技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及香豆素类化合物九里香酮制备抗 肿瘤药物的新用途。
背景技术
九里香酮(murrayone)是一种香豆素类化合物，可以从芸香科植物 九里香(Murraya exotica L.)和千里香(Murraya paniculata(L.)Jack)中提 取获得，也可采用香豆素类化合物前体进行半合成的方法获得(中华人民 共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典I部.2005：9.)。九里香酮 的化学结构式如下：
九里香酮具有较好的抗菌、抗炎作用(1.邹联新，郑汉臣，杨紫仁.九 里香属植物研究进展.药学实践杂志.1997；15(4)：214-219.2.颜杰，裴建梅. HPLC法测定三九胃泰颗粒中九里香酮的含量.中草药.2005；36(3)：375-376. 3.睢大员，李淑惠.九里香化学及抗生育作用研究概况.中草药. 1994；25(8)：435-437，448.)，但至今未见有关其具有抗肿瘤活性的报道。
发明内容
本发明提供一种应用香豆素类化合物九里香酮制备抗肿瘤药物的新 用途。
本发明经体内、体外实验表明，九里香酮对肿瘤细胞的生长和对动物 皮下移植瘤的生长均具有抑制作用，并经动物急性毒性实验，表明九里香 酮的急性毒性较低，因此，可用于制备抗肿瘤药物。
本发明九里香酮价格低廉、安全性高，辅以药学上可接受的辅料，采 用常规制剂技术即可制成各种口服、注射、外用制剂，具有良好的开发利 用前景。
附图说明
图1为九里香酮对5种肿瘤细胞株细胞生长的抑制曲线图。
图2为九里香酮对5种肿瘤细胞株细胞生长的半数抑制浓度IC50值图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步阐述，但本发明的保护范围 并不限于此。
实施例1 九里香酮对肿瘤细胞生长的抑制作用实验(MTT法)
细胞株：
采用常规使用的5种肿瘤细胞株：人白血病细胞株K562，人肝癌细胞 株Hep3B和HepG2，人结肠癌细胞株SW480和人宫颈癌细胞株HeLa，由上 海东方肝胆外科医院肿瘤免疫与基因治疗研究中心提供(下同)。
九里香酮：
购买于成都普思生物科技有限公司，纯度大于98％(HPLC法，下同)。 分别用含体积分数为10％小牛血清的DMEM培养液或用含体积分数为10％ 小牛血清的RPMI1640培养液配制成不同浓度的九里香酮溶液，浓度分别为 5、10、20、40、80mg/mL。
3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)：
购买于Sigma-Aldrich公司，用PBS磷酸盐缓冲液配制成1mg/mL溶液。
实验方法(MTT法)：
取对数生长期的肿瘤细胞株，Hep3B和HepG2分别用含体积分数为 10％小牛血清的DMEM培养液培养，K562、SW480和HeLa细胞株分别用含 体积分数为10％小牛血清的RPMI1640培养液培养，制成单细胞悬液后，分 别将5种肿瘤细胞株接种于96孔板，每孔细胞悬液为200μL，细胞接种密度 为1×104个/孔，每种肿瘤细胞株各设3个组，即空白对照组、阴性对照组和 九里香酮实验组。细胞先在体积分数5％ CO2、37℃及饱和湿度下培养24 小时，小心吸弃上清液，然后将含有不同浓度九里香酮的培养液200μl加 入相应孔中，九里香酮浓度分别为5、10、20、40、80mg/mL，每个浓度 各设6个复孔；阴性对照组的相应孔中则加等体积的肿瘤细胞悬液，空白 对照组的相应孔中则为等体积细胞培养液，不含肿瘤细胞，空白对照组和 阴性对照组也各设6个复孔；将该96孔板在体积分数5％ CO2、37℃、饱和 湿度下培养44小时后，将96孔板置于离心机离心5分钟，去上清，小心用 PBS冲洗2遍后，各孔加入100μL浓度为1mg/mL的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2， 5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)，37℃继续培养4小时；再将96孔板置于离心 机离心5分钟，去上清，每孔加入二甲基亚砜150μL，震荡混匀，使沉淀充 分溶解，10分钟后于酶标仪上测定吸光度A值，测定波长为490nm，按下 列公式计算抑制率和半数抑制浓度(IC50)。抑制率(％)＝(对照组A值- 实验组A值)/对照组A值×100％；半数抑制浓度(IC50)采用对数机率单 位法，以直线回归方程计算肿瘤细胞生长抑制率为50％的药物浓度。结果 见图1、图2。由图1、图2可见，九里香酮对5种细胞株的增殖均有较强的 抑制作用，其中对人白血病K562细胞的抑制作用最强。
实施例2 九里香酮对动物皮下移植瘤生长的抑制作用实验
动物：
昆明种小鼠，雌雄各半，体重18g±2g，由上海医科大学动物中心提供。 动物以颗粒饲料喂养，自由摄食和饮水(下同)。
细胞株：
H22小鼠肝癌细胞株、HepS小鼠肝癌细胞株：由中科院上海细胞研究 所提供。
环磷酰胺粉针剂(CTX)：上海华联制药有限公司产品。
九里香酮：同上。
台盼蓝：
台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒：购买于上海碧云天生物技术有限 公司。
实验方法：
取8只雌性小鼠，随机分成2组，按常规分别腹腔接种H22小鼠肝癌细 胞株和HepS小鼠肝癌细胞株，第9天，各选1只健康较好的小鼠，颈椎脱臼 处死，腹部皮肤消毒后，抽取腹腔积液，1000rpm离心5分钟，PBS洗2次， 采用台盼蓝染色进行细胞计数，其活肝癌细胞大于95％，根据活细胞计数， 分别用生理盐水稀释成HepS细胞悬液和H22细胞悬液，细胞浓度均为1×107个/mL。
取50只小鼠，雌雄各半，每只小鼠于右腋皮下接种上述H22细胞悬液 0.2mL。另取50只小鼠，雌雄各半，每只小鼠于右腋皮下接种上述HepS细 胞悬液0.2mL。小鼠于接种后次日各随机分为5组，即阴性对照组、阳性对 照组、九里香酮低、中、高剂量组，每组各10只，尾静脉注射给药，给药 体积按小鼠体重每10g给药0.2mL。九里香酮低、中、高剂量组的九里香酮 给药剂量按体重依次为50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg，每日1次，连续 10天；阴性对照组小鼠尾静脉注射等容积生理盐水注射液，每日1次，连 续10天；阳性对照组注射环磷酰胺(CTX)溶液，CTX给药剂量为30mg/kg， 隔日1次，连用3次。第11天处死动物，解剖并完整分离肿瘤，称瘤重量， 计算肿瘤抑制率。
肿瘤抑制率(％)＝(阴性对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/阴性对 照组平均瘤重×100％。
结果见表1。
表1 九里香酮对小鼠HepS、H22移植性肝癌的作用(Mean±SD)
*P<0.05vs生理盐水组
由表1可见，九里香酮三个剂量组与阴性对照组相比，对HepS、H22皮 下移植瘤的生长均有显著的抑制作用，特别是高剂量组，其肿瘤抑制率接 近阳性对照组。
实施例3 九里香酮的急性毒性实验
按常规以药物最大溶解度，给小鼠最大的给药容量，按体重单次灌胃 给予九里香酮2.5g/kg，或单次腹腔注射给予九里香酮1.5g/kg，观察给药 后动物14天内的毒性反应及死亡情况。结果如下：
1)小鼠单次灌胃给药后4小时内未见异常，给药后14天内，小鼠未出 现死亡，第15天，处死全部小鼠，解剖，肉眼检查各脏器，均未见明显病 变。
2)小鼠腹腔注射给药后20分钟，3只小鼠出现精神萎靡、蜷缩、活动 减少，给药后1小时后，全部小鼠恢复正常，给药后14天内，小鼠未出现 死亡，第15天，处死全部小鼠，解剖，肉眼检查各脏器，均未见明显病变。
上述结果表明，九里香酮的急性毒性较低，因此安全性好。
实施例4 九里香酮片剂的制备
取九里香酮200g，羟丙基甲基纤维素50g，微晶纤维素100g、交联羧 甲基纤维素钠20g，混匀，加入适量60％乙醇制成软材，过24目筛制粒，50℃ 干燥2小时，干燥颗粒过30目筛整粒，加入硬脂酸镁2.5g，混匀，压成2000 片。