技术领域
本发明属于中药提取与应用的技术领域，具体涉及天胡荽有效部位的制备 方法及在制备抗肝纤维化药物中的应用。
背景技术
肝纤维化(hepatic fibrosis)是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时，肝脏 内纤维组织的异常增生，是诸多慢性肝病发展至肝硬化过程中所共有的病理组 织学变化，是影响慢性肝病预后的重要环节。造成肝细胞坏死和炎症的致病因 子有很多，在国外，尤其是欧美国家，以酒精中毒为多数，在我国主要由肝炎 病毒所致最常见。
病毒性肝炎肝纤维化，是人体受到肝炎病毒感染后，引起肝内慢性炎症刺 激而产生纤维组织增生。目前研究表明引起慢性肝炎导致肝纤维化的病毒主要 是乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)及丁型肝炎病毒(HDV)。在我国 主要是HBV导致的病毒性肝炎肝纤维化。国外学者对小儿慢性肝炎进行了1—10 年的随访研究表明，3.4～32％慢性肝炎可发展为肝纤维化，年龄越大发生越显 著。近年来，流行病学的研究表明，肝硬化患者中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 明显高于非肝硬化者或一般人群，北京报告肝硬化病人的HBsAg阳性率高达 85.7％，上海报告为85.5％，台湾报告为85.4％，广州报告为74.5％，广西报告为 71.8％，这说明HBV是导致肝硬化的驻要因素。我国是乙型肝炎的高流行区，HBV 在全国人群中的感染率为60％，HBsAg携带者约有1.5亿，慢性乙型肝炎患者有 3000万以上，这些病人如得不到有效的治疗，就会演变成肝纤维化，肝纤维化 的许多患者通过不同的途径，又进一步发展成肝硬化，在肝硬化的基础上，又 有一定比例的患者，尤其是病毒性肝炎为病因者可继续发展为肝癌，引起严重 的不良后果。可见病毒性肝炎肝纤维化是一类严重威胁我国人民群众生命健康、 给国民经济造成重大负担的疾病。
近年来，抗肝纤维化的治疗虽然有了一些进展，但目前仍无理想的药物， 秋水仙碱，青霉胺等十几种药物，虽有抑制肝纤维化的作用，但毒副作用较大， 限制了其临床上的使用。因此研究开发抗病毒性肝炎纤维化药物是一项极为紧 迫而重要的课题。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明通过对天胡荽的研究与提取，设计提 供一种天胡荽有效部位的制备方法及其在抗肝纤维的应用的技术方案。
所述的天胡荽有效部位的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
(1)天胡荽药材中加入1-10倍重量的乙醇提取1-3次，乙醇的浓度为 30-70％；
(2)将上述的提取液减压回收乙醇后上大孔树脂柱，水洗脱3个体积后用 浓度50-70％的乙醇洗脱；
(3)经步骤(2)的纯化液采用硅胶柱层析，收集洗脱液，减压回收溶剂， 再用甲醇多次重结晶，即得到天胡荽的有效部位。
所述的天胡荽有效部位的制备方法，其特征在于步骤(1)用3-8倍重量的 乙醇提取2-3次，乙醇的浓度为40-60％。
所述的天胡荽有效部位的制备方法，其特征在于步骤(2)采用NKA-9、D101、 AB-8、HPD100、HPD400型大孔树脂装柱。
所述的天胡荽有效部位的制备方法，其特征在于步骤(3)采用氯仿∶甲醇∶ 水不同比例的洗脱液进行洗脱。
所述的天胡荽有效部位在制备治疗或预防肝纤维化的药物中的应用。
所述的天胡荽有效部位的应用，其特征在于天胡荽有效部位可制备成药剂 学上使用的片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸、溶液剂和注射剂。
本发明以民间用于肝炎、肝硬化治疗的天胡荽为研究对象，在相关药效实 验跟踪指导下，筛选得到具有抗肝纤维化作用的有效部位，该方法设计合理、 工艺简单、成本低，而且天胡荽有效部位来源于天然药物，与同类治疗抗肝纤 维化的化学药品相比具有低毒高效性，并对有效部位进行了对HBV转染HepG2 细胞体外的抑制试验以及抗肝肝纤维化相关的药效学实验，表明其具有显著的 药理作用。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，实施例中HAS、HHAS为本发明 人对从天胡荽有效部位中分离得到的两个单体成分的命名，天胡荽药材采于杭 州地区，经专家鉴定为伞形科植物天胡荽Hydrozotyle sibthorpioides Lam. 的全草。
实施例1
(1)天胡荽药材用8倍重量的乙醇提取3次，乙醇的浓度为50％，每次1 小时；提取工艺的验证：取药材2kg，按最佳提取工艺进行提取，以HAS的提 取得率为考察指标，结果HAS的转移率为87.2％，有效部位的提取得率按HAS、 HHAS的总量计为1.2％；
(2)将上述的提取液减压回收乙醇后，上HPD400型大孔树脂柱，上样液 的浓度为0.20mg(生药)/ml，上样量折合生药与树脂比为1：4(kg/L)，水洗 脱3个体积后用浓度70％的乙醇洗脱；
(3)取纯化后的有效部位，采用硅胶柱层析，用CHCl3:MeOH:H20＝20:3:1 (上层)-CHCl3:MeOH:H2O＝10:3:1(上层)洗脱，收集CHCl3:MeOH:H2O＝10:3:1 洗脱液，减压回收溶剂，用甲醇多次重结晶，即得HAS，得率为0.51％(HAS： 生药)。
实施例2
(1)天胡荽药材用6倍重量的乙醇提取2次，乙醇的浓度为60％，每次1 小时；
(2)将上述的提取液减压回收乙醇后，上HPD400型大孔树脂柱，上样液 的浓度为0.25mg(生药)/ml，上样量折合生药与树脂比为1：4(kg/L)，水洗 脱3个体积后用浓度50％的乙醇洗脱；
(3)取纯化后的有效部位，采用硅胶柱层析，用CHCl3:MeOH:H2O＝20:3:1 (上层)-CHCl3:MeOH:H2O＝10:3:1(上层)洗脱，收集CHCl3:MeOH:H2O＝10:3:1 洗脱液，减压回收溶剂，用甲醇多次重结晶，即得HAS，得率为0.52％(HAS∶ 生药)。
实施例3
(1)天胡荽药材用10倍重量的乙醇提取1次，乙醇的浓度为70％；
(2)将上述的提取液减压回收乙醇后上NKA-9、D101、AB-8或HPD100大 孔树脂柱，上样液的浓度为0.25mg(生药)/ml，0.30mg(生药)/ml、0.15mg (生药)/ml上样量折合生药与树脂比为1：4(kg/L)，水洗脱3个体积后用浓 度60％的乙醇洗脱；
(3)取纯化后的有效部位，采用硅胶柱层析，用CHCl3:MeOH:H2O＝20:3:1 (上层)-CHCl3:MeOH:H2O＝10:3:1(上层)洗脱，收集CHCl3:MeOH:H2O＝10:3:1 洗脱液，减压回收溶剂，用甲醇多次重结晶，即得HAS，得率为0.49％(HAS∶ 生药)。
一有效部位对HBV转染HepG2细胞的体外抑制试验
(1)药物毒性试验(TC50)：MTT法测定结果表明50％死亡药物浓度(TC50) 为18mg/ml。
(2)药物对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用(IC50)：有效部位 各剂量组对2.2.15细胞分泌的HBsAg活性有显著的抑制作用，并显示一定的量 效关系。有效部位三个高剂量组对2.2.15细胞分泌的HBeAg活性有显著的抑制 作用，并显示一定的量效关系，两个低剂量组(1.1mg/ml和0.55mg/ml)无明 显抑制作用(P>0.05)。(表1，2)
(3)有效部位的治疗指数：依据有效部位对HBsAg、HBeAg的抑制作用情况， 选择HBsAg、HBeAg作为药物效果的筛选指标，通过MTT法测定药物的细胞毒性 浓度，并计算出相应治疗指数(TI)来评价药物临床应用前景，用TI的数值范 围评价HAS抗乙肝病毒的活性。药物效价评定：TI≥2：有效低毒；1<TI<2： 低效低毒；TI<1：有毒性作用，不适宜作为抗病毒药物(表3)。
表1 有效部位在2.2.15细胞培养中对HBsAg活性的抑制作用
注：与空白对照组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001
表2 有效部位在2.2.15细胞培养中对HBeAg活性的抑制作用
注：与空白对照组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001
表3 有效部位的治疗指数
二 有效部位对小鼠急性肝损伤的试验
1.1.1 药物制备
①有效部位粉末溶于水中，每5g加植物油和吐温各一滴助溶，分别配成浓 度为100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml及6.25mg/ml的溶液。②联苯 双酯滴丸，42丸(1.5mg/丸)研磨成细粉，加吐温和植物油各一滴，溶于10ml 水中，制成6.34mg/ml的溶液。冰箱保存备用。
1.1.2 急性肝损伤模型制备
健康ICR小鼠94只，随机分为正常对照组、模型对照组、联苯双酯组、有 效部位5个剂量组。其中，正常组10只，其余各组各12只。正常组、模型组 均灌胃(ig)蒸馏水10ml/kg，其余各组分别给予联苯双酯50mg/kg，有效部位 2g/kg、1g/kg、0.5g/kg、0.25g/kg及0.125g/kg。每天灌胃一次，连续5天。 末次给药1小时后，除正常对照组腹腔注射生理盐水10ml/kg外，其余各组均 腹腔注射TAA 40mg/kg，禁食17h后进行指标测定。
1.1.3 测定方法
1.1.3.1 血清样品处理
小鼠摘眼球取血约1.5ml，静置30分钟，待血液凝固后，3500转/分离心 10分钟，取上层血清，4℃冰箱低温保存。
1.1.3.2 ALT、AST活性检测
改良赖氏法测定，血清中的ALT能与丙氨酸和α-酮戊二酸反应生成丙酮酸 及谷氨酸，丙酮酸与2，4-二硝基苯肼生成的2，4-二硝基苯腙在碱性溶液中显 棕红色，在505nm处有最大吸收值。血清中的AST能与门冬氨酸和α-酮戊二酸 反应生成草酰乙酸和谷氨酸，草酰乙酸也可与2，4-二硝基苯肼生成棕红色的2， 4-二硝基苯腙，同上法测定。按试剂盒的说明操作，应用半自动生化仪测定。
1.1.3.3 病理标本的采集及HE染色
肝组织均取自肝左叶的相同部位，大小约5mm×5mm×5mm，10％福尔马林固 定，常规石蜡切片。经HE染色后，光镜下观察肝脏组织、细胞的病理变化。
1.2 统计方法
计量资料以x±s表示，组间差异采用EXCEL统计软件以t检验进行统计 学处理。
2、实验结果
2.1 一般生化测定
不同剂量有效部位组能显著降低TAA所致小鼠急性肝损伤中的ALT含量， 且具有一定的量效关系。但对AST未见有何影响(表4)。
表4 有效部位对TAA所致急性化学性肝损伤的影响
2.2 病理检查结果
光镜下可见：正常组动物肝小叶结构完整，细胞正常；模型组动物肝小叶 中央静脉周围肝细胞大面积变性、坏死，有大量炎细胞浸润和肝组织充血。有 效部位治疗组和阳性对照组动物肝小叶中央静脉附近仅有少量肝细胞坏死，有 少量炎细胞浸润和肝组织充血。
三有效部位对CCl4所致大鼠慢性肝损伤的试验
1.1.1 药物制备
有效部位制备：将有效部位粉末溶于水中，每5g加植物油和吐温各一滴 助溶，分别配成浓度为12.5mg/ml、62.5mg/ml及187.5mg/ml的溶液。
汉防己甲素制备：将100g汉防己甲素，加植物油以及吐温各一滴作为乳 化剂，溶于100ml水中，配置成为1.00ml/ml的溶液。4℃冰箱中保存备用。
1.1.2 慢性肝纤维化模型制备
SD大鼠50只，随机分为正常对照组、模型对照组、汉防己甲素组 (10mg/kg)、有效部位高剂量组(1.5g/kg)、有效部位中剂量组(0.5g/kg)、 有效部位低剂量组(0.1g/kg)。其中，模型组10只，其余各组各8只。采用 CCl4制备慢性大鼠肝纤维化模型，即用40％ CCl4的橄榄油溶液皮下注射，首剂 量5ml/kg体重，从第二次开始3ml/kg体重，每3天造模一次，共6周。三个 给药组和阳性组均从造模的第1天开始给药，均为灌胃给药。正常组、模型组 给予等量的蒸馏水。实验持续6周。各组动物最后一次灌胃后24小时断头取 血，取肝脏组织浸泡于10％福尔马林中固定。
1.1.3 观察指标及测定方法
1.1.3.1 对大鼠一般情况及体重的观察
每天观察大鼠的一般症状，饮食变化，行为(自主活动，精神状态)及毛 发变化。
1.1.3.2 血清ALT、AST、Alb、TP水平的测定
取血后静置30min，血液凝固后，于3500转/分离心10分钟，取上层血清， 按试剂盒操作，应用上海ANALYTECH-738PLUS半自动生化仪测定ALT、AST水 平。
总蛋白的测定采用双缩脲法，蛋白质多肽链中的肽键在碱性溶液中与铜离 子作用产生紫红色络合物，在540nm波长处有特定吸收峰。按试剂盒的说明操 作。
白蛋白测定采用BCG法，白蛋白具有与阴离子结合的特性，在PH4.2的环 境中溴甲酚绿(BCG)与白蛋白结合形成蓝绿色复合物，在628nm波长处有最 大吸收值。按试剂盒的说明操作。
1.1.3.3病理标本的采集
肝组织均取自肝左叶的相同部位，大小约5mm×5mm×5mm，10％福尔马林固 定，常规石蜡切片。
1.1.3.4HE染色，光镜下观察肝脏组织、细胞的病理变化，并做半定量分析。
1.1.3.5 VG染色光镜下观察肝脏组织纤维化程度，做半定量分析。
1.1.3.6 肝匀浆中羟脯氨酸含量测定肝组织加少量生理盐水磨成匀浆，用95％ 酒精脱脂半日，再用丙酮脱脂两天，取出后在110℃烤箱中烘干，研成细粉， 测定羟脯氨酸含量。具体方法是：取肝粉40mg放于磨口试管中，加6mol/L盐 酸3ml，加盖，于125℃烤箱中水解5小时(每30min补足盐酸一次)，冷却后 移入50ml容量瓶中，用6mol/L氢氧化钠调PH接近6，稀释并定容至50ml， 过滤。吸取滤液2ml放入试管中，加0.05mol/L氯氨T溶液1ml，摇匀，室温 放置20min，加3.15mol/L过氯酸1ml，放置5min，再加1ml的10％对二甲氨 基苯甲醛溶液，于60℃水浴中保温20min，显色，冷却后在550nm波长下比色。
试剂配制：①柠檬酸缓冲液：柠檬酸50g，冰醋酸12ml，醋酸钠(3H2O) 120g，氢氧化钠34g，蒸馏水溶解并稀释至1000ml，调PH至6.0，冰箱保存。 ②0.05mol/L氯氨T溶液：1.41g氯氨T溶于20ml水中，加30ml乙二醇甲醚， 再加50ml柠檬酸缓冲液，冰箱保存。③3.15mol/L过氯酸：70％过氯酸27ml， 蒸馏水稀释至100ml。④10％对二甲氨基苯甲醛溶液：对二甲氨基苯甲醛10g 溶于100ml乙二醇甲醚中，如不溶，在60℃水浴中加热，冰箱保存。⑤标准试 剂：称取100mg羟脯氨酸溶于0.01mol/L盐酸中，移入100ml容量瓶，稀释至 刻度，作为贮存标准液。取贮存液2ml，稀释至100ml作为应用液，其浓度为 20μg/ml。
计算：根据半自动生化仪读出吸光度值×20μg/ml÷2H(标准试剂的吸光 度值)×50(稀释倍数)÷40(称取肝粉的mg数)＝1mg干肝粉中所含Hyp 的μg数(也即mg/g干肝)。
1.2 疗效判定标准
1.2.1 细胞变性坏死程度评分标准
肝组织大体及镜下病理学改变按文献肉眼观察小鼠肝脏的外形、体积、颜 色及质地的改变。HE染色后显微镜下观察肝组织切片的病理变化，重点观察肝 细胞变性、坏死，将肝细胞变性坏死程度化分成4级，即0级：正常肝组织， 无变性坏死，评分0分；I级：肝细胞变性范围不超过肝小叶半径的1/2，以 水变性为主，肝细胞呈点状或小灶状坏死，汇管区炎症细胞浸润，评分1分； II级：肝细胞变性范围超过肝小叶半径1/2，以气球样变性为主，较多肝细胞 呈碎片状坏死，汇管区大量炎症细胞的浸润，评分2分；III级：肝细胞大片变 性坏死，范围超过肝小叶半径的2/3，并以肝细胞的碎片状和桥接状坏死为主， 肝实质内大量纤维组织增生，向内伸展包绕肝小叶，且可见中央静脉偏位，评 分3分。
1.2.2 胶原纤维增生程度半定量标准
VG染色后，按如下半定量标准判断胶原纤维增生程度。0级：正常肝组织， 无胶原纤维增生，评分0分；I级：胶原纤维明显增多，从汇管区或中央静脉 呈星状向外延伸，无纤维隔形成，评分1分；II级：胶原纤维明显增多形成彼 此不连接的不完全性纤维隔，评分2分；III级：胶原纤维增多形成完全的相互 连接的纤维隔，分割肝实质，评分3分。
1.3 统计方法
计量资料以x±s表示，组间差异采用EXCEL统计软件以t检验进行统计 学处理。
2 实验结果
2.1 大鼠一般情况
正常组大鼠毛色光泽，较温顺；模型组大鼠表现烦躁，易激怒。进食量及 饮水量各组大鼠无明显区别。实验过程中，各组大鼠无死亡记录，模型组大鼠 毛发蓬松，且有部分皮肤溃烂；汉防己甲素组和有效部位组大鼠在外观上与正 常组大鼠比较无明显差异(表5)。
表5 有效部位对各组大鼠体重变化及肝脏系数的影响
注：与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01
2.2 一般生化测定
除空白组外，与模型组比较，各组大鼠的ALT、AST、TP、Alb指标变化无 明显差异(表6)。
表6 有效部位对肝纤维化大鼠肝功能的影响
注：由于ALT值超出正常测量范围，所得数值为血清稀释10倍所测得
2.3 对肝脏羟脯氨酸含量的影响
低、中、高三种剂量的有效部位均能显著降低大鼠肝脏Hyp含量(表7)。
表7 有效部位对肝纤维化大鼠肝组织中羟脯氨酸含量的影响
注：与模型组比较：**P<0.01
2.4 对大鼠肝脏病理学的影响
2.4.1 肉眼观察
正常对照组肝脏呈红褐色，表面光滑，质软；慢性肝损伤组肝脏明显肿胀， 粗糙，色苍黄，部分肝表面呈结节状，质硬，油腻；汉防己甲素组和各有效部 位给药组部分肝脏轻度肿大，黄褐色，表面尚光滑。
2.4.2 HE染色观察有效部位的疗效
光镜下正常组肝脏结构正常，肝细胞索围绕中央静脉呈放射状排列，未见 明显病变。模型的肝细胞明显肿胀变性，部分气球样变性，其中多为脂肪变性、 小灶性坏死，部分肝细胞呈结节样再生，门脉区及坏死区纤维组织大量增生， 包绕肝细胞形成大小不等的假小叶；高倍镜下假小叶内中央静脉偏位或缺失， 肝细胞呈脂肪变性，肝纤维组织明显增生，与正常组比有显著性差异(P<0.01)。 汉防己甲素组和有效部位高剂量给药组肝组织结构较完整，肝细胞变性、坏死 较损伤组轻(P<0.05)，中、低剂量组治疗效果没有显著差异(表8)。
表8 有效部位对各组大鼠肝细胞变性坏死程度的影响
注：与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01
2.4.3 VG染色观察肝脏组织纤维化程度
普通光镜下正常肝组织胶原纤维及肝窦网状纤维均成鲜红色。正常对照组 肝脏形态学正常，仅见血管壁有少量纤细胶原，肝组织内无纤维组织增生。模 型对照组可见肝小叶结构紊乱，汇管区扩大，纤维组织明显增生，较粗纤维间 隔形成，并向外延伸分割肝小叶。有效部位组及汉防己甲素组肝小叶结构较紊 乱，与模型组比较，中央静脉周围及汇管区纤维组织轻度增生或有纤细的纤维 间隔形成，纤维条索变少、变细。各组大鼠纤维化程度见表9。
表9 有效部位对各组大鼠纤维增生程度的影响
注：与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01
四 有效部位及HAS对猪血清所致大鼠慢性肝损伤的试验
1.1.1 药物制备：
有效部位制备：将有效部位粉末溶于水中，每5g加植物油以及吐温各一滴 助溶，分别配置成为50mg/ml，150mg/ml的溶液。
HAS制备：将HAS粉末溶于水中，每5g加植物油以及吐温各一滴助溶，分 别配置成为50mg/ml，150mg/ml的溶液。
阳性药制备：将100万单位的γ干扰素粉末溶于5ml的生理盐水，制备成 20万单位/ml的γ干扰素注射液。
以上药物均放置在4℃冰箱中保存备用。
1.1.2 肝纤维化模型制备以及分组：
Wistar大鼠70只，随机分成正常对照组，模型对照组，阳性药(γ干扰 素)对照组(0.5ml/kg)，HAS中剂量组(0.5g/kg)，HAS高剂量组(1.5g/kg)， 有效部位中剂量组(0.5g/kg)，v高剂量组(1.5g/kg)。其中模型组12只，空 白组8只，其余各组均为10只。采用猪血清致免疫型纤维化模型，即采用0.5ml 的精制猪血清进行腹腔注射，每周两次，共八周。空白组大鼠腹腔注射0.5ml 生理盐水作为对照。
HAS(中，高)组，有效部位(中，高)组和阳性药组于造模首日起开始给 药，阳性药组采用肌肉注射的方法给药，其余4四组采用灌胃给药。空白组， 模型组予以等量蒸馏水作为对照。
实验共持续八周，用药期间每三天称重一次。于最后一次给药后，各组动 物禁食24小时，眼眶取血后处死，取肝脏组织浸泡于10％福尔马林中固定。
1.1.3 观察指标及其测定方法
1.1.3.1 血清指标：取血后静置30min后，于4000r/min离心10分钟，取上层 血清，按试剂盒操作，测定ALT，AST，ALB，TP。
1.1.3.2 HYP测定：肝组织加少量生理盐水磨成匀浆，用95％酒精脱脂一天， 再用丙酮脱脂两天，取出后在110℃烘箱中烘干，碾成肝粉，用于测定HYP的 含量。取肝粉40mg放于磨口试管中，加6mol/l盐酸3ml，加盖后，放于125 ℃烘箱中水解5h，每30min补足盐酸，冷却后，利用6mol/l氢氧化钠调节PH 接近6，稀释并定容致50ml，过滤。吸取滤液2ml放入试管中，假如0.05mol/l 氯胺T溶液1ml，摇匀，室温放置20min，加3.15mol/l高氯酸1ml，放置5min， 再加入1ml的10％对二甲氨基苯甲醛溶液，于60℃水浴中保温20min，显色， 冷却后在550nm波长下比色。
试剂配置：①柠檬酸缓冲液：柠檬酸50g，冰醋酸12ml，醋酸钠120g，氢 氧化钠34g，蒸馏水溶解并稀释至1000ml，调节PH至6.0，4℃保存备用。② 0.05ml/l氯胺T溶液：1.41g氯胺T溶于20ml水中，加30ml乙二醇甲醚。再 加50ml柠檬酸缓冲液，4℃保存备用。③3.15mol/l高氯酸：70％高氯酸27ml， 蒸馏水稀释至100ml。④10％对二甲氨基苯甲醛溶液：对二甲氨基苯甲醛溶液10g 溶于100ml乙二醇甲醚中，如不溶，在60℃水浴中加热，冰箱保存。⑤HYP标 准试剂，称取100mgHYP溶于0.01mol/l盐酸中，定容至100ml，作为贮存保准 液。取其中2ml，稀释至100ml作为应用液，其浓度为20μg/ml。
1.1.3.3 取材以及病理半定量分析：肝组织均取自肝左叶的相同部位，大小约 为5mm×5mm×5mm，10％福尔马林固定，常规石蜡切片。在光镜下对H-E染色切 片和MASSON染色切片进行观察，并进行半定量分析。
1.1.4 疗效判定标准
1.1.4.1 采用组织学疗效评估采用半定量计分系统(SSS)对肝脏纤维化程度进 行量化处理，进而评估药物对于肝纤维化的治疗效果。其具体标准见表10。
表10 纤维化半定量计分系统
计分::L+P+2×(N×W)
1.1.4.2 肝表面纤维束径宽的定量分析，各组MASSON染色切片在×10镜下， 各取3个视野，并用MoticImages Advanced 3.0测试系统软件对其进行周长 和面积的测定，用周长与面积的比值作为其径宽的量度，进而来判断药效。
1.2 统计方法
各计量资料以x±S表示，组间差异采用EXCEL统计软件以t检验进行统计 学处理。
2.实验结果
2.1 对于大鼠体征的影响
造模前，各组大鼠健康状态良好，进食、饮水均正常，粪便成形，毛色有 光泽。造模后，模型组大鼠毛色较其他各组大鼠黯淡，且粪便大多粘湿，较稀。 除了正常组外，其余各组间的体重以及肝脏系数无明显差异。各组大鼠体重， 肝重以及肝脏系数见表11。
表11 HAS及有效部位对各组大鼠的体重，肝重以及肝脏系数的影响
注：与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01
2.2 对于血清中ALT以及AST活性的影响
模型组大鼠血清中的ALT以及AST活性明显高于正常大鼠(P<0.01)，说明 猪血清作为异种蛋白，对大鼠的肝组织造成实质性肝损伤。而HAS组，有效部 位组以及γ干扰素组的ALT以及AST的活性明显低于模型组(P<0.01—0.05)。 结果见表12。
表12 HAS对血清中ALT以及AST的影响
注：与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01
2.3 对于血清中TP，ALB，Glb影响
通过TP和ALB的含量来计算GLB的含量(GLB＝TP-ALB)，并计算血清中 ALB/GLB的含量比。各组大鼠血清中的ALB/GLB差异不显著，猪血清并不能影 响血清中TP，ALB，GLB的含量。结果见表13。
表13 HAS及有效部位对血清中ALB，TP，GLB以及ALB/GLB的影响
2.4 对肝脏HYP的影响
模型组肝脏中的HYP含量明显高于正常组大鼠(P<0.01)，证实了猪血清诱 导的肝纤维化模型已经复制成功。不同剂量HAS以及有效部位均能显著降低HYP 的含量(P<0.01)，并显示出一定的量效关系。结果见表14
表14 HAS及有效部位对肝脏HYP的影响
注：与模型组比较：**P<0.01
2.5 肝纤维化半定量计分
在光镜对于各组大鼠肝脏的MASSON染色切片进行观察比较，参照SSS系统 对其进行纤维化半定量计分。结果见表15
表15 肝纤维化半定量计分
注：与模型组比较：**P<0.01
2.6 肝表面纤维束的定量计算
利用MoticImages Advanced 3.0测试系统软件测量MASSON染色切片下的 纤维束的面积和周长，通过其面积与周长的比值来考查HAS对肝表面纤维的治 疗效果。结果表明，γ干扰素，高剂量HAS以及两个剂量的有效部位均能减少 猪血清所致的肝脏纤维化程度(P<0.05-0.01)，结果见表16。
表16 HAS及有效部位对于肝纤维束的影响
注：与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01