接枝纳米炭抗癌前药及其制备方法和应用
技术领域
本发明将接枝纳米炭与抗癌药物通过特定的化学键结合，形成大分子抗癌前药，在 淋巴中酶的作用下，能缓慢释放出游离的抗癌药物，具有靶向治疗或抑制癌细胞淋巴转 移的特性。
背景技术
目前，还没有直接用于治疗恶性肿瘤局部淋巴转移的靶向化疗药物。专利号：ZL 92104309.0，发明名称：抗癌药物脂质体的制备方法，公开了一些抗癌药物脂质体的制 备方法。北美的阿霉素脂质体，具有一定的淋巴系统靶向性，但静脉给药后，主要聚积 在肝脏和脾脏，不能有效到达恶性肿瘤的局部引流淋巴结。脂质体虽然有一定的靶向性， 但其稳定性较差。
专利号：ZL 85100233，发明名称：主链含5-氟尿嘧啶聚酯(PFUE-II-N)的合成，该 技术的特点是：利用抗癌药物5-氟尿嘧啶和高分子偶联，显著提高了5-氟尿嘧啶在体内 的半衰期。专利号：ZL 02113731.5，发明名称：一种纳米炭混悬组合物及其制备方法， 公开了一种用于示踪恶性肿瘤的区域引流淋巴结的纳米炭混悬液的制备方法。该专利指 出，纳米炭混悬液注射到局部后，能在几分钟内将区域引流淋巴结染黑，从而外科医生 可以全面地清除肿瘤，提高了癌症患者的生存质量。将纳米炭经过氧化使得纳米炭上接 有羧基和羟基等官能团，称为接枝纳米炭，它不仅具有淋巴的靶向性，并且有大量的羧 酸基团分布在炭黑的表面上。但是目前这些仅仅作为示踪剂，还没有直接用于治疗恶性 肿瘤局部淋巴转移的靶向化疗药物的报道。
发明内容
本发明的技术方案是提供一种抗癌前药，是接枝纳米炭和抗癌药物偶联后，形成的 大分子前药。
本发明所述接枝纳米炭是根据200510054965.X号，发明名称为“接枝纳米炭的医药 用途”的发明专利申请提供的方法制备得到。
所述淋巴靶向抗癌前药，其结构式如下：
CB_S-D)n
其中，CB为带羧基的接枝纳米炭；D为具有氨基、亚氨基或羟基的抗癌药物；S为 酯键或酰胺键；n为≥1的整数，其中所述酯键或酰胺键能够被酶水解，缓慢释放出游离 的抗癌药物。
其中，所述抗癌药物为5-氟尿嘧啶、阿霉素、表阿霉素，柔红霉素、佐柔比星、 米托蒽醌或丝裂霉素。
本发明提供的抗癌前药的制备方法之一：
先将接枝纳米炭CB和SOCl2、PCl3、PCl5、POCl3或草酰氯等酰氯化试剂反应，生 成CB-COCl，然后再与具有氨基、亚氨基或羟基的药物偶联得到。
具体地说，包括以下步骤：
a、准备下列重量配比的原料：
具有氨基、亚氨基或羟基的药物：1-20份
接枝纳米炭CB：0.4-100份
酰氯化试剂：10-200份
溶剂：5-200份
b、接枝纳米炭CB酰氯化反应：
将0.4-100份接枝纳米炭和10-200份酰氯化试剂在10-80℃搅拌反应5-48小 时，浓缩除去过量的酰氯化试剂，得黑色固体；
c、偶联反应：
将1-20份药物溶解于5-200份溶剂，将所得溶液加入步骤b所得黑色固体中， 在10-80℃搅拌反应5-48小时。反应完成，减压浓缩，转入透析袋中透析24小时。 将透析袋内物转移至培养皿中，真空干燥得黑色固体。
本发明提供的抗癌前药的制备方法之二：
将接枝纳米炭黑和具有氨基、亚氨基或羟基的药物在羧基活化剂和催化剂的作用下 偶联得到。
具体地说，包括以下步骤：
a、准备下列重量配比的原料：
具有氨基、亚氨基或羟基的药物：1-20份
接枝纳米炭CB：0.4-100份
羧基活化剂：1-60份
溶剂：5-200份
催化剂：0.5-50份
b、偶联反应：
将药物溶解于溶剂中，加入接枝纳米炭和催化剂，降温到0℃，加入羧基活化剂， 搅拌1小时，然后室温反应5-48小时。过滤除去二环己基脲，滤液用乙醚提取，除去 DCC和DMAP(TLC：乙醚/甲醇/乙酸乙酯＝5∶3∶1)，然后加入丙酮，使沉淀凝聚。4200r/min 离心20min，将固体转入透析袋，用二次水透析24小时。然后在透析袋内物中加入丙酮， 4200r/min离心20min，沉淀真空干燥，得黑色固体。
所述羧基活化剂为N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-环己基-N′-二甲胺丙基 碳二亚胺(CDC)、N-羟基琥珀酰亚胺、N-乙氧甲酰-2-乙氧基二氢喹啉(EEDQ)、1 -羟基苯并三唑、羟基二咪唑等；催化剂为二甲氨基吡啶(DMAP)、吡啶、4-吡咯烷基 吡啶(PPY)或三乙胺等。
上述方法所用有机溶剂为四氢呋喃、吡啶、乙醚、二氧六环、乙腈、二甲基亚砜、 甲苯、N，N-二甲基甲酰胺或甲酰胺中的一种或多种。
本发明所述接枝纳米炭，是在纳米炭表面经过氧化，接有羧基和羟基等官能团，它 不仅改善了纳米炭在水中的分散性，且可以与碱性药物或带有羟基的药物发生酰化或酯 化反应，成为一个有效的药物载体，将药物运达淋巴结，在酶的催化下释放药物。试验 表明本发明制备的接枝纳米炭一抗癌药物偶联物，抗癌前药在血清中能缓慢释放出游离 的抗癌药物，而在生理盐水中不能释放。所述抗癌前药是新一带具有淋巴靶向性的化疗 药物。
附图说明
图1接枝纳米炭与氟尿嘧啶的反应产物CB-5-Fu的红外图谱
以下通过具体实施例的方式，对本发明做进一步详述，但不应理解为是对本发明的 限制。本领域普通技术人员根据上述技术方案，还可以做出多种形式的修改、替换、变 更。凡基于上述技术思想所作的修改、替换、变更均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1：阿霉素-接枝纳米炭偶联物的制备一
将1.5g(含羧基12mmol)接枝纳米炭置入100ml烧瓶中，加入25ml SOCl2，79℃加 热回流5小时，减压浓缩至干。然后将酰氯化的炭黑加入到含有5.8g(10mmol)盐酸阿 霉素的30ml吡啶溶液中，室温反应24小时，将反应物置入透析袋，二次水透析24小时 后，透析袋内物中加入丙酮，4200r/min离心20min，沉淀真空干燥，得黑色固体6.79g。
实施例2：阿霉素-接枝纳米炭偶联物的制备二
将5.8g(10mmol)盐酸阿霉素溶解于50ml甲酰胺和10ml吡啶混合液中，加入1.5g (含羧基12mmol)接枝纳米炭和0.5gDMAP，降温到0℃，加入2.5gDCC，搅拌1小时， 然后室温反应12小时。过滤除去二环己基脲，滤液用乙醚提取除去DCC和DMAP(TLC： 乙醚/甲醇/乙酸乙酯＝5∶3∶1)，然后加入丙酮，使沉淀凝聚，4200r/min离心20min。 固体转入透析袋，用二次水透析24小时后，透析袋内物中加入丙酮，4200r/min离心 20min，沉淀真空干燥，得黑色固体6.84g。
实施例3：阿霉素-接枝纳米炭偶联物的制备三
将5.8g(10mmol)盐酸阿霉素溶解于50ml二甲基甲酰胺和10ml吡啶混合液中，加 入1.5g(含羧基12mmol)接枝纳米炭和0.5gDMAP，降温到0℃，加入2.5gDCC，搅拌1 小时，然后室温反应12小时。过滤除去二环己基脲，然后加入丙酮，使沉淀凝聚， 4200r/min离心20min。沉淀用乙醚提取除去DCC和DMAP(TLC：乙醚/甲醇/乙酸乙酯＝5∶ 3∶1)。固体转入透析袋，用二次水透析24小时后，透析袋内物中加入丙酮，4200r/min 离心20min，沉淀真空干燥，得黑色固体6.69g。
实施例4：表阿霉素-接枝纳米炭偶联物的制备
将1.45g(2.5mmol)盐酸表阿霉素溶解于30ml甲酰胺和5ml吡啶混合液中，加入 0.4g(含羧基3.2mmol)接枝纳米炭和0.1gDMAP，降温到0℃，加入1.3gDCC，搅拌1 小时，然后室温反应12小时。过滤除去二环己基脲，滤液用乙醚提取除去DCC和DMAP (TLC：乙醚/甲醇/乙酸乙酯＝5∶3∶1)，然后加入丙酮，使沉淀凝聚，4200r/min离心 20min。固体转入透析袋，用二次水透析24小时后，透析袋内物中加入丙酮，4200r/min 离心20min，沉淀真空干燥，得黑色固体2.41g。
实施例5：5-氟尿嘧啶-接枝纳米炭偶联物的制备一
称取13.0g(100mmol)5-氟尿嘧啶于干燥的200ml圆底烧瓶中，加入50ml六甲基 二硅胺烷及10ml三甲基氯硅烷，120℃回流5小时，降温到室温，96℃减压蒸出未反应 的六甲基二硅胺烷，得白色固体。将所得白色固体溶解于100ml新蒸四氢呋喃，加入接 枝纳米炭10.0g(含羧基80mmol)，冰浴冷却到0℃，加入25.0g二环己基碳二亚胺(DCC)， 控制温度在℃搅拌1小时，然后加热到60℃反应24小时。反应完毕，用玻沙漏斗过滤 除去二环己基脲，滤液中加入丙酮，使其凝聚，4200r/min离心20min，沉淀用乙醚反复 提取，直到检测不到DCC(TLC：乙醚/甲醇/乙酸乙酯＝5∶3∶1)。沉淀转入处理过的透 析袋，加入适量的二次水，室温透析24小时，除去未反应的5-Fu。透析袋内物60℃干 燥，得浅黑色固体18.63g.
接枝纳米炭与氟尿嘧啶的反应CB-5-Fu的红外图谱见图1。与接枝纳米炭的红外比 较，羧基所在的1722.1cm-1位置的峰明显减小，并且出现了1626.4cm-1和1576.6cm-1的双峰(解为酰胺键上的NH振动)，说明羧基已经和氟尿嘧啶以酰胺键结合，生成了 目标产物5-Fu-CB。
实施例6：5-氟尿嘧啶-接枝纳米炭偶联物的制备二
称取10.0g接枝纳米炭(含羧基80mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入30mlSOCl2， 在79℃回流5小时，反应完成，降温到室温，减压浓缩至干，得黑色固体。将13.0g (100mmol)5-Fu溶解于50ml吡啶中，把该溶液加到所得黑色固体中，80℃搅拌8小 时。反应完成，降温，减压浓缩至干，用少量二次水将瓶内固体洗出，转移到处理过的 透析袋中，用二次水透析24小时。将透析袋内物转移至培养皿中，60℃干燥得黑色固体 17.92g
实施例7：5-氟尿嘧啶-接枝纳米炭偶联物的制备三
将13.0g(100mmol)5-Fu溶解于50mlTHF中，然后加入10g接枝纳米炭(含羧基 80mmol)，降温到0℃，加入25.0gDCC，保持0℃搅拌1小时，然后室温搅拌反应24小 时。过滤除去二环己基脲，加入丙酮，4200r/min离心20min，沉淀用大量乙醚洗涤，直 到检测不到DCC(TLC：乙醚/甲醇/乙酸乙酯＝5∶3∶1)。固体加入适量二次水，转入处 理过的透析袋，用二次水透析24小时，60℃干燥得黑色固体18.34g。
实施例8：5-氟尿嘧啶-接枝纳米炭偶联物的制备四
将13.0g(100mmol)5-Fu溶解于50ml二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入10g接 枝纳米炭(含羧基80mmol)和1.0g二甲氨基吡啶(DMAP)。降温到0℃，加入25.0gDCC， 保持0℃搅拌1小时，然后升温到室温，搅拌反应12小时，过滤除去二环己基脲。加入 丙酮，4200r/min离心20min，沉淀用大量乙醚洗涤，直到检测不到DCC和DMAP(TLC： 乙醚/甲醇/乙酸乙酯＝5∶3∶1)。固体加入适量二次水，转入透析袋，用二次水透析24 小时，60℃干燥得黑色固体19.13g
实施例9：柔红霉素-接枝纳米炭偶联物的制备
5.64g(10mmol)盐酸柔红霉素溶于50mlN，N-二甲基甲酰胺(DMF)和10ml吡啶混 合溶液中，依次加入1.5g(含羧基12mmol)接枝纳米炭和0.5gDMAP，降温到0℃，加入 2.5gDCC，搅拌1小时，然后室温反应12小时。然后加入丙酮，使其产生沉淀，4200r/min 离心20min。沉淀用乙醚提取，直到检测不到DCC和DMAP(TLC：乙醚/甲醇/乙酸乙酯＝5∶ 3∶1)。固体加入适量二次水，转入透析袋，用二次水透析24小时后，透析袋内物中加 入丙酮，4200r/min离心20min，沉淀真空干燥，得黑色固体6.75g。
实施例10：米托蒽醌-接枝纳米炭偶联物的制备
5.2g(10mmol)盐酸米托蒽醌溶于50ml二甲基亚砜(DMSO)和10ml三乙胺混合溶 液中，依次加入1.5g(含羧基12mmol)接枝纳米炭和0.5gDMAP，降温到0℃，加入2.5gDCC， 搅拌1小时，然后室温反应12小时。然后加入丙酮，使其产生沉淀，4200r/min离心20min。 用乙醚提取，直到检测不到DCC和DMAP(TLC：乙醚/甲醇/乙酸乙酯＝5∶3∶1)。固体加 入适量二次水，转入透析袋，用二次水透析24小时后，透析袋内物中加入丙酮，4200r/min 离心20min，沉淀真空干燥，得黑色固体6.32g。
实施例11：偶联物在鼠血清和生理盐水中的释放特性
精确称取阿霉素-接枝纳米炭偶联物(阿霉素-CB)、表阿霉素-接枝纳米炭(表阿霉 素-CB)偶联物、5-氟尿嘧啶-接枝纳米炭(5-氟尿嘧啶-CB)偶联物、柔红霉素-接枝 纳米炭(柔红霉素-CB)偶联物和米托蒽醌-接枝纳米炭(米托蒽醌-CB)偶联物5mg于具 塞试管中，每个样品称两个样。分别向试管加入5ml新鲜鼠血清和生理盐水，在37℃恒 温搅拌，每隔一段时间分别取出100μl上层液体，经处理后用HPLC测定，结果如下表。
表1偶联物在血清和生理盐水中水解对照
从表中可以看出，药物和接枝纳米炭偶联后，在生理盐水中几乎不能释放出药物， 而在血清中可以缓慢释放出药物。这是因为在血清中酶的作用下，形成的化学键发生断 裂。
实施例12：偶联物对肉瘤S180荷瘤小鼠药效学对比研究
1、对肉瘤S180生长的影响
1.1实验材料
1.1.1试验动物
BALB/C小鼠，雌雄各半，体重18～22g，由四川大学实验动物中心提供，合格证号： 10。
1.1.2瘤株
由四川大学药学院药理室赠送，悬浮于RPMI-1640培养液中，使瘤细胞浓度成为1 ×107/L后备用。
1.2方法
取健康BALB/C小鼠240只，分组及给药见表2。无菌条件下将S180肉瘤株接种于每 只小鼠腋下皮内，接种量0.1ml。接种后开始腹腔注射给药，药物组给予相应药物 0.2ml·10g-1，模型组给予同体积生理盐水，连续给药1周，第8天将小鼠处死，取出瘤 体剥离后称取瘤体净重。结果见表2。
表2对肉瘤S180生长的影响
组别 动物数 (只) 剂量 (mg/kg) 瘤体平均重量 (g) 抑瘤率 (％) 模型组 CB组 阿霉素组 阿霉素-CB组 表阿霉素组 表阿霉素-CB组 5-氟尿嘧啶组 5-氟尿嘧啶-CB组 柔红霉素组 柔红霉素-CB组 米托蒽醌组 米托蒽醌-CB组 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 - 20 10 相当于含阿霉素10 20 相当于含表阿霉素20 100 相当于含5-氟尿嘧啶100 10 相当于含柔红霉素10 5 相当于含米托蒽醌5 1.45±0.56 1.12±0.52* 1.05±0.34* 0.72±0.23**# 1.05±0.87* 0.82±0.23*# 1.32±0.45 1.01±0.69*# 1.08±0.95* 1.09±0.52* 1.00±0.45* 0.87±0.95** 22.76 27.59 50.34 27.59 43.45 8.96 30.34 25.52 24.83 31.03 40.00
注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与相对应未接枝的药物组比较#P＜0.05。
1.3结论
各给药组对肉瘤S180实体瘤生长具有明显抑制作用，与模型组比较P＜0.05，P＜ 0.01；阿霉素-CB、表阿霉素-CB和5-氟尿嘧啶-CB组与相对应的阿霉素、表阿霉素及5- 氟尿嘧啶组比较P＜0.05，其余各组比较虽无统计学差异，但其抑制作用均好于单独应 用药物组，由此可见接枝纳米炭与药物的偶联可以达到缓释作用，减少抗肿瘤药物在运 输中的损失，达到充分发挥药效的目的。
2、对肉瘤S180荷瘤小鼠生存期的影响
2.1实验材料
2.1.1试验动物
BALB/C小鼠，雌雄各半，体重18～22g，由四川大学实验动物中心提供，合格证号： 10。
2.1.2瘤株
由四川大学药学院药理室赠送，悬浮于RPMI-1640培养液中，使瘤细胞浓度成为1 ×107/L后备用。
2.2方法
取健康BALB/C小鼠240只，分组及给药见表3。无菌条件下将S180肉瘤株接种于每 只小鼠腹腔内，接种量0.2ml。接种后腹腔注射给药，连续给药1周，药物组给予相应 药物0.2ml·10g-1，模型组给予同体积生理盐水。从接种瘤液后开始观察，每天观察各 组动物死亡情况，计算60天内的平均生存期，并计算各组延命率。结果见表3。
表3对肉瘤S180荷瘤小鼠生存期的影响
组别 动物数 (只) 剂量 (mg/kg) 平均存活天数 (天) 延命率 (％) 模型组 CB组 阿霉素组 阿霉素-CB组 表阿霉素组 表阿霉素-CB组 5-氟尿嘧啶组 5-氟尿嘧啶-CB组 柔红霉素组 柔红霉素-CB组 米托蒽醌组 米托蒽醌-CB组 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 10 相当于含阿霉素10 20 相当于含表阿霉素20 100 相当于含5-氟尿嘧啶100 10 相当于含柔红霉素10 5 相当于含米托蒽醌5 17.56±3.24 22.35±2.45* 25.89±3.23* 27.15±2.48** 26.36±3.02* 28.05±3.65** 23.85±1.54* 26.45±3.21* 22.91±2.54* 24.34±3.13* 25.32±2.25* 28.01±2.64** 27.28 47.44 54.61 50.11 59.74 35.82 50.63 30.47 38.61 44.19 59.51
注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
2.3结论
各给药组对肉瘤S180荷瘤小鼠生存期具有明显延长作用，与模型组比较P＜0.05，P ＜0.01，药物组与药物-CB组比较无统计学差异，但药物-CB组荷瘤小鼠存活时间比药物 组延长，显示其疗效比单独应用药物好。即接枝纳米炭与药物偶联后达到缓释作用，可 以有效延长荷瘤小鼠存活时间。
综上，本发明提供的接枝纳米炭与药物偶联的抗癌前药能够靶向地进入淋巴，在淋 巴中酶的作用下，酯键或酰胺键发生水解，缓慢释放出游离的抗癌药物，从而能够有效 地治疗或抑制癌细胞的淋巴转移。