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1、10申请公布号CN103275916A43申请公布日20130904CN103275916ACN103275916A21申请号201310222243522申请日20130605CCTCCNOM201313720130410CCTCCNOM201313820130410C12N1/21200601A62D3/02200701C12R1/01200601A62D101/2820070171申请人广东省微生物研究所地址510070广东省广州市先烈中路100号72发明人陈杏娟许玫英孙国萍74专利代理机构广州科粤专利商标代理有限公司44001代理人刘明星54发明名称具有较强细胞表面疏水性的基因工程菌及。
2、其应用57摘要本发明公开了一种具有较强细胞表面疏水性的基因工程菌及其应用。本发明的基因工程菌SDECOLORATIONISB21或B26，其具有较强的细胞表面疏水性，对不可溶性的零价铁金属的氧化能力和三氧化二铁的还原能力得到加强，尤其是对新型的难降解的疏水性有机污染物十溴联苯醚的降解能力得到加强，从而拓宽了SHEWANELLA属细菌在环境污染修复领域中的应用。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书6页序列表3页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表3页附图1页10申请公布号CN103275916ACN103275916A1/1页21基。
3、因工程菌SHEWANELLADECOLORATIONISB21，其保藏编号为CCTCCNOM2013137。2权利要求1所述的基因工程菌SDECOLORATIONISB21在环境污染修复领域中的疏水性物质的降解中的应用。3根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的疏水性物质为十溴联苯醚。4基因工程菌SHEWANELLADECOLORATIONISB26，其保藏编号为CCTCCNOM2013138。5权利要求4所述的基因工程菌SDECOLORATIONISB26在环境污染修复领域中的疏水性物质的降解中的应用。6根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的疏水性物质为十溴联苯醚。权利要求书CN1。
4、03275916A1/6页3具有较强细胞表面疏水性的基因工程菌及其应用技术领域0001本发明属于生物技术领域，具体涉及具有较强细胞表面疏水性的基因工程菌及其应用。背景技术0002疏水相互作用是非极性分子之间的一种弱的非共价的相互作用，这些非极性的分子在水相环境中具有避开水而相互聚集的倾向。细菌细胞的疏水相互作用是指疏水性较强的细胞能够避开水易与疏水性较强的物质发生作用，疏水性是决定细菌非特异性黏附到各种生物和非生物表面及界面的最重要动力之一，显著影响细菌的致病性、粘附性、腐蚀性和降解疏水性物质的能力等。0003自从MUDD首次报道细菌表面的疏水现象以来，人们从细菌表面电荷、表面蛋白和脂多糖等方。
5、面研究了细菌的细胞表面疏水性，但对细胞表面疏水性的相关基因还了解甚少。0004有关研究表明兼性厌氧SHEWANELLA属细菌可以利用多种高价态金属及其氧化物和有机污染物作为电子受体进行厌氧呼吸，其特别的细胞表面结构及胞外成分使其具有吸附和还原疏水性胞外物质的能力，这种细胞表面疏水性随着细菌生长状态的不同而表现差异，并与培养过程添加的碳源物质和电子受体有关。0005但是，对一些新型的难降解的疏水性有机污染物，SHEWANELLA属细菌的降解能力还不强，获得具有稳定的较高细胞表面疏水性的基因工程菌，不仅可以从理论上深入研究细菌细胞表面疏水性的相关基因，还可以拓宽SHEWANELLA属细菌在环境污染。
6、修复领域中的应用。发明内容0006本发明的目的是提供具有较强细胞表面疏水性的基因工程菌及其应用。0007本发明通过转座子突变法将MINITN10插入到出发菌株SHEWANELLADECOLORATIONISS12的细胞表面疏水性负相关基因上，使该基因突变失活，从而获得了两株具有较强的细胞表面疏水性的基因工程菌SHEWANELLADECOLORATIONISB21或SHEWANELLADECOLORATIONISB26，其具有较强的细胞表面疏水性，对不可溶性的零价铁金属的氧化能力和三氧化二铁的还原能力得到加强，尤其是对新型的难降解的疏水性有机污染物十溴联苯醚的降解能力得到加强，从而拓宽了SHEW。
7、ANELLA属细菌在环境污染修复领域中的应用。0008本发明的有较强细胞表面疏水性的基因工程菌SHEWANELLADECOLORATIONISB21，其于2013年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址中国武汉武汉大学，邮编430072，其保藏编号为CCTCCNOM2013137。0009本发明的有较强细胞表面疏水性的基因工程菌SHEWANELLADECOLORATIONISB26，其于2013年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址中国武汉武汉说明书CN103275916A2/6页4大学，邮编430072，其保藏编号为CCTCCNOM2013138。0。
8、010本发明的还提供了基因工程菌SDECOLORATIONISB21或SDECOLORATIONISB26在环境污染修复领域中的疏水性物质的降解中的应用，特别是在降解十溴联苯醚中的应用。0011本发明所述的基因工程菌是利用转座子MINITN10插入到出发菌株脱色希瓦氏菌（SHEWANELLADECOLORATIONIS）S12的基因组中，通过水/液体石蜡两相系统筛选在有机相及乳化层中具有较强粘附能力的菌株，从而获得细胞表面疏水性负相关基因失活的工程菌。0012本发明选用的质粒载体为PBSL80，含有MINITN10转座子、氨苄青霉素和卡那霉素抗性基因，且该转座子对环境是安全的。0013本发明选。
9、用的供体菌为大肠杆菌ECOLIWM3064（PIR，DAP），其优点在于含有PIR基因，可以把外源质粒导入到受体菌中。另外，该供体菌为二氨基庚二酸营养缺陷性，可以通过不在外源补充二氨基庚二酸的方法达到与基因工程菌分离的目的。0014本发明基因工程菌SDECOLORATIONISB21或B26，其具有较强的细胞表面疏水性，对不可溶性的零价铁金属的氧化能力和三氧化二铁的还原能力得到加强，尤其是对新型的难降解的疏水性有机污染物十溴联苯醚的降解能力得到加强，从而拓宽了SHEWANELLA属细菌在环境污染修复领域中的应用。0015本发明的脱色希瓦氏菌（SDECOLORATIONIS）S12已保藏于中国典。
10、型培养物保藏中心（CCTCC），其保藏号为CCTCCNOM203093；和日本东京大学应用微生物研究所（保藏号为IAM15094T），并已获得了国家发明专利（专利号ZL2003101123617）。附图说明0016图1为质粒PBSL180的结构示意图。0017图2为基因工程菌和野生株以十溴联苯醚为唯一电子受体生长的曲线图。具体实施方式0018以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。0019实施例1具有较强细胞表面疏水性的基因工程菌SDECOLORATIONISB21和B26的构建方法0020将含有质粒载体（PBSL180）的大肠杆菌ECOLIWM3064（PBSL180）接种于。
11、含有50G/ML氨苄青霉素和50G/ML二氨基庚二酸的LB液体培养基中，于37、转速200RPM/MIN的摇床中培养过夜，出发菌株SDECOLORATIONISS12接种于LB液体培养基中，于33、转速200RPM/MIN的摇床中培养过夜。对菌液以12,000G离心10MIN，去上清，收集菌体。用含有50G/ML二氨基庚二酸的LB液体培养基洗涤ECOLIWM3064（PBSL180）菌体2次后，再用一定体积的上述液体培养基重悬菌体，使菌体A600达到06左右。用LB液体培养基洗涤SDECOLORATIONISS12菌体2次以后，再用一定体积LB液体培养基重悬菌体，使菌体A600达到06左右。0。
12、021按照供体菌ECOLIWM3064（PBSL180）和受体菌SDECOLORATIONISS12以体积比115的比例混合上述两种菌悬液，于37静置培养2H。然后将灭菌滤膜置于含有说明书CN103275916A3/6页550G/ML二氨基庚二酸的LB培养基平板中央，吸取混合菌液于培养基平板滤膜中央，于33的恒温培养箱中培养18H。0022将上步骤所得培养物用缓冲液（含01MMOL/LNACL和005MMOL/LHEPES，余量为水，PH74）洗涤2次，然后用一定体积的上述缓冲液重悬菌体，使菌体A600达到05左右。按照水相和有机相以体积比21的比例，往菌悬液中加入液体石蜡后，置于涡旋器上涡旋。
13、60S，然后静置15MIN。取上层有机相和乳化层的菌液，以12,000G离心10MIN，去上清，收集菌体。以上述相同体积的缓冲液重悬菌体后，加入上述相同体积的液体石蜡，以上述步骤继续涡旋并静置菌液。如此重复2次。0023取上步骤获得的上层有机相和乳化层的菌体，涂布在含有50G/ML卡那霉素的LB培养基平板上，于33培养48H。将长出的单菌落转接到新的含有50G/ML卡那霉素的LB培养基平板上，于33培养18H。0024上步骤长出的基因工程菌中，筛选出2个，分别命名为基因工程菌SDECOLORATIONISB21和SDECOLORATIONISB26。0025基因工程菌SHEWANELLADEC。
14、OLORATIONISB21，其于2013年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址中国武汉武汉大学，邮编430072，其保藏编号为CCTCCNOM2013137。0026基因工程菌SHEWANELLADECOLORATIONISB26，其于2013年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址中国武汉武汉大学，邮编430072，其保藏编号为CCTCCNOM2013138。0027实施例20028实施例1的基因工程菌SDECOLORATIONISB21，将其接种到含有50G/ML卡那霉素的LB液体培养基中，于33、转速200RPM/MIN的摇床中培养过夜。以12。
15、,000G离心10MIN，去上清，收集菌体。按照上海生工生物工程技术有限公司的柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒的说明书操作提取基因工程菌的基因组DNA。设计上游引物为外侧的下游转座子MINITN10特异引物5TGTGGCGGACCGCTATCAGGAC3，设计下游引物为随机引物5GGCCACGCGTCGACTAGTCANNNNNNNNNNAGCTG3，对基因组DNA进行第一轮PCR扩增。PCR扩增体系总体积为50L超纯无菌水390L，10PCRBUFFER50L，100MMOL/LDNTP10L，100PMOL/UL上游引物25L，100PMOL/UL下游引物10L，25U/LTAQ酶05L，1。
16、0NG/UL基因组DNA10L。94预变性5MIN后进入6个循环94变性30S，30退火30S，72延伸15MIN；然后进入30个循环94变性30S，45退火30S，72延伸20MIN；最后延伸10MIN。0029按照上海生工生物工程技术有限公司的柱式PCR产物纯化试剂盒的说明书操作，对第一轮的PCR产物进行纯化回收，回收体积共50L，以回收产物为DNA模板进行第二轮PCR扩增。设计上游引物为内侧的下游转座子MINITN10特异引物5CAATTCGAGCTCCACCGATCCG3，设计下游引物为随机引物的内侧序列5GGCCACGCGTCGACTAGTCA3。PCR扩增体系总体积为50L超纯无菌。
17、水365L，10PCRBUFFER50L，100MMOL/LDNTP10L，100PMOL/UL上游引物10L，100PMOL/UL下游引物10L，25U/LTAQ酶05L，第一轮PCR产物回收产物50L。94预变性5MIN后进入30个循环94变性30S，52退火30S，72延伸2MIN；最后延伸10MIN。说明书CN103275916A4/6页60030对第二轮的PCR产物，以内侧的上游转座子MINITN10特异引物5CAATTCGAGCTCCACCGATCCG3为测序引物，送样北京六合华大基因科技股份有限公司测定DNA片段的序列，测序结果如SEQIDNO1所示。0031如SEQIDNO1所。
18、示的序列，其中163位碱基为MINITN10上的序列，641237位碱基为SDECOLORATIONISS12基因组序列的TONBDEPENDENTRECEPTOR基因的1950513位碱基。基因工程菌SDECOLORATIONISB21为TONBDEPENDENTRECEPTOR基因失活的突变株，转座子插入到TONBDEPENDENTRECEPTOR基因的第1950位碱基中，该外膜蛋白指导TONB蛋白连接的物质穿过细胞膜。0032实施例30033本实施例的基因工程菌是实施例1的基因工程菌SDECOLORATIONISB26，转座子插入位点下游DNA片段的鉴定方法同实施例2，测序结果如SEQI。
19、DNO2所示。0034其中163位碱基为MINITN10上的序列，641096位碱基为SDECOLORATIONISS12基因组序列，64131位碱基为SDECOLORATIONISS12的MLTAINTERACTINGMIPAFAMILYPROTEIN基因的671位碱基。基因工程菌SDECOLORATIONISB26为MLTAINTERACTINGMIPAFAMILYPROTEIN基因失活的突变株，转座子插入到MLTAINTERACTINGMIPAFAMILYPROTEIN基因的第67位碱基中，该蛋白与PBP1B蛋白结合形成肽聚糖聚合酶，与MLTA蛋白结合形成肽聚糖水解酶。0035实施例4基。
20、因工程菌和野生株的细胞表面疏水性比较0036将基因工程菌SDECOLORATIONISB21和B26分别接种到含有50G/ML卡那霉素的LB液体培养基中，野生株SDECOLORATIONISS12接种到LB液体培养基中，均置于33、转速200RPM/MIN的摇床中培养过夜。按照1的接菌量，分别接种基因工程菌的过夜培养物于新鲜的含有50G/ML卡那霉素的LB液体培养基中，接种野生株的过夜培养物于新鲜的LB液体培养基中，培养6H左右，使所有菌株的生长周期达到对数期生长的中后期。0037然后将菌液以12,000G离心10MIN，去上清，分别收集菌体。用缓冲液（含01MMOL/LNACL和005MMO。
21、L/LHEPES，余量为水，PH74）分别洗涤菌体2次，然后用一定体积的上述缓冲液重悬菌体，使各菌体A600达到05左右，此时测定并记录A600值，用A0表示。按照水相和有机相以体积比21的比例，往各菌悬液中加入液体石蜡后，置于涡旋器上涡旋60S，然后静置15MIN。取下层的菌悬液测定A600值并记录，用A表示。按照以下公式计算各菌株的细胞表面疏水性，疏水性1001A/A0。0038按上述方法测得的不同菌株的疏水性如下表10039表1基因工程菌SDECOLORATIONISB21和B26和野生株的细胞表面疏水性比较00400041从表1可以看出，构建的基因工程菌SDECOLORATIONISB。
22、21和B26比野生株具有更强的细胞表面疏水性。说明书CN103275916A5/6页70042实施例5基因工程菌SDECOLORATIONISB21、B26和野生株氧化不可溶的零价铁金属和还原不可溶的铁化合物的能力比较0043将基因工程菌SDECOLORATIONISB21和B26分别接种到含有50G/ML卡那霉素的LB液体培养基中，野生株SDECOLORATIONISS12接种到LB液体培养基中，均置于33、转速200RPM/MIN的摇床中培养过夜。按照1的接菌量，分别接种基因工程菌的过夜培养物于新鲜的含有50G/ML卡那霉素的LB液体培养基中，接种野生株的过夜培养物于新鲜的LB液体培养基中。
23、，培养6H左右，使所有菌株的生长周期达到对数期生长的中后期。0044然后将菌液以12,000G离心10MIN，去上清，分别收集菌体。用缓冲液（含01MMOL/LNACL和005MMOL/LHEPES，余量为水，PH74）分别洗涤菌体2次，然后用一定体积的上述缓冲液重悬菌体，使各菌体A600达到05左右。按照1的接菌量，分别接种基因工程菌的过夜培养物于下述液体培养基（氧化不可溶的零价铁金属用的培养基或还原不可溶的铁化合物用的培养基）中，分别充入氮气5MIN后，置于厌氧工作站中33静置培养。每间隔一定时间取出一定量的培养液于12,000G离心10MIN去除菌体，然后采用国标邻菲啰啉分光光度法测定培。
24、养液中FEII的浓度，以此反映不同菌株氧化不可溶的零价铁金属和还原不可溶的铁化合物的能力。0045氧化不可溶的零价铁金属用的培养基NA2HPO412H2O57MMOL/L；KH2PO433MMOL/L；NH4CL180MMOL/L；酵母抽提物02G/L；零价铁金属28G/L；琥珀酸钠10MMOL/L；硝酸钠1MMOL/L，余量为水。0046还原不可溶的铁化合物用的培养基NA2HPO412H2O57MMOL/L；KH2PO433MMOL/L；NH4CL180MMOL/L；酵母抽提物02G/L；甲酸钠10MMOL/L；琥珀酸钠10MMOL/L；三氧化二铁016G/L，余量为水。0047按上述方法测。
25、得的不同菌株的氧化零价铁金属和还原铁化合物的能力如下表2所示0048表2基因工程菌和野生株氧化零价铁金属和还原铁化合物的能力比较0049B21B26S12零价铁金属氧化能力（MG/L/H/OD）370336022502铁化合物还原能力（MG/L/H/OD）0440030360020330010050从表2可以看出，构建的基因工程菌比野生株对不可溶性的零价铁的氧化能力和三氧化二铁的还原能力都得到加强。0051实施例6基因工程菌SDECOLORATIONISB21、B26和野生株降解新型的难降解的疏水性有机污染物十溴联苯醚的能力比较0052将基因工程菌SDECOLORATIONISB21和B26分。
26、别接种到含有50G/ML卡那霉素的LB液体培养基中，野生株SDECOLORATIONISS12接种到LB液体培养基中，均置于33、转速200RPM/MIN的摇床中培养过夜。按照1的接菌量，分别接种基因工程菌的过夜培养物于新鲜的含有50G/ML卡那霉素的LB液体培养基中，接种野生株的过夜培养物于新鲜的LB液体培养基中，培养6H左右，使所有菌株的生长周期达到对数期生长的中后期。说明书CN103275916A6/6页80053然后将菌液以12,000G离心10MIN，去上清，分别收集菌体。用缓冲液（含01MMOL/LNACL和005MMOL/LHEPES，余量为水，PH74）分别洗涤菌体2次，然后用。
27、一定体积的上述缓冲液重悬菌体，使各菌体A600达到05左右。按照1的接菌量，分别接种基因工程菌的过夜培养物于下述液体培养基（降解十溴联苯醚用的培养基）中，分别充入氮气5MIN后，置于厌氧工作站中33静置培养。每间隔一定时间取出一定量的培养液测定A600，以菌株在十溴联苯醚为唯一电子受体的培养基中的生长状况反映不同菌株降解十溴联苯醚的能力。0054降解十溴联苯醚用的培养基NA2HPO412H2O57MMOL/L；KH2PO433MMOL/L；NH4CL180MMOL/L；酵母抽提物02G/L；甲酸钠10MMOL/L；环糊精5MMOL/L；二甲基亚砜005（VV）；十溴联苯醚BDE20905MG/L，余量为水。0055结果如图2所示，由图2可以看出，在以十溴联苯醚为唯一电子受体的培养基中，64小时内野生株S12基本维持A600约为003的生长，而构建的基因工程菌B21和B26则分别可以达到A600约为010和007的生长，说明基因工程菌对新型的难降解的疏水性有机污染物十溴联苯醚的降解能力也得到了加强。说明书CN103275916A1/3页900010002序列表CN103275916A2/3页100003序列表CN103275916A103/3页11序列表CN103275916A111/1页12图1图2说明书附图CN103275916A12。