技术领域
本发明属于药物制剂领域，具体涉及具有免疫磁性的高分子纳米药物微球 的制备方法以及这种药物的应用。
背景技术
传统的抗肿瘤药物是通过各种途经给药后，达到一定的血药浓度分布于全 身而产生治疗作用。这种治疗方法最大的缺陷是缺乏选择性，同时还产生毒副 作用，从而导致治疗肿瘤的效果并不理想。为了提高化疗药物对肿瘤的靶向作 用，增加药物的有效利用率，人们提出了导向药物的设想，即用某种具有特殊亲 和力的载体将抗肿瘤药物选择性地分布于体内癌变部位，降低其对正常组织的 毒副作用，并使癌变组织的药物浓度增大。其中阿霉素(英文名称为doxorubicin) 是阻碍癌细胞中核酸合成的一种广谱抗癌药。它具有强效的抗癌活性，但临床 应用毒副作用大，对正常组织和器官产生严重损伤(S.Mitra，U.Gaur，P.C. Ghosh，A.N.，et al.Tumour targeted delivery of encapsulated dextran-doxorubicin conjugate using chitosan nanoparticles as carrier. J Control Rel，74(2001)317-323)。为了提高其药物效果，减小毒副作 用，人们将其负载于生物大分子，脂质体，纳米高分子微粒，聚合物结合体和 聚合物胶束等一系列药物载体系统，从而达到控释药物和提高病灶部位药物浓 度的目的。控释体系所用的载体材料须是可生物降解或生物相容性好的聚合物， 可生物降解的聚合物包括天然和合成两类。天然可生物降解的高分子材料主要 包括血清蛋白、明胶、壳聚糖、海藻酸钠等；合成类的可生物降解聚合物，如 脂肪族聚酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚原酸酯、聚己内酯、聚尿烷、聚氨基酸 等(张蜀，谭载友，陈济民.聚乳酸类缓释、控释注射剂的研究进展。《中 国药学杂志》，2002，37(11)：810-812)。天然的高分子材料，具有良好的生物 相容性，且海藻酸钠、壳聚糖等材料的价格又低廉，是比较理想的可降解载体 材料。磁性抗癌微粒是新一代靶向给药系统，在足够强的外磁场作用下，药物 微球可滞留于局部组织，缓慢释放高浓度抗癌药物，实现药物的定位释放，从 而产生靶向的、高效低毒的药物效应(陶凯雄，陈道达，田源，吴在德，虎风 仙，抗癌药物磁性微球靶向给药的药代动力学研究，实用癌症杂志，7(2000)， 347-349)。其优点是，可以避免被网状内皮系统的巨噬细胞吞噬(朱盛山，药 物新制剂，北京，人民卫生出版社，1993)。另外生物靶向治疗是随着现代生物 技术的发展而发展起来的新型靶向给药系统，利用细胞膜表面受体、单克隆抗体 的专一性，将配体、抗体结合在载体上与靶细胞表面受体特异性结合，使药物 准确到达靶细胞(罗莎，吴华.肿瘤靶向诊断及治疗中的导向系统研究进展，放 射学实践，2004，19(1)：64-66)。这些药物载体，一方面可对药物起到缓释、 控释作用，另一方面具有靶向功能，可对病变部位靶向给药，使阿霉素在病变 部位聚集；同时载药量大且有缓释药物的特点，提高药物治疗效果，降低药物 对正常组织的毒副作用，为抗肿瘤药物治疗提供新的具有靶向功能的药物。
近年来，人们对各种载体及其制备进行了大量的研究。早在1978年，widder 等就开始利用白蛋白制备亚微米级的药物控释粒子。作为药物载体，白蛋白是 一种优良的天然高分子材料。但早期制备的白蛋白微球，粒径偏大，临床应用 会引起栓塞，限制了其进一步的应用(Wedder KJ，Senyei AE，Scarpelli DG. Magnetic microspheres：A model system for site specific drug delivery in vivo.Proc Exp Bio Med，1978，158(1)：141-146)。
谭家驹等改进传统的方法，采用反相微乳液的方法，以油酸作为油相， span-85为表面活性剂，通过形成水相含有白蛋白和磁粉的反相微乳液，加热固 化等步骤，制备出磁性白蛋白纳米粒子的粒径在200nm左右(谭家驹，张春富， 冯彦林等.靶向治疗用Fe3O4及其白蛋白包被磁性纳米粒子的制备，中国医学工 程杂志，2003，11(6)：30-32)，适合靶向治疗癌症的进一步研究。
董聿生等用反相悬浮包埋技术合成了粒径在43～295μm之间的磁性琼脂糖 微球。(董聿生，梁峰，余向阳，常建华，郭立安，磁性琼脂糖亲和吸附剂的合成 与应用，2001，31(2)：121-123)Fe3O4含量5.5％，形状规则，表面光滑，具 有良好的磁响应性。
Tadahiko等应用逆相蒸发法(reverse-phase evaporation method)制备磁 性阿霉素脂质体治疗大鼠骨肉瘤，脂质体平均直径146nm。在肿瘤内植入磁场 的引导下，静脉注射磁性阿霉素脂质体后其肿瘤内阿霉素浓度比静脉注射同剂 量的游离阿霉素高出4倍，而心脏、肾脏内的阿霉素浓度要比静脉注射同剂量 的游离阿霉素低(Tadahiko K，Takashi S，Shoji S，et al.Targeted systemic chemotherapy using magnetic liposomes with incorporated adriamycin for osteosarcoma in hamsters.Int.J Oncology，2001，18：121)。
上述的制备方法中，没有磁性的微球，粒径小，达到纳米级，但载药量都不 高，在加入磁粉后，微球的粒径变得很大，达到几百微米，从而阻碍了进一步 的应用。
Suzawa等将阿霉素，通过聚乙二醇和二肽构成的复合物与单克隆抗体结合 形成药物偶联物。结果显示，这种药物偶联物能够特异靶向肿瘤细胞，并被肿瘤 细胞表达的特定酶所分解而释放出药物，从而起到提高药物浓度，减少毒副作用 (Suzawa T，Nagamura S，Saito H，et al.Enhanced tumor cell selectivity of adriamycin-monoclonal antibody conjugate via a poly(ethylene glycol)-based cleavable linker[J] J Controlled Release，2002，19(1-3)：229-242)。Kader Abdul等将低密度脂蛋白结合抗肿瘤药 物如5-氟尿嘧啶、多柔比星阿霉素，靶向人宫颈癌细胞、乳腺癌细胞，通过受体 介导的摄取和细胞内化，药物能成功地在脂蛋白受体中释放，提高了药物利用率， 减少了副作用(Kader Abdul，Pate Alan.Loading anticancer drugs into HDL as well as LDL has little affect on properties of complexes and enhances cytotoxicity to human carcinoma cells[J].J Control Release，2002，80 (1-3)29-44)。
Yokoyama H等将肿瘤细胞坏死因子(TNF)与无唾液酸糖蛋白受体的配体 (ASGP-R)的特异性配基半乳糖偶联，再进行放射性核素标记得TNF-Gal-核素复 合物，通过ASGP-R将TNF-Gal-核素复合物导入肝脏，利用肿瘤细胞表面增加的 TNF受体及放射性核素的协同双效作用，共同促进肝癌细胞凋亡(Yokoyama H，Goto S，Chen CL，et al.Major hepatic resection may suppress the growth of tumors remaining in the residual liver[J]. Br J Cancer，2000，83(8)：1096-1101)。
Hosokawa等将载有多柔比星阿霉素的脂质体的微粒连接上人源化单克隆抗 体的片段F(ab’)2构成复合体MCC465，已经进入了靶向治疗胃肿瘤的临床试验， 显示出很好的治疗效果并大大的减少了副作用(Hosokawa S，Tagawa T，Niki H，. et al. Efficacy of immunoliposomes on cancer models in a cell-surface-antigen-density-dependent manner[J].Br J Cancer，2003， 89(8)，1545-1551.)。Dagor等利用载有多肽的脂质体微粒靶向肠肿瘤血管，肿 瘤细胞内显示了很高的微粒浓度，结果发现这种特异靶向性微粒在肿瘤细胞内的 聚积还受配合体的种类及肿瘤类型等微环境的影响(Dagar S，Krishnadas A， Rubinstein I，et al.VIP grafted sterically stabilized liposomes for targeted imaging of breast cancer：in vivo studies[J].J Control Release， 2003，91(1-2)，123-133)。
Dufes等报道了经转铁蛋白、葡聚糖修饰的壳聚糖微粒可以使表面高表达转 铁蛋白受体的细胞摄取量增加(Dufes C，Schatzlein AG，Tetley L，et al.Niosomes and polymeric chitosan based yesicle bearing transferring and glucose ligands for drug targeting [J].Pharm Res， 2000，17(10)：1250-1258)。将单克隆抗体通过共价交联或吸附在纳米粒子的表 面形成具有免疫活性的纳米粒子，它具有双重靶向性，即一方面它属于纳米粒子 体系，可通过控制粒子大小使其选择性地被动滞留在特定的器官；另一方面，可 通过改变粒子表面修饰的抗体在体内免疫应答而特异性作用于其相关抗原的细 胞，使其易达到靶细胞区。
上述方法制备的药物载体，有的靶向能力不强和制备过程复杂，有的载药 不高和不具有药物缓释效果，不利于发挥实际应用。
海藻酸钠具有温和的溶胶一凝胶性质、良好的生物兼容性、便宜的价格， 其适于包埋或释放药物、蛋白与细胞，并且海藻酸钠稳定、无毒、成球性较好， 包埋物范围十分广泛。如壳聚糖-海藻酸钙颗粒包埋血红蛋白制作人工细胞、明 胶-海藻酸微胶囊包埋α-干扰素、海藻酸微球包埋免疫试剂霍乱毒素与多糖抗 体及内源乳化法制备海藻酸钙微囊包埋卡介苗(结核杆菌BCG)制作人工疫苗 等。研究表明，胰岛素、水蛭素等多肽包埋在海藻酸钙-壳聚糖微囊中，在模拟胃 液中没有明显的释放，而在模拟肠液中释放较快，这将有效提高多肽药物的生物 活性与利用率(王康，何志敏.海藻酸微胶囊的制备及在药物控释中的研究进 展[J]化学工程，2002，30(1))，但上述方法所制得海藻酸钠的微球一般都为 微米级，且不具有磁靶向和特异靶向性的功能，所以不具有靶向药物载体的相 关功能，限制了其进一步的应用。
发明专利申请公开说明书(公开号：CN 1328064A；国别：中国； 公开日：2001年12月26日)就公开了一种磁性药物纳米微球，其中采用 苯乙烯单体引发聚合反应，生成高分子化合物。其一般不能用于药学或生物领 域。
发明内容：
为了克服上述技术的缺点，本发明的目的是提出一种可生物降解的，粒径 在100-300nm左右的免疫磁性药物纳米微球及其制备方法，这种免疫磁性高分 子药物微球具有良好的磁响应性和抗体特异靶向性。本发明还公开了一种用于 治疗恶性肿瘤的药物组合物以及所述的免疫磁性药物微球在制备治疗恶性肿瘤 的药物中的应用。
具体的技术方案如下：
一种免疫磁性药物微球，其中以含有羧基的生物可降解的高分子材料海藻 酸钠交联形成高分子包裹层，包裹层内还包含缓释药物和纳米磁性材料，然后 在化学交联剂的作用下，将高分层上再连接单抗，形成免疫磁性药物微球。免 疫磁性药物微球的粒径范围在60～800nm左右，但粒经主要分布在100--300nm。
所述的免疫磁性药物微球，其中所述的缓释药物含量占整个微球重量的 0---20％(w/w，w/w代表质量百分比，不等于0)。较好的，所述的纳米药物微 球，其中所述的缓释药物含量占整个微球重量的0---15％(w/w，不等于0)。本 发明制得的免疫磁性纳米微球的缓释药物半衰期为5-15D，较好的范围为7-10D (D的含义为day)。缓释药物的半衰期表达的是一个药物有效治疗时间，时间 太短，药物释放太快，将不能达到持久的治疗作用。时间太长，将导致药效的 下降，同样也不能对病体造成显著的影响。所述的缓释药物选自水溶性的化疗 药物。所述的水溶性的化疗药物选自阿霉素、顺铂、表阿霉素的一种或其组合。 所述的水溶性的化疗药物选自阿霉素。
一般说来，当缓释药物的含量大于一个固定值时，其将达到饱和，也就是 将不能与微球形成稳定的体系。所以，药物的含量都具有一个合适的范围。例 如0-20％。超过这个范围之后，将会出现药物不能稳定的与高分子包裹层和磁性 纳米材料交联结合。
所述的磁性药物微球中，生物可降解的高分子材料选自海藻酸钠，其含量 占整个微球重量的60-75％(w/w，w/w代表质量百分比)。
所述的免疫磁性药物微球，所述的纳米磁性材料为纳米碳包铁粉末，其含 量占整个微球重量的10-20％(w/w)。所述的纳米碳包铁粉末平均粒径为 1-300nm，较好的平均粒径为0.8---100nm，更好的为20---60nm。更好的为 20-30nm。最好为25nm，此时该粉末的粒径大小在20～60nm之间，最大不超过 60nm。最好采用深圳市尊业纳米材料有限公司生产的碳包铁粉末，具有较好的 效果。此时粒径的大小，会严重影响最终形成的磁性纳米微球的稳定性。粒径 太大，最终形成的微球将不能稳定的形成胶体溶液。外边包覆几纳米后的碳膜， 磁响应性好，性质稳定，不易被氧化。
所述的免疫磁性药物微球，表层接上的特异靶向性的单克隆抗体选自 Hab18。在所述的免疫磁性药物微球中，所述的单克隆抗体含量为每毫克微球含 Hab18为35-66ug。
最终，本产品的组成在于包括下述物质：
纳米磁性材料 10-20％(w/w)
缓释药物 0-20％(w/w)
高分子材料 60-75％(w/w)。
单抗含量 35-66ug/mg
其它杂质为余量，微球的粒径在100-300nm。
较佳的，本产品的组成在于包括下述物质：
纳米碳包铁 5-10％(w/w)
阿霉素 0-15％w/w)
海藻酸钠 60-75％(w/w)。
Hab含量 50-65ug/mg
其它杂质为余量，微球的粒径在100---300纳米。
所述的其他杂质，主要指反应中遗留的反应物，如水、交联剂、有机溶剂 等等，其含量为痕量。由于反应的不完善，其他杂质含量也可以增多。
关于免疫磁性药物微球中磁粉的含量，较好的，可采用原子吸收光谱法测 定。具体步骤可以是：准确称取10mg的磁性药物微球，加入浓硝酸并加热溶解， 稀释后，原子吸收光谱测定含量。然后根据所测铁的含量在折算出碳包铁粉末。 具体的取用量可根据实际情况变动。
药物含量的测定，较好的，可采用吸光光度法测定。具体步骤可以如下： 称取一份10mg的磁性药物微球和一份质量相同的空白微球，用相同量的含有少 量浓盐酸的PBS溶液溶解，离心后，取上层清夜用分光光度计测定吸光度，用 标准曲线换算药物含量。具体的取用量可根据实际情况变动。
免疫磁性药物微球的磁响性能实验测定，较好的采用透光率法。具体步骤 可以如下：取5mg的免疫磁性药物微球超声分散在10ml蒸馏水中，取上清液， 在2T的磁场中，2.5cm距离内，测定随时间变化的透光率。具体的取用量可根 据实际情况变动。
有关检测方法的参考文章，为邱广亮，李咏兰，邱广明等，《肺靶向顺铂磁性 白蛋白微球的制备及性质》，中国医药工业杂志，2001，32(12)：544-546页。
免疫磁性药物微球中的药物缓释，采用的方法如下：取5mg微球于塑料试 管中，加入8ml0.01mol/L PBS(PH＝7.4)，置于37℃水浴摇床100r/min振荡，定 时取出试管，进行4000r/min离心5min，取出上清液用紫外-可见分光光度计测 量阿霉素的含量，并计算累积释放百分率。累积释放率(％)＝W1/W2×100％，式 中W1，W2为微球在PBS中溶出的阿霉素量和阿霉素总量。
免疫磁性药物微球中单抗含量的测量采用考马斯亮蓝，测量制备免疫磁性 纳米药物微球实验过程中收集的上清液中抗体的含量，运用反推的方法，用实 验投入量-回收量＝连接量，运用标准曲线计算出微球中抗体的含量。
免疫磁性药物微球抗体的活性检测运用流式细胞术，具体步骤如下：分别 取一定量的磁性纳米药物微球和免疫磁性纳米药物微球，加入等量的兔抗小鼠 IgG-FITC，4℃作用30min，用PBS离心洗涤数次，即获得FITC标记的荧光微球， 先将标记的磁性纳米药物微球进行流式实验，以其为空白参比，再将标记的免 疫磁性纳米药物微球进行流式实验，由免疫磁性纳米药物微球中抗体与兔抗小 鼠IgG-FITC是否呈阳性反应，来判断抗体的活性和显示已连上抗体的微球所占 百分比数量。
免疫磁性药物微球与靶细胞SMMC-7221的结合运用酶联免疫吸附实验法，以 免疫磁性药物微球和纯抗体作比较，来判断微球的特异结合性。
所述的免疫磁性药物微球的制备方法，其包括以下步骤：
(1)形成微乳液：将含有生物可降解的高分子材料、纳米磁性材料，缓释药 物分散在水溶液中组成水相体系，并加入到由乳化剂和有机溶剂组成的油相体 系中，混合均匀后形成反相微乳液，其中每毫升水相中含有高分子材料为10- 25mg，药物为10-30mg，纳米磁性材料为5-10mg，每毫升油相中含乳化剂为 0.05-0.2g。
(2)固化反应：将步骤(1)所制得的反相乳液在室温下，并在超声和搅拌的 条件下，加入交联剂氯化钙，反应0.3-0.45小时，然后洗涤和分选，冷冻干燥。 对于形成能够顺利进行反应的微乳液这一步骤，其关键的调控因素在于控制好 不同时间内高分子材料与交联剂的加入比例与加入量，使之能够平顺的反应， 在每一个油包水的微相上形成需要的纳米磁性微球。较好的方案是高分子材料 1.5～2％，交联剂氯化钙水溶液的浓度在40％。这种情况下，有利于固化时间 控制在0.15---0.45小时。
其中(1)所述的海藻酸钠，纳米磁性材料，缓释药物分散在蒸馏水中，并 滴入由乳化剂和有机溶剂组成的微乳体系，混合均匀至成为反相微乳液，比较 好的方式可主要采用(包括)下列具体步骤：
A、把海藻酸钠先溶于水中，形成初步的高分子溶液。在此步骤中，较 好的选择，其水溶液的浓度在2～4％(w/v，代表质量体积比)。
B、把缓释药物和磁粉溶于水中并超声混合。加入上述高分子溶液中， 至完全溶解均匀。
C、然后将药物和磁粉混合溶液加入到上述高分子溶液中，混合均匀， 形成匀相体系。较好的混合方法是采用超声搅拌。
D、将乳化剂和溶剂混合均匀，然后将上述的磁性高分子药物混悬液滴 入乳化剂和溶剂的混合液中，形成均匀的反相乳液体系。
E、在加入交联剂，不断混合均匀，较好的混合方法是采用超声搅拌。
需要说明的是，其中(1)所述形成微乳液仍然可以采用除上述方法以外的 其他具体步骤来实现，而上述具体步骤是一种较佳的方式。
此时，经过固化反应，溶液中已形成磁性药物微球，通常，为了进一步制 备成品，还包括以下步骤：
(3)清洗。
(4)对清洗之后的磁性药物微球进行干燥。
由于考虑到产品是用作药品，公知的，一般采用丙酮或其他易挥发的溶剂， 进行磁性分离清洗。经过清洗所制得的产品，已具备基本使用功能。然而，由 于在实际的使用过程中，对药物的含量需要有一个准确的确定，并且，清洗之 后的产品容易结块，而且含有很多杂质。因此，需要对清洗之后的药物微球进 行干燥。较好的，采用冷冻干燥。
(5)连接抗体：将步骤(2)所制得的微球和一定量的单抗溶入0.01mol/l 的PBS中，加入交联剂EDC，室温反应12-24小时。
(6)用蒸馏水洗涤和冷冻干燥
上所述方法中的缓释药物选自水溶性的化疗药物。所述的水溶性的化疗药 物选自阿霉素、顺铂、表阿霉素的一种或其组合。较好的，所述的水溶性的化 疗药物为阿霉素。
所述方法中的生物可降解的高分子材料选自海藻酸钠。较好的是选用浓度 为1.5％-2.0％(w/v，代表质量体积比)的海藻酸钠水溶液。
所述方法的纳米磁性材料为纳米碳包铁粉末。
所述的磁性药物微球，所述的纳米碳包铁粉末平均粒径为0.8-300nm，较 好的平均粒径为0.8---100nm，更好的为20---60nm。更好的为20-30nm。最好 为25nm，此时该粉末的粒径大小在20～60nm之间，最大不超过60nm。此时粒 径的大小，会严重影响最终形成的磁性纳米微球的稳定性。粒径太大，最终形 成的微球将不能稳定的形成胶体溶液。外边包覆几纳米后的碳膜，磁相应性好， 性质稳定，不易被氧化。更小纳米磁性材料，有利于形成更小的磁性药物微球。
所述方法中固化微球所用的交联剂选自氯化钙溶液。较好的，具体使用中， 采用交联剂为浓度在40％(w/w)左右的氯化钙溶液。
所述方法中的所提到的混合，较好的为超声搅拌方式。所述的超声搅拌， 就是为超声波和搅拌同时进行。
所述的方法中，固化微球的时间控制在0.5h为好。时间太长，对于实际生 产而言无意义。
所述方法中连接抗体的过程中的加入抗体量为每毫克微球加入50-400ug。 较好的为300ug/mg。
所述方法中连接抗体反应时间为12-24小时，较好的反应时间为18小时。
用于治疗恶性肿瘤的药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的磁性药物微 球和药学上可接受的载体。所述的药物组合物，一般是采用本发明的磁性药物 微球制作成注射用的药剂。所述的药学上可接受的载体，主要是指与磁性药物 微球相配伍的生理盐水以及其他的一些常用药学助剂。
本发明的另一目的，是公开了所述的免疫磁性药物微球在制备治疗恶性肿 瘤的药物中的应用。由于采用本发明所生产的免疫磁性微球具有良好的磁响应 性和抗体特异靶向性，药物含量在10％以上，并且为亲水性的产品，能够与药 学上可接受的载体形成稳定的溶胶体系，并可配合固定导向的磁场，进行恶性 肿瘤的靶向治疗，尤其是肝肿瘤细胞的靶向治疗。
目前，国际上磁性药物微球主要侧重于疏水高分子组成的微米或亚微米微 球。比较而言，本发明用反相微乳液交联制备的免疫磁性高分子磁性药物微球 具有以下特点：(1)制备的免疫磁性高分子药物微球粒径范围在60~800nm，而 平均粒径主要分布在100-300纳米。(2)微球的粒径可以由乳化剂的用量和油 相的选择来调节。(3)高分子微球由亲水性的可生物降解的材料组成，因此本 发明产品具有良好的亲水性，并且相对于过去的产品(参见发明专利申请公开 说明书，公开号：CN 1328064A；国别：中国；公开日：2001年12月 26日，公开了一种磁性聚合物纳米微球，其中采用采用苯乙烯单体引发聚合反 应，生成高分子化合物)，具有良好的生物相容性，可用于医学和生物领域。(4) 药物可控，可根据投入药物的质量来调节，可达10％以上。(5)缓释时间长， 半衰期可达7天，甚至达到7-20天。(6)微球中抗体的含量可以达到每毫克微 球含65ug Hab18，且具有活性和特异结合性。(7)制备方法简单，重现性好。
附图说明
图1是实施例1原料中的磁性碳包铁粉透射电镜图。
图2是实施例1中的磁性药物微球(放大27k倍)的TEM照片
图3是实施例7的免疫磁性海藻酸钠阿霉素微球透射电镜图
图4是实施例7的免疫磁性海藻酸钠阿霉素微球粒径及分布图。
图5是实施例7的免疫磁性海藻酸钠阿霉素微球磁响应曲线图。
图6是实施例7的免疫磁性海藻酸钠阿霉素微球粒的药物缓释图。
图7是实施例7的免疫磁性海藻酸钠阿霉素微球粒的流式细胞图。
图8是实施例7的免疫磁性海藻酸钠阿霉素微球粒与靶细胞的结合图。
具体实施方式：
一：磁性载药纳米微球的制备
实施利1：
取100mg碳包铁铁磁粉(深圳市尊业纳米材料有限公司生产，型号为JY-FeC， 平均粒径为25nm，最大粒径为60nm)，磁性碳包铁粉透射电镜图见图1。100mg 的阿霉素(日本产，深圳万乐药业公司提供，含量98.4％)，200mg海藻酸钠(温 州市东升化工试剂厂)溶于10ml蒸馏水中，超声混匀，形成水性混悬液。将上 述混悬液滴入100正庚烷中，其中包含20gAOT(所述的AOT，为气溶胶OT，分子 式为C20H37NaO7S，分子量为444.56，由上海巨枫化学科技有限公司采购，嘉善 巨枫化工厂生产，皂价为220-225)。10mim后，再加入6ml，40％的氯化钙水 溶液，0.5小时后停止搅拌。用适量的丙酮，磁性分离清洗3～5遍，然后离心 分选，冷冻干燥备用。
实验结果所得纳米微球的外貌为球形，平均粒径为185nm，分布范围在100～ 300nm。磁粉的含量为16.5％，药物的含量为11.9％，剩下是高分子的含量， 因为杂质含量不高，估计它占了71.6％。透射电镜观察其形貌见图2。
磁性药物微球中磁粉的含量用原子吸收光谱法测定，具体步骤为：准确称取 10mg的免疫磁性药物微球，先后加入浓硝酸和加热溶解，稀释后，原子吸收光 谱测定含量，在折算出碳包铁的含量。
药物含量的测定采用以下方法：称取一份5mg的磁性药物微球和一份质量 相同的空白微球，用50ml的含少量浓盐酸的PBS溶解，离心后取上清夜，用分 光光度计测定吸光度，用标准曲线换算药物含量。
注意，以下实施例未提及部分与实施例1相同。
实施利2：
取100mg碳包铁铁磁粉和100mg的阿霉素，100mg海藻酸钠溶于10ml蒸馏 水中，超声混匀，形成水性混悬液。将上述混悬液滴入100正庚烷中，其中包 含20gAOT 10mim后，再加入5ml，40％的氯化钙水溶液，0.5小时后停止搅拌。 用适量的丙酮，磁性分离清洗3～5遍，然后离心分选，冷冻干燥即得微球。
实验结果所得纳米微球的成球性比较差，其平均粒径为171nm，主要分布范 围在100～300nm。磁粉的含量为23.2％，药物的含量为11.4％，剩下是高分 子的含量。
实施利3：
取100mg碳包铁铁磁粉和100mg的阿霉素，150mg海藻酸钠溶于10ml蒸馏 水中，超声混匀，形成水性混悬液。将上述混悬液滴入100正庚烷中，其中包 含20gAOT 10mim后，再加入5ml，40％的氯化钙水溶液，0.5小时后停止搅拌。 用适量的丙酮，磁性分离清洗3～5遍，然后离心分选，冷冻干燥即得微球。 实验结果所得纳米微球的外貌为球形，平均粒径为178nm，粒径分布范围在100～ 300nm。磁粉的含量为19.3％，药物的含量为13.5％，剩下是高分子的含量。
实施利4：
取100mg碳包铁铁磁粉和100mg的阿霉素，250mg海藻酸钠溶于10ml蒸馏 水中，超声混匀，形成水性混悬液。将上述混悬液滴入100正庚烷中，其中包 含20gAOT 10mim后，再加入5ml，40％的氯化钙水溶液，0.5小时后停止搅拌。 用适量的丙酮，磁性分离清洗3～5遍，然后离心分选，冷冻干燥即得微球。 实验结果所得纳米微球的外貌为球形，平均粒径为220nm，粒径分布范围在100～ 300nm。磁粉的含量为15.3％，药物的含量为10.1％，剩下是高分子的含量。
实施利5：
取100mg碳包铁铁磁粉和200mg的阿霉素，200mg海藻酸钠溶于10ml蒸馏 水中，超声混匀，形成水性混悬液。将上述混悬液滴入100正庚烷中，其中包 含20gAOT 10mim后，再加入5ml，40％的氯化钙水溶液，0.5小时后停止搅拌。 用适量的丙酮，磁性分离清洗3～5遍，然后离心分选，冷冻干燥即得微球。 实验结果所得纳米微球的外貌为球形，平均粒径为310nm，，磁粉的含量为14％， 药物的含量为18.0％，剩下是高分子的含量。
实施利6：
取100mg碳包铁铁磁粉和300mg的阿霉素，200mg海藻酸钠溶于10ml蒸馏 水中，超声混匀，形成水性混悬液。将上述混悬液滴入100正庚烷中，其中包 含20gAOT 10mim后，再加入5ml，40％的氯化钙水溶液，0.5小时后停止搅拌。 用适量的丙酮，磁性分离清洗3～5遍，然后离心分选，冷冻干燥即得微球。 实验结果所得纳米微球的外貌为球形，平均粒径为347nm，磁粉的含量为13％， 药物的含量为19.1％，剩下是高分子的含量。
二：免疫磁性载药纳米微球的制备
实施利7
采用最优化的制备条件实施利1所制取的载药微球。取4mg这种最优化的 微球和600ug抗体Hab18溶于6ml 0.01mol/lPBS溶液，再加入90mg交联剂 EDC(水溶性的碳二亚胺)，室温反应18小时后，蒸馏水洗涤和冷冻干燥。
实验结果所得磁粉的含量为14.6％，药物的含量为10.8％，抗体的含量为 65ug/mg微球，其余为高分子含量。
免疫磁性药物微球中磁粉的含量用原子吸收光谱法测定，具体步骤为：准 确称取10mg的免疫磁性药物微球，先后加入浓硝酸和加热溶解，稀释后，原子 吸收光谱测定含量，在折算出碳包铁的含量。
药物含量的测定采用以下方法：称取一份5mg的磁性药物微球和一份质量 相同的空白微球，用50ml的含少量浓盐酸的PBS溶解，离心后取上清夜，用分 光光度计测定吸光度，用标准曲线换算药物含量。
剩下是高分子的含量，因为杂质含量不高，估计它占了75％。透射电镜观察 其形貌见图3，；激光散射仪测定其粒径分布见图4，平均粒径171nm，分布范围 在100～300nm。
取5mg的免疫磁性微球超声分散在10mg蒸馏水中，取上清液。在2T的磁 场中，2.5cm距离内，用紫外-可见分光广度计测定磁场中微球的透光率随时间 的变化，得到磁响应性曲线见图5。
用体外模拟缓释实验可以得药物的累积缓释率如图6
用流式细胞术和ELISA实验对微球进行抗体活性检测和靶细胞的结合实验， 见图7和图8，可见免疫磁性微球的抗体仍然具有活性并且能与靶细胞特异结合。
注意，以下实施例未提及部分与实施例1相同。
实施例8
取4mg最优化的药物微球和200ug抗体Hab18溶于6ml 0.01mol/lPBS溶 液，再加入90mg交联剂EDC(水溶性的碳二亚胺)，室温反应18小时后，蒸馏水 洗涤和冷冻干燥。
实验结果所得磁粉的含量为14.2％，药物的含量为10.3％，抗体的含量为 35.lug/mg微球，其余为高分子含量。
实施例9
取4mg最优化的药物微球和400ug抗体Hab18溶于6ml 0.01mol/lPBS溶 液，再加入90mg交联剂EDC(水溶性的碳二亚胺)，室温反应18小时后，蒸馏水 洗涤和冷冻干燥。
实验结果所得磁粉的含量为13.9％，药物的含量为11.2％，抗体的含量为 55.6ug/mg微球，其余为高分子含量。
实施例10
取4mg最优化的药物微球和800ug抗体Hab18溶于6ml 0.01mol/lPBS溶 液，再加入90mg交联剂EDC(水溶性的碳二亚胺)，室温反应18小时后，蒸馏水 洗涤和冷冻干燥。
实验结果所得磁粉的含量为14.8％，药物的含量为10.5％，抗体的含量 为67.8ug/mg微球，其余为高分子含量。
实施例11
取4mg最优化的药物微球和600ug抗体Hab18溶于6ml 0.01mol/lPBS溶 液，再加入90mg交联剂EDC(水溶性的碳二亚胺)，室温反应6小时后，蒸馏水 洗涤和冷冻干燥。
实验结果所得磁粉的含量为15.2％，药物的含量为11.5％，抗体的含量为 47.9ug/mg微球，其余为高分子含量。
实施例12
取4mg最优化的药物微球和600ug抗体Hab18溶于6ml 0.01mol/lPBS溶 液，再加入90mg交联剂EDC(水溶性的碳二亚胺)，室温反应12小时后，蒸馏水 洗涤和冷冻干燥。
实验结果所得磁粉的含量为14.3％，药物的含量为11.0％，抗体的含量为 60.7ug/mg微球，其余为高分子含量。
实施例13
取4mg最优化的药物微球和600ug抗体Hab18溶于6ml 0.01mol/lPBS溶 液，再加入90mg交联剂EDC(水溶性的碳二亚胺)，室温反应24小时后，蒸馏水 洗涤和冷冻干燥。
实验结果所得磁粉的含量为13.6％，药物的含量为9.9％，抗体的含量为 66.5ug/mg微球，其余为高分子含量。
实施例14
取4mg药物微球和600ug抗体人乳腺癌单抗M4G3Ab溶于6ml 0.01mol/lPBS 溶液，再加入90mg交联剂EDC(水溶性的碳二亚胺)，室温反应18小时后，蒸馏 水洗涤和冷冻干燥。
实验结果所得磁粉的含量为13.5％，药物的含量为10.2％，抗体的含量为 55.2ug/mg微球，其余为高分子含量。微球的形貌为球形，粒径主要分布范围在 100～300nm。
将所得单抗载药微球用ELISA实验进行抗体活性检测和靶细胞乳腺癌细胞 MCF-7的结合实验，结果显示免疫磁性微球的抗体仍然具有活性并且能与靶细胞 特异结合。
实施例15
取4mg上述微球和600ug抗肺癌单抗CD3抗体溶于6ml 0.01mol/lPBS溶 液，再加入90mg交联剂EDC(水溶性的碳二亚胺)，室温反应18小时后，蒸馏水 洗涤和冷冻干燥。
实验结果所得磁粉的含量为15.1％，药物的含量为9.7％，抗体的含量为 57.3ug/mg微球，其余为高分子含量。微球的形貌为球形，粒径分布范围在100～ 300nm。
将所得单抗载药微球用ELISA实验进行抗体活性检测和靶细胞肺癌细胞 PC80445的结合实验，结果显示免疫磁性微球的抗体仍然具有活性并且能与靶细 胞特异结合。
实施例16
取4mg上述微球和600ug抗大肠癌CL-3单抗溶于6ml 0.01mol/lPBS溶液， 再加入90mg交联剂EDC(水溶性的碳二亚胺)，室温反应18小时后，蒸馏水洗涤 和冷冻干燥。
实验结果所得磁粉的含量为13.5％，药物的含量为11.2％，抗体的含量为 56ug/mg微球，其余为高分子含量。微球的形貌为球形，粒径分布范围在100～ 300nm。
将所得单抗载药微球用ELISA实验进行抗体活性检测和靶细胞人大肠癌细 胞LS-174T的结合实验，结果显示免疫磁性微球的抗体仍然具有活性并且能与 靶细胞特异结合。
实施例17
取4mg上述微球和600ug转铁蛋白受体单抗WuT9溶于6ml 0.01mol/lPBS 溶液，再加入90mg交联剂EDC(水溶性的碳二亚胺)，室温反应18小时后，蒸馏 水洗涤和冷冻干燥。
实验结果所得磁粉的含量为13.5％，药物的含量为11.2％，抗体的含量为 56ug/mg微球，其余为高分子含量。微球的形貌为球形，粒径分布范围在100～ 300nm。
将所得单抗载药微球用ELISA实验进行抗体活性检测和靶细胞SMMC-7721 的结合实验，见图9，可见免疫磁性微球的抗体仍然具有活性并且能与靶细胞特 异结合。
实施例18
取4mg上述微球和600ug抗胃癌细胞单抗溶于6ml 0.01mol/lPBS溶液， 再加入90mg交联剂EDC(水溶性的碳二亚胺)，室温反应18小时后，蒸馏水洗涤 和冷冻干燥。
实验结果所得磁粉的含量为13.5％，药物的含量为11.2％，抗体的含量为 56ug/mg微球，其余为高分子含量。微球的形貌为球形，粒径分布范围在100～ 300nm。
将所得单抗载药微球用ELISA实验进行抗体活性检测和靶细胞胃癌细胞的 结合实验，结果显示免疫磁性微球的抗体仍然具有活性并且能与靶细胞特异结 合。
实施例19
取4mg上述微球和600ug抗PSMA单克隆抗体Ed-5溶于6ml 0.01mol/lPBS 溶液，再加入90mg交联剂EDC(水溶性的碳二亚胺)，室温反应18小时后，蒸馏 水洗涤和冷冻干燥。
实验结果所得磁粉的含量为13.5％，药物的含量为11.2％，抗体的含量为 56ug/mg微球，其余为高分子含量。微球的形貌为球形，粒径分布范围在100～ 300nm。
将所得单抗载药微球用ELISA实验进行抗体活性检测和靶细胞人前列腺癌 细胞LACaP的结合实验，结果显示免疫磁性微球的抗体仍然具有活性并且能与 靶细胞特异结合。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因 此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明 而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，因此，在与本发明权利 要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的范围之内。