在一些实施方案中， 所述给予通过使用笔式注射装置来实现。
附图简述
图1示出SCX-HPLC方法测出的毒蜥外泌肽-4在代表性 DMSO制剂中的纯度。
图2示出RP-HPLC方法测出的毒蜥外泌肽-4在代表性DMSO 制剂中的纯度。
图3示出SCX-HPLC方法测出的，与25℃下保持的含水缓 冲液制剂相比代表性DMSO制剂的初始纯度百分比。
图4示出SCX-HPLC方法测出的，与40℃下保持的含水缓 冲液制剂相比代表性DMSO制剂的初始纯度百分比。
发明详述
标准的肽和蛋白质药物制剂是稀水溶液。肽稳定性通常通过 改变一个或多个以下参数来实现：pH、缓冲液类型、离子强度和赋 形剂(EDTA、抗坏血酸等)。对于这些制剂，不能完全稳定化需要水 的降解途径(水解、脱酰胺、外消旋作用)，这种制剂通常必须保藏在 零度以下或冷冻温度下，以保护它免于通过降解途径(如酸/碱催化的 水解、脱酰胺、外消旋作用和氧化作用)发生的降解。与此对比，在 一个方面，在非水溶剂如二甲亚砜(DMSO)中配制的肠降血糖素和肠 降血糖素模拟肽显示出在化学上和物理上比在水中配制的更加稳 定。本发明要求保护的制剂能使肽化合物在高温下(例如从冷冻温度 至约50℃、室温至约40℃、室温至约生理温度等)和高浓度下(例如 2.5％w/v、5％w/v、10％w/v等)保持稳定。
按照本公开内容，DMSO是示例性的非质子极性溶剂。尽管 不想局限于理论，但还是认为非质子溶剂能降低降解速度，是因为 它们缺乏给降解反应贡献质子的能力。相反，认为极性比水更强的 溶剂(例如水的偶极矩为1.85，DMF为3.82，DMSO为3.96)能增加 降解速度，是因为它们能帮助稳定化速度决定步骤。但是，发现某 些非质子极性溶剂的总体作用是一般使肽的溶液稳定化，所述肽如 肠降血糖素和肠降血糖素模拟肽，更具体的说具有天冬酰胺、谷氨 酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨酸、酪氨酸、 组氨酸、赖氨酸和/或精氨酸氨基酸残基的肽。
因此，本发明在一个方面提供以下问题的解决方案，即如何 用合适的储器由其以可控或所需速度泵出或定量供给配制的肽，实 现治疗活性肠降血糖素和肠降血糖素模拟肽的长期稳定性和延迟传 递。储器可植入在皮肤下面(例如作为可植入泵装置)，或者以连接或 不连接的方式位于身体外部(例如作为笔式注射装置或外部泵装置)。 肽的配制方式使得在非冷冻温度下(如室温或生理温度)提供稳定性持 续治疗暴露期间，且可供应治疗活性材料持续长达2年。
本发明的另一个方面提供非质子极性溶剂如DMSO使肽制剂 稳定化而抵抗化学和物理降解的用途。已发现非质子极性溶剂可改 进肠降血糖素或肠降血糖素模拟肽在多种制剂条件下(包括高浓度和 高温)的总体稳定性，从而使这种肽在非冷冻下的长期储藏成为可能， 也使在长期可植入装置中的传递成为可能(长期装置若不这样就不可 行)。
本发明的又一个方面提供非质子极性溶剂使肠降血糖素或肠 降血糖素模拟肽制剂稳定化的用途，这使得这种肽能以化学未修饰 形式、修饰但具有治疗活性的形式和/或容易转化成治疗活性物质的 形式随时间推移而释放。
本发明在一个方面提供包括DMSO和10％水的共溶剂溶液。 大约8％w/w的水将DMSO的冰点降低到正好0℃以下。观察到对 于含有10％w/w水(0.67摩尔分数DMSO)的DMSO溶剂溶液，毒蜥 外泌肽-4的稳定性得到增强。
本文所用的以下术语具有以下涵义：
术语“化学稳定性”意指由化学途径如氧化或水解形成的降 解产物的可接受百分比。具体的说，如果在室温下两个月后形成的 降解产物不超过约30％、25％、20％、10％、5％、2％或1％，则认为 制剂具有化学稳定性。
术语“物理稳定性”意指所形成的聚集体(例如二聚体、三聚 体和更大的形式)的可接受百分比。具体的说，如果在室温下两个月 后形成的聚集体不超过约25％、20％、15％、10％、5％、2％或1％， 则认为制剂具有物理稳定性。
术语“稳定的制剂”意指在室温下两个月(或在高温下相当的 条件)后保持有至少约65％的化学上和物理上稳定的肽化合物。特别 有用的制剂是在这些条件下保持有至少约80％的化学上和物理上稳 定的肽制剂。特别适需的稳定制剂是在灭菌辐射(例如γ射线、β射 线或电子束)后不显示极大降解的制剂。
术语“肽”和/或“肽化合物”意指由最多约50个氨基酸残基 通过酰胺键(CONH)结合在一起的聚合物。任何这些聚合物的类似 物、衍生物、激动剂、拮抗剂和药物可接受的盐都包括在这些术语 中。这些术语还包括具有D-氨基酸、D-或L-构型的修饰、衍生化或 非天然的氨基酸和/或肽模拟单元(peptomimetic unit)作为其结构一部 分的肽和/或肽化合物。
术语“肠降血糖素”或“肠降血糖素模拟肽”指以下化合物(例 如肽)，其直接或间接地造成胰岛素释放量发生葡萄糖依赖性增加， 使得当血浆葡萄糖水平升高时从胰腺释放的胰岛素量大于当血浆葡 萄糖水平正常时。但是，肠降血糖素和肠降血糖素模拟肽可具有许 多另外的生物功能，本文公开的制剂和方法并不局限于仅在胰岛素 释放情形下的用途。肠降血糖素的具体实例包括GIP和GLP-1以及 它们的类似物和衍生物。肠降血糖素模拟肽的实例包括毒蜥外泌肽-3 和毒蜥外泌肽-4以及它们的类似物和衍生物。
术语“高浓度”意指约2.5％w/v直至特定肽的最大溶解度。
术语“赋形剂”意指在制剂中加入作为稀释剂或介质或者加 入以给予形状或稠度的物质。举例说，赋形剂包括用以将药物溶于 制剂中的溶剂如EtOH，用以促进药物在制剂中的溶解的非离子型表 面活性剂如Tween 20，和用以预防或抑制微生物生长的防腐剂如苄 醇或对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯。
术语“非质子极性溶剂”意指不含有酸性氢和不充当氢键供 体的极性溶剂。非质子极性溶剂的实例包括二甲亚砜(DMSO)、二甲 基甲酰胺(DMF)、乙酸乙酯、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基乙酰胺 (DMA)和碳酸丙烯酯。
术语“非水质子溶剂”意指含有与氧或氮连接的氢，从而能 够形成氢键或供给质子的非极性溶剂。非水质子溶剂的实例包括聚 乙二醇(PEG)、丙二醇(PG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、甲氧基丙二醇 (MPEG)、甘油和四氢呋喃聚乙二醇醚。
本发明的一个方面涉及肠降血糖素和肠降血糖素模拟肽化合 物在至少一种非质子极性溶剂中的药物制剂，其在高温下能长时间 稳定。标准的稀含水肽和蛋白质制剂需要操纵缓冲剂类型、离子强 度、pH和赋形剂(例如EDTA和抗坏血酸)来实现稳定性。与此对比， 本发明要求保护的制剂通过使用非质子极性溶剂来实现肽化合物的 稳定化。具体的说，可通过本文公开的制剂来提供高浓度(例如约2.5％ w/v)的肽化合物的稳定性。
上文提到，意外发现配制在非质子极性溶剂中的某些肽如肠 降血糖素和肠降血糖素模拟肽(包括GLP-1和毒蜥外泌肽，特别是毒 蜥外泌肽)比在水中配制时具有改进的稳定性。在一个方面，提供在 至少一种非质子极性溶剂中包含肠降血糖素或肠降血糖素模拟肽的 药物制剂，其在高温或非冷冻温度下在化学上和物理上长时间稳定。 该制剂可还包含一种或多种稳定性赋形剂。这种制剂即使在使用高 浓度时也稳定。因此，这些制剂的有利之处在于，它们可在处于或 高于非冷冻温度、室温或生理温度下长时间运输和储藏。它们还适 合在可植入传递装置中使用。
在某些实施方案中，肽溶解于一种或多种非质子极性溶剂、 各非质子极性溶剂的混合物、一种或多种非质子极性溶剂和水的混 合物或者一种或多种非质子极性溶剂、稳定性赋形剂(如缓冲剂)和非 水质子溶剂的混合物中。制剂可以是自由流动的液体、粘稠凝胶样 混合物或冷冻干燥的组合物。肽在制剂中稳定化，使得它以化学未 修饰形式、修饰但具有治疗活性的形式和/或容易转化成治疗活性物 质的形式释放。
在一些实施方案中，可将肠降血糖素和肠降血糖素模拟肽化 合物与金属离子络合，所成的蛋白质或肽-金属络合物相比未络合的 蛋白质或肽的溶解情况，显示出在一种或多种非质子极性溶剂、各 非质子极性溶剂的混合物、一种或多种非质子极性溶剂和水的混合 物或者一种或多种非质子极性溶剂、稳定性赋形剂(如缓冲剂)和非水 质子溶剂的混合物中的溶解度减少。在一些实施方案中，通过将治 疗活性肽或蛋白质与金属离子如锌阳离子进行络合或螯合，使它们 的稳定性得到增强，所述肽或蛋白质如肠降血糖素模拟肽，或者更 具体的说毒蜥外泌肽-3、毒蜥外泌肽-4或其类似物或衍生物。在一些 实施方案中，将肽或蛋白质-金属络合物悬浮于DMSO、0.5％水/DMSO 或10％水/DMSO中，所成的肽或蛋白质-金属络合物相比未络合的肽 或蛋白质的溶解情况显示出改进的稳定性。虽然不想局限于理论， 但还是认为例如与锌阳离子的络合或螯合是通过减少治疗活性肽或 蛋白质的溶解度，从而减少该肽或蛋白质对溶剂分解的降解作用的 易感性，来增加该肽或蛋白质的稳定性的。因此，与将非络合的蛋 白质或肽溶解于该溶剂中相比，随后将肽或蛋白质-锌络合物悬浮在 非质子极性溶剂中可进一步改进络合物的稳定性。在一些实施方案 中，获得了可目视观察到的白色沉淀物于DMSO中的分散体，该沉 淀物含有大约25mg/mL的毒蜥外泌肽-4-锌络合物形式的毒蜥外泌肽 -4。在一些实施方案中，毒蜥外泌肽-4-锌络合物于DMSO中的分散 体含有约1mg/ml至约100mg/mL的毒蜥外泌肽-4。在一些实施方案 中，对肽-金属锌络合物在各种温度下和在不同时间长度的稳定性进 行进一步测试。
蛋白质、肽或肽化合物与金属离子的络合可用于配制在长时 间内传递的有益物。络合作用还可让蛋白质、肽或肽化合物在所需pH 下进行配制，使得制剂可与第二有益物进行混合或共给予，而因pH 改变所致的沉淀的风险减少。
在一些实施方案中，制剂将为液体形式，或者在使用条件下 将为可流动的粘稠凝胶。这种制剂可显示出例如约0.25-1,000,000cP 的粘度。在另一个实施方案中，制剂将为冻干粉，在临用前可进行 重构。
在另一个方面，公开了肠降血糖素和肠降血糖素模拟肽在本 文所述制剂中的用途，所述肽从pH为约pH4至约pH7.5、约pH4 至约pH6、约pH4至约pH5或pH4.5的水溶液中冻干(在配制前或 后)，所述制剂导致稳定性提高。在又一个方面，公开了肠降血糖素 和肠降血糖素模拟肽在本发明制剂中的用途，所述肽从pH处于或低 于肠降血糖素肽的pI的水溶液中冻干(在配制前或后)，所述制剂导 致稳定性提高。
肠降血糖素和肠降血糖素模拟肽是在葡萄糖水平正常或者特 别是升高时引起胰岛素释放量增加的化合物。这些肠降血糖素和肠 降血糖素模拟肽除了胰岛素分泌方面的固有作用外，还具有其它作 用。例如，它们也可具有减少胰高血糖素产生和延迟胃排空的作用。 另外，它们还可具有改进胰岛素敏感性的作用，且它们可增加胰岛 细胞新生(即新胰岛的形成)。
肠降血糖素作用的概念从以下观察结果发展而来：对口服葡 萄糖的胰岛素响应超过静脉内给予相等量葡萄糖后所测出的响应。 推断认为，肠衍生的因子或者说肠降血糖素影响了餐后胰岛素释放。 营养物进入胃部和近端胃肠道引起肠降血糖素激素的释放，后者然 后刺激胰岛素分泌。这个促胰岛素作用(insulinotropism)或者说刺激胰 岛素分泌的能力，可通过比较对口服和静脉内葡萄糖负荷的胰岛素 或C-肽响应来定量。这样，证实了肠降血糖素作用是健康个人中约 50％-70％的对口服葡萄糖的胰岛素响应的原因。
虽然许多餐后产生的激素也具有肠降血糖素样活性，但主要 的肠降血糖素和肠降血糖素模拟肽包括葡萄糖依赖性促胰岛素多肽 (也称肠抑胃肽(GIP))、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和毒蜥外泌肽。
GIP和GLP-1均属于胰高血糖素肽超家族，因此共有一些氨 基酸序列同一性。GIP和GLP-1由胃肠道中的特化细胞分泌，具有 位于胰岛细胞以及其它组织上的受体。两者作为肠降血糖素均响应 营养物的摄取而从肠中分泌，从而导致胰岛素分泌提高。GIP和GLP-1 的促胰岛素作用取决于周围葡萄糖的升高。两者都被二肽基肽酶IV (DPP-IV)这种遍在酶快速失活。
更具体的说，GIP是在特化的肠内分泌K细胞中合成并由其 分泌的单一42氨基酸肽。这些细胞主要集中在十二指肠和近端空肠， 但也可在肠中各处发现。GIP分泌的主要刺激因素是富含碳水化合物 和脂质的膳食的摄取。摄取后，循环血浆GIP水平增加10-20倍。完 整GIP的半寿期在健康人中估计大约为7.3分钟，在糖尿病受试者中 为5.2分钟。
除了用GIP灌注方案外，还用GIP受体拮抗剂、GIP肽拮抗 剂和GIP受体敲除小鼠阐明了GIP的生理作用。在大鼠和小鼠中阻 断GIP与其受体的结合，导致口服葡萄糖负荷后葡萄糖依赖性胰岛 素分泌减弱。类似地，在大鼠中给予GIP拮抗剂或GIP抗血清明显 减少餐后胰岛素释放。GIP受体敲除小鼠显示正常的空腹葡萄糖水 平，但在口服葡萄糖负荷后显示轻度葡萄糖不耐受。有趣的是，这 些小鼠还显示对数月高脂肪饲喂后由膳食引起的肥胖的抗性。另外， 在瘦蛋白缺陷型ob/ob小鼠中，GIP受体敲除基因型似乎能减少所发 展的肥胖的程度。
在分离的大鼠胰岛、分离的灌注大鼠胰腺、狗和人中GIP灌 注都显示出现胰岛素分泌的刺激。在逐步的正常血糖钳夹、轻度高 血糖(超出基底54mg/dL)钳夹和中度高血糖(超出基底143mg/dL)钳 夹过程中，证明GIP灌注只在高葡萄糖浓度存在下才导致胰岛素分 泌。此外，证明GIP在正常血糖或高血糖条件下在正常人中没有促 胰高血糖素作用。因此，内源释放的GIP的作用似乎是餐后胰岛素 分泌的重要机制，且似乎在空腹状态下不起作用。
GIP还具有许多非肠降血糖素方面的作用。与其它胰岛素促分 泌素不同的是，在INS-1胰岛细胞系研究中发现，GIP能刺激β细胞 增殖和细胞存活。此外，动物研究提示GIP在脂质代谢中的作用： 刺激脂蛋白脂肪酶活性，诱导脂肪酸掺入到脂肪组织中和刺激脂肪 酸合成。但是，在人体中，没有明显证据证明GIP对脂质代谢的作 用。GIP似乎还刺激胰高血糖素从分离的灌注大鼠胰腺的分泌，不过 在人体研究中没有证明其对胰高血糖素分泌的显著影响。此外，与 GLP-1不同的是，GIP似乎通过加速胃的排空而不是通过抑制胃肠道 运动性而起作用。
GLP-1这种胰高血糖素基因的产物，是由主要位于回肠和结肠 的肠内分泌L细胞合成和分泌的30/31氨基酸肽，不过十二指肠和空 肠中的L细胞也有分泌。胰高血糖素基因的其它肠降血糖素产物包 括不具生物活性的肠高血糖素和具有一定促胰岛素特性的泌酸调节 肽。和GIP一样，GLP-1受体在胰岛、大脑、心脏、肾脏和胃肠道 中广泛表达。
在膳食摄取后有两种主要形式的生物活性GLP-1分泌：GLP- 1(7-37)和GLP-1(7-36)酰胺，它们只相差一个氨基酸。虽然两者等 效且具有类似的生物活性，但循环中的活性GLP-1大部分似乎是 GLP-1(7-36)酰胺。GLP-1从远端肠道的分泌由营养物进入近端胃肠 道内腔中引发的神经和内分泌信号触发。GLP-1的循环水平在食物 摄取数分钟时间内快速增加，且与胰岛素的释放高度相关。和GIP 一样，GLP-1在高葡萄糖浓度存在下增强胰岛素分泌。DPP-IV能将 GLP-1快速切割成其截短的失活代谢物。灌注的GLP-1其半寿期比 GIP要短，在非糖尿病人和糖尿病人中都大约为2分钟。
GLP-1能发挥许多生物作用，在动物研究中所见的GLP-1作 用大多数在人类研究中也得到证明。GLP-1是对口服葡萄糖的胰岛 素响应的原因的显著部分，用GLP-1受体拮抗剂进行的动物和人类 研究均表明GLP-1对于正常葡萄糖耐受可能是必要的。GLP-1不仅 能增强胰岛素分泌，而且能以葡萄糖依赖性方式抑制胰高血糖素的 分泌。换句话说，GLP-1对胰高血糖素的抑制不出现在低血糖的血 浆葡萄糖浓度，而是需要正常血糖或高血糖的存在。有证据证明GLP-1 和GIP一样能增加β细胞增殖和帮助维持β细胞群体。在动物和人 类研究中还证实GLP-1能减慢胃排空，导致减慢营养物进入肠道中 和降低餐后葡萄糖浓度。
GLP-1在调节食物摄入和重量减轻的作用也得到极大的关注。 在啮齿类动物中，GLP-1或GLP-1受体激动剂的急性脑室内注射导 致食物摄入的减少。此外，GLP-1受体拮抗剂毒蜥外泌肽9-39的中 枢给予导致大鼠食物摄入增加。
总之，GLP-1：(1)刺激葡萄糖依赖性胰岛素分泌；(2)抑制餐 后胰高血糖素分泌；(3)在葡萄糖负荷或膳食摄取后降低血糖和(4)减 慢胃排空，导致血糖波动减少和葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少。
毒蜥外泌肽是涉及到胰岛素分泌的另一肽家族。毒蜥外泌肽 存在于希拉毒蜥(Gila-monster，美国亚利桑那州独有的蜥蜴)和墨西哥 珠毒蜥(Mexican Beaded Lizard)的唾液中。毒蜥外泌肽-3存在于墨西 哥珠毒蜥(Heloderma horridum)的唾液中，毒蜥外泌肽-4存在于希拉 毒蜥(Heloderma suspectum)的唾液中(Eng，J.等，J.Biol.Chem.， 265：20259-62，1990；Eng.，J.等，J.Biol.Chem.，267：7402-05(1992))。 毒蜥外泌肽与胰高血糖素样肽家族的几个成员具有一些序列相似 性，其中与GLP-1具有53％的最高同一性(Goke等，J.Biol.Chem.， 268：19650-55(1993))。
毒蜥外泌肽-4是胰岛素分泌性TC1细胞、来自豚鼠胰腺的分 散腺泡细胞和来自胃的胃壁细胞上的GLP-1受体的强力激动剂；该 肽还能刺激促生长素抑制素释放和抑制分离胃中的胃泌素释放(Goke 等，J.Biol.Chem.，268：19650-55(1993)；Schepp等，Eur.J.Pharmacol， 69：183-91(1994)；Eissele等，Life Sci，55：629-34(1994))。发现毒蜥外 泌肽-3和毒蜥外泌肽-4是刺激胰腺腺泡细胞中的cAMP产生和从该 细胞释放淀粉酶的GLP-1激动剂(Malhotra，R.等，Relulatory Peptides， 41：149-56(1992)；Raufman等，J.Biol Chem.，267：21432-37(1992)； Singh等，Regul Pept，53：47-59(1994))。已提议将毒蜥外泌肽-3和毒蜥 外泌肽-4的促胰岛素活性用于糖尿病的治疗和高血糖的预防(Eng，美 国专利第5,424,286号)。
已有报告说截短的毒蜥外泌肽，如毒蜥外泌肽[9-39]这种羧基 酰胺化分子和3-39至9-39的片断，是GLP-1的强力和选择性拮抗剂 (Goke等，J.Biol.Chem.，268：19650-55(1993)；Raufman，J.P.等，J.Biol Chem.，266：2897-902(1991)；Schepp，W.等，Eur.J.Pharm.，269：183-91 (1994)；Montrose-Rafizadeh等，Diabetes，45(Suppl.2)：152A(1996))。 毒蜥外泌肽[9-39]在体内阻断内源性GLP-1，导致胰岛素分泌减少 (Wang等，J.Clin.Invest.，95：417-21(1995)；D′Alessio等，J.Clin.Invest， 97：133-38(1996))。已从大鼠胰岛细胞克隆出明显导致GLP-1的促胰 岛素作用的受体(Thorens，B.，Proc.Natl.Acad. Sci USA 89：8641-8645 (1992))。毒蜥外泌肽和毒蜥外泌肽[9-39]能结合克隆的GLP-1受体(大 鼠胰腺细胞GLP-1受体：Fehmann HC等，Peptides，15(3)：453-6 (1994)；人GLP-1受体：Thorens B等，Diabetes，42(11)：1678-82 (1993))。在转染了克隆的GLP-1受体的细胞中，毒蜥外泌肽-4是激 动剂，即它增加cAMP，而毒蜥外泌肽[9-39]是拮抗剂，即它阻断毒 蜥外泌肽-4和GLP-1的刺激作用(出处同上)。
毒蜥外泌肽-4是存在于希拉毒蜥(Heloderma horridum)唾液中 的39氨基酸C末端酰胺化肽，与GLP-1肽序列具有53％氨基酸序 列同一性。参见例如Eng，J.等.J.Bio.Chem.，267：11，第7402-7405页 (1992)；Young等.，Diabetes，第48卷第1026-1034页，1999年5月。 就其活性而言，毒蜥外泌肽-4是GLP-1受体的高度特异性激动剂， 且和GLP-1一样能够刺激胰岛素分泌。因此，毒蜥外泌肽-4和GLP- 1一样被认为是促胰岛素肽。
但是，与GIP和GLP-1不同的是，毒蜥外泌肽-4在人体中具 有相对较长的半寿期，因为它对在体内快速降解GIP和GLP-1序列 的二肽基肽酶IV具有抗性。此外，已证实与GLP-1相比，毒蜥外泌 肽-4具有较强的刺激胰岛素分泌的能力，可用较少量的毒蜥外泌肽-4 来获得这种刺激活性。参见例如美国专利第5,424,286号(通过引用结 合到本文中)。因此，毒蜥外泌肽-4或其衍生物(参见例如美国专利第 6,528,486号(通过引用结合到本文中)及其相应的国际申请WO 01/04156中所述的衍生物)比GIP和GLP-1具有更大的适用于治疗涉 及胰岛素水平调节异常的病症(例如糖尿病)的潜在用途。同样落入本 发明范围的是包含毒蜥外泌肽激动剂、毒蜥外泌肽类似物和/或毒蜥 外泌肽激动剂类似物(如国际专利申请出版物WO99/25727、WO 99/25728和WO99/07404中公开的)的组合物。
可用于本文公开的制剂和方法的肽化合物可以以盐、通常是 药物可接受盐的形式使用。有用的盐是本领域技术人员公知的，包 括与无机酸、有机酸、无机碱或有机碱所成的盐。在一个实施方案 中，盐是乙酸盐。
容易溶于非质子极性溶剂的肽和肽化合物特别有用，不过可 用本领域公知的各种赋形剂和增溶技术来提高目的肽的溶解度。本 领域技术人员能根据化合物的溶解度容易确定那些化合物可用，即 化合物必须可溶于特定的非质子极性溶剂中达到至少可接受的量。 在一个具体的实施方案中，肽化合物是毒蜥外泌肽，包括毒蜥外泌 肽-4及其类似物。
或者，显示较低溶解度的蛋白质、肽和肽化合物也有用。在 一些实施方案中，治疗活性肽或蛋白质，如毒蜥外泌肽模拟物或者 更具体的说毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4或它们的类似物或衍生物， 其稳定性可通过用金属离子如锌阳离子对该肽或蛋白质进行络合或 螯合来增强。虽然不想局限于理论，但还是认为例如与锌阳离子的 络合或螯合是通过减少治疗活性肽或蛋白质的溶解度，从而减少该 肽或蛋白质对溶剂分解的降解作用的易感性，来增加该肽或蛋白质 的稳定性的。因此，随后将肽或蛋白质-锌络合物悬浮在非质子极性 溶剂中，相比将非络合的蛋白质或肽溶解于该溶剂中，预期可进一 步改进络合物的稳定性。
肠降血糖素或肠降血糖素模拟肽的比例，可视化合物、待治 疗病症、化合物的溶解度、预期剂量和给药持续时间而变。(参见例 如The Pharmacological Basis of Therapeutics，Gilman等，第7版(1985) 和Pharmaceutical Sciences，Remington，第18版(1990)，这两个文献 的公开内容通过引用结合到本文中)。肽在高浓度制剂中的浓度可在 从至少约0.05mg/mL到该肽化合物的最大溶解度的范围内。在一个 实施方案中，该范围为0.05mg/mL至约100mg/mL，约0.05mg/mL 至约50mg/mL，约0.2mg/mL至约25mg/mL，约1.0mg/mL至约10.0 mg/mL，约2.5至约5.0mg/mL等。
还落入本公开范围的是本文所述制剂的体内代谢产物。这种 产物可例如由所给予化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、酯化等， 主要是酶促过程而产生。因此，本发明还包括由以下方法产生的化 合物，该方法包括将本文所述制剂与哺乳动物接触足以产生其代谢 产物的一段时间。这种产物通常如下鉴定：制备放射标记(例如C14或H3)的本文所述制剂，将其以可检测剂量(例如大于约0.5mg/kg)给 予哺乳动物如大鼠、小鼠、豚鼠、猴子或人，让代谢有足够时间发 生(通常约30秒至约30小时)，从尿液、血液或其它生物样品分离出 其转化产物。这些产物由于进行了标记而容易分离(其他产物用能够 结合残存在代谢物中的表位的抗体来分离)。代谢物结构以常规方式 测定，例如通过MS或NMR分析来测定。一般来说，可用本领域技 术人员公知的常规药物代谢研究的相同方式来进行代谢物分析。转 化产物即使不具有自己的生物活性，只要它们在别的情况下不在体 内存在，也可用于本文所述制剂的治疗性给药的诊断试验。
通常，简单地将所需数量(可为治疗有效量)的所需肽化合物溶 解于选定的非质子极性溶剂中，可制备本文描述的稳定制剂。示例 性的非质子极性溶剂包括二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、 乙酸乙酯、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基乙酰胺(DMA)、碳酸丙烯 酯和它们的混合物。
非质子极性溶剂可任选包括少量的所需数量的水。增加肽制 剂所含的水量通常会增加肽的降解。但是，制剂的稳定化作用仍然 可足以导致可接受的长期稳定性。
在一个实施方案中，非质子极性溶剂的冰点处于或低于约 0℃，以避免在储藏过程中发生冻结。在这点上，虽然不想局限于理 论，但还是认为肽稳定性是通过避免相变而促成的。故此，在一个 方面，制剂可显示出低于约0℃的冰点。这种冰点可以是非质子极 性溶剂的固有特性，或者可用共溶剂体系来获得所需的冰点。
可用于本文所述制剂的情形中的稳定性赋形剂，包括任何起 到增加肠降血糖素或肠降血糖素模拟肽在本发明制剂中的溶解度、 物理稳定性和/或化学稳定性的药物可接受成分。本文描述的药物制 剂可包括一种或多种稳定性赋形剂，且每种赋形剂可具有一种或多 种稳定性功能。
在一个方面，稳定性赋形剂可起到使肽的物理性质稳定化的 作用。能够使肠降血糖素或肠降血糖素模拟肽稳定化的合适稳定性 赋形剂的实例包括糖、糖醇、非水溶剂或它们的混合物。在此情形 下的合适非水溶剂的实例有乙醇、甘油、丙二醇和聚乙二醇。
在一些实施方案中，稳定性赋形剂可起到使肽稳定化而免于 化学降解的作用，例如通过减少或防止天冬酰胺和谷氨酰胺氨基酸 残基形成环状亚酰胺或其它降解产物来稳定化。
化学降解的减少可观察到为例如，与不含非质子极性溶剂和/ 或至少一种稳定性赋形剂的制剂的降解速度相比，包含非质子极性 溶剂和/或至少一种稳定性赋形剂的制剂的降解速度减少了约2％、约 5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约 25％、约30％、约35％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％ 或约90％。
在一些实施方案中，与不含非质子极性溶剂和/或至少一种稳 定性赋形剂的制剂相比，包含非质子极性溶剂和/或至少一种稳定性 赋形剂的制剂，如果在25℃下一个月后观察到化学降解产物百分比 较少，则认为该制剂显示化学降解产物减少。在一些实施方案中， 与不含非质子极性溶剂和/或至少一种稳定性赋形剂的制剂相比，包 含非质子极性溶剂和/或至少一种稳定性赋形剂的制剂，如果在25℃ 下两个月后观察到化学降解产物百分比较少，则认为该制剂显示化 学降解产物减少。在一些实施方案中，与不含非质子极性溶剂和/或 至少一种稳定性赋形剂的制剂相比，包含非质子极性溶剂和/或至少 一种稳定性赋形剂的制剂，如果在25℃下三个月后观察到化学降解 产物百分比较少，则认为该制剂显示化学降解产物减少。在一些实 施方案中，与不含非质子极性溶剂和/或至少一种稳定性赋形剂的制 剂相比，包含非质子极性溶剂和/或至少一种稳定性赋形剂的制剂， 如果在25℃下六个月后观察到化学降解产物百分比较少，则认为该 制剂显示化学降解产物减少。在一些实施方案中，与不含非质子极 性溶剂和/或至少一种稳定性赋形剂的制剂相比，包含非质子极性溶 剂和/或至少一种稳定性赋形剂的制剂，如果在37℃下一个月后观察 到化学降解产物百分比较少，则认为该制剂显示化学降解产物减少。 在一些实施方案中，与不含非质子极性溶剂和/或至少一种稳定性赋 形剂的制剂相比，包含非质子极性溶剂和/或至少一种稳定性赋形剂 的制剂，如果在37℃下两个月后观察到化学降解产物百分比较少， 则认为该制剂显示化学降解产物减少。在一些实施方案中，与不含 非质子极性溶剂和/或至少一种稳定性赋形剂的制剂相比，包含非质 子极性溶剂和/或至少一种稳定性赋形剂的制剂，如果在37℃下三个 月后观察到化学降解产物百分比较少，则认为该制剂显示化学降解 产物减少。在一些实施方案中，与不含非质子极性溶剂和/或至少一 种稳定性赋形剂的制剂相比，包含非质子极性溶剂和/或至少一种稳 定性赋形剂的制剂，如果在37℃下六个月后观察到化学降解产物百 分比较少，则认为该制剂显示化学降解产物减少。
在又一方面，稳定性赋形剂可起到使非质子极性溶剂的冰点 降低至0℃或以下的作用。低于0℃的冰点据认为是通过防止在制备 和储藏的可能条件下出现相变来使制剂稳定化。在这点上，虽然不 想局限于理论，但还是认为肽的物理稳定性是通过使相变减至最低 来保持的。在这个情形下的合适赋形剂的实例包括水、盐、糖、糖 醇和它们的混合物。或者，在这个情形下的赋形剂可以是非水质子 溶剂或者能够使第一非质子极性溶剂的冰点降低的第二非质子极性 溶剂。
在又一个方面，稳定性赋形剂可起到将制剂的粘度增加到 0.25-1,000,000cP的范围内的作用。在这个情形下的合适稳定性赋形 剂的实例包括热响应性聚合物，它能增加制剂的粘度，但在使用条 件下不会发生胶凝。
在一个实施方案中，稳定性赋形剂可以是非水质子溶剂。合 适的非水质子溶剂的实例包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇(PG)、聚乙烯 吡咯烷酮(PVP)、甲氧基丙二醇(MPEG)、甘油和四氢呋喃聚乙二醇醚。
在另一个实施方案中，稳定性赋形剂可以是含水缓冲剂、抗 氧化剂、螯合剂、表面活性剂或任何其它能增加肽的溶解度或稳定 性的药物可接受添加剂。合适的缓冲剂的实例包括乙酸盐、柠檬酸 盐、磷酸盐、酒石酸盐和谷氨酸盐缓冲剂。合适的抗氧化剂的实例 包括抗坏血酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、一硫代甘油、硫代硫酸钠、 亚硫酸盐、BHT、BHA、抗坏血酸棕榈酸酯、没食子酸丙酯、维生 素E或者它们的混合物。合适的螯合剂的实例包括EDTA、甘油、 酒石酸及其盐、柠檬酸及其盐或者任何它们的混合物。
在另一个方面，提供了使用本文所述制剂的方法。所述方法 主要包括将本文所述制剂给予有需要的受试者。所述方法可在任何 可使用肠降血糖素或肠降血糖素模拟肽的治疗性或预防性情形中使 用。举非限制性实例说，所述方法可包括治疗或预防糖尿病(包括I 型、II型糖尿病和妊娠糖尿病)、葡萄糖不耐受、肥胖症、血脂异常、 心肌梗塞的，或者任何其它公知的肠降血糖素或肠降血糖素模拟肽 的用途。
按照本文公开的方法，药物制剂可以以任何本领域公知的能 使肠降血糖素或肠降血糖素模拟肽以生物学有效量供受试者或样品 利用的方式来给予。例如，可通过本领域公知的任何中枢或外周途 径将制剂给予受试者，所述途径包括但不限于口服、胃肠外、透皮、 透黏膜或肺部途径。在一个实施方案中，采用胃肠外给予途径。具 体的示例性给药途径包括口服、眼内、直肠内、口腔内、局部、鼻 内、眼用、皮下、肌肉内、静脉内、大脑内、透皮和肺部途径。合 适的给药方法的确定通常是基于以下考虑：待治疗的病症(例如疾病 和紊乱)、病症(例如疾病和紊乱)的阶段、受试者的舒适情况和本领 域技术人员公知的其它因素。
给药可以是间歇给药或连续给药，两者均可以是急性给药和/ 或慢性给药。连续给药可用可植入或可附接的泵控制传递装置来实 现，所述装置如描述于美国专利第5,728,396号、第5,985,305号、 第6,261,584号和第6,395,292号，各个专利通过引用结合到本文中。 但是，可使用本领域公知的任何植入控制传递装置。或者，对本文 所述制剂和方法可使用本领域领域公知的笔式注射装置。
在一个实施方案中，给药可以是预防性治疗，与对病症(例 如生活方式、遗传史、手术等)的诊断或观察(认定受试者处于发展特 定疾病或紊乱的风险)同时开始。在另一个实施方案中，给药可以在 与特定疾病或紊乱有关的症状出现之后进行。
术语“有效量”指用以治疗、改善、预防或消除所确定的病 症(例如疾病或紊乱)，或者用以显示可检测的治疗性或预防性作用的 药剂量。所述作用可通过例如化学标记、抗原水平或到达可测事件(如 发病率或死亡率)的时间来检测。对某受试者的准确有效量将取决于 受试者的体重、大小和健康状况；病症的性质和程度；以及选定进 行给药的治疗药物或治疗药物组合。对特定情况的有效量可通过落 入临床医生技能和判断范围内的日常实验来确定。
对于任何肽，有效量可首先在细胞培养试验，例如在动物模 型(如大鼠或小鼠模型)中进行估计。动物模型还可用来确定给药的适 当浓度范围和途径。然后可用这种信息来确定在人类中给药的有用 剂量和途径。
功效和毒性可通过标准的药学方法在细胞培养物或实验动物 中进行确定，例如ED50(在50％的群体中具有治疗有效性的剂量)和 LD50(对50％的群体致死的剂量)。治疗作用与毒性作用之间剂量比称 治疗指数，它可表示为ED50/LD50比。优选显示大治疗指数的药物组 合物。可将从细胞培养试验和动物研究获得的数据用于配制一系列 人用剂量。这种组合物中所含的剂量通常在落入一个循环浓度范围 内，该浓度包括具有极少或没有毒性的ED50。取决于所采用的剂型、 受试者的敏感度和给药途径，剂量可在这个范围内变动。
更具体的说，在本文公开方法中使用的肠降血糖素或肠降血 糖素模拟肽上观察到的浓度-生物作用关系表明，对于体重在约50至 约100kg的受试者，目标剂量(单剂量、分隔剂量或连续剂量)将在约 1μg/天至约1g/天、或约10μg/天至约10mg/天、或约10μg/天至约 250μg/天、或约10μg/天至约50μg/天、或约20μg/天的范围内。对 于体重超过或低于所述体重范围的受试者，剂量可作相应调整。准 确剂量须由从业医生根据与需要治疗的受试者有关的各个因素来确 定。
在又一个实施方案中，本文公开的方法还包括对需要治疗的 受试者的鉴定。可用任何有效的标准来确定受试者可从肠降血糖素 或肠降血糖素模拟肽的给药受益。诊断例如心脏病、肥胖症、血脂 异常和糖尿病的方法，以及鉴定有风险发展这些紊乱的个体的程序， 是本领域技术人员公知的。这种程序可包括临床检验、身体检查、 个人面谈和家族史评估。
为帮助理解本发明，纳入了以下实施例。当然，本文描述的 实验不应被解释为具体限制本发明，而且现知的或以后开发出的、 在本领域技术人员的能力范围内的本发明各种变化，也被认为落入 本文描述的和下文要求保护的本发明范围。
实施例
现就以下非限制性实施例对本发明作更详细的描述，给出这 些实施例是为了更完全地说明本发明，而不应被解释为限制本发明 的范围。
实施例1：
毒蜥外泌肽-4在DMSO和加有0.5％水的DMSO中的稳定性 可如下进行评估。评估可基于毒蜥外泌肽-4样品在5℃、25℃和40℃ 下储藏最长至六个月的稳定性。此外，还可评估毒蜥外泌肽-4在 DMSO中对比于在pH4.5的含水缓冲液中的稳定性。
可用三种HPLC方法来分析样品：用以测定功效(mg/ml)的 大小排阻HPLC(SEC-HPLC)和两种用以评估纯度(％)的方法——强阳 离子交换(SCX)方法和反相(RP)方法。这些方法可按需进行改变，以 实现适当的样品分析。另外，样品的水分含量可用合适的Karl Fischer 分析程序来评估。
例如，可用SEC-HPLC通过外标测定法测量毒蜥外泌肽-4 溶液的功效，所述功效基于与合格(qualified)参考标准溶液比较的含 毒蜥外泌肽溶液在214nm处的总肽含量。可通过比较样品中和参考 标准溶液中的毒蜥外泌肽-4峰的保留时间，确定毒蜥外泌肽-4的身 份、功效和标记强度。
对于六个月的递药时间，基于20μg/天的剂量，大约3600μg 的毒蜥外泌肽-4可适合需要。假定代表性的递药储器大约为150μL， 则约25mg/mL的浓度可适合需要。此外，蛋白质和肽一般是冻干的， 常常包含一些残余水分。故此，可研究水对肽稳定性的影响，样品 可在纯DMSO中和在加有0.5％水的DMSO中制备。
这个浓度的水会将DMSO的18.6℃冰点降低至只有约 17.5℃。肽由于摩尔浓度低，预期它仅稍为进一步降低冰点。可用在 充氮干燥器中、在五氧化二磷上放置至少24小时进行干燥的毒蜥外 泌肽-4来制备样品。可用充氮手套袋来制备母液和各个单独样品。 可将干燥器、设备和供应品放入手套袋中。可给手套袋充以氮气并 密封。可通过将大约1250mg毒蜥外泌肽-4加入到50mL容量瓶中 来制备样品。可加入DMSO(密闭容器)以达到最终体积。然后可将 大约一半的溶液转移到25mL容量瓶，可加入125μL水，将所得溶 液混合，获得含0.5％w/v水的最终溶液。然后可将各样品分装到单 独的2-mL小瓶中，盖上盖子，卷曲密封。可将样品在纸板盒中5℃、 25℃和40℃下保藏，以保护免受光照。然后可在所需的时间间隔测 试样品的纯度和功效。
下表提供按类似于上述的方式制备的毒蜥外泌肽-4代表性样 品的结果。更具体的说，在N2气氛下制备毒蜥外泌肽-4于纯DMSO 和DMSO/0.5％水中的25mg/mL样品，并在5、25和40℃下保持6 个月。
方法 温度(℃) 体系 功效(mg/mL) SEC-HPLC 0个月 1个月 2个月 3个月 6个月 功效(mg/mL) 5 纯DMSO 24.5 5 0.5％水/DMSO 24.4 25 纯DMSO 23.4 24.8 24.5 24.4 24.3 25 0.5％水/DMSO 23.4 24.9 24.5 24.4 24.3 40 纯DMSO 24.8 24.6 24.7 23.6 40 0.5％水/DMSO 24.9 24.7 24 4 23.1
方法 温度(℃) 体系 ％纯度 RP-HPLC 1个月 2个月 3个月 6个月 ％纯度 5 纯DMSO 99.7 5 0.5％水/DMSO 99.6 25 纯DMSO 99.7 99.1 98.4 97.0 25 0.5％水/DMSO 99.5 99.2 98.3 96.6 40 纯DMSO 96.5 90.2 83.7 71.1 40 0.5％水/DMSO 96.3 90.3 83.8 71.7
方法 温度(℃) 体系 ％纯度 SCX-HPLC 1个月 2个月 3个月 6个月 ％纯度 5 纯DMSO 99.5 5 0.5％水/DMSO 99.4 25 纯DMSO 99.0 98.4 96.7 95.8 25 0.5％水/DMSO 99.2 98.3 97.9 95.8 40 纯DMSO 95.8 90.2 85.0 72.2 40 0.5％水/DMSO 96.0 90.7 85.7 72.5
方法 温度 (℃) 体系 ％纯度 SCX-HPLC 0.25个月 0.5个月 1个月 2个月 3个月 ％纯度 25 含水缓冲液 (pH4.5) 99.2 98.5 97.1 94.8 90.4 40 含水缓冲液 (pH4.5) 92.2 87.9
毒蜥外泌肽-4可配制在DMSO和掺入0.5％水的DMSO中。 简言之，如上所说明，因为可能从冻干肽残余水分引入的0.5％水的 存在，没有出现很大的差异。毒蜥外泌肽-4在40℃下6个月后其纯 度从初始值降低约28％。在25℃下同样时间，该纯度降低约3-4％。 (见图1和2)。但是在5℃下，该纯度保持在比初始纯度值低0.4-0.6％ 以内。基本上没有观察到功效的变化。与含水产物稳定性(图3和4) 比较明显可见，在非质子极性溶剂DMSO中毒蜥外泌肽-4稳定性得 到改进。
实施例2：非质子极性溶剂体系中的毒蜥外泌肽-4稳定性
如实施例1所证明，DMSO能使毒蜥外泌肽-4的稳定性改进。 也可评估毒蜥外泌肽-4在其它非质子极性溶剂和在DMSO基共溶剂 体系中的稳定性。评估可基于毒蜥外泌肽-4样品在5℃、25℃和37℃ 下储藏最长至六个月的稳定性。除了二甲亚砜(DMSO)外，进行评估 的溶剂还包括水、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲 基吡咯烷酮(NMP)、碳酸丙烯酯和乙酸乙酯。
可用三种HPLC方法来分析样品；用以测定功效(mg/ml)的 大小排阻HPLC(SEC-HPLC)和两种用以评估纯度(％)的方法——强阳 离子交换(SCX)方法和反相(RP)方法。这些方法可按需进行改变，以 实现适当的样品分析。另外，样品的水分含量可用合适的Karl Fischer 分析程序来评估。
例如，可用SEC-HPLC通过外标测定法测量毒蜥外泌肽-4 溶液的功效，所述功效基于与合格参考标准溶液比较的含毒蜥外泌 肽溶液在214nm处的总肽含量。可通过比较样品中和参考标准溶液 中的毒蜥外泌肽-4峰的保留时间，确定毒蜥外泌肽-4的身份、功效 和标记强度。
非水溶剂：可评估毒蜥外泌肽-4在冰点低于0℃的非质子极 性溶剂中的稳定性。符合这些标准的代表性溶剂为DMA、DMF、 NMP、碳酸丙烯酯和乙酸乙酯。
与水的共溶剂体系：大约8％w/w的水即能将DMSO的冰点 降低到正好0℃以下。为提供另外的抗冻结保护，可评估10％w/w 水溶液。将水加入到体系中会产生与肽发生水解反应的可能性。但 是，DMSO和水分子之间存在着强相互作用，可减轻水解反应。事 实上，对于10％w/w水(0.67摩尔分数DMSO)，已证实该混合物的 特征是1∶1 DMSO：水复合物。只有在水的摩尔分数超过0.6的情况下 纯水分子才普遍。另外，在pH极端值下水解反应增加，表明催化是 通过水合氢离子和羟基离子进行的。许多化合物(包括水)的电离在 DMSO中都被抑制，水的pKa从纯水的15.75转为DMSO溶液中的 32。这相当于中性溶液中水合氢离子和羟基离子减少大于1×108M。 因此，需要评估这个体系中的毒蜥外泌肽-4稳定性。
与非质子极性溶剂的共溶剂体系：还可用其它溶剂来降低 DMSO的冰点。因此，可用DMSO与DMA、DMF、NMP、碳酸丙 烯酯或乙酸乙酯制备二元溶剂体系。可对这些混合物进行设计，以 利用到富含DMSO的混合物所提供的改进的溶解度和/或稳定性。可 首先确定非水溶剂的适当量。接着可通过目视检查共溶剂混合物来 评估毒蜥外泌肽-4的溶解性。可选出能提供充足的毒蜥外泌肽-4溶 解性且在冰箱中不冻结的体系进行稳定性分析。
DMSO：可制备10mg/mL的毒蜥外泌肽-4的DMSO溶液用 作对照。
许多目的非水溶剂具有很强的吸湿性，当暴露于空气时能吸 收水分。此外，可将各样品分装到部分填充的各容器中。因此，可 用充氮手套袋或盒来制备母液和各个单独样品。可将各样品放入手 套袋中。可给手套袋充以氮气并密封。可通过将大约110mg毒蜥外 泌肽-4加入到玻璃小瓶中来制备样品。然后可加入非水溶剂或共溶 剂体系，以达到约10mg/mL的最终浓度。然后可将各样品(大约0.5mL) 分装到单独的2mL小瓶中，盖上盖子，卷曲密封。可将样品在纸板 盒中5℃、25℃和37℃下保藏，以保护免受光照。然后可按需在一 个月、两个月、三个月和六个月时测试样品。
毒蜥外泌肽-4的代表性样品按类似于上述的方式制备。更具 体的说，制备以下样品：
制剂号 溶剂体系 混合物％w/w溶剂/DMSO 1 乙酸乙酯/DMSO 33％w/w 2 碳酸丙烯酯/DMSO 30％w/w 3 N-甲基吡咯烷酮/DMSO 26％w/w 4 二甲基甲酰胺/DMSO 25％w/w 5 二甲基乙酰胺/DMSO 30％w/w 6 水/DMSO 10％w/w 7 N-甲基吡咯烷酮 (纯) 8 二甲基甲酰胺 (纯) 9 二甲基乙酰胺 (纯) 10 DMSO (纯)
以下各表提供了各代表性样品的结果。
初始值的百分比 月数 SCX-纯度 37℃ 25℃ 制剂号 初始值 1 2 3 6 1 2 3 6 1 98.8 64.0 32.9 85.1 71.3 2 97.1 16.4 51.3 3 97.6 88.0 77.7 62.0 52.1 95.8 90.0 83.3 78.1 4 98.6 19.8 60.5 5 99.0 86.4 72.2 53.5 40.9 94.0 89.6 86.9 77.6 6 99.1 94.3 88.7 79.6 73.6 97.3 97.8 96.8 91.3 7 81.4 30.7 52.1 8 92.9 5.6 28.1 9 98.3 65.7 28.7 87.3 76.7 10 99.1 95.9 93.1 85.4 74.7 99.0 97.8 96.1 92.3
初始值的百分比 月数 RP-纯度 37℃ 25℃ 制剂号 初始值 1 2 3 6 1 2 3 6 1 97.0 62.2 32.8 86.8 73.2 2 95.4 14.2 49.6 3 96.2 90.4 77.2 62.5 47.3 95.5 91.3 83.7 76.5 4 96.5 20.1 64.1 5 97.5 88.3 74.1 50.8 39.0 96.2 92.5 86 8 78.7 6 97.7 97.7 94.7 87.3 81.5 99.5 98.7 97.6 96.9 7 86.6 32.5 59.9 8 91.8 0.4 26.5 9 96.8 68.4 28.6 89.4 80.7 10 97.4 98.0 94.1 83.1 74.3 99.5 98.9 97.4 95.5
初始值的百分比 月数 SEC-功效 37℃ 25℃ 制剂号 初始值 1 2 3 6 1 2 3 6 1 9.05 107.0 107.5 103.3 102.5 2 8.24 99.0 98.4 3 8.52 100.1 103.0 96.3 91.6 99.9 101.2 98.6 97.7 4 8.80 103.2 99.5 5 9.06 100.8 100.8 99.3 101.5 100.5 100.0 100.2 98.9 6 9.48 101.6 102.1 102.2 99.2 98.5 100.7 100.9 99.6 7 9.57 98.2 98.7 8 9.27 103.3 102.2 9 9.02 102.2 100.5 102.2 103.7 10 9.42 102.7 102.1 102.7 98.9 100.9 101.9 101.5 101.9
实施例3：非质子极性溶剂体系中肽-锌络合物稳定性的提高
作为提高治疗活性肠降血糖素或肠降血糖素模拟肽化合物 (如毒蜥外泌肽-3、毒蜥外泌肽-4或它们的类似物或衍生物)的稳定性 的一种方法，可将肽与金属离子如锌阳离子进行络合。虽然不想局 限于理论，但还是认为例如与锌阳离子的络合或螯合是通过减少治 疗活性肠降血糖素或肠降血糖素模拟肽的溶解度，从而减少该肽对 溶剂分解的降解作用的易感性，来增加该肽的稳定性的。因此，相 比将非络合的肽溶解于该溶剂中，随后将肽-锌络合物悬浮在非质子 极性溶剂中，预期可进一步改进络合物的稳定性。可评估毒蜥外泌 肽-4-锌络合物悬浮在以下溶剂中的稳定性：DMSO、加有0.5％水的 DMSO、其它非质子极性溶剂(例如水、DMA、DMF、NMP、碳酸丙 烯酯或乙酸乙酯)、如上所述的DMSO基共溶剂体系或者非质子非极 性溶剂(例如硅油或聚二甲基硅氧烷)。评估可基于毒蜥外泌肽-4-锌样 品在5℃、25℃、37℃和/或40℃下储藏直至6月的稳定性。此外， 还可评估毒蜥外泌肽-4在DMSO中相比在pH为约4.0至约7.5之间 的含水缓冲液中的稳定性。
可用三种HPLC方法来分析样品：用以测定功效(mg/ml)的 大小排阻HPLC(SEC-HPLC)和两种用以评估纯度(％)的方法——强阳 离子交换(SCX)方法和反相(RP)方法。这些方法可按需进行改变，以 实现适当的样品分析。另外，样品的水分含量可用合适的Karl Fischer 分析程序来评估。
例如，可用SEC-HPLC通过外标测定法测量毒蜥外泌肽-4- 锌溶液的功效，所述功效基于与合格参考标准溶液比较的含毒蜥外 泌肽-4-锌溶液在214nm处的总肽含量。可通过比较样品中和参考标 准溶液中的毒蜥外泌肽-4-锌峰的保留时间，确定毒蜥外泌肽-4-锌的 身份、功效和标记强度。
络合物形成：将毒蜥外泌肽-4与锌混合，发现毒蜥外泌肽-4- 锌络合物在中性pH下沉淀。在20mL烧杯中，将0.1074克的毒蜥 外泌肽-4和1.16158克的二水乙酸锌溶解于10mL去离子水中，制 备含大约10.7mg/mL毒蜥外泌肽-4的透明溶液。此溶液的起始pH 为5.73。当滴加45％w/w氢氧化钾溶液将此溶液的pH调节到7.00 时，溶液变得混浊，观察到白色沉淀(毒蜥外泌肽-4-锌络合物)。然后 将5mL的毒蜥外泌肽-4-锌络合物的混浊悬浮液转移到15mL离心管 中，在4000rpm下离心5分钟，除去上清液。
在DMSO中的分散体：可将肽-金属络合物悬浮在非质子极 性溶剂如DMSO、0.5％水/DMSO或10％水/DMSO中，形成肽-金属 络合物在其中可显示改进的稳定性的悬浮液。例如，向如上所述沉 淀的毒蜥外泌肽-4-锌络合物中加入2mL DMSO，倒置混合内容物。 获得了含大约25mg/mL毒蜥外泌肽-4的可目视观察白色沉淀物在 DMSO中的分散体，表明毒蜥外泌肽-4-锌络合物不溶于DMSO中。 可对此分散体在各种温度下和在不同时间长度的稳定性作进一步的 测试。
本文引述的所有出版物和专利申请通过引用结合到本文中， 引用程度如同每个单独的出版物或专利申请被专门和单独地指出通 过引用结合到本文中。
尽管上文已详细描述了一些实施方案，但本领域技术人员显 然知道，可对它们作出许多修改而不偏离这些实施方案的教导内容。
所有这些修改都意在被涵括在本发明的权利要求当中。