钙泊三醇一水化合物纳米晶体 发明领域 本发明涉及纳米晶体形式的钙泊三醇 (calcipotriol) 一水合物， 并涉及包含在 旨在用于预防或治疗皮肤疾病和病症的药物组合物中的所述纳米晶体。
发明背景
银屑病是慢性炎性皮肤疾病， 其表现为由于表皮角化病造成的红斑状、 干燥、 鳞状 斑块。斑块最常见于肘、 膝和头皮， 尽管更多的病灶可能出现在身体的其他部分， 特别是腰 骶区域。 轻度至中度银屑病的最常见治疗涉及含皮质类固醇作为活性成分的组合物的局部 应用。 尽管有效， 但皮质类固醇具有许多副作用的缺点， 例如皮肤萎缩、 条纹 (striae)、 痤疮 样皮疹、 口周皮炎、 皮肤真菌和细菌的过度生长、 色素皮肤着色不足和酒渣鼻。
然而， 多年来， 银屑病的有利的非类固醇治疗在于用配制在软膏组合物中的维
生素 D 类似物钙泊三醇的局部治疗 ( 由 LEO Pharma 作为或软 或膏销售 )， 其中钙泊三醇存在于溶剂或乳膏组合物中 ( 由 LEO Pharma 以乳膏销售 )， 其中钙泊三醇以微粒的悬浮液形式存在。软膏组合物中的溶剂 是丙二醇， 其具有增强活性成分穿透进入皮肤的优点， 导致效力的改善， 但已知其还作为 皮肤刺激剂。因此， 据报道， 在局部组合物中包含丙二醇通常会造成患者发展成接触性皮 炎 ( 一项研究报道了 12.5％的丙二醇的大量刺激反应， 参见 M.Hannuksela 等人， Contact Dermatitis 1， 1975， 第 112-116 页 )， 且当以高浓度使用丙二醇时， 刺激反应的数量增加 ( 如 J.Catanzaro 和 J.Graham Smith， J.Am.Acad.Dermatol.24， 1991， 第 90-95 页综述 )。 尤其由于丙二醇的存在而导致了钙泊三醇穿透进入皮肤的改善， 已经发现 膏比 了皮肤刺激。 发明概述
人类皮肤、 特别地外层角质层提供了抗微生物病原体和毒素化学物质侵入的有效 屏障。 尽管皮肤的这种性质通常是有利的， 但其复杂化了药物的皮肤施用， 因为应用在患皮 肤疾病的患者皮肤上的大量 - 即使不是大多数 - 活性成分可能不会渗入到其发挥其活性的 皮肤的有活力层。为了确保活性成分充分地穿透到真皮和表皮中， 一般优选地以溶解状态 包含活性成分， 一般地在以醇如乙醇或者二醇如丙二醇的形式的溶剂存在下。丙二醇是熟 知的渗透增强剂， 即能穿透角质层并将低分子组分例如载体中的治疗性活性组分 “拉入到” 表皮中的物质。丙二醇本身可能会引起显著的皮肤刺激， 并且其还能将载体的低分子和可 能刺激组分 “拉入到” 表皮中， 造成常规载体包括丙二醇的总体刺激作用。为此， 旨在治疗 炎症皮肤疾病的在组合物中作为溶剂存在的丙二醇可能加重炎症应答。
在产生本发明的研究中， 目的是提供包含钙泊三醇作为活性成分的局部组合物，
软乳膏在治疗银屑病病灶中更有效， 但也在很大一部分银屑病患者中造成其具有与软膏那些相当的皮肤穿透性和生物学活性特性， 但其不含丙二醇作为溶剂。
已经令人惊奇地发现， 可能制备纳米晶体形式的化学稳定的 ( 即不会降解成24- 表钙泊三醇或其他降解产物 ) 钙泊三醇一水合物， 因为出乎意料地， 纳米化期间， 没有 显著量的无定形钙泊三醇因高应力或冲击力或者高温而形成。此外， 纳米晶体是物理稳定 的， 因为在制备后， 在纳米晶体的悬浮液中没有观察到聚集或晶体生长或者晶体 ( 多态 ) 形 式的改变。纳米晶体可以容易地配制到局部乳膏和软膏组合物中， 从中钙泊三醇 ( 一水合 物 ) 可以以与来自 软膏的钙泊三醇穿透的相当的量渗透到皮肤的活力层 ( 即 真皮层和表皮层 ) 中， 并产生类似或更高水平的生物学活性 ( 如通过靶基因的体外活化所 测定 )， 而不用借助于包含穿透增强剂如丙二醇 ( 其是潜在的皮肤刺激剂 )。
因此， 本发明的一个方面涉及如动态光散射所测定颗粒大小分布为 200-600nm 的 纳米晶体形式的钙泊三醇一水合物的悬浮液， 该悬浮液还包含水相， 所述水相包括足以防 止钙泊三醇一水合物纳米晶体聚集物形成和 / 或晶体生长的量的非离子、 聚合物表面活性 剂。
另一方面， 本发明涉及如动态光散射所测定颗粒大小分布为 200-600nm 的纳米晶 体形式的钙泊三醇一水合物， 所述纳米晶体可通过包括以下步骤的方法获得 ：
(a) 将包含所述水相重量约 1％至约 5％的非离子、 聚合物表面活性剂的水相中的 晶态钙泊三醇一水合物缩减， 导致微粒的形成， 所述微粒的颗粒大小分布为约 5-20μm， 平 均颗粒大小约 10μm ；
(b) 在约 300-800 巴的压力下， 将步骤 (a) 的所述悬浮液进行第一个循环的高压均 化一段时间， 所述一段时间足以获得约 15-40％的颗粒大小分布为 200-600nm 的钙泊三醇 一水合物的晶体 ；
(c) 在约 800-1200 巴的压力下， 将步骤 (b) 的所述悬浮液进行第二个循环的高压 均化一段时间， 所述一段时间足以获得约 40-80％的颗粒大小分布为 200-600nm 的钙泊三 醇一水合物的晶体 ；
(d) 在约 1200-1700 巴的压力下， 将步骤 (c) 的所述悬浮液进行第三个循环的高压 均化一段时间， 所述一段时间足以获得约 90％或更多的颗粒大小分布为 200-600nm 的钙泊 三醇一水合物的晶体 ； 和
(e) 任选地从水相中分离所得钙泊三醇一水合物的纳米晶体。
另一方面， 本发明涉及包含上述钙泊三醇一水合物纳米晶体和可药用载体的药物 组合物。
在又一方面， 本发明涉及包含钙泊三醇一水合物纳米晶体或纳米悬浮液的组合物 的用途， 用于治疗皮肤疾病或病症， 例如银屑病、 脂溢性银屑病、 掌跖脓疱病、 皮炎、 干皮病 鱼鳞癣、 酒渣鼻或痤疮。
附图简述
图 1 是显示如动态光散射测定的、 通过本方法制备的钙泊三醇一水合物纳米晶体 的颗粒大小分布的图。
图 2a 是将在 2％泊洛沙姆 188 中钙泊三醇一水合物纳米悬浮液的拉曼光谱与没有 进行纳米化的钙泊三醇一水合物的拉曼光谱比较的图。该图显示 ： 本发明的纳米化方法并 没有导致钙泊三醇一水合物晶形的任何改变。
图 2b 和 2c 是显示通过本方法制备的两批钙泊三醇一水合物纳米晶体的差示扫描 量热法 (DSC) 分析的结果的图。 在 100℃ / 分钟 ( 图 2b) 和在 100℃ / 分钟 ( 实线 )、 300℃ /分钟 ( 虚线 )， 以及 500℃ / 分钟 ( 短划线 )( 图 2c) 进行 DSC。图中稍微更宽的线反映了在 约 8℃发生的放热事件， 认为是由于无定形钙泊三醇的结晶所致。
图 3 是显示与软膏的释放率比较， 钙泊三醇自本纳米悬浮液的释放 软膏的释放率。 “纳率的图。该图显示， 纳米悬浮液制剂的释放率显著地高于米悬浮液乳膏” 是根据实施例 3 的乳膏。 “纳米悬浮液 . 软膏 . 含水” 相当于没有甘油的实 施例 2 的组合物 A， 而 “纳米悬浮液 . 软膏 . 甘油” 是实施例 2 的组合物 A。
图 4a 是显示自两种纳米悬浮液软膏即实施例 2 的组合物 A 和 C 穿透进入皮肤并 流入皮肤的图。 “WSP 软膏” 是组合物 A， 而 “Sonnecone 软膏” 是组合物 C。
图 4b 是显示与软膏比较， 钙泊三醇自本发明纳米悬浮液软膏组合物A、 C 和 D 穿透进入皮肤并流入皮肤的图。该图显示， 自纳米悬浮液软膏进入活力皮肤的穿 透性与
软膏相当， 而流量显著更低， 导致了钙泊三醇的更少全身性暴露。 图 5 是显示与 乳膏。 乳膏比较， 钙泊三醇自本发明纳米悬浮液乳膏穿透进入皮肤并流入皮肤的图。该图显示， 钙泊三醇自纳米悬浮液乳膏进入活力皮肤的穿透性显 著地高于
图 6 是人角质细胞中通过维生素 D3 活化编码抗菌肽 (cathelicidin) 的基因的略 图。抗菌肽基因活化的机制被用于生物学测定中， 所述测定使用重构人表皮 ( 培养的人角 质细胞， 以形成人皮肤的表皮层特征 )， 在该表皮上应用含钙泊三醇的本发明组合物以活化 抗菌肽， 如下文实施例 8 中所详述。
发明详述
定义
在本发明的上下文中， 术语 “纳米晶体” 意指钙泊三醇一水合物的晶体颗粒， 其 呈纳米大小范围， 即直径在 1-1000nm 之间。纳米晶体有利地具有这样的颗粒大小分布 ： ≥ 90％的纳米晶体具有 100-900nm 之间、 特别地 200-600nm 之间的颗粒大小。
术语 “纳米悬浮液” 意指悬浮在水相中的如上所定义的纳米晶体。
术语 “颗粒大小分布” 意指根据厂商说明书 ( 可得自 Malvern Instruments， 英 国 )、 使用 Zetasizer Nano ZS 或 ZS90、 通过动态光散射 ( 也称为光子关联光谱学 ) 测定的 最小和最大钙泊三醇一水合物晶体之间的跨度。 动态光散射通过用激光照射颗粒并分析由 于流体中颗粒的布朗运动产生的散射光中的强度波动来测定悬浮在液体中的固体颗粒的 大小。强度波动与颗粒大小相关， 因为较大的颗粒比较小颗粒移动更慢， 即强度波动更慢。
术语 “无定形” 意指其分子没有有序排列的固体物质， 即晶态的对立面。
“钙泊三醇” 为式
的维生素 D 类似物。
已经发现钙泊三醇以两种晶态形式无水物和一水合物存在。 钙泊三醇一水合物及 其制备公开于 WO 94/15912 中。
术语 “化学稳定性” 或 “化学稳定的” 意指钙泊三醇一水合物纳米晶体在悬浮液中 或者在最终的药物产品中不会随时间显著地降解成 24- 表钙泊三醇或其他钙泊三醇的降 解产物。在后者的情况下， “化学稳定性” 指在产品的贮藏期限期间、 一般为室温下 2 年， 不 超过 10％、 优选地不超过 6％的钙泊三醇一水合物降解。通过将纳米晶体或含纳米晶体的 组合物进行 40℃的加速稳定性研究， 获得室温下化学稳定性的近似值。 如果在 40℃， 3 个月 后降解少于 10％的物质， 那么通常认为相当于室温 2 年的贮藏期限。
术语 “物理稳定性” 或 “物理稳定的” 意指钙泊三醇一水合物纳米晶体具有与还没 有进行纳米化的参照钙泊三醇一水合物基本相同的晶形， 如通过拉曼光谱学所测定， 即其 没有由于纳米化表现出多态性。此外， “物理稳定性” 指在掺入了所述纳米晶体的要求专利 保护的悬浮液或药物组合物中， 纳米晶体没有表现出聚集或晶体生长。
术语 “基本上非水性的” 意指冻干的或喷雾干燥的钙泊三醇一水合物纳米晶体的 自由水 ( 与晶体结合的水相反 ) 的含量按重量计少于纳米晶体的约 2％， 优选地按重量计少 于纳米晶体的约 1％， 例如按重量计少于纳米晶体的约 0.5％。类似地， 在 “基本上无水的” 软膏组合物中自由水的含量按重量计少于组合物的约 3％， 优选地按重量计少于组合物的 约 2％， 例如按重量计少于组合物的约 1％或 0.5％。
术语 “增溶能力” 意指溶剂或溶剂混合物溶解给定物质的能力， 表示为实现物质的 完全溶解所需要的量。
术语 “皮肤穿透” 意指活性成分扩散到皮肤的不同层， 即角质层、 表皮层和真皮层 中。
术语 “皮肤渗透” 意指活性成分经皮肤流入体循环中， 或者在体外研究、 例如那 些在下文实施例 7 中所报道的体外研究的情况下， 活性成分经皮肤流入实验中所使用的
Franz 细胞装置的接受液 (receptor fluid)。
术语 “生物学活性” 意指当在本发明组合物中应用于皮肤时， 维生素 D 衍生物或类 似物的活性。如在下文实施例 8 中所详述， 组合物的生物学活性在体外测定法中测定， 测量 编码生物标志物抗菌肽的靶基因在含有培养的人角质细胞的重构人类表皮中的活化。钙泊三醇一水合物纳米晶体的制备
近年来， 作为提供溶解性差药物的改善溶解速率的方法， 治疗性活性成分的纳米 晶体或纳米悬浮液的制备得到了越来越多的研究。当施用药物时， 纳米晶体的更大表面积 确保了更高的溶解速度。 迄今为止， 该技术主要用于配制口服或者静脉内施用的活性成分。
制备药物纳米晶体的若干方法已经描述于文献中。大体上， 可以将该方法分成两 类， 即研磨和高压均化。
US 5,145,684 公开了在表面改性剂如聚乙烯吡咯烷酮、 聚乙烯醇、 卵磷脂或其他 表面活性剂存在下， 通过球磨 4-5 天制备晶态纳米颗粒的方法。
在这些条件下球磨钙泊三醇一水合物， 或者可能导致钙泊三醇一水合物直接化 学降解， 或者形成大量无定形钙泊三醇， 所述无定形钙泊三醇对于含有其的药物组合物的 足够的储存稳定性 / 贮藏期限是不利的， 因为无定形物质比晶态物质对化学降解相对更敏 感。
CA 2375992 公开了在低于 20 ℃、 优选地低于 0 ℃的温度、 在无水介质中， 在活 塞 - 裂隙 (piston-gap) 均化器中通过高压均化制备颗粒大小为 5μm 以下、 优选地 1μm 以 下的药物颗粒的方法。通过将微粒化的药物颗粒在 1500 巴进行 10-20 个循环的高压均化， 实施纳米化。在本方法中， 我们使用含水介质用于缩减钙泊三醇， 因为使用无水介质 ( 液体 石蜡 ) 没有导致钙泊三醇一水合物晶体的任何尺寸减少。 WO 2004/054549 公开了水中包含甘油单酯的乳膏基质中螺内酯纳米颗粒的局部 制剂。纳米颗粒使用活塞 - 裂隙高压均化制备。
已经发现， 在 1500 巴高压均化几个循环对于缩减钙泊三醇一水合物是不合适的， 因为该方法导致钙泊三醇一水合物晶体的聚集， 甚至是在合适的表面活性剂存在的情况 下。
WO 2008/058755 公开了通过珍珠或球磨研磨、 然后通过高压均化制备美容活性 物质的纳米晶体。两种方法的组合显示出比单独的高压均化更有利， 因为后者需要在高压 (1500 巴 ) 下的许多循环的均化。 组合方法使得可以使用更低压力下的仅一个循环的均化， 来获得纳米化颗粒。
在有利的实施方案中， 本发明涉及用于制备如动态光散射所测定颗粒大小分布为 200-600nm 的钙泊三醇一水合物纳米晶体的方法， 该方法包括步骤
(a) 将包含所述水相重量约 1％至约 5％的非离子、 聚合物表面活性剂的水相中的 晶态钙泊三醇一水合物缩减， 导致微粒的形成， 所述微粒的颗粒大小分布为约 5-20μm， 平 均颗粒大小约 10μm ；
(b) 在约 300-800 巴的压力下， 将步骤 (a) 的所述悬浮液进行第一个循环的高压均 化一段时间， 所述一段时间足以获得约 15-40％的颗粒大小分布为 200-600nm 的钙泊三醇 一水合物的晶体 ；
(c) 在约 800-1200 巴的压力下， 将步骤 (b) 的所述悬浮液进行第二个循环的高压 均化一段时间， 所述一段时间足以获得约 40-80％的颗粒大小分布为 200-600nm 的钙泊三 醇一水合物的晶体 ；
(d) 在约 1200-1700 巴的压力下， 将步骤 (c) 的所述悬浮液进行第三个循环的高压 均化一段时间， 所述一段时间足以获得约 90％或更多的颗粒大小分布为 200-600nm 的钙泊
三醇一水合物的晶体 ； 和
(e) 任选地从水相中分离所得钙泊三醇一水合物的纳米晶体。
在最终的悬浮液 ( 步骤 (d) 后 ) 中， 具有 200-600nm 的颗粒大小分布的钙泊三醇 一水合物晶体的量优选地为约 95％或更多。
本方法不同于在 WO 2008/058755 中所公开的方法， 其将最初的缩减步骤 (a) 与三 个连续的高压均化循环组合， 每一循环都在增加的压力下进行。其不同于 WO 2008/058755 的优选方法， 其中活性成分的球磨之后是低压 ( 例如 100 巴， 参见实施例 8 和 9) 下一个循 环的高压均化， 导致所需颗粒大小减少。 已经发现， 该方法不足以提供满意的钙泊三醇一水 合物颗粒大小和颗粒大小分布， 即仅约 15-40％的晶体在所需的颗粒大小分布内。
此外， 已经发现， 不同于在 WO 2008/058755 中所公开的方法， 其中对于三分之二 的活性成分， 温度必须维持在 20℃以下和理想地在 0℃至 5℃之间， 本发明方法的实施不需 要温度控制。不需要应用温度控制提供了简单化步骤的优点。然而， 令人惊奇地是， 在本发 明方法中并不需要温度控制， 而钙泊三醇对温度增加是敏感的， 并且在无温度控制缩减处 理的情况下， 预计钙泊三醇可能会被化学降解。
本发明的实施方案
本悬浮液可以含有非离子、 聚合物表面活性剂， 其加入是为了以防止钙泊三醇的 纳米晶体聚集和 / 或防止晶体生长。表面活性剂优选地应当是不会引起钙泊三醇一水合物 纳米晶体的任何显著增溶的表面活性剂， 即其应当具有较差的增溶能力， 并且可以有利地 选自泊洛沙姆或聚山梨酯表面活性剂， 以及聚氧乙烯 C6-24 烷基醚。泊洛沙姆可以选自泊洛 沙姆 124、 泊洛沙姆 188、 泊洛沙姆 237、 泊洛沙姆 338 和泊洛沙姆 407。特别地， 已经发现， 泊洛沙姆 188 就增溶钙泊三醇而言具有较差的增溶能力， 因此作为用于本纳米悬浮液的当 前有利的表面活性剂。 当将聚山梨酯用作表面活性剂时， 其可以选自聚山梨酯 20、 聚山梨酯 40、 聚山梨酯 60、 聚山梨酯 61、 聚山梨酯 80 和聚山梨酯 81。当前优选的聚氧乙烯 C6-24 烷基 醚是聚乙二醇 1000 单鲸蜡基醚 (cetomacrogol 1000)。
水相中表面活性剂的量可以为悬浮液重量的约 0.01％至约 5％。一般优选地， 所 述水相中表面活性剂的量为悬浮液重量的约 0.6-1.2％。取决于缩减和高压均化期间所应 用的条件， 在所得悬浮液中存在的钙泊三醇一水合物纳米晶体可以具有如动态光散射所测 定的 200-350nm、 350-400nm 或 400-500nm 的平均颗粒大小。
可以将纳米悬浮液冷冻干燥或者喷雾干燥成在表面上包含表面活性剂的纳米晶 体。然后可以将冷冻干燥或者喷雾干燥的纳米晶体用于掺入到无水组合物中。
已经令人惊奇地发现 ： 本纳米化方法导致了仅非显著量的无定形钙泊三醇的产 生。本领域技术人员熟知， 由于在晶格中缺少分子排列， 无定形化合物的存在使物质不稳 定， 其使物质暴露于化学降解或者使晶体结构重排成不同的多态形式 ( 参见 Chow 等人， J.Pharm.Sci.97(8)， 2008， 第 2855-2877 页 )。如根据厂商说明书使用 Perkin-Elmer DSC 8500 仪器的差示扫描量热法所测定， 不可能检测到仪器检测极限 ( 约 5％ ) 的显著量的无 定形钙泊三醇， 参见图 2b。
在本发明方法中， 将钙泊三醇的晶体首先在水相中使用直径为 1-4mm 如 2-3mm 的 球或珠进行研磨或预研磨。球或珠可以由玻璃或类似的硬物质例如氧化锆组成。研磨可以 合适地在约 500-4000 转 / 分钟、 例如约 1000-3000 转 / 分钟、 例如约 2000 转 / 分钟进行2-5 小时， 例如 3 小时。
用于研磨的表面活性剂可以合适地为非离子、 聚合物表面活性剂， 其以悬浮液重 量的约 1.5 至约 3％， 特别地以悬浮液重量的约 2％的量加入到水相中。表面活性剂优选地 选自如上所述的泊洛沙姆或聚山梨酯表面活性剂。随后将悬浮液直接用于高压均化步骤， 使用泊洛沙姆 188 已获得对于高压均化后颗粒大小分布而言特别有利的结果。应当注意， 因为在本生产方法中用水洗涤步骤 (a) 中所使用的研磨设备， 且在步骤 (d) 后用水洗涤高 压均化设备， 所以在最终悬浮液中表面活性剂的浓度为悬浮液重量的约 0.6-1.2％。
根据厂商说明、 使用活塞裂隙 (piston gap) 均化器、 例如 EmulsiflexC3( 可从 Avestin 获得 ) 进行高压均化步骤 (b)-(d)。
对于钙泊三醇一水合物的纳米化， 已经发现， 在约 500-650 巴的压力下进行步骤 (b) 的第一个循环高压均化是有利的。获得 15-40％具有所需颗粒大小分布的钙泊三醇一 水合物纳米晶体需要的时间为 7-15 分钟， 例如 8-12 分钟， 例如约 10 分钟。
步骤 (c) 的第二个循环的高压均化可以合适地在约 1000-1100 巴的压力下进行。 获得 40-80％具有所需颗粒大小分布的钙泊三醇一水合物纳米晶体所需要的时间为 7-15 分钟， 例如 8-12 分钟， 例如约 10 分钟。 步骤 (d) 的第三个循环的高压均化可以合适地在约 1400-1500 巴的压力下进行。 获得 90％或更多的具有所需颗粒大小分布的钙泊三醇一水合物纳米晶体所需要的时间为 7-15 分钟， 例如 8-12 分钟， 例如约 10 分钟。
如果意图将钙泊三醇一水合物纳米晶体包含在无水制剂中， 可以合适地将它们进 行冷冻干燥或者喷雾干燥 ( 至水含量 ( 自由水 ) 为按纳米晶体重量计小于约 2％， 例如小于 约 1％或者小于约 0.5％ )。
可以将钙泊三醇一水合物纳米晶体或者包含纳米晶体的悬浮液包含在药物组合 物中， 所述药物组合物包含与活性成分兼容的可药用载体。
当与可药用赋形剂混合来提供如下所述的组合物时， 非离子聚合物表面活性剂的 量优选地为按组合物重量计约 0.03-0.06％。
在一个实施方案中， 本组合物是软膏。根据当前的 FDA 分类， 软膏是半固体剂型， 其中可以含有按重量计多达 20％的水和挥发性物质， 并且其在载体中含有按重量计超过 50％的碳氢化合物、 蜡或多元醇。 因此， 根据本发明， 软膏可以是油包水组合物， 在这种情况 下， 可以将纳米悬浮液就此加入到组合物的亲脂性组分中， 以使组合物含有按重量计多达 10％、 优选按重量计多达 5％的水相。 备选地， 组合物可以是无水软膏， 其含有按组合物的重 量计小于约 2％、 优选地小于 1％的自由水。
软膏载体可以适宜地含有石蜡， 选自由链长为 C5-60 的碳氢化合物组成的石蜡及其 混合物。通常使用的软膏载体是矿脂或白软石蜡， 其由不同链长 ( 最大值为约 C40-44) 的碳 氢化合物组成， 或者矿脂和液体石蜡 ( 由最大值为 C28-40 的不同链长的碳氢化合物组成 ) 的 混合物。 尽管矿脂提供了受处理皮肤表面的封闭、 降低了水经皮肤的损失， 并且加强了组合 物中活性成分的治疗作用， 但是在应用后， 其倾向于在相当一段时间持续具有油腻和 / 或 发粘的感觉， 并且其并不容易涂抹。因此， 优选地是应用由稍微更低链长的碳氢化合物组 成的石蜡， 例如由具有最大值为 C14-16、 C18-22、 C20-22、 C20-26 的链长的碳氢化合物或其混合物组 成的石蜡。已经发现， 此类石蜡是更加美容可接受的， 因为它们在应用时较不发粘和 / 或
油腻， 并且更容易涂抹。因此， 期望它们产生改善的患者顺应性。该类型的合适的石蜡由 Sonneborn 生产并以商标名 Sonnecone、 例如 Sonnecone CM、 Sonnecone DM1、 Sonnecone DM2 和 Sonnecone HV 销售。 这些石蜡进一步公开和表征在 WO 2008/141078 中， 所述专利申 请在本文中引用作为参考。( 已经通过气相层析测定了石蜡的碳氢化合物组成 )。
为了将所需粘度赋予本发明组合物， 其可以合适地包含亲脂性粘度增加成分， 例 如蜡。蜡可以是矿物蜡， 其由高分子量碳氢化合物、 例如饱和 C35-70 链烷的混合物组成， 如微 晶蜡。备选地， 蜡可以是植物或动物蜡， 例如 C14-32 脂肪酸和 C14-32 脂肪醇的酯如蜂蜡。粘度 增加成分的量可以根据成分的增粘力变化， 但可以一般地按重量计为组合物的约 1-20％。 当粘度增加成分是微晶蜡时， 其一般地以按重量计为组合物的约 5-15％、 例如约 10％的量 存在。
为了维持组合物的良好物理稳定性， 特别地为了避免其中水相和脂质相的分离， 可以有利地包含 HLB 值为 3-8 的油包水乳化剂。此类乳化剂的实例是聚氧乙烯 C8-22 烷基 醚， 例如聚氧乙烯硬脂酰醚、 聚氧乙烯鲸蜡基醚、 聚氧乙烯油基醚或聚氧乙烯月桂基醚。乳 化剂的量一般为组合物的 2-10％ w/w。
组合物可以额外地包含软化剂， 其可以软化银屑病斑块增厚的表皮。包含在本组 合物中的合适的软化剂可以是硅蜡 (silicone Wax) 或挥发性硅油， 因为已经另外发现， 硅 酮的存在可以帮助钙泊三醇穿透进入皮肤。还发现， 包含硅酮的组合物可以导致更少的皮 肤刺激。包含在本组合物中的合适的硅油可以选自环二甲基硅酮 (cyclomethicone)、 聚二 甲基硅氧烷 (dimethicone)。包含在本组合物中的硅油的量一般为按重量计组合物的约 1％至约 10％、 例如约 5％。
在软膏中， 认为丙二醇是许多患者经历的皮肤刺激的主要因素。然而， 已经发现， 钙泊三醇本身可能在一些患者中是轻微刺激性的 (A.Fullerton 和 J.Serup， Br.J.Dermatol.137， 1997，第 234-240 页 和 A.Fullerton 等 人， Br.J.Dermatol. 138， 1998， 第 259-265 页 )。因此， 有利地是在本组合物中包含抗刺激性化合物， 例如甘油、 山梨 醇、 蔗糖、 糖精、 薄荷醇、 桉树脑 (eucalyptol) 或烟酰胺。已经将甘油描述为能保护皮肤免 于刺激性物质的物质 (J.Bettinger 等人， Dermatology 197， 1998， 第 18-24 页 )， 并且我们 已发现其以剂量依赖方式降低 IL-1α 的释放 ： 因此， 已经发现 ： 在钙泊三醇软膏中存在按 重量计 15％的甘油导致比包含按重量计 10％的甘油显著更低水平的 IL-1α 释放， 进而， 包 含按重量计 10％的甘油导致比包含按重量计 5％的甘油显著更低水平的 IL-1α 释放。 然而， 除抗刺激性作用外， 已经令人惊奇的发现， 甘油能加强钙泊三醇的生物学活 性， 因为已经发现， 组合物中较低量的甘油增加了抗菌肽的表达 ( 在下文实施例 4 中所述的 测定中 )( 即当按重量甘油的量为 5％时比当甘油的量分别为 10％或 15％时表达更多的抗 菌肽 ) ： 其暗示， 对于甘油的包含， 必须在有利的抗刺激性作用和有利的增效作用之间寻找 平衡。我们已经发现， 在本组合物中包含按重量计约 5-10％的甘油产生了显著的抗刺激性 作用， 并显著地增强了钙泊三醇的生物学活性。
已知钙泊三醇是对酸性条件 ( 在含水组合物中低于约 7.0 的 pH 或者在无水组合 物中的酸性反应物质 ) 极其敏感的物质， 所述酸性条件有助于钙泊三醇的快速降解。为了 确保在组合物的贮藏期限期间物质的足够化学稳定性， 明智的是包含能中和酸性杂质的化 合物， 所述酸性杂质可能存在于组合物的一种或多种赋形剂中， 并且对钙泊三醇的化学稳
定性是不利的。 如果组合物是含水的， 那么酸中和化合物可以选自缓冲液如磷酸盐缓冲液， 其可以以按重量计组合物的 0.025-0.065％的量包含。另一方面， 如果组合物是无水的， 那 么酸中和化合物可以有利地为胺类， 例如三乙醇胺、 三羟甲基氨基甲烷 (trometamol)、 单乙 醇胺或二乙醇胺， 其以按重量计组合物的 0.1-2％的量包含于组合物中。
在另一实施方案中， 本组合物是乳膏， 其可以包含与软膏类似的组分， 但其一般为 含有大量水的水包油乳液。
在特定的实施方案中， 本组合物包含
0.003-0.008％ w/w 的钙泊三醇一水合物
2-8％ w/w 的聚氧乙烯硬脂醚
2-10％ w/w 的水
0.001-0.005％ w/w 的泊洛沙姆 188
70-90％ w/w 的石蜡载体
本组合物还可以包含在皮肤制剂中通常使用的其他组分， 例如抗氧化剂 ( 例如 α- 生育酚 )、 防腐剂、 乙二胺四乙酸钠、 色素、 皮肤止痛剂、 皮肤愈合剂和皮肤调节剂， 例如 脲、 尿囊素或红没药醇， 参见 CTFA Cosmetic Ingredients Handbook， 第二版， 1992 年。 通过将有效量的本发明的组合物局部施用给需要该治疗的患者， 可以将本发明 的组合物用于治疗银屑病、 脂溢性银屑病 (sebopsoriasis)、 掌跖脓疱病、 皮炎、 鱼鳞癣、 酒 渣鼻或痤疮以及相关的皮肤疾病。所述方法优选包括每日一次或两次局部施用治疗有效 剂量的所述组合物。为此， 根据本发明的组合物优选地含有约 0.001-0.5mg/g、 优选地约 0.002-0.25mg/g、 特别地 0.005-0.05mg/g 的钙泊三醇一水合物纳米晶体。考虑本组合物可 有利地用于这些皮肤疾病的维持治疗， 即在可见症状消失后继续治疗以推迟症状的复发。
为了提供急性期银屑病和其他皮肤病症的更有效治疗， 可以有利地在组合物中包 含一种或多种其他治疗活性成分。 此类其他活性成分的实例包括但不限于抗炎症药物例如 皮质类固醇， 如倍他米松及其酯类如戊酸酯或二丙酸酯、 氯倍他索或其酯类如丙酸酯、 氢化 可的松或其酯如乙酸酯 ； 非甾类抗炎症药物， 例如萘普生、 吲哚美辛、 双氯芬酸、 布洛芬、 右 布洛芬、 酮基布洛芬、 氟比洛芬、 吡罗昔康、 氯诺昔康或萘丁美酮、 磷酸二酯酶 4 抑制剂 ( 例 如 WO 2008/077404、 WO 2008/104175、 WO 2008/128538 或 WO2010/069322 中公开的化合物 ) 或 p38MAP 激酶抑制剂 ( 例如 WO2005/009940 或 WO 2006/063585 中公开的化合物 )。
本发明进一步通过以下实施例进行说明， 所述实施例并不意图以任何方式限制要 求专利保护的本发明的范围。
实施例 实施例 1
钙泊三醇一水合物纳米晶体的制备
将 4g 泊洛沙姆 188 溶解在 196ml 实验室水中， 同时搅拌， 并加入合适量的 NaOH 将 pH 调整至 8.5。
将 3.5g 2mm 玻璃球称重到配备螺帽的小瓶中。将 0.035g 钙泊三醇一水合物加入 到每一小瓶中， 然后将 1.05g 2％泊洛沙姆 188 溶液加入到每一小瓶中。在定轨振荡器上 2000 转 / 分钟振荡， 来研磨钙泊三醇一水合物。
研磨后， 用 24.0g 实验室水 pH8.5 洗涤用于研磨的小瓶和玻璃球， 并将钙泊三醇一 水合物悬浮液倒入蓝盖瓶中。将悬浮液转移到 EmulsiflexC3(Avestin) 高压均化器中， 将 蓝盖瓶用 4.9g 实验室水 pH8.5 洗涤。在 500 巴进行高压均化 10 分钟， 在 1000 巴进行 10 分 钟和 1400 巴进行 10 分钟。高压均化后， 用 4.9g 实验室水 pH8.5 洗涤 Emulsiflex 装置的 圆筒， 然后使用 Zetasizer Nano ZS90、 通过动态光散射测定颗粒大小分布， 为 200-600nm， 平均颗粒大小为 350-400nm。
通过拉曼光谱学， 将纳米晶体的拉曼光谱与没有进行纳米化的钙泊三醇一水合物 的拉曼光谱比较， 确定得到的纳米晶体为钙泊三醇一水合物。
在氮气氛下、 以 100℃、 300℃和 500℃ / 分钟的加热速率、 使用 DSC 分析， 对通过本 发明方法制备的两批钙泊三醇纳米晶体测定了该方法中产生的无定形钙泊三醇的量。 用于 分析的仪器为 Perkin Elmer DSC 8500。
结果显示于图 2b 和 2c， 其显示了在约 8℃起始的放热事件。认为该放热事件极有 可能是由于无定形钙泊三醇的结晶。其显示结晶过程期间散发的热量非常小， 事实上非常 接近于检测限。因为结晶过程中散发的热量与样品中存在的无定形化合物的量成比例， 我 们做出结论 ： 在两批中仅存在微少量的无定形钙泊三醇。
实施例 2
含钙泊三醇一水合物纳米晶体的软膏
下表 1 中所示组成的软膏如下制备 ： 在加热至 80-85℃并缓慢搅拌下混合脂质相 的成分 ( 碳氢化合物 + 聚氧乙烯 -2- 硬脂醚 +α- 生育酚 )。将乙二胺四乙酸二钠和磷酸 氢二钠二水合物溶解于合适量的调整至含 50μg/g 钙泊三醇一水合物的含水钙泊三醇一 水合物纳米悬浮液 ( 如实施例 1 所述制备 ) 来制备水相。在搅拌并加热至 35-40℃的情况 下， 将甘油加入到悬浮液中， 并根据需要将混合物的 pH 用 1N HCl 或 NaOH 调整至 8.5。
将水相加入到脂质相中搅拌 30 分钟。之后， 将得到的软膏缓慢冷却至 32℃以下， 并装入铝管中和储存于室温。
表1
在 40℃ /75％相对湿度测试组合物的化学稳定性达 3 个月。结果显示 ： 在测试条 件下， 钙泊三醇具有令人满意的稳定性。
实施例 3
含钙泊三醇一水合物纳米晶体的乳膏
通过在 80℃熔化聚乙二醇 1000 单鲸蜡基醚、 十六醇十八醇混合物、 液体石蜡和白 软石蜡制备下表 2 中显示组成的乳膏。 通过在 80℃将磷酸氢二钠二水合物和氯化氯丙烯基 六甲撑三铵 (chloroallylhexaminium chloride) 溶解于纯化水中来制备水相。在搅拌下 将甘油加入到溶液中， 并根据需要， 将混合物的 pH 用 1N HCl 或 NaOH 调整至 8.5。
在均化下将水相与脂质相混合， 并冷却至 55℃。 在强烈搅拌下加入剩余的水， 并在 低速搅拌下将所得乳膏冷却至 25℃。
在＜ 30℃， 将合适量的调整至含有 50μg/g 钙泊三醇一水合物的钙泊三醇一水合 物纳米悬浮液 ( 如在实施例 1 所述制备 ) 加入到乳膏中搅拌 30 分钟。将得到的乳膏装入 管中并储存待用。
表2
15CN 102770125 A
成分 (mg/g)说明书组合物 H 0.05 30 60 0.5 30 2 0.03 50 170 加至 1g 组合物 I 0.05 30 60 0.5 30 2 0.03 50 170 加至 1g12/15 页组合物 G 0.05 30 60 0.5 30 2 0.03 50 170 加至 1g钙泊三醇一水合物纳米晶体 聚乙二醇 1000 单鲸蜡基醚 十六醇十八醇混合物 氯化氯丙烯基六甲撑三铵 甘油 磷酸氢二钠二水合物 泊洛沙姆 188 泊洛沙姆 407 聚山梨酯 80 液体石蜡 白软石蜡 纯化水
在 40℃ /75％相对湿度测试乳膏组合物的化学稳定性达 3 个月。结果显示 ： 在测 试条件下， 钙泊三醇具有令人满意的稳定性。
实施例 4
含钙泊三醇一水合物纳米晶体的非水性软膏
将如实施例 1 所述制备的钙泊三醇一水合物纳米悬浮液冷冻干燥过夜。通过将纳 米晶体分散在液体石蜡中并将白软石蜡加入到分散物中， 将冷冻干燥的、 基本上无水的纳 米晶体用于制备软膏。
非水性软膏的组成显示于下表 3 中。
表3
成分 钙泊三醇一水合物纳米晶体 液体石蜡 白软石蜡 含量 50μg 50mg 750mg16CN 102770125 A说泊洛沙姆 188明书0.05mg13/15 页在 40℃ /75％相对湿度测试非水性软膏的稳定性达 3 个月。结果显示 ： 在测试条 件下， 钙泊三醇具有令人满意的稳定性。
实施例 6
与软膏相比较的纳米悬浮液组合物的释放在 Plexiglass 的扩散池中、 使用 Spectra/Porv 6 膜分隔接受室和供体室 (n ＝每 批 6 池 )， 测定实施例 1 和 2 中所述的组合物中钙泊三醇的体外释放。测定了钙泊三醇向接 受相的释放， 所述接受相由 0.04M 等渗磷酸盐缓冲液 pH7.4 和异丙醇 (70 ∶ 30v/v) 组成。 通过 HPLC/UV 分析样品。
结果显示于下图 3 中， 其显示 ： 钙泊三醇从本纳米悬浮液软膏和乳膏中释放的速 率显著高于从
软膏中释放的速率。结 果 显 示 于 图 3 中， 其显示 ： 从纳米悬浮液制剂中释放的速率显著高于从 软膏中释放的速率。实施例 7
体外皮肤穿透研究
为了研究来自本发明组合物的钙泊三醇的皮肤穿透性和渗透性， 进行了皮肤扩散 实验。在研究中使用来自猪耳的全层皮肤。使用前， 将耳朵保持冷冻于 -18℃。在实验前一 天， 将耳朵置于冰箱 (5±3℃ ) 中缓慢解冻。在实验当天， 使用兽医毛发修边机去除毛发。 用解剖刀清扫皮肤的皮下脂肪， 从每一耳朵中切割两段皮肤， 并且以平衡规则固定在 Franz 扩散池中。
基 本 上 以 T.J.Franz， “The finite dose technique as a valid in vitro model for the study of percutaneous absorption in man” ， Current Problems in Dermatology， 1978， J.W.H.Mall( 编辑 )， Karger， Basel， 第 58-68 页所述的方式使用 Static 2 Franz 型扩散池， 其具有 3.14cm 可用扩散面积和 8.6-11.1ml 接受体积。测量并记录每一 池的比容。在每一池的接受室中放置磁棒。固定皮肤后， 用生理盐水 (35℃ ) 填充每一接受 室， 用于皮肤的水合。将小池放置于热控制水浴中， 所述水浴放置在设定为 400 转 / 分钟的 磁力搅拌器上。将水浴中的循环水保持在 35±1℃， 使皮肤表面的温度为约 32℃。1 小时 后， 用接受培养基 ( 含 4％牛血清白蛋白的 0.04M 等渗磷酸盐缓冲液 pH 7.4(35℃ )) 替换 盐水。在研究期间所有时间都维持漏槽条件 (Sink condition)， 即接受培养基中活性化合 物的浓度低于培养基中化合物溶解度的 10％。
一式六份测试每一测试组合物的体外皮肤渗透性 ( 即 n ＝ 6)。在 0 小时， 以预定 2 剂量 4mg/cm 将每一测试化合物应用于皮肤膜。将玻璃刮刀用于该应用， 并测定组合物的 残余量， 以得出实际应用于皮肤的组合物的量。
皮肤穿透实验允许进行 21 小时。然后从以下区室中收集样品 ：
使用胶带 ( 直径 22mm， CuDerm Corp.， Dallas， Texas， 美国 )， 通过胶带剥离 10 次， 收集角质层。使用标准压力， 将每一胶带剥离应用于测试面积 5 秒， 并以一 种轻微的连续推动将其从测试区域移开。 对于每一次重复的剥离， 撕扯的方向是变化的。 然后以类似的方式从皮肤中取样活表皮和真皮。
收集并分析在扩散池中残留的接受液样品 (1ml)。
通过 LC 质谱仪测定样品中钙泊三醇的浓度。
图 4a 的结果显示了使用两种不同的石蜡载体， 组合物 A 和 C 对活力皮肤的穿透 性， 图 4b 显示 ： 从纳米悬浮液软膏向活力皮肤的穿透性与 软膏的穿透性相当， 但流量 (flux) 显著更低， 导致更少的对钙泊三醇的全身性暴露。
图 5 显示进一步的结果， 该图显示 ： 来自纳米悬浮液乳膏的组合物 G 的钙泊三醇对 活力皮肤的穿透性比
乳膏的穿透性显著更高。实施例 8
组合物的生物学活性
如下图 6 所示， 抗菌肽是在人角质细胞中表达的抗微生物肽。在感染的皮肤或者 破坏的皮肤屏障上， 抗菌肽的表达被强烈诱导。 在银屑病中， 抗菌肽的水平在银屑病患者的 病变皮肤中是增加的。已经发现， 维生素 D3 或维生素 D 类似物如钙泊三醇通过与维生素 D 受体结合， 可诱导编码抗菌肽的基因的表达 ( 参见 TT Wang 等人， J.Immunol.173(5)， 2004， 第 2909-2912 页 ； J Schauber 等人， Immunology 118(4)， 2006， 第 509-519 页 ； Schauber 和 Gallo， J.Allergy Clin Immunol 122， 2008， 第 261-266 页 ； M.Peric 等人， PloS One4(7)， 2009 年 7 月 22 日， e6340)。已经将该发现应用于开发一种测定法， 其中通过测量编码抗茵 肽的基因的诱导水平， 已经确定了来自测试组合物的钙泊三醇在人角质细胞中的摄取和生 物学活性。
在该测定法中， 将如上文实施例 3 所述制备的钙泊三醇一水合物纳米晶体乳膏 ( 组合物 G) 以 10μl 的量一式三份局部应用于重构人表皮， 所述重构人表皮由在 0.5em2 聚 碳酸酯滤器 ( 可得自 Laboratories， Nice， 法国 ) 上培养 12 天的正常人角质 细胞组成。在细胞因子 IL-17A(20ng/ml)、 IL-22(20ng/ml) 和 TNF-α(5ng/ml) 存在下处理 该组织 1 或 2 天， 然后从聚碳酸酯滤器中分离表皮， 并速冻在液氮中。通过常规方法从细胞 中提取 RNA 并合成 cDNA。然后使用以下来自 Applied Biosystems 的试验 CAMPHs0018038_ m1 和 GAPDH Hs99999905_m1 进行实时定量 PCR(qPCR)。将抗菌肽的表达水平经 GAPDH 归一 化， 并通过与
软膏和乳膏比较， 进行相对定量。结果显示于下表 4 中。 表4
1在第 1 天， 相对于乳膏的活化倍数 软膏获得的类似的靶表 4 的结果显示 ： 组合物 G 的应用产生了与用18CN 102770125 A说明书乳膏的大约两倍。15/15 页基因的活化， 而该靶基因的活化为
因此， 该结果表明 ： 用不含丙二醇且具有更多有利美容性能的制剂获得的效力， 与 软膏获得的效力一样好。 将如上文实施例 2 所述制备的组合物 A、 C 和 D 以 10μl 的量一式三份局部应用用
于重构的人表皮上， 所述重构的人表皮由在 0.5cm2 聚碳酸酯滤器 ( 可得自 Laboratories， Nice， 法 国 ) 上 培 养 12 天 的 正 常 人 角 质 细 胞 组 成。 处 理 该 组 织 1 或 2 天， 然后从聚碳酸酯滤器中分离表皮， 并速冻在液氮中。通过常规方法从细胞中提取 RNA 并 合 成 cDNA。 然 后 使 用 以 下 来 自 Applied Biosystems 的 试 验 CAMP Hs0018038_ m1 和 GAPDHHs99999905_m1 进行 qPCR。将抗菌肽的表达水平经 GAPDH 归一化， 并通过与 软膏比较， 进行相对定量。
结果显示于下表 5 中。 表5
1相对于软膏表 5 的结果显示 ： 本发明组合物产生了更高的靶基因活化， 即它们比市售的软膏 具有更高的生物学活性。
实施例 5
在小型猪中的局部耐受研究
通过皮肤应用， 每日施用给小型猪 4 周， 评估实施例 2 的组合物 A、 C 和 D 的局部耐 受性。将
软膏用于比较。动物每天暴露于测试物品 8 小时。 SPF 小型猪中进行该研究。 每只动物具有 6 个应用位点，在 10 只雌性每一应用位点接受 250mg 量的测试制剂。在给药开始之前以及在尸体剖检当天， 每天记录 临床指征， 并有关红斑和水肿每天一次评分应用位点的皮肤反应。 每天记录食物消耗， 并每 周记录体重。在处理期的最后， 对全部动物进行总尸体剖检， 并收集皮肤样品， 用于组织病 理学检查。
结果显示 ： 在研究期间没有观察到不良治疗相关临床指征， 但是观察到 1-2 级的 软膏所观察到的明显。结果显示 ： 软膏可以在人类患者中更好耐受。皮肤反应 ( 红斑 )。除组合物 A 外， 红斑不如 本发明组合物比