技术领域
本发明属于医药领域，具体而言是涉及从中药补骨脂中经过提取、精制，获得总补骨脂苷提取物的方法，以及该提取物的药物用途。
背景技术
目前，在全球范围内，中草药都有一定的市场，随着人们对健康要求认识水平的增高以及人口的老龄化，亚健康状态化，人们更加渴望回归自然，利用纯天然程度高的药物治疗、预防一些化学合成药物所不能解决得问题，因此天然植物药的应用超出它原来民族传统文化的背景。从天然药物中寻求副作用小、且物美价廉的药物成为世界各国医药企业所追逐的目标。欧共体对草药进行了统一立法，加拿大和澳大利亚等国草药地位已经合法化，美国政府也已起草了植物药管理办法，开始接受天然药物的复方混合制剂作为治疗药，这些为中药作为治疗药进入国际医药市场提供了良好的国际环境。另一方面，随着全球经济一体化进程的加快，特别是我国正式加入WTO，中国医药市场融入国际医药大市场的广度和深度将进一步加剧。面临强大跨国医药集团的激烈竞争以及日本、韩国、印度、泰国等亚洲国家传统医药产品和德国、法国等欧洲国家植物药的巨大冲击，我国传统中药产生的众多产品由于尚不能符合国际医药市场的标准和要求而被拒之门外。
中药补骨脂为豆科植物补骨脂(Psoralea corylifolia L)果实，性温，味辛，具补肾助阳之功效。主治肾虚冷泻，小便频数，阳萎，腰膝冷痛，虚寒喘咳，外用治白癜风。现代研究表明，补骨脂具有扩张血管，增加心肌收缩力，抗菌，雌性激素样作用，治疗白癜风等生理活性。补骨脂含有多种活性成分，以补骨脂苷和异补骨脂苷为代表的苷类是其重要的活性成分之一，但目前文献及专利尚无获得补骨脂苷类的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种低成本、易操作、稳定性好、易于产业化的补骨脂总苷提取物的制备方法，并对其中代表性成分进行含量测定。
本发明制备方法通过以下技术方案实现：
(1)补骨脂用水做溶剂提取；
(2)提取液浓缩后醇沉；
(3)醇沉上清液用小极性有机试剂萃取；
(4)萃取后水层用大孔树脂纯化，得总补骨脂苷提取物，其中总补骨脂苷含量为80％以上；
其中：步骤(1)中，溶剂用量8-15倍量，加热提取1-3次，每次0.5-2小时。最佳溶剂用量为10倍量，加热提取2次，每次2小时。
步骤(2)中，乙醇浓度为70-95％，最佳乙醇浓度为80％。
步骤(3)中，小极性有机试剂选用石油醚，氯仿或乙酸乙酯。
步骤(4)中，萃取后水层通过大孔吸附树脂层析柱，先用水冲洗，再用乙醇水溶液冲洗，收集洗脱液，洗脱液减压浓缩至无醇，冷冻干燥，即得总补骨脂苷。其中乙醇水溶液醇浓度为30-100％。通过HPLC进行含量测定，补骨脂总苷中补骨脂苷(Psoralenoside)含量为40-50％，异补骨脂苷(Isopsoralenoside)含量为40-50％。
本发明的另一个目的是提供所述的补骨脂总苷提取物在制备升高白细胞的药物中的应用。
本发明方法制备述的补骨脂总苷提取物，与制剂允许的敷料或赋形剂制备成任何一种药剂学上所说的剂型，也可配合其他药物或组分一起制成药物制剂。
药物剂型可以是片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、凝胶剂、软膏剂、油膏剂、霜剂、栓剂、注射剂、粉针剂、贴剂、滴丸、混悬剂等。
本发明所述方法采用简单的流程从中药补骨脂中获得补骨脂总苷，并对其中补骨脂苷和异补骨脂苷进行含量测定，方法简便、经济，利于工业化大规模生产。经药理实验证明，该补骨脂总苷提取物以及其含有的补骨脂苷和异补骨脂苷均能对抗环磷酰胺所致的白细胞降低，具有显著的免疫增强作用，可在制备升高白细胞的药物中应用。
附图说明
图1补骨脂总苷色谱图。
具体实施方式
本发明结合实施例作进一步的说明。本发明实施例仅用于说明而并非对本发明的限制。
实施例一补骨脂苷和异补骨脂苷的HPLC分析及含量测定方法
色谱条件色谱柱Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；采用梯度洗脱，流动相A相为0.1％冰醋酸水溶液，流动相B相为含0.1％冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脱程序如下：0分钟时，流动相为95％的A、5％的B；20分钟时，流动相为70％的A、30％的B；25分钟时，流动相为50％的A、50％的B；30分钟时，流动相为5％的A、95％的B。溶液流速1.0mL·min-1；检测波长246nm；柱温30℃，即可测定补骨脂苷和异补骨脂苷的含量。参见图1，图中1为异补骨脂苷，2为补骨脂苷。
实施例二
取补骨脂1kg，50℃干燥6小时，加8倍量水微沸状态加热回流提取2小时，提取液过滤，减压浓缩，醇沉，调节醇浓度至80％，取上清液，浓缩至无醇后加乙酸乙酯萃取，分离水层，上大孔树脂，用水冲洗，弃去，继续用30％乙醇水溶液洗脱。收集洗脱液，减压浓缩至无醇，冷冻干燥，即得补骨脂总苷。按实施例一方法测定，总补骨脂苷中补骨脂苷含量为38％，异补骨脂苷含量为42％。
实施例三
取补骨脂1kg，50℃干燥6小时，加8倍量水微沸状态加热回流提取2小时，提取液过滤，减压浓缩，醇沉，调节醇浓度至70％，取上清液，浓缩至无醇后加乙酸乙酯萃取，分离水层，上大孔树脂，用水冲洗，弃去，继续用50％乙醇水溶液洗脱。收集洗脱液，减压浓缩至无醇，冷冻干燥，即得补骨脂总苷。按实施例一方法测定，总补骨脂苷中补骨脂苷含量为40％，异补骨脂苷含量为42％。
实施例四
取补骨脂1kg，50℃干燥6小时，加12倍量水微沸状态加热回流提取2小时，提取液过滤，减压浓缩，醇沉，调节醇浓度至70％，取上清液，浓缩至无醇后加乙酸乙酯萃取，分离水层，上大孔树脂，用水冲洗，弃去，继续用70％乙醇水溶液洗脱。收集洗脱液，减压浓缩至无醇，冷冻干燥，即得补骨脂总苷。按实施例一方法测定，总补骨脂苷中补骨脂苷含量为41％，异补骨脂苷含量为43％。
实施例五
取补骨脂1kg，50℃干燥6小时，加10倍量水微沸状态加热回流提取2次，每次1小时，提取液过滤，减压浓缩，醇沉，调节醇浓度至80％，取上清液，浓缩至无醇后加氯仿萃取2遍，分离水层，上大孔树脂，用水冲洗，弃去，继续用80％乙醇水溶液洗脱。收集洗脱液，减压浓缩至无醇，冷冻干燥，即得补骨脂总苷。按实施例一方法测定，总补骨脂苷中补骨脂苷含量为43％，异补骨脂苷含量为41％。
实施例六
取补骨脂1kg，50℃干燥6小时，加10倍量水微沸状态加热回流提取2次，每次2小时，提取液过滤，减压浓缩，醇沉，调节醇浓度至70％，取上清液，浓缩至无醇后加乙酸乙酯萃取3遍，分离水层，上大孔树脂，用水冲洗至无糖(molish反应)，弃去，继续用70％乙醇水溶液洗脱。收集洗脱液，减压浓缩至无醇，冷冻干燥，即得补骨脂总苷。按实施例一方法测定，总补骨脂苷中补骨脂苷含量为46％，异补骨脂苷含量为45％。
实施例七滴丸的制备
取补骨脂总苷0.5g与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6～8℃液体石蜡中，除油，制得滴丸300粒。
实施例八冻干粉针剂的制备
取降香油1.5g，加入到13ml饱和的羟丙基β-环糊精中，搅拌溶解，滤过，滤液低温干燥得降香油和羟丙基β-环糊精的包合物粉末。除上述降香油合羟丙基β-环糊精的包合物粉末外，再取补骨脂总苷0.5g、甘露醇5.5g、依地酸钙钠0.9g和蒸馏水2ml，上述组分混匀后，冷冻干燥，分装350支，即得。
实施例九片剂的制备
取补骨脂总苷100克与微晶纤维素混合均匀，加3％聚维酮乙醇溶液制软材，过18目筛制颗粒，60℃干燥1小时，整粒，加入滑石粉适量，混匀，压片，即得。
实施例十胶囊的制备
取补骨脂总苷与花生油按2∶18的比例水溶式不锈钢搅拌灌中，同时加入适量明胶和甘油混合，放出再用胶体磨磨浆，磨出的混合液搅拌，制成药液；将甘油与蒸馏水在40-50℃温度下搅拌混溶，再将甘油液温至80-90℃，取明胶加入其中混合搅拌，直至全部溶化成胶液，然后在60℃温度下使胶液静置4小时，用制板机制成胶板供制丸工序使用；将上述制成的药液和胶板送入压丸机制丸，然后在22-25℃温度下吹风4小时作滚筒定型，又在25-30℃温度下吹风干燥16-20小时，检选合格胶丸，用95％乙醇清洗，在25-30℃下吹风干燥4小时，即得。
实施例十一注射液的制备
取补骨脂总苷100克用40℃注射用水溶解，加入适量药用载体等渗剂，调节溶液的pH值为7.0-8.0，加注射用水至全量，用超滤器超滤除热源，测定pH值后，用膜过滤，分装后，高压灭菌，检验、包装，即得。
实施例十二补骨脂总苷对环磷酰胺所致正常小鼠白细胞计数降低的影响
1.实验目的：考察补骨脂总苷对环磷酰胺所致白细胞降低的影响。
2.实验材料
2.1药品与试剂：阿胶，山东东阿阿胶股份有限公司，批号：0311101；注射用环磷酰胺(CTX)，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：7063021；白细胞稀释液：冰醋酸2ml，1％龙胆紫1ml，蒸馏水加至100ml。
2.2实验器材：细胞计数板，显微镜，1000μl、100μl微量移液器。
2.3实验动物：ICR小鼠，雌雄对半，体重18-22g，由浙江省医学科学院动物中心提供。
3.方法与步骤
3.1取健康18-22g ICR小鼠，在本实验室条件下饲养2天后，随机分组：
正常对照组：等容积生理盐水
模型组：等容积生理盐水
阿胶组：1.5g·Kg-1；
实验组：低、高剂量组(生药量2g·Kg-1、4g·Kg-1)；
每组10只。各组小鼠连续给药8天。
3.2给药第3天，每只小鼠腹腔注射环磷酰胺100mg/kg(0.2ml/10g)。
3.3第8天(注射环磷酰胺后第五天)给药2h后，眼眶静脉取血，吸取20μl血液，立即转入380μl白细胞稀释液，轻轻摇动1～2分钟，充分混匀后计数。
4.实验结果
实验结果显示，注射环磷酰胺后第五天，模型组白细胞计数为(3.33±0.98)×106/ml，较正常组(7.24±1.62)×106/ml明显降低，差异有显著意义(P＜0.01)。低剂量组与高剂量组白细胞计数为(4.05±0.80)×106/ml、(4.29±1.37)×106/ml，较模型组明显升高，差异有显著意义(P＜0.05，P＜0.05)。阳性对照组(阿胶组)白细胞计数为(4.05±0.83)×106/ml，较模型组明显升高，差异有显著意义(P＜0.05)。
表1补骨脂总苷对环磷酰胺所致正常小鼠白细胞计数降低的影响(x±s，n＝10)
注：与正常组比较*P＜0.05，**P＜0.01；
与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01。
5.结论
补骨脂总苷低、高剂量均能对抗环磷酰胺所致的白细胞降低。
实施例十三补骨脂苷对环磷酰胺所致正常小鼠白细胞计数降低的影响
1.实验目的：考察补骨脂苷对环磷酰胺所致白细胞降低的影响。
2.实验材料
2.1药品与试剂
阿胶，山东东阿阿胶股份有限公司，批号：0311101；
注射用环磷酰胺(CTX)，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：07063021；
白细胞稀释液：冰醋酸2ml，1％龙胆紫1ml，蒸馏水加至100ml。
2.2实验器材：细胞计数板，显微镜，1000μl、100μl微量移液器。
2.3实验动物
ICR小鼠，雌雄对半，体重18-22g，由浙江省医学科学院动物中心提供。
3.方法与步骤
3.1取健康18-22g ICR小鼠，在本实验室条件下饲养2天后，随机分组：
正常对照组：等容积生理盐水
模型组：等容积生理盐水
阿胶组：1.5g·Kg-1；
实验组：低、高剂量组(0.1g·Kg-1、0.3g·Kg-1)；
每组10只。各组小鼠连续给药8天。
3.2给药第3天，每只小鼠腹腔注射环磷酰胺100mg/kg(0.2ml/10g)。
3.3第8天(注射环磷酰胺后第五天)给药2h后，眼眶静脉取血，吸取20μl血液，立即转入380μl白细胞稀释液，轻轻摇动1～2分钟，充分混匀后计数。
4.实验结果
实验结果显示，注射环磷酰胺后第五天，模型组白细胞计数为(3.33±0.98)×106/ml，较正常组(7.24±1.62)×106/ml明显降低，差异有显著意义(P＜0.01)。低剂量组与高剂量组白细胞计数为(3.82±0.66)×106/ml、(3.99±1.12)×106/ml，较模型组明显升高，差异有显著意义(P＜0.05，P＜0.05)。阳性对照组(阿胶组)白细胞计数为(4.05±0.83)×106/ml，较模型组明显升高，差异有显著意义(P＜0.05)。
表2补骨脂苷对环磷酰胺所致正常小鼠白细胞计数降低的影响(x±s，n＝10)
注：与正常组比较*P＜0.05，**P＜0.01；
与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01。
5.结论
补骨脂苷低、高剂量均能对抗环磷酰胺所致的白细胞降低。
实施例十四异补骨脂苷对环磷酰胺所致正常小鼠白细胞计数降低的影响
1.实验目的：考察异补骨脂苷对环磷酰胺所致白细胞降低的影响。
2.实验材料
2.1药品与试剂：阿胶，山东东阿阿胶股份有限公司，批号：0311101；注射用环磷酰胺(CTX)，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：07063021；白细胞稀释液：冰醋酸2ml，1％龙胆紫1ml，蒸馏水加至100ml。
2.2实验器材：细胞计数板，显微镜，1000μl、100μl微量移液器。
2.3实验动物
ICR小鼠，雌雄对半，体重18-22g，由浙江省医学科学院动物中心提供。
3.方法与步骤
3.1取健康18-22g ICR小鼠，在本实验室条件下饲养2天后，随机分组：
正常对照组：等容积生理盐水
模型组：等容积生理盐水
阿胶组：1.5g·Kg-1；
实验组：低、高剂量组(0.1g·Kg-1、0.3g·Kg-1)；
每组10只。各组小鼠连续给药8天。
3.2给药第3天，每只小鼠腹腔注射环磷酰胺100mg/kg(0.2ml/10g)。
3.3第8天(注射环磷酰胺后第五天)给药2h后，眼眶静脉取血，吸取20μl血液，立即转入380μl白细胞稀释液，轻轻摇动1～2分钟，充分混匀后计数。
4.实验结果
实验结果显示，注射环磷酰胺后第五天，模型组白细胞计数为(3.33±0.98)×106/ml，较正常组(7.24±1.62)×106/ml明显降低，差异有显著意义(P＜0.01)。低剂量组与高剂量组白细胞计数为(4.01±1.02)×106/ml、(3.89±0.65)×106/ml，较模型组明显升高，差异有显著意义(P＜0.05，P＜0.05)。阳性对照组(阿胶组)白细胞计数为(4.05±0.83)×106/ml，较模型组明显升高，差异有显著意义(P＜0.05)。
表3异补骨脂苷对环磷酰胺所致正常小鼠白细胞计数降低的影响(x±s，n＝10)
注：与正常组比较*P＜0.05，**P＜0.01；
与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01。
5.结论
异补骨脂苷低、高剂量均能对抗环磷酰胺所致的白细胞降低。