相关申请的引用
本申请要求于2008年12月11日提交的美国临时申请61/121,778和 2008年12月11日提交的美国临时申请61/121,787的优先权，通过引用将 其两者结合于本文中。
背景技术
癌症的特征在于，当细胞增殖的正常调节丧失时发生不受控制的细胞 生长。这种丧失经常表现为涉及细胞生长和分裂、凋亡、血管生成、肿瘤 侵袭和转移的细胞通路的调节异常的结果。
染料木黄酮，4′，5，7-三羟基异黄酮-5，7-二羟基-3-(4-羟苯基)-4H-1-苯并 吡喃-4-酮(示出于下方)是存在于植物如大豆中的天然化合物。已经广泛研 究了染料木黄酮在包括癌症的大量人类疾病的预防和治疗中的潜在作用。
染料木黄酮
染料木黄酮是BCS II级异黄酮，其可以从包括马萨诸塞州沃本 (Woburn，MA)的LC实验室的大量来源商购。已经识别了对于染料木黄酮 的细胞靶和由染料木黄酮调节的信号通路，且与癌症相关的那些包括对细 胞生长和分裂、凋亡、血管生成、肿瘤侵袭和转移重要的靶和通路。除了 染料木黄酮自身固有的抗肿瘤作用之外，研究已经显示，在体外人类癌细 胞系和体内癌症动物模型两者中，染料木黄酮还加强或突出了几种临床使 用的化疗剂的抗肿瘤作用。从治疗观点来看，这些数据是令人感兴趣的， 因为化学疗法是大多数实体瘤治疗中的基石。
染料木黄酮实际上不溶于水，但是具有高的细胞膜渗透性。低的水溶 性和慢的溶出速度经常是造成药物化合物的低生物利用度原因的限制性 因素，从而限制其应用。
尽管染料木黄酮具有抗癌药物的特定性质的长期已知的事实，但是尚 未或并未将成功的染料木黄酮治疗方案用于癌症的治疗中。对此的一个似 乎合理的的解释可能是以其已知形式的染料木黄酮的差溶解度和差生物 利用度以及快速的II相新陈代谢。
由于过去20年来药物发现策略的发展，已经显著改变了药物开发候 选物的物理化学性质。开发候选物通常更加亲油且水溶性较低，这对工业 造成巨大的问题。研究已经显示，一些药物候选物在临床阶段失败，原因 在于差的人体生物利用度以及与制剂的问题。未完全重新设计分子的解决 这些问题的传统方法包括盐选择、制造无定形材料、粒子尺寸降低、前体 药物和不同的配制方法。近来，已经将活性药物成分(API)的晶型用于改变 API的物理化学性质。
尽管治疗效能对于治疗剂是主要关心的事，但是药物候选物的盐和固 态形式(即，结晶或无定形形式)对其作为可行API的药理性质和其开发能 够是关键性的。例如，药物候选物的每种盐或每种晶型可以具有不同的固 态(物理和化学)性质。由API的新型固体形式(如初始化合物的共晶体、盐 或多晶型物)展示的物理性质的不同影响药物参数如储存稳定性、可压缩 性和密度(在制剂和产品制造方面重要的)以及溶解度和溶出速度(在决定 生物利用度方面的重要因素)。因为这些实际物理性质受API的晶型的固 态性质影响，所以它们能够显著地影响作为API的化合物的选择、最终药 物剂型、制造方法的最优化和体内的吸收。而且，发现用于进一步药物开 发的最适当的多晶型能够减少所述开发的时间和费用。
获得API的晶型在药物开发中是极其有用的。其容许更好地表征药 物候选物的化学和物理性质。还可以通过形成API的盐和/或API的结晶 盐来获得特定API的期望性质。与处于其无定形态的游离碱相比，晶型和 结晶盐经常具有更好的化学和物理性质。与无定形多晶型相比，这种盐和 晶型可以与本发明一样，具有更有利的药物和药理性质或更易于加工。它 们还可以具有更好的储存稳定性。
能够影响加工性的一种这种物理性质是固体在研磨前后的流动性。流 动性影响在加工成药物组合物期间对材料进行处理的容易性。当粉末状化 合物的粒子不能容易地互相流过时，制剂专家在开发片剂或胶囊制剂时必 须考虑上述事实，这可能需要使用助流剂如胶态二氧化硅、滑石、淀粉或 三碱式磷酸钙。
API的另一个潜在重要的固态性质是其在含水流体中的溶出速率。活 性成分在患者胃津中的溶出速率可以具有治疗重要性，这是因为其影响口 服给予活性成分可到达患者血流的速度。
通过使API盐形成和/或结晶，与API或其盐的现有固体形式相比， API的新固态形式可以具有独特的性质。例如，结晶盐可以具有与API自 身不同的溶出和溶解度性能且可以被用于在治疗上递送API。包含API的 结晶盐的新药物制剂可以具有超过现有药物制剂的优异性能。
当与具有相同化学组成的其他形式相比时，API的结晶盐或其他晶型 通常具有特殊的结晶和光谱性质。特定形式的结晶和光谱性质典型地通过 X射线粉末衍射(XRPD)和其他技术中的单晶X射线晶体学来测量。特定 的晶型经常还展示特殊的热行为。热行为通过诸如毛细管熔点、热重分析 (TGA)和差示扫描量热法(DSC)的这样的技术在实验室中进行测量。
发明内容
本发明涉及染料木黄酮的晶型，包括结晶染料木黄酮盐和结晶染料木 黄酮水合物。包含本发明的染料木黄酮的晶型的治疗组合物表示本发明的 另一个实施方式，如利用本发明的那些晶型或包含它们的治疗组合物治疗 或预防癌症和其他过度增殖性疾病的方法所做的一样。结晶染料木黄酮的 治疗组合物还可以被用于治疗或预防慢性炎症、感染、囊性纤维化和淀粉 样变性。如本文中所使用的且如本领域中已知的，术语“环境温度”是指 人类适应的封闭空间内的温度，即室温。例如，环境温度可以在例如约 20℃至约25℃的范围内。
如本文中所使用的且如本领域中已知的，术语“约”是指在数量或量 上接近。
如本文中所使用的且如本领域中已知的，术语“浆液”是指固体在液 体中的悬浮液。
如本文中所使用的且如本领域中已知的，术语“°2θ”与[度-2θ]、[°2Th.] 及其变体可互换。
附图说明
在下文中描述以及并入且构成说明书的一部分的下列图说明了根据 本公开内容的示例性实施方式，且不应该被认为限制本发明的范围，因为 本发明可以许可其他等效的实施方式。所述图不必按比例，且为了清楚和 简洁，可以将所述图的特定特征和特定视图按比例或示意性地扩大来显 示。
图1描述了结晶染料木黄酮钠盐二水合物的XRPD图谱。
图2描述了经干燥的结晶染料木黄酮钠盐二水合物的DSC曲线。
图3描述了结晶染料木黄酮钠盐二水合物的重量蒸汽吸附(GVS)曲 线。
图4描述了来自在环境温度下干燥约24小时的制备的结晶染料木黄 酮钠盐二水合物的样品的TGA曲线。
图5描述了来自在80℃下干燥过夜制备的结晶染料木黄酮钠盐二水 合物的样品的TGA曲线。
图6描述了在80℃下保持7天和在40℃/75相对湿度(RH)％下保持 7天的稳定性研究之后，获得的结晶染料木黄酮钠盐二水合物的四个 XRPD图谱。
图7是结晶染料木黄酮钠盐二水合物的1H核磁共振(NMR)光谱。
图8描述了在结晶染料木黄酮钠盐二水合物的水合研究之后的XRPD 图谱。
图9是结晶染料木黄酮钠盐二水合物的分子模型，其示出了结晶染料 木黄酮钠盐二水合物的二聚结构中中心对称的两个钠阳离子，其中分子内 氢键如虚线所示。
图10是示出了结晶染料木黄酮钠盐二水合物的层形成的分子模型。
图11是示出了结晶染料木黄酮钠盐二水合物的堆积的分子模型。
图12描述了基于关于结晶染料木黄酮钠盐二水合物的单晶数据的计 算的XRPD图谱。
图13描述了在染料木黄酮和结晶染料木黄酮钠盐二水合物的十二指 肠内给药之后，全部染料木黄酮的血浆浓度(平均，n＝3)。
图14描述了关于来自大规模合成的结晶染料木黄酮钠盐二水合物的 XRPD图谱。
图15描述了关于无定形染料木黄酮钾盐的XRPD图谱。
图16描述了关于结晶染料木黄酮钾盐二水合物的XRPD图谱。
图17描述了结晶染料木黄酮钾盐二水合物的TGA曲线。
图18描述了结晶染料木黄酮钾盐二水合物的DSC曲线。
图19描述了结晶染料木黄酮钾盐二水合物的GVS曲线。
图20描述了结晶染料木黄酮钾盐二水合物的1H NMR。
图21描述了来自结晶染料木黄酮钾盐二水合物的稳定性研究的 XRPD图谱。
图22描述了关于结晶染料木黄酮钾盐二水合物的水合研究的XRPD 图谱。
图23描述了关于结晶染料木黄酮钙盐的XRPD图谱。
图24描述了关于结晶染料木黄酮钙盐的TGA曲线。
图25描述了关于结晶染料木黄酮镁盐，1当量的XRPD图谱。
图26描述了关于结晶染料木黄酮镁盐，1当量的TGA曲线。
图27描述了关于结晶染料木黄酮镁盐，2当量的XRPD图谱。
图28描述了关于结晶染料木黄酮镁盐，2当量的TGA曲线。
图29描述了关于结晶染料木黄酮的XRPD图谱。
图30描述了关于来自甲苯的结晶染料木黄酮L-赖氨酸盐的XRPD图 谱。
图31描述了关于来自异丙醇的结晶染料木黄酮L-赖氨酸盐的XRPD 图谱。
图32描述了关于来自异丙醇的结晶染料木黄酮/染料木黄酮混合物的 TGA曲线。
图33描述了关于结晶染料木黄酮N-甲基葡糖胺(葡甲胺)盐的XRPD 图谱。
图34描述了关于由丙酮制备的结晶染料木黄酮N-乙基葡糖胺(葡乙 胺)盐的XRPD图谱。
图35描述了关于由异丙醇制备的结晶染料木黄酮N-乙基葡糖胺(葡 乙胺)盐的XRPD图谱。
图36描述了来自丙酮的结晶染料木黄酮N-乙基葡糖胺盐的TGA曲 线。
图37描述了关于结晶染料木黄酮二乙胺盐的XRPD图谱。
图38描述了关于结晶染料木黄酮一水合物的XRPD图谱。
图39描述了结晶染料木黄酮一水合物的TGA曲线。
具体实施方式
本发明涉及染料木黄酮的物理化学性质的改进，由此这种化合物可适 用于药物开发。本文中公开了几种新的染料木黄酮晶型，包括例如结晶染 料木黄酮钠盐、钾盐、镁盐、N-甲基葡糖胺(葡甲胺)盐、钙盐、L-赖氨酸 盐、N-乙基葡糖胺(葡乙胺)盐和二乙胺盐，以及染料木黄酮的结晶一水合 物。下面描述染料木黄酮的这些晶型。尽管在本文中描述了染料木黄酮的 晶型，但是本发明还涉及包含染料木黄酮的公开晶型的新型化学组合物。 描述了那些晶型的治疗应用以及包含它们的治疗组合物。下面也描述了用 于表征所述晶型的方法。
本发明的一个实施方式涉及结晶染料木黄酮钠盐二水合物。结晶染料 木黄酮钠盐二水合物可具有用于药物开发的合适特征。唯一可能的不利可 能是其针状形态，这对于制造期间的流动性或压缩不一定理想。使用偏光 显微镜(PLM)观察针状形态。可以将这种结晶针状材料的研磨、或本领域 中已知的类似技术用于获得更均匀的粒子形态，所述粒子形态可以被用于 制备用于制造其药物组合物的材料。普通技术人员可以确定适合用于期望 的药物组合物的粒度。可以使用例如约5μm的粒度。然而，应当注意， 持续的研磨可能由于在这种过程期间涉及的高温而使材料脱水。另一方 面，80℃储存试验已指示，在升高的温度下，在7天的时间内，材料能 够以水合物存在而仅具有轻微的变化。这减轻了在研磨时脱水的风险。
如图9中所示，本发明的结晶染料木黄酮钠盐二水合物具有与两个染 料木黄酮分子和四个水分子结合的二聚结构中心对称的两个钠阳离子。结 晶染料木黄酮钠盐二水合物可以由例如普通溶剂IPA(异丙醇或2-丙醇)在 环境温度下制备而不需要任何特殊处理如温度循环、超声或快速蒸发。如 下列实施例1中所示，本发明的结晶染料木黄酮钠盐二水合物具有优异的 稳定性。与染料木黄酮自身相比，其更加可溶于水、水性溶剂体系和有机 溶剂。另外，与染料木黄酮相比，结晶染料木黄酮钠盐二水合物显示出优 异的早期和晚期固有动力学溶解度曲线。还显示与染料木黄酮相比，本发 明的结晶染料木黄酮钠二水合物具有更高的生物利用度。
本发明的另一个实施方式是结晶染料木黄酮钾盐二水合物。结晶染料 木黄酮钾盐二水合物也可以由例如普通溶剂IPA(异丙醇或2-丙醇)在环境 温度下制备而不需要任何特殊处理如温度循环、超声或快速蒸发。结晶染 料木黄酮钾盐二水合物易于由固体染料木黄酮钾盐形成。临近回收的时 候，染料木黄酮钾盐似乎是不稳定的无水无定形盐，其然后快速地从环境 吸水而结晶成二水合材料。如下列实施例2中所讨论的，结晶染料木黄酮 钾二水合物盐具有良好的稳定性。染料木黄酮钾盐二水合物是晶体且具有 针状形态(但是比相应的结晶染料木黄酮钠盐二水合物更厚的针)。
除了本发明的结晶染料木黄酮钠盐和钾盐之外，本发明的其他独立实 施方式涉及染料木黄酮与镁、N-甲基葡糖胺(葡甲胺)、钙、L-赖氨酸、N- 乙基葡糖胺(葡乙胺)和二乙胺的结晶盐。本发明的还一个实施方式涉及染 料木黄酮的结晶一水合物形式。在下列实施例中描述了染料木黄酮的这些 晶型中的每一种、其制备和表征。
染料木黄酮晶型的治疗应用
本发明涉及染料木黄酮的至少一种晶型，例如至少一种结晶染料木黄 酮盐的治疗应用。术语“治疗”或“处理”是指哺乳动物的疾病或病症的 任何治疗，包括：预防或保护免于疾病或病症，即，使得不产生临床症状； 抑制疾病或病症，即，阻止或抑制临床症状的发展；和/或解除疾病或病症， 即，使得临床症状复原。本领域的技术人员应当理解，在人类医学中，不 可能总是区别“防止”和“抑制”，因为最终诱导的一个或多个事件可能 是未知的、潜伏的，或者在发生一个或多个事件以后很久才确定患者。因 此，如本文中所用的，术语“预防”旨在作为“治疗”的要素以包含本文 中定义的“防止”和“抑制”两者。如本文中所用的，术语“保护”旨在 包括“预防”。
根据本发明的染料木黄酮晶型可用作药剂，其可以被用于治疗过度增 殖性疾病如例如包括例如肠癌、胃癌、食道癌、乳房癌、肺癌、前列腺癌、 膀胱癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、皮肤癌、甲状腺癌和胰腺癌的各种 癌症，以及白血病或淋巴瘤。这里提到的白血病和淋巴瘤可以是骨髓系统 的肿瘤，如例如淋巴系统的急性骨髓性白血病。
另外，还可以将本文中公开的染料木黄酮晶型用于通过疗法来治疗恒 温动物如例如人的方法。例如，可以将根据本发明的结晶染料木黄酮盐用 于治疗过度增殖性疾病如例如包括例如肠癌、胃癌、食道癌、乳房癌、肺 癌、前列腺癌、膀胱癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、皮肤癌、甲状腺癌 和胰腺癌的各种癌症，以及白血病或淋巴瘤的方法。这里提到的白血病和 淋巴瘤可以是骨髓系统的肿瘤，如例如淋巴系统的急性骨髓性白血病。
而且，可以将根据本发明的染料木黄酮晶型用于对患有过度增殖性疾 病如例如包括例如肠癌、胃癌、食道癌、乳房癌、肺癌、前列腺癌、膀胱 癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、皮肤癌、甲状腺癌和胰腺癌的各种癌症， 以及白血病或淋巴瘤的人进行治疗的方法。在另一个实施方式中，可以将 根据本公开内容的染料木黄酮晶型用于预防过度增殖性疾病如例如包括 例如肠癌、胃癌、食道癌、乳房癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、脑癌、肾 癌、卵巢癌、肝癌、皮肤癌、甲状腺癌和胰腺癌的各种癌症，以及白血病 或淋巴瘤。这里提到的白血病和淋巴瘤可以是骨髓系统的肿瘤，如例如淋 巴系统的急性骨髓性白血病。包括对需要其的人给予治疗有效量的染料木 黄酮的至少一种晶型的步骤。在上述治疗人类的任何一种方法中使用染料 木黄酮的至少一种晶型还形成了本发明的方面。
本文中定义的治疗可以被用作单一疗法或可以在本发明的至少一种 化合物之外，还涉及常规的外科或放射疗法或化学疗法。这种化学疗法可 包括一种以上下列种类的抗肿瘤剂：(i)在医学肿瘤中使用的抗增殖/抗肿瘤 药物及其组合，如烷基化和类似烷基化(alkylating like)的试剂(例如顺铂、 卡铂、环磷酰胺、氮芥、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、白消安和亚硝基脲)、 抗代谢物(例如盐酸吉西他滨、5-氟尿嘧啶、替加氟、雷替曲塞、甲氨蝶呤、 阿糖胞苷和羟基脲)、抗肿瘤抗生素(例如，蒽环霉素如阿霉素、博来霉素、 多柔比星、道诺霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素-C、更生霉素和光 神霉素)、抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱如长春新碱、长春花碱、长春 地辛和长春瑞滨以及紫杉烷类如紫杉醇和泰索帝)以及拓扑异构酶抑制剂 (例如表鬼臼毒素如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶、托泊替康和喜树碱)； (ii)细胞生长抑制剂如抗雌激素药(例如他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、 屈洛昔芬和碘酰芬(iodoxyfene))、雌激素受体拮抗剂(例如氟维司群)、抗雄 激素药(例如比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特和醋酸环丙孕酮)、LHRH拮抗 剂或LHRH促效剂(例如戈舍瑞林、亮丙瑞林和布舍瑞林)、孕激素(例如醋 酸甲地孕酮)、芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑(vorazole)和 依西美坦)以及5-α-还原酶(例如非那雄胺)抑制剂；(iii)抑制癌细胞侵入的 试剂(例如金属蛋白酶抑制剂如马立马司他和尿激酶血纤维蛋白溶酶原激 活物受体功能的抑制剂)；(iv)生长因子功能的抑制剂，例如包括生长因子 抗体、生长因子受体抗体的这种抑制剂(例如抗ErbB2抗体曲妥珠单抗(赫 赛汀)和抗ErbB1抗体(西妥昔单抗))、法尼基转移酶抑制剂、酪氨酸激酶 抑制剂和丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂例如表皮生长因子家族的抑制剂(例 如，EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉 代丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼，AZDI839)、N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2- 甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(厄洛替尼，OSI-774)和6-丙烯酰胺基-N-(3-氯-4- 氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(CI1033))、血小板衍生的生长因 子家族的抑制剂和肝细胞生长因子家族的抑制剂；(v)抗血管生成剂如抑制 血管内皮生长因子的作用的那些(例如抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐 单抗(阿瓦斯汀)以及化合物如在国际专利申请WO97/22596、WO 97/30035、WO97/32856和WO98/13354中公开的那些)以及通过其他机理 起作用的化合物(例如利诺胺、整联蛋白功能的抑制剂和血管抑素)；(vi) 血管破坏剂如考布他汀A4和在国际专利申请WO99/02166、WO 00/40529、WO00/41669、WO01/92224、WO02/04434和WO02/08213 中公开的化合物；(vii)反义治疗，例如针对上面列出的靶的那些，如ISIS 2503、抗反义寡核苷酸(anti-ras antisense)；(viii)基因治疗方法，包括例 如，取代异常基因如异常p53或异常BRCA1或BRCA2、GDEPT(基因导 向性酶前体药物疗法)方法诸如使用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基 还原酶的那些的方法，和提高患者对化学疗法或放射疗法的耐受性的方法 如多药耐药性基因治疗；以及(ix)免疫疗法，包括例如提高患者肿瘤细胞 的免疫原性的体外和体内方法，如利用细胞因子如白介素2、白介素4或 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的转染，使用转染的免疫细胞如细胞因子转 染的树突细胞的方法，使用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法以及使用抗 独特型抗体的方法。
在上述讨论的治疗中，还可以将根据本发明的染料木黄酮的至少一种 晶型与一种以上细胞周期抑制剂例如与抑制细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDK)的细胞周期抑制剂组合使用，或与甲磺酸伊马替尼(格列卫(Glivec)) 组合使用。这种联合治疗可以通过同时、连续或分别给药单独的治疗成分 的方式而获得。这种组合产物可以使用在本文中所述的剂量范围内的本发 明的至少一种化合物以及在其批准的剂量范围内的其他至少一种药物活 性试剂。可以将组合产物配制成单一剂型。
本发明还提供了可以适合用于细胞增殖性病症(如癌症)的治疗的组 合，其包含染料木黄酮的至少一种晶型诸如如前文中所述的至少一种结晶 染料木黄酮盐、以及如前文中所述的至少一种另外的抗肿瘤剂。这种组合 可以用作用于联合治疗细胞增殖性病症(如癌症)的药品。
除了其在治疗药物中的应用之外，作为寻找新治疗剂的一部分，根据 本发明的染料木黄酮的至少一种晶型还可以用作体外和体内试验体系的 开发和标准化中的药理学工具，所述试验体系用于评价在实验动物如猫、 狗、兔子、猴子、大鼠和小鼠中的细胞周期活性的抑制剂的效果。
本发明的另一个方面涉及根据本发明的染料木黄酮的至少一种晶型 在制备用于治疗以下疾病的药剂中的治疗应用，在所述疾病中，炎症的抑 制是有益的，所述疾病如例如慢性炎症、炎症性肠病、克罗恩病、舍格伦 病、风湿性关节炎、关节炎、异位性皮炎、血管炎、牛皮癣、良性前列腺 增生、伤口愈合、末期肾病、慢性肾病、慢性阻塞性肺病或哮喘。
另外，还可以将根据本发明的染料木黄酮的至少一种晶型用于制备用 于治疗以下疾病的药剂，在所述疾病中，感染的抑制是有益的，所述疾病 如例如局部感染、全身感染、脓毒症、全身真菌感染或局部真菌感染。
本发明的又一个方面涉及染料木黄酮的至少一种晶型用于治疗以下 疾病的应用，在所述疾病中，在身体器官和人腺体中恢复正常的氯化物和 盐(水)的移动是有益的，所述疾病如例如刺激囊性纤维化跨膜传导调节剂。
本发明的还一个方面涉及染料木黄酮的至少一种晶型用于治疗以下 疾病的应用，在所述疾病中，由形成引发器官功能障碍的不溶性细胞外原 纤维沉淀物来抑制可溶性蛋白是有益的，所述应用如例如抑制由TTR基 因产物的氨基酸序列中的改变造成的转甲状腺素蛋白(TTR)淀粉样变性。 在本公开内容的另一个实施方式中，可以将本文中描述的染料木黄酮的至 少一种晶型用于治疗家族性淀粉样变多发性神经病。
包含染料木黄酮晶型的药物组合物
本发明还涉及药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的根据本 发明的染料木黄酮的至少一种晶型以及药用(药物可接受的)载体(还称 作药用赋形剂)。如上文中所讨论的，根据本发明的染料木黄酮的晶型可 以是在治疗上对治疗或预防例如上文讨论的疾病状态是有用的，所述疾病 状态包括例如与异常血管生成相关的那些。
用于治疗那些疾病状态的药物组合物可以包含治疗有效量的根据本 发明的染料木黄酮的至少一种晶型以便下调涉及控制血管生成的基因的 转录，从而治疗具有特定疾病的患者。本发明的药物组合物可以是包含根 据本发明的染料木黄酮的至少一种晶型的任何药物形式。药物组合物可以 是例如片剂、胶囊剂、液体悬浮液、可注射、局部或经皮给药的。药物组 合物通常包含例如按重量计约1％至约99％的本发明的染料木黄酮的至少 一种晶型和例如按重量计99％至1％的至少一种合适的药物赋形剂。在一 个实施方式中，所述组合物可以是按重量计在约5％至约75％之间的本发 明的染料木黄酮的至少一种晶型，剩下的是至少一种合适的药物赋形剂或 至少一种其他佐剂，如下文所讨论的。
“治疗有效量的根据本发明的染料木黄酮的至少一种晶型”通常在约 0.05-约500mg/kg的范围内。预防或治疗任何特定患者所需要的实际量可 以取决于各种因素，包括例如被治疗的疾病状态及其严重性；所用的具体 的药物组合物；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；给药模式； 给药时间；给药途径；和染料木黄酮晶型的排泄率；治疗的持续时间；与 所用的具体混合物组合或同时使用的任何药物；以及其他在医疗领域中熟 知的这种因素。在通过引用结合于本文中的Goodman和Gilman的“The Pharmacological Basis of Therapeutics(治疗学的药理学基础)”，Tenth Edition，A.Gilman，J.Hardman and L.Limbird，eds.，McGraw-Hill Press， 155-173，2001中，讨论了这些因素。可以将根据本发明的染料木黄酮晶 型和包含它们的药物组合物与抗癌剂或其他试剂组合使用，所述试剂通常 对因癌症而被治疗的患者给药。还可以在单一药物组合物中，将它们与一 种以上这种试剂共同配制。
取决于药物组合物的类型，药用载体可以选自本领域已知的任何一种 载体或多种载体的组合。药用载体的选择取决于待使用的药物形式和期望 给药方法。对于本发明的药物组合物，即具有本发明的染料木黄酮的至少 一种晶型的药物组合物，应当选择保持晶型的载体。换言之，载体不应当 实质上改变染料木黄酮的晶型。载体也不应该另外与所使用的染料木黄酮 盐的晶型不相容，如通过产生任何不期望的生物效应，或者另外与药物组 合物的任何其他成分以有害的方式相互作用。
本发明的药物组合物可以通过药物制剂领域中已知的方法来制备，例 如参见通过引用结合于本文中的Remington’s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.，(Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1990)。以固体剂型，可以将染 料木黄酮的至少一种晶型与至少一种药用赋形剂如例如柠檬酸钠或磷酸 二钙，或以下物质混合：(a)填料或补充剂如例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄 糖、甘露醇和硅酸，(b)粘结剂如例如纤维素衍生物、淀粉、藻酸盐 (alignates)、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶，(c)保湿剂如 例如甘油，(d)崩解剂如例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、交 联羧甲基纤维素钠、复合硅酸盐和碳酸钠，(e)溶液缓凝剂如例如石蜡，(f) 吸收促进剂如例如季铵化合物，(g)润湿剂如例如十六烷醇和甘油单硬脂酸 酯、硬脂酸镁等，(h)吸附剂如例如高岭土和膨润土，以及(i)润滑剂如例如 滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠或其混合物。 在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂型还可以包含缓冲剂。
还可以将药物制剂领域中已知的药用佐剂用于本发明的药物组合物 中。这些包括但不限于防腐剂、润湿剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂、芳香 剂、乳化剂和分散剂。可以通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯 甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等来确保微生物作用的防止。还期望的 是包含等渗剂例如糖、氯化钠等。如果需要，本发明的药物组合物还可以 包含少量的辅助物质如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、抗氧化剂等，如例 如柠檬酸、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁羟甲苯等。
可以利用涂层和壳，如肠溶衣和本领域中熟知的其他物质来制备如上 所述的固体剂型。它们可以包含安抚剂，且还能够是这种组合物，其以延 迟的方式在肠道的特定部分中释放一种或多种活性化合物。可以使用的嵌 入组合物的非限制性实例是聚合物和石蜡。活性化合物还可以是微胶囊形 式，如果需要，可以具有一种以上上述赋形剂。
除了活性化合物之外，悬浮液可以包含悬浮剂如例如乙氧基化的异硬 脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、 膨润土、琼脂和黄蓍胶，或这些物质的混合物等。
用于直肠给药的组合物例如为栓剂，其可以通过将根据本公开内容的 染料木黄酮的至少一种晶型与例如合适的非刺激性赋形剂或载体如可可 油、聚乙二醇或栓剂蜡混合而制备，所述非刺激性赋形剂或载体在常温下 可以是固体而在体温下可以是液体，因此在合适的体腔中时熔化且释放其 中的活性成分。
因为在制备期间保持染料木黄酮的晶型，所以对于本发明的药物组合 物来说，固体剂型是优选的。可以使用包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂和 粒剂的用于口服给药的固体剂型。在这种固体剂型中，可以将活性化合物 与至少一种惰性的药用赋形剂(也称作药用载体)混合。还可以将根据本发 明的染料木黄酮的晶型用作液体药物组合物的制剂中的前体。可以通过任 何公认的给药方式或用于提供相似用途的试剂来以纯形式或以适当的药 物组合物给予染料木黄酮晶型。因此，给药可以是以固体、半固体、冻干 粉的形式或液体剂型如例如片剂、栓剂、丸剂、软弹性硬胶囊剂、粉剂、 溶液剂、悬浮液或气雾剂等，如例如以适用于精确剂量的简单给药的单位 剂型，例如经口、经颊、经鼻、不经肠(静脉内、肌肉内或皮下)、局部、 经皮、阴道内、经膀胱内、全身内或直肠给药。给药的一个途径可以是使 用便利的每日剂量方案的口服给药，所述给药方案可以根据待治疗的疾病 状态的严重程度来调节。
本发明还涉及使用用于治疗各种疾病的染料木黄酮的至少一种晶型 的药剂的制备。这些包括但不限于：其中一种以上蛋白质酪氨酸激酶的抑 制是有益的疾病，如例如受染料木黄酮影响的激酶是可能的靶；过度增殖 性疾病如各种癌症，如例如肠癌、乳房癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾 癌或胰腺癌、或白血病或淋巴瘤或增殖性炎症萎缩；其中炎症的抑制是有 益的疾病，如例如慢性炎症、炎症性肠病、克罗恩病、舍格伦病、风湿性 关节炎、关节炎、异位性皮炎、血管炎、牛皮癣、良性前列腺增生、伤口 愈合、末期肾病、慢性肾病、慢性阻塞性肺病、哮喘；其中感染的抑制是 有益的疾病，如例如局部感染、全身感染、脓毒症、全身真菌感染、局部 真菌感染；其中在人的身体器官和腺体中恢复正常的氯化物和盐(水)的移 动是有益的疾病，如例如刺激囊性纤维化跨膜传导调节剂以及涉及绝经后 情况如热潮红和骨质疏松症的疾病和症状以及其中由形成引发器官功能 障碍的不溶性细胞外原纤维沉淀物来抑制可溶性蛋白是有益的疾病，如淀 粉样变性，例如原纤维沉淀物由转甲状腺素蛋白(TTR)构成的那些，如家 族性淀粉样变多发性神经病。
实施例
将下列分析技术用于下列实施例中：
X射线粉末衍射(XRPD)：X射线粉末衍射研究在Bruker D8-Discover 衍射仪上进行。在XRPD零背景的单个96孔板样品架上将约5mg的样品 轻轻压缩。然后以传输方式将样品装入到Bruker D8-Discover衍射仪中， 并利用表1中所示的实验条件进行分析。
表1：XRPD测量条件
差示扫描量热法(DSC)：将约2mg的样品称重至DSC铝盘中并用铝 盖将其封闭(非密封地)。然后将样品盘装入到在25℃下冷却并保持的 Pyris 1珀金埃尔默(Perkin-Elmer)DSC(装备有液氮冷却单元)中。一旦获得 稳定的热流响应，则然后在10℃/分钟的扫描速度下将样品加热至 300℃，且对所得的热流响应进行监控。使用20cm3/分钟的氦清洗以防止 样品在加热期间的热致氧化并且还用于降低通过样品的热滞以提高设备 灵敏度。在分析之前，使用铟参考标准对设备进行温度和热流校准。
重量法蒸汽吸附(GVS)：将约15mg样品放在金属丝网蒸汽吸附天平 盘中，并将其装入到提供的SMS本征蒸汽吸附天平(表面测量系统仪器) 中。然后通过保持0％湿度环境对样品进行干燥，直至显示不再有重量变 化。随后，接着以10％的RH增量对样品进行0-90％RH的升温曲线，在 每一步骤保持样品直至已获得平衡(99.5％步骤完成)。在达到平衡时，将装 置内的％RH提升到下一步并重复平衡程序。在吸附循环完成之后，接着 使用相同的程序对样品进行干燥。然后，对吸附/脱附循环期间的重量变化 进行监控，从而使得可以确定样品的吸湿性。
热重分析(TGA)：将约5mg样品精确称重至TGA铂盘中，并将其装 入到保持在室温下的珀金埃尔默TGA7热重分析仪中。然后，在10℃/ 分钟的速率下将样品从25℃加热至300℃，在此期间，对重量的变化进 行监控。所使用的清洗气体为20cm3/分钟流量的氮。在分析之前，使用 100mg参考重量对设备进行重量校准，并使用镍铝合金参考标准对设备进 行温度校准。
偏光显微镜(PLM)：使用装备有高分辨率莱卡相机和图像采集软件 (Firecam V.1.0)的莱卡莱兹(Leica Leitz)DMRB偏光显微镜确定结晶(双折 射)的存在。除非另有说明，使用10x物镜记录所有图像。
1 H核磁共振(NMR)：1H NMR在Bruker AC200 200MHz光谱仪上进 行，各样品的NMR在氘代甲醇中进行。以约5mg浓度制备各个样品。
实施例1-结晶染料木黄酮钠盐二水合物
1.1染料木黄酮钠盐二水合物的制备：将约300mg染料木黄酮放入 到6cm3(20体积)的IPA中。在添加1M氢氧化钠(NaOH)时，反应快速明 显(从浅黄色到鲜黄色的颜色变化)。在环境温度下将混合物振荡约3小时， 然后使其静置约2天(周末)。通过过滤将固体分离，然后使其在环境温度 下干燥约24小时。根据这种方法制备的染料木黄酮钠盐是结晶染料木黄 酮钠盐二水合物，其已经通过下列方法表征。
1.2结晶染料木黄酮钠盐二水合物的XRPD
使用上述程序获得了如图1中所示的XRPD图谱。如图1中所示， XRPD分析显示了可能是钠盐的IPA溶剂化物的固体型杂质。在80℃下 将材料过夜干燥除去杂质。将在实验的°2θ±0.2°2θ处的XRPD图谱中的 峰列出于表2中。峰的全部列表或其子集可以足以表征结晶染料木黄酮钠 盐二水合物。可以单独或组合地用于表征结晶染料木黄酮钠盐二水合物的 来自图1的峰的一个子集包括5.9、11.6、11.8、15.2、24.8、28.2、28.9 和28.9°2θ±0.2°2θ。
表2
1.3经干燥的结晶染料木黄酮钠盐二水合物的DSC
通过将结晶染料木黄酮钠二水合物盐干燥来制备样品，根据在上述 1.1中所述的程序，在80℃下过夜来制备样品。图2示出了经干燥的结 晶染料木黄酮钠盐二水合物的样品的DSC。DSC指示在约91℃下脱水， 然后在约132℃下熔化。其他峰可能与降解有关(也由下文讨论的图4和 5中所示的TGA曲线指示)。
1.4结晶染料木黄酮钠盐二水合物的GVS
如图3中所示，结晶染料木黄酮钠二水合物的GVS研究指示水合物 形成(在分析之前的GVS循环脱水材料)且吸附最多45wt％的水。然而，在 20至70RH％(材料的典型工作范围)之间，观察到仅约2％的湿度变化。
1.5结晶染料木黄酮钠盐二水合物的TGA
图4示出了来自上述1.1的在环境温度下干燥约24小时的结晶染料 木黄酮钠盐二水合物的样品的TGA曲线。图5是来自在80℃下过夜干 燥的制备的结晶染料木黄酮钠二水合物盐的样品的TGA。TGA指示，钠 盐发生水合且在约75℃下开始水损失，从而适合于进一步开发。重量损 失符合一摩尔水对一摩尔钠。
1.6结晶染料木黄酮钠盐二水合物的PLM
结晶染料木黄酮钠盐二水合物的PLM示出了针状形态。
1.7结晶染料木黄酮钠盐二水合物的溶解度测量
水溶性：使用下列方案来测量水溶性。在将pH设定在4.5、6.7和7.5 的水性介质中制得染料木黄酮和结晶染料木黄酮钠二水合物盐的浆液，将 每种浆液在环境温度下振荡约24小时，然后使用0.2μm过滤器将其过滤 至干净的小瓶中。然后，将饱和溶液稀释，并在Chirobiotic T高效液相色 谱(HPLC)柱和设定在λ最大＝270nm的紫外检测器上使用N-Ac-DL-蛋氨酸 分析API(染料木黄酮)含量。流动相是在30分钟的时间内，以等强度 (isocratic)模式流动的乙腈/水。将结果示于表3中(BDL＝低于检出限)。从 利用染料木黄酮流动的HPLC曲线中API峰并不明显(应该在约6-7分钟 处出现)指示，染料木黄酮在水性介质中极其不可溶且水平低于所用HPLC 技术的灵敏度(技术的灵敏度mg至μg水平)。报导了染料木黄酮显示出在 10-40nM的范围内的水溶性。
表3
在不同溶剂中的溶解度：使用下列方案测量了在不同有机溶剂中的溶 解度。分别将约25mg份的染料木黄酮和结晶染料木黄酮钠二水合物盐放 在48个不同的小瓶中。向小瓶中专门添加各溶剂的5体积等份。在每次 添加之间，检查混合物的溶解且如果溶解不明显，则继续所述程序直至观 察到溶解或当已经添加50体积时。将结果示出于表4中。
表4
1.8结晶染料木黄酮钠盐二水合物的稳定性研究
在80℃下对样品稳定性检验7天并在40℃/75RH％下检验7天。在 7天后注意到诸如颜色变化的观察结果，且在7天后进行样品的XRPD以 研究任何固体形式变化。图6示出了结晶染料木黄酮钠盐二水合物的原始 样品以及在80℃下7天和在40℃/75RH％下7天的样品的XRPD图谱。 40℃/75RH％研究指示在7天时间内没有变化。将材料在80℃下储存7 天的时间指示结晶度的轻微损失，所述损失暗示缓慢脱水。7天光稳定性 试验揭示颜色或固体形式均无变化。
1.9结晶染料木黄酮钠盐二水合物的 1 H NMR光谱
图7示出了结晶染料木黄酮钠盐二水合物的1H NMR光谱。表5列 出了1H NMR光谱中的峰。在图8的1H NMR中染料木黄酮中在约5.9处 的芳香族质子的化学位移移动至6.1ppm确认了盐形成。
表5
化学位移 多重性(mulitlpicity) 范围(ppm) 7.952 s 7.932-7.919 7.372 m 7.429-7.306 6.861 m 6.927-6.791 6.101 dd 6.187-6.028 4.936 s 5.256-4.723 3.34 q 3.577-3.096 1.085 s 1.213-0.934
s＝单峰，m＝多重峰，dd＝两个双峰，q＝四重峰(quadruplet)
1.10结晶染料木黄酮钠盐二水合物的歧化研究
使50mg结晶染料木黄酮钠盐二水合物样品在250μL蒸馏水中浆化 约48小时，然后通过XRPD检查其歧化。还使用康宁(Corning)240pH测 定仪测量上清液的pH。未观察到歧化的迹象。在浆化之后上清液的pH为 7.1。
1.11结晶染料木黄酮钠盐二水合物的水合研究
在水平面处，将约100mg结晶染料木黄酮钠盐二水合物放在约500 μL IPA/水混合物(3％、5％和10％)中。在环境温度下将各种混合物搅拌 约48小时，然后将其过滤以回收用于XRPD和TGA研究的固体。如图8 中所示，水合由原始材料在XRPD图谱中的变化指示，所述变化符合来自 TGA的重量损失(材料依赖性)。水合研究揭示无进一步的水合；但是除去 了IPA溶剂化物杂质。
1.12结晶染料木黄酮钠盐二水合物的单晶X射线衍射
单晶制备：从结晶染料木黄酮钠盐二水合物(约48mg)溶解于50∶50 IPA/水(3cm3)中的溶液中生长晶体。然后，使溶液通过刺穿的石蜡膜 (parafilm)缓慢蒸发。在约2周的蒸发之后，可明显得到针状晶体。
单晶X射线衍射：选择样品的板条状针以用于数据收集。使用Bruker Smart Apex CCD衍射仪，利用Mo-Kα辐射来收集衍射数据，所述衍射仪 装备有在150K下运行的Oxford Cryosystem低温装置。
在将数据集编入索引时，确定晶体结构是伪对称的。能够以尺寸 a＝3.76，b＝30.23，c＝12.12β＝106.2°，V＝1324的原始的、度量上单 斜的晶胞将强数据编入索引。所有数据的完整索引仅能够利用尺寸 a＝7.52，b＝11.65，c＝30.46α＝89.8°，β＝82.9°，γ＝88.1°，V＝2647的更 大的三斜晶胞而获得。这种晶胞自身可变化成尺寸a＝7.52，b＝60.46， c＝11.65β＝91.9°，V＝5295的伪的以单斜C为中心的晶胞。
将衍射数据归一化并归约(SAINT)，并使用多重扫描程序SADABS 校正系统误差。通过使用在上述三斜晶胞上归一化的数据集的直接法 (SHELXS)来在P-1中解答结构。使用所有数据(SHELXL)将所述结构对 |F|2进行精修。双晶律的并入对于结构的完成是必需的。所用的双晶律 是关于[-102]方向的二重旋转，所述方向对应于上述单斜晶胞的b轴方向。
除了是双晶的之外，所述结构还是伪对称的。这是指，在有机片段内 的原子坐标互相联系，且其导致相关性和转入最小二乘法精修的数学不稳 定。为了解决这些相似性，对所有化学相关的键长和键角施加约束。分子 对(1和2、以及3和4)通过a/2的转化而相关，因此，强迫使等价的各向 异性的位移参数相等。需要一些减幅(damping)以实现会聚。例如，相关性 还导致等价键长变得人为的不同，且应当注意，不能将任何重要性归因于 化学等价键长中的明显不同。将需要更精细的精修模型以解决这些效果。
将连接至碳的氢原子放到计算位置中。可以将一些连接至氧的氢原子 设置在不同的图中。特别地，将H原子连接至配位钠离子的O原子(O141 和O144)。将用于配位体-水H原子的位置设置在关于可能H位置的场所 而计算的傅里叶图中；在模型中包括构成几何合理的H键且避免短接触的 那些。将连接至O8的H原子设置在不同的图中，然后，将整个分子作为 旋转刚性基团进行初始精修，之后，利用骑式模型(riding model)对H原子 进行处理。沿短O...O向量放置剩余的H原子(H7A和H142)。在傅里叶 图中没有氢原子在O42和O43上的证据，且放置它们的尝试导致与其他H 原子的不合理的短H...H接触的发展。
最终的‘常规’R因子[基于F和带有F＞4σ(F)的7355数据]为0.0616。 将其他晶体和精修参数列出于表6中。
表6关于结晶染料木黄酮钠盐二水合物的单晶数据和结构精修。
A晶体数据
B数据收集
C解答和精修
讨论：结晶染料木黄酮钠盐二水合物的单晶结构显示，所述化合物具 有[Na2(H2O)4(μ-H2O)2(LH)2]L2·2H2O的全式，其中LH＝全质子化的染料木 黄酮配位体C15H10O5，且μ-H2O是Na离子之间的桥接水分子(即，Na离 子各自结合至两个末端水和两个桥接水(指定的μ-H2O)，附加一个LH配 位体-参见图9)。该结论取决于上述H原子放置的模型。通常将使用X射 线数据的氢原子放置看作是试验性的，因为在结构分析期间遇到的问题， 这里更是这样。即，提出的H原子位置确实与涉及几何标准氢键的所有H 原子形成了貌似真实的H键组。
如图9中所示，阳离子性钠络合物由穿过反演中心而形成的二聚单元 组成。所述钠离子是五配位的，配位层由两个末端和两个桥接水配位体以 及一个LH配位体组成。氢键在配位的醇部分和一个末端水分子之间形成 (H141...O1和H141...O4)。L-阴离子在酚的O42和O43位点处去质子化。 C-O-距离相当短(平均1.34)。内部氢键在H6*和O8*，配位LH和L-阴离 子之间形成。
图9示出了结晶染料木黄酮钠盐二水合物的二聚结构中中心对称的 两个钠阳离子，其中分子内氢键如虚线所示。
晶体中的堆积由氢键支配。阳离子通过水分子连接至阴离子以形成 层，所述层还是阳离子与阴离子之间的堆积相互作用的特征。图10示出 了涉及基于O11的阳离子和基于O12的阴离子的一个这样的层。以蓝绿 色示出了水分子。所述图是沿[010]的。
还形成了由基于O13和O14的分子构成的相似层，两种类型的层沿 b轴交替，通过H键连接。图11示出了作为三维网络的整体图像。图11 示出了沿[100]方向观看的结晶染料木黄酮钠盐二水合物的堆积。
使用PLATON/MISSYM程序的分析指示，能够使用小(1324)晶胞 和空间群P21/c来独立描述有机片段，且其仅是打破这种对称的钠离子和 水分子，从而解释了衍射图谱中强数据和弱数据的图谱以及在精修中经历 的伪对称问题。
将关于结晶染料木黄酮钠盐二水合物的基于单晶数据和结构的计算 的XRPD图谱示出于图12中。表7列出了计算的XRPD图谱的峰。峰的 全部列表或其子集可以足以表征结晶染料木黄酮钠盐二水合物。可以单独 或组合地用于表征结晶染料木黄酮钠盐二水合物的来自图12的峰的一个 子集包括5.8、11.6、15.2、17.6、25.1、28.4、28.8和29.2°2θ±0.2°2θ。
表7
1.13在雄性斯-道大鼠中十二指肠内和静脉内给药之后，单独的染料 木黄酮以及来自结晶染料木黄酮钠盐二水合物的生物利用度。
用于体内研究的剂量给药溶液的制备：在干燥剂和遮光下在室温下储 存染料木黄酮和结晶染料木黄酮钠盐二水合物。所述剂量给药溶液在剂量 给药的日子由粉末新鲜制备。在50∶50的DMSO∶盐水中以1mg/mL(游离酸) 制备用于静脉内给药(IV)的剂量给药溶液。在0.2％的羧甲基纤维素钠 (NaCMC)在水中的溶液中以2mg/mL(染料木黄酮游离酸)制备用于十二指 肠内给药(ID)的剂量给药溶液。
动物剂量给药：在禁食的雄性斯-道大鼠中评价染料木黄酮的药物动 力学。对每个动物装配有用于血液取样的颈静脉套管(JVC)。对用于静脉 内剂量给药的动物装配有用于剂量给药的另外的JVC。对用于十二指肠内 剂量给药的动物装配有用于剂量给药的十二指肠套管(IDC)。每个笼子里 容纳一个外科手术改良的动物。在研究开始之前，任意地对所有动物提供 商业的啮齿动物食物(LabDiet，Certified Rodent Diet#5002)。然后，在研究 之前和在研究期间，不给动物食物最少12小时，直至当送回食物时为剂 量后8小时。任意地提供水。
在剂量给药的日子，在时间零点时以单次推注剂量给予十二指肠内剂 量给药溶液。在约1分钟内以缓慢IV注射给予静脉内剂量。在注入结束 时开始血液取样次数。收集血液样品。将研究设计示出于表8中。
表8：在大鼠中，染料木黄酮和结晶染料木黄酮钠盐二水合物的比较 药物动力学研究的概要。
通过颈静脉套管收集来自大鼠的每个血液样品并将其放在包含肝素 钠作为抗凝血剂的冷冻的聚丙烯管中。在4℃的温度下并以13,000rpm的 速度将样品离心分离5分钟。在整个处理过程中将样品保持冷冻。将每个 血浆样品分成两份。第一份包含50μL血浆。将所有剩余的血浆体积用于 第二份。然后，将样品放在干冰上，并在设定为保持-60℃至-80℃的冰 箱中储存。在利用葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶混合物过夜孵化之后，通过 LC-MS/MS对血浆样品中染料木黄酮的总浓度进行分析。使用WinNonlin 软件对药物动力学参数进行计算。
血浆样品的分析：开发了用于确定大鼠血浆中的染料木黄酮的 LC-MS/MS分析方法。在样品分析之前，分析标准曲线以确定所述方法的 特性、范围和线性。在分析之前，通过利用β-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶 对所有样品进行预处理和孵化来确定血浆样品中的全部染料木黄酮。利用 酶混合物的孵化去结合了回到母型的染料木黄酮的任何葡糖苷酸或硫酸 酯代谢物。
关于LC-MS/MS分析的验收标准：将一个标准曲线分散在每个分析 流程的整个过程中。为了使流程合格，除了在±25％可接受的LLOQ处之 外，至少5/8的标准必须精确在±20％范围内。
药物动力学分析：使用药物动力学程序WinNonlin v.4.1对单独的血 浆浓度相对于关于染料木黄酮的时间数据的关系进行非房室模型分析(非 代谢区分析，non-compartmental analysis)。将低于定量限(10ng/mL)的血 浆浓度指定为仅用于PK分析的零值。
结果：如图13中所示，在ID剂量给药之后，与结晶染料木黄酮钠 盐二水合物相比，染料木黄酮的平均血浆浓度和PK曲线明显不同。来自 结晶染料木黄酮钠二水合物盐的染料木黄酮的平均峰值血浆浓度(C最大)与 染料木黄酮的峰值血浆浓度相比为4.2倍高，两者分别为8330±2176 ng/mL和1983±1130ng/mL。在结晶染料木黄酮钠盐二水合物的ID剂量 给药之后的15分钟内，已经观察到染料木黄酮的最大血浆浓度(C最大)，而 染料木黄酮的C最大在剂量后2小时才观察到(图13和表10)。与关于染料 木黄酮的16±4.4％相比，来自结晶染料木黄酮钠盐二水合物的染料木黄 酮生物利用度为55±16％(表9)。
表9：在20mg/kg的各种形式的十二指肠内给药之后的药物动力学参 数(平均±SD，n＝3)。
PK参数 染料木黄酮 结晶染料木黄酮钠盐二水合物 C最大(ng/ml) 1983±1130 8330±2176 t最大(h) 2.0±0 0.83±1.0 AUC最后(h·kg·ng/ml/mg) 414±111 1161±358 生物利用度(％) 16±4.4 55±16
如表10中所示，在IV剂量给药之后，染料木黄酮和结晶染料木黄 酮钠盐二水合物的药物动力学曲线在两种形式之间并不是显著不同。
表10：在1mg/kg的各种形式的静脉内给药之后的药物动力学参数(平 均±SD，n＝3)。1外推至t＝0。
PK参数 染料木黄酮 结晶染料木黄酮钠盐二水合物 C0(ng/ml)1 6617±1059 6640±1223 T1/2(h) 1.4±0.3 1.6±0.9 CL(L/h/kg) 0.40±0.09 0.47±0.08 Vss(L/kg) 0.40±0.06 0.36±0.09 AUC最后(h·kg·ng/ml/mg) 2533±638 2129±331 AUC∞(h·kg·ng/ml/mg) 2584±639 2189±356
1.14在染料木黄酮和结晶染料木黄酮钠盐二水合物之间的物理化学 特征以及动力学和平衡溶解度比较。
与染料木黄酮相比，结晶染料木黄酮钠盐二水合物在EtOH/dH2O溶 液中显示优异的早期和晚期固有动力学溶解度曲线。结晶染料木黄酮钠盐 二水合物在100％EtOH中的低的晚期固有动力学溶解度对溶剂的非生理 学性质给出的临床前开发具有较低的实际含义。
实验的：在SuperSol 1000(PREVENTOR Gmbh)溶解度分析中运行染 料木黄酮和结晶染料木黄酮钠盐二水合物，并通过测量在250nm波长处 流过测量室中的吸光度而在封闭体系中随时间测量化合物的浓度。由于两 种化合物在纯去离子H2O中形成悬浮液，所以根据欧洲药典指南01/2008， 2.9.3节，表2.9.3.5，由100％EtOH的溶液以及dH2O和EtOH，特别是 EtOH50/50(体积/体积)和EtOH/dH2O75/25(体积/体积)的混合物来评价物理 化学性质。
测量了下列参数：
t [MSS] 定义为：从分析开始到最大溶解速度的时间(分钟)
C [MSS] 定义为：表示为最大溶解速度时的浓度的早期动力学溶解度 (mg×1-1)
C [Eq] 定义为：表示为在平衡动力学溶解度时的浓度的晚期动力学溶解 度(mg×1-1)
t [Eq] 定义为：从分析开始到平衡动力学溶解度的时间(分钟)
ΔC[C Eq -C MSS ]定义为：在如上所述的早期和晚期动力学溶解度之间的 浓度差(mg×1-1)
Δt[C Eq -C MSS ]定义为：在早期和晚期动力学溶解度终点之间的时间差 (分钟)
MSS定义为：由C[MSS]/t[MSS]定义的最大溶解度速度(mg×1-1×分钟-1)
ISI定义为：由ΔC[CEq-CMSS]/Δt[CEq-CMSS]定义的固有溶解度系数
ISI值越高，溶解越快，且晚期固有动力学平衡溶解度C[Eq]的相对贡 献越强。
KSR定义为：由C[MSS]/C[Eq]得到的动力学溶解度比
KSR是早期动力学溶解度对全部晚期动力学平衡溶解度的相对贡献 的数字比率指示器。KSR值越高，早期动力学溶解度C[MSS]的相对贡献越 强。
结果：在表11、12和13中报导的条件下对染料木黄酮和结晶染料木 黄酮钠盐二水合物的热力学、动力学和平衡溶解度数据进行评价。
如表11中所示，染料木黄酮显示出(a)良好的MSS，(b)合格的KSR 和(c)良好的晚期溶解度曲线，而结晶染料木黄酮钠盐二水合物显示出(a) 优异的MSS，(b)优异的KSR和(c)良好至合格的ISI。对于EtOH/dH2O 50/50(体积/体积)，结晶染料木黄酮钠盐二水合物显示了最好的晚期固有动 力学溶解度曲线。
表11：EtOH/dH2O 50/50(体积/体积)
对于EtOH/dH2O 75/25(体积/体积)，如表13中所示，染料木黄酮显 示出(a)良好的MSS，(b)良好的KSR和(c)良好的晚期溶解度曲线。结晶染 料木黄酮钠盐二水合物显示出(a)优异的MSS，(b)优异的KSR和(c)优异的 ISI，其是最好的早期和晚期固有动力学溶解度曲线。
表12：EtOH/dH2O 75/25(体积/体积)
如表13中所报导的，在EtOH 100％时，染料木黄酮显示出(a)良好的 MSS，(b)合格的KSR和(c)良好的晚期溶解度曲线，而比较起来，结晶染 料木黄酮钠盐二水合物显示出(a)优异的MSS，(b)优异的KSR和(c)差的 ISI。结晶染料木黄酮钠盐二水合物显示出最好的早期固有动力学溶解度曲 线，但是对整个曲线的贡献小。
表13：EtOH 100％
1.15结晶染料木黄酮钠盐二水合物的大规模合成
合成：使用下列程序在千克规模上制备结晶染料木黄酮钠盐二水合 物：
1.将5.2kg的2-丙醇(IPA)和320g中性染料木黄酮进料到15L玻璃 反应器中。
2.将混合物的温度调节至22±3℃，并在22±4℃下，在约40分钟 的期间逐滴加入632g的2M NaOH水溶液。
3.在22±4℃下将混合物搅拌约19小时并将其冷却至约15℃，并 搅拌4小时。
4.在温度循环(15±3℃→35±3℃，在1小时期间→35±3℃，保持4 小时→15±3℃，在1小时期间→15±3℃，保持4小时)下将混合物搅拌约 90小时并最终在15±3℃下搅拌约4.5小时。
5.将沉淀的产物进行过滤，并用1.2kg的预冷却的2-丙醇洗涤。
6.在真空盘式干燥器中，不在真空下对过滤产物进行干燥，首先在 30℃的设定温度下干燥约19小时，然后在40℃的设定温度下干燥约20 小时，然后在50℃的设定温度下干燥约24小时，然后在60℃的设定温 度下干燥约16小时，最后在70℃的设定温度下干燥约10小时，直至由 KF滴定法测量的水含量满足设定规格。
7.最后，对产物(0.24kg)进行研磨并装入PE袋中。
可选的重结晶程序：使用下列程序对结晶染料木黄酮钠盐二水合物进 行重结晶：
1.将24g的按上述制备的结晶染料木黄酮钠盐二水合物添加到240 ml的乙醇中。
2.在250rpm下对此混合物进行搅拌并在45℃下对其进行加热约 30分钟。
3.使所得溶液冷却至室温。
4.然后以每1分钟添加1份的多份(如下所详述)添加庚烷。在每次添 加之间使用间歇的40rpm搅拌。
·添加4.151ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加3.272ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加5.209ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加3.505ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加3.885ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加5.465ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加6.314ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加6.656ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加8.258ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加6.969ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加11.115ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加10.750ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加14.219ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加9.261ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加14.913ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加13.471ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加15.753ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加19.172ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加23.441ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加25.503ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加26.856ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加28.126ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加28.070ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加36.738ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加35.989ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加49.677ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加50.145ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加32.579ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加61.538ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加57.143ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加51.948ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
·添加90.909ml庚烷并在40rpm下间歇搅拌。
5.然后，将样品在室温下静置过夜以结晶(约18小时)。
6.通过真空过滤收集结晶产物。
7.然后，将结晶产物干燥约21小时，同时通过卡尔.费歇尔滴定法监 控水含量以避免脱水的风险。
图14示出了重结晶的结晶染料木黄酮钠盐二水合物的XRPD图谱。 将在实验的°2θ±0.2°2θ处的XRPD图谱中的峰列出于表14中。峰的全部 列表或其子集可以足以表征结晶染料木黄酮钠盐二水合物。可以单独或组 合地用于表征结晶染料木黄酮钠盐二水合物的来自图14的峰的一个子集 包括6.0、7.1、11.8、11.9、15.3、17.8、21.3、25.0、28.3、28.6和29.1°2θ±0.2 °2θ。峰的优选子集包括6.0、7.1、15.3、25.0及三个峰28.3、28.6和29.1 °2θ±0.2°2θ中的至少两个，以及6.0、7.1、15.3、25.0和28.3°2θ±0.2°2θ。
表14
实施例2-结晶染料木黄酮钾盐二水合物
2.1染料木黄酮钾盐的制备：将约300mg的染料木黄酮放入到6 cm3(20体积)的IPA中。在添加1M氢氧化钾(KOH)时，浆液的反应明显(即， 浆液到透明溶液)。在环境温度下使混合物振荡约3小时，在其期间，沉 淀明显。然后，使其在环境温度下静置约2天(周末)。通过过滤将固体分 离，然后使其在环境温度下干燥约24小时。
当在环境房间条件下朝向空气打开时，在静置时由无定形钾盐形成结 晶染料木黄酮钾盐二水合物。当在水合研究中所述的IPA/水混合物中使染 料木黄酮钾盐浆化以通过水吸收来形成结晶染料木黄酮钾盐二水合物时， 其还可以由无定形钾盐制备。
由此，看起来染料木黄酮钾盐在临近回收时是不稳定的无水的无定形 盐，然后其迅速地从环境中吸收水以结晶成二水合材料。该发现受所有都 在下文中描述的光稳定性试验；水合研究；40℃/75RH％研究；80℃储 存研究和TGA试验支持。80℃储存研究由于材料看起来在该升高的温度 下吸水而特别值得注意；因此表明水合物在80℃下是稳定的。GVS数据 还指示，染料木黄酮钾盐二水合物是最稳定的形式，因此是可开发的。尽 管上述合成程序不直接产生二水合材料，但是其可以通过进一步将溶剂体 系处理或改变至包含更高的水含量(即，3％水/IPA)来很好地产生。类似 于结晶染料木黄酮钠盐二水合物，通过80℃储存试验，稍微减轻了研磨 中脱水的风险。
2.2无定形染料木黄酮钾盐的XRPD
如图15中所示，XRPD分析揭示，如2.1中所述产生的固体染料木 黄酮钾盐是无定形的(即，没有峰)。
2.3结晶染料木黄酮钾盐二水合物的XRPD
图16示出了结晶染料木黄酮钾盐二水合物的XRPD图谱。将在实验 的°2θ±0.2°2θ处的XRPD图谱中的峰列出于表15中。峰的全部列表或其 子集可以足以表征结晶染料木黄酮钾盐二水合物。可以单独或组合地用于 表征结晶染料木黄酮钾盐二水合物的来自图16的峰的一个子集包括11.6、 14.5、14.8、24.5、25.2、27.6、28.0和28.4°2θ±0.2°2θ。峰的优选子集包 括11.6、14.5、24.5、25.2以及三个峰27.6、28.0和28.4°2θ±0.2°2θ中的 至少两个。
表15
2.4结晶染料木黄酮钾盐二水合物的PLM
染料木黄酮钾盐二水合物的PLM分析显示，钾盐是结晶的且具有针 状形态。与结晶染料木黄酮钠盐二水合物的针相比，所述针更厚。
2.5结晶染料木黄酮钾盐二水合物的TGA
如图17中所示，TGA指示，钾盐是水合的且在约75℃下开始水损 失，从而适合于进一步开发。重量损失符合2摩尔水对1摩尔钾。
2.6结晶染料木黄酮钾盐二水合物的DSC
如图18中所示，DSC指示，在约91℃下脱水而没有熔化。其他峰 可能与降解有关(也由图16的TGA所指示)。
2.7结晶染料木黄酮钾盐二水合物的GVS
如图19中所示，GVS研究指示水合物形成(在分析之前的GVS循环 脱水材料)且吸附最多16wt％的水。然而，在20与70RH％(材料的典型工 作范围)之间，观察到仅约3％的湿度变化。这对于药物开发是有价值的性 质。
2.8结晶染料木黄酮钾盐二水合物的溶解度研究
使用实施例1.7中所述的方案测量结晶染料木黄酮钾盐二水合物的水 溶性。表16比较了结晶染料木黄酮钾盐二水合物与染料木黄酮的水溶性。
表16
2.9结晶染料木黄酮钾盐二水合物的1H NMR
图20示出了结晶染料木黄酮钾盐二水合物的1H NMR光谱。表17 列出了1H NMR光谱中的峰。在图20的1H NMR中染料木黄酮中在约5.9 处的芳香族质子的化学位移移动至6.1ppm确认了盐形成。
表17
化学位移 多重性 范围 7.959 S 8.009-7.941 7.375 m 7.437-7.322 6.861 m 6.932-6.800 6.154 dd 6.246-6.068 4.949 s 5.148-4.714 3.34 q 3.444-3.137 1.182 d 1.228-1.149
S＝单峰，m＝多重峰，d＝双峰，dd＝两个双峰，q＝四重峰
2.10结晶染料木黄酮钾盐二水合物的稳定性研究
在80℃下对样品稳定性检验7天并在40℃/75RH％下检验7天。在 7天后注意到诸如颜色变化的观察结果，且在7天后进行样品的XRPD以 研究任何固体形式变化。图21示出了结晶染料木黄酮钾盐二水合物在 80℃下7天和在40℃/75RH％下7天的样品的XRPD图谱。40℃/75RH％ 研究指示，染料木黄酮钾盐结晶以形成染料木黄酮钾盐二水合物。将结晶 染料木黄酮钾盐二水合物在80℃下储存7天的时间指示到染料木黄酮钾 盐二水合物的结晶。
2.11结晶染料木黄酮钾盐二水合物的水合研究
在水平面处，将约100mg的结晶染料木黄酮钠盐二水合物放在约500 μL IPA/水混合物(3％、5％和10％)中。在环境温度下将各种混合物搅拌约 48小时，然后将其过滤以回收用于XRPD和TGA研究的固体。如图22 中所示，水合研究揭示与结晶染料木黄酮钾盐二水合物一致的水合。
2.12结晶染料木黄酮钾盐二水合物的歧化研究
使结晶染料木黄酮钾盐二水合物的样品在蒸馏水中浆化约48小时， 然后通过XRPD检查其歧化。还使用康宁(Corning)240pH测定仪测量上 清液的pH。未观察到歧化的迹象。上清液的pH为指示无歧化的7.3。
实施例3-结晶染料木黄酮钙盐
3.1结晶染料木黄酮钙盐的制备
将约25mg的染料木黄酮放入到与约7mg固体氢氧化钙相同的容器 中。向固体混合物中，添加500μL的IPA/水(50∶50)，并将混合物在环境 温度下振荡约24小时。在搅拌之后，接着在振荡下对浆液进行温度循环 (40℃至环境温度，在4小时时间内)约72小时。然后通过过滤将固体分 离，并使其在环境温度下干燥约24小时。
3.2结晶染料木黄酮钙盐的表征
图23示出了结晶染料木黄酮钙盐的XRPD图谱。将在实验的2θ±0.2 °2θ处的XRPD图谱中的峰列出于表18中。峰的全部列表或其子集可以 足以表征结晶染料木黄酮钙盐。可以单独或组合地用于表征结晶染料木黄 酮钙盐的来自图23的峰的一个子集包括8.0、15.3、25.1和25.6°2θ±0.2 °2θ。将结晶染料木黄酮钙盐的TGA示出于图24中。结晶染料木黄酮钙 盐的PLM图像显示了针状晶体。
表18
实施例4-结晶染料木黄酮镁盐，1当量制备
4.1结晶染料木黄酮镁盐，1当量的制备
将约25mg的染料木黄酮放入到与约5.5mg固体氢氧化镁相同的容 器中。向固体混合物中，添加500μL的IPA/水(50∶50)，并将混合物在环 境温度下振荡约24小时。在搅拌之后，接着在振荡下对浆液进行温度循 环(40℃至环境温度，在4小时时间内)约72小时。然后通过过滤将固体 分离，并使其在环境温度下干燥约24小时。
4.2结晶染料木黄酮镁盐，1当量的表征
图25示出了由1当量制备的结晶染料木黄酮镁盐的XRPD图谱。将 在实验的°2θ±0.2°2θ处的XRPD图谱中的峰列出于表19中。峰的全部列 表或其子集可以足以表征结晶染料木黄酮镁盐。可以单独或组合地用于表 征结晶染料木黄酮镁盐的来自图25的峰的一个子集包括9.0、18.6、23.7、 25.7和38.0°2θ±0.2°2θ。将结晶染料木黄酮镁盐，1当量制备的TGA示 出于图26中。结晶染料木黄酮镁盐，1当量制备的PLM图像显示染料木 黄酮镁盐为晶体。
表19
实施例5-结晶染料木黄酮镁盐，2当量制备
5.1结晶染料木黄酮镁盐，2当量的制备
将约25mg的染料木黄酮放入到与约11mg固体氢氧化镁相同的容器 中。向固体混合物中，添加500μL的IPA/水(50∶50)，并将混合物在环境温 度下振荡约24小时。在搅拌之后，接着在振荡下对浆液进行温度循环 (40℃至环境温度，在4小时时间内)约72小时。然后通过过滤将固体分 离，并使其在环境温度下干燥约24小时。
5.2结晶染料木黄酮镁盐，2当量制备的表征
图27示出了结晶染料木黄酮镁盐，2当量制备的XRPD图谱。将在 实验的°2θ±0.2°2θ处的XRPD图谱中的峰列出于表20中。峰的全部列表 或其子集可以足以表征结晶染料木黄酮镁盐。将结晶染料木黄酮镁盐，2 当量的TGA曲线示出于图28中。
表20
来自1当量制备和2当量制备两者的结晶染料木黄酮镁盐的相似的 XRPD图谱和TGA曲线表明，由两种制备获得相同的结晶染料木黄酮镁 盐。可以单独或组合地用于表征结晶染料木黄酮镁盐的XAPD峰的一个子 集包括9.0、18.6、23.7、25.7和38.0°2θ±0.2°2θ。
实施例6-结晶染料木黄酮L-赖氨酸盐
6.1结晶染料木黄酮L-赖氨酸盐的制备
将约25mg的染料木黄酮放入到与约15mg固体L-赖氨酸一水合物相 同的容器中。向固体混合物中，添加500μL的IPA或甲苯，并将混合物在 环境温度下振荡约24小时。在搅拌之后，接着在振荡下对浆液进行温度 循环(40℃至环境温度，在4小时时间内)约72小时。然后通过过滤将固 体分离，并使其在环境温度下干燥约24小时。
6.2结晶染料木黄酮L-赖氨酸盐/染料木黄酮混合物的表征
通过XRPD对来自甲苯和IPA的结晶染料木黄酮L-赖氨酸盐的样品 进行分析，并产生图30和31中所示的XRPD图谱。下面也示出了关于结 晶染料木黄酮的XRPD图谱。如XRPD所指示的，两种方法产生了染料 木黄酮和染料木黄酮L-赖氨酸盐的混合物。图29示出了结晶染料木黄酮 的XRPD图谱。将在实验的°2θ±0.2°2θ处的图29的XRPD图谱中的峰 列出于表21中。
表21
6.3来自甲苯的结晶染料木黄酮L-赖氨酸盐的表征
图30示出了来自甲苯的结晶染料木黄酮L-赖氨酸盐的XRPD图谱。 将在实验的°2θ±0.2°2θ处的XRPD图谱中的峰列出于表22中。
表22
6.4来自IPA的结晶染料木黄酮L-赖氨酸盐的表征
图31示出了来自IPA的结晶染料木黄酮L-赖氨酸盐的XRPD图谱。 将在实验的°2θ±0.2°2θ处的XRPD图谱中的峰列出于表23中。将结晶染 料木黄酮L-赖氨酸/染料木黄酮混合物的TGA示出于图32中。如来自甲 苯的结晶混合物的PLM图像所做的一样，来自IPA的染料木黄酮L-赖氨 酸/染料木黄酮混合物的PLM图像显示了结晶材料。
表23
关于来自异丙醇和甲苯两者的结晶染料木黄酮L-赖氨酸盐的相似 XRPD图谱表明从两种制备获得了相同的结晶染料木黄酮L-赖氨酸盐。来 自表21或22的峰的全部列表或其子集可以足以表征结晶染料木黄酮L- 赖氨酸盐。通过将图30和31中的结晶染料木黄酮L-赖氨酸盐XRPD图 谱与图29中的结晶染料木黄酮的XRPD图谱进行比较，可以单独或组合 地用于表征结晶染料木黄酮L-赖氨酸盐的峰的一个子集包括5.2、18.6、 19.7、20.6和21.0°2θ±0.2°2θ。
实施例7-结晶染料木黄酮N-甲基葡糖胺(葡甲胺)盐
7.1结晶染料木黄酮N-甲基葡糖胺盐的制备
将约25mg的染料木黄酮放入到与约20mg固体N-甲基葡糖胺相同 的容器中。向固体混合物中，添加500μL的丙酮，并将混合物在环境温 度下振荡约24小时。在搅拌之后，接着在振荡下对浆液进行温度循环 (40℃至环境温度，在4小时时间内)约72小时。然后通过过滤将固体分 离，并使其在环境温度下干燥约24小时。
7.2结晶染料木黄酮N-甲基葡糖胺盐的表征
图33示出了结晶染料木黄酮N-甲基葡糖胺盐的XRPD图谱。将在实 验的°2θ±0.2°2θ处的XRPD图谱中的峰列出于表24中。峰的全部列表或 其子集可以足以表征结晶染料木黄酮N-甲基葡糖胺盐。可以单独或组合 地用于表征结晶染料木黄酮N-甲基葡糖胺盐的来自图33的峰的一个子集 包括7.5、7.8、12.3、14.8、16.5、17.1、17.6、18.8、19.4、20.0、20.8和 29.1°2θ±0.2°2θ。优选子集包括在12.3、14.8、17.6和19.4°2θ±0.2°2θ 处的峰。
表24
实施例8-结晶染料木黄酮N-乙基葡糖胺(葡乙胺)盐
8.1结晶染料木黄酮N-乙基葡糖胺(葡乙胺)盐的制备
将约25mg的染料木黄酮放入到与约19mg固体N-乙基葡糖胺相同 的容器中。向固体混合物中，添加500μL的丙酮或IPA，并将混合物在环 境温度下振荡约24小时。在搅拌之后，接着在振荡下对浆液进行温度循 环(40℃至环境温度，在4小时时间内)约72小时。然后通过过滤将固体 分离，并使其在环境温度下干燥约24小时。
8.2结晶染料木黄酮N-乙基葡糖胺(葡乙胺)盐的表征
通过XRPD对上述制备的结晶染料木黄酮N-乙基葡糖胺(葡乙胺)盐 的样品进行分析，并产生了图34和35中所示的图谱。从丙酮和IPA两者 中都鉴定了不稳定的结晶盐。图34示出了来自丙酮的结晶染料木黄酮N- 乙基葡糖胺(葡乙胺)盐的XRPD图谱。将在实验的°2θ±0.2°2θ处的XRPD 图谱中的峰列出于表25中。图35示出了来自IPA的结晶染料木黄酮N- 乙基葡糖胺(葡乙胺)盐的XRPD图谱。将在实验的°2θ±0.2°2θ处的XRPD 图谱中的峰列出于表26中。在任一表中的峰的全部列表或其子集可以足 以表征结晶染料木黄酮N-乙基葡糖胺(葡乙胺)盐。可以单独或组合地用于 表征结晶染料木黄酮N-乙基葡糖胺(葡乙胺)盐的基于图34和35的峰的一 个子集包括7.4、12.7、14.7、16.0、18.1、19.0、19.2、21.7、22.1和26.3°2θ±0.2 °2θ。峰的优选子集包括7.4、12.7、14.7、16.0、18.1和26.3°2θ±0.2°2θ。 将来自丙酮的结晶染料木黄酮N-乙基葡糖胺盐的TGA曲线示出于图36 中。来自丙酮的结晶染料木黄酮N-乙基葡糖胺盐的PLM图像显示了材料 为晶体。
表25
表26
实施例9-结晶染料木黄酮二乙胺盐
9.1结晶染料木黄酮二乙胺盐的制备
制备了染料木黄酮在THF(520.2mg，在19.25mL的THF中)中和二乙 胺在THF∶ETOH(1∶1)中的储备溶液。以化学计量的量将染料木黄酮和二乙 胺的储备溶液添加到一起，并通过0.2μm的尼龙过滤器将溶液过滤到干 净的小瓶中，且使其在环境条件下蒸发。
9.2结晶染料木黄酮二乙胺盐的表征
使用下列设备对上述分离的固体材料进行XRPD分析：装备有具有 120°的2θ范围的CPS(弯曲位置敏感的)检测器的Inel XRG-3000衍射仪； 使用Cu Kα辐射的Shimadzu(岛津)XRD-6000X射线粉末衍射仪；以及装 备有布鲁克二维衍射检测系统(布鲁克总区域衍射检测系统，Bruker’s General Area Diffraction Detection System)(GADDS，v.4.1.19)的Bruker D-8 Discover衍射仪。在数据段中，在每个样品的图谱上列出具体采集参数。 图37示出了结晶染料木黄酮二乙胺盐的XRPD图谱。将在实验的°2θ±0.2 °2θ处的XRPD图谱中的峰列于表27中。峰的全部列表或其子集可以足 以表征结晶染料木黄酮二乙胺盐。可以单独或组合地用于表征结晶染料木 黄酮二乙胺盐的来自图37的峰的一个子集包括7.4、8.2、15.3、25.3和28.4 °2θ±0.1°2θ。
表27
实施例10-结晶染料木黄酮一水合物
10.1结晶染料木黄酮一水合物的制备
在THF中制备了染料木黄酮的储备溶液(472mg在17.47mL THF中)。 将染料木黄酮储备溶液(1mL)添加至玻璃瓶中，接着添加1mL D-葡萄糖醛 酸溶液(84.1mg在4.33mL水中)。在环境条件下使溶液蒸发。在1天之后， 通过将剩余的溶液倾析来分离固体，然后利用滤纸将其吸干。
10.2结晶染料木黄酮一水合物的表征
使用下列设备对结晶染料木黄酮一水合物样品进行XRPD分析：装 备有具有120°的2θ范围的CPS(弯曲位置敏感的)检测器的Inel XRG-3000 衍射仪；使用Cu Kα辐射的Shimadzu(岛津)XRD-6000X射线粉末衍射仪； 以及装备有布鲁克二维衍射检测系统(Bruker’s General Area Diffraction Detection System)(GADDS，v.4.1.19)的Bruker D-8Discover衍射仪。图38 示出了结晶染料木黄酮一水合物的XRPD图谱。将在实验的°2θ±0.2°2θ 处的XRPD图谱中的峰列出于表28中。峰的全部列表或其子集可以足以 表征结晶染料木黄酮一水合物。可以单独或组合地用于表征结晶染料木黄 酮一水合物的来自图38的峰的一个子集包括9.0、11.3、13.4、14.8、23.1、 25.0、26.8和28.5°2θ±0.1°2θ。
表28
使用TA Instruments 2950热重分析仪进行结晶染料木黄酮一水合物 的热重分析(TGA)。图39示出了结晶染料木黄酮一水合物样品的TGA曲 线。热重分析指示样品含有按重量计6％的挥发性成分，这与一水合物相 当。