一种抗肿瘤纳米复合粒子及其制备方法和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610009317.0 (22)申请日 2016.01.07 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105435226 A (43)申请公布日 2016.03.30 (73)专利权人 中国人民解放军第二军医大学 地址 200433 上海市杨浦区翔殷路800号 (72)发明人 阴雷 李晓琳 王林辉 张亚非 杨志 胡南滔 (74)专利代理机构 上海伯瑞杰知识产权代理有 限公司 31227 代理人 曹莉 (51)Int.Cl. A61K 41/00(2006.01) A。

2、61K 47/02(2006.01) A61K 31/337(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (56)对比文件 CN 104436210 A,2015.03.25, Xiaoying Yang et alHigh-Efficiency Loading and Controlled Release of Doxorubicin Hydrochloride on Graphene Oxide. J. Phys. Chem. C .2008,第112卷 L. R. Hirsch et alNanoshell- mediated near-infrared thermal t。

3、herapy of tumors under magnetic resonance guidance. PNAS .2003,第100卷(第23期), 审查员 张丽芳 (54)发明名称 一种抗肿瘤纳米复合粒子及其制备方法和 应用 (57)摘要 本发明属于纳米复合材料领域， 特别涉及一 种抗肿瘤纳米复合粒子及其制备方法和应用， 所 述复合粒子以二氧化硅纳米粒子为核， 核的粒径 为200-650nm， 在核的表面包覆有金纳米粒子和 石墨烯的混合壳层， 壳的厚度为40-80nm。 所述抗 肿瘤纳米复合粒子的分散性好， 可搭载抗肿瘤药 物， 且载药量大。 所述抗肿瘤纳米复合粒子生物 相容性高、 副作用。

4、小， 且具有良好的光热作用， 在 780nm的激光作用下， 对于肿瘤细胞的杀伤力显 著， 可用于光热治疗。 本发明的制备工艺简单、 反 应温和、 绿色环保。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 105435226 B 2018.08.17 CN 105435226 B 1.一种抗肿瘤纳米复合粒子， 其特征在于： 所述复合粒子以二氧化硅纳米粒子为核， 核 的粒径为200-650nm， 在核的表面包覆有金纳米粒子和石墨烯的混合壳层， 壳的厚度为40- 80nm； 该抗肿瘤纳米复合粒子的制备方法， 其步骤包括： (1)在甲醇和正丁醇的混合溶液中依次滴入正硅酸乙酯和氨水， 反应1-3小时后离心。

5、处 理， 将样品分散在无水乙醇中， 形成二氧化硅乙醇溶液； (2)在步骤(1)中的二氧化硅乙醇溶液中加入3-氨基丙基三甲氧基硅烷， 95回流反应 1-3小时后离心处理， 样品分散在无水乙醇中， 形成氨基化二氧化硅乙醇溶液； (3)氮气氛围中， 在碱性水溶液中加入四羟甲基氯化磷溶液， 搅拌4-7分钟， 加入氯金酸 溶液， 水浴20-28， 搅拌8-12小时， 形成金种溶液， 0-4密封保存； (4)向步骤(3)中的金种溶液中加入步骤(2)的氨基化二氧化硅乙醇溶液， 超声处理3-6 分钟， 20-28水浴静置1-3小时后， 离心处理， 并将沉淀分散在超纯水中形成Au-APTMS- SiO2水溶液；。

6、 (5)在18-26的搅拌条件下， 将碳酸钾和氯金酸的混合溶液中滴加步骤(4)中的Au- APTMS-SiO2溶液， 搅拌3-6分钟后加入甲醛， 继续搅拌9-11分钟后进行离心处理， 并将离心 的固体分散在超纯水中， 得到SiO2Au核壳纳米粒子的水溶液； 所述碳酸钾和氯金酸的体积比为60： 70-1， 氯金酸与Au-APTMS-SiO2溶液的加入量比为1 10-3-310-3mmol： 5mL； (6)在18-26条件下， 向SiO2Au水溶液中， 加入聚乙二醇修饰剂溶液， 搅拌20-40s后， 将反应液在0-4条件下静置8-12小时； (7)超声条件下， 向步骤(6)的反应液中加入氧化石墨。

7、烯溶液， 18-26条件下搅拌8-12 小时， 离心即可； 所述反应液和氧化石墨烯的加入量体积比为80-120 L： 1 g。 2.根据权利要求1所述的抗肿瘤纳米复合粒子， 其特征在于： 所述步骤(1)中， 甲醇、 正 丁醇、 正硅酸乙酯和氨水的体积比为1:3:0.01-0.08:0.1-0.5， 所述正硅酸乙酯与无水乙醇 的体积比为1:50-200。 3.根据权利要求1所述的抗肿瘤纳米复合粒子， 其特征在于： 所述步骤(2)中， 二氧化硅 乙醇溶液与3-氨基丙基三甲氧基硅烷的体积比为450-550:1。 4.根据权利要求1所述的抗肿瘤纳米复合粒子， 其特征在于： 所述步骤(3)中， 四羟甲基。

8、 氯化磷与氯金酸的摩尔比为1:30-40， 四羟甲基氯化磷的浓度为1.2mmol/L， 氯金酸的浓度 为25mmol/L。 5.根据权利要求1所述的抗肿瘤纳米复合粒子， 其特征在于： 所述步骤(4)中， 金种溶液 和氨基化二氧化硅乙醇溶液体积比为5:1-3。 6.根据权利要求1所述的抗肿瘤纳米复合粒子， 其特征在于： 所述步骤(6)中， SiO2Au水 溶液与聚乙二醇修饰剂的加入量配比为1mL： 510-7-510-9mol。 7.权利要求1所述的抗肿瘤纳米复合粒子在制备治疗抗肿瘤药物载体中的应用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105435226 B 2 一种抗肿瘤纳米复合粒子及。

9、其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属于纳米复合材料领域， 特别涉及一种抗肿瘤纳米复合粒子及其制备方法 和应用。 背景技术 0002 纳米技术的出现和迅速发展为肿瘤的治疗提供了新的研究方向， 尤其是多功能纳 米粒子， 被认为在肿瘤治疗方面具有极大的发展潜力。 利用纳米粒子可以实现载药、 靶向、 光热等多种模式相结合的肿瘤治疗方案。 目前， 研发一种生物相容性好、 光热转换效率高、 载药量大以及药物缓释可控的抗肿瘤纳米粒子是该研究领域的重点发展方向。 0003 光热治疗是一种新的肿瘤治疗方法。 其基本原理是将光热诱导剂纳米粒子富集在 肿瘤部位， 利用近红外激光照射(7001000nm)，。

10、 纳米粒子可以吸收光能， 利用光热转换效 应升高局部温度。 由于肿瘤细胞对温度较正常细胞敏感， 易被选择性杀伤而不影响正常细 胞功能。 因此， 与传统肿瘤化疗方法相比， 光热疗法具有高选择性、 微创性、 副作用小等优 点。 金纳米粒子由于细胞毒性低、 稳定性好、 光热转换效率高等优点， 适合作为诱导剂用于 肿瘤的光热治疗备受关注。 0004 由于抗肿瘤药物本身的毒副作用严重限制了化疗药物的使用剂量和次数。 为了提 高肿瘤的治疗效率， 利用纳米粒子载体靶向输送化疗药物， 可有效增加肿瘤组织局部药物 浓度， 提高药物的利用率和疗效。 其中靶向作用可以分为主动靶向和被动靶向。 主动靶向是 指载药纳米。

11、粒子表面连接有特异探针可以识别肿瘤细胞， 而被动靶向是利用肿瘤血管内皮 细胞间隙(100-780nm)与正常组织细胞间隙(5-10nm)的差别， 通过控制载药纳米粒子的粒 径大小实现被动靶向。 氧化石墨烯具有比表面积大， 细胞毒性低， 较好的水溶性及低生产成 本等优点， 使其成为生物相容性良好的载药纳米材料而应用于生物医学领域。 0005 因此， 本领域迫切需要一种在生物环境下分散性好、 生物相容性高、 副作用小的多 功能抗肿瘤光热载药纳米粒子。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种抗肿瘤纳米复合粒子， 该纳米粒子具有光热、 载药功能， 可搭载抗癌药物， 且载药量大。 0007 本发明的。

12、另一个目的是提供上述抗肿瘤纳米复合粒子的制备方法。 0008 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现： 0009 一种抗肿瘤纳米复合粒子， 其特征在于： 所述复合粒子以二氧化硅纳米粒子为核， 核的粒径为200-650nm， 在核的表面包覆有金纳米粒子和石墨烯的混合壳层， 壳的厚度为 40-80nm。 优选的， 所述核的粒径为200-250nm。 0010 上述抗肿瘤纳米复合粒子的制备方法， 其步骤包括： 0011 (1)在甲醇和正丁醇的混合溶液中依次滴入正硅酸乙酯和氨水， 反应1-3 小时后 离心处理， 将样品分散在无水乙醇中， 形成二氧化硅乙醇溶液； 说 明 书 1/4 页 3 CN 105。

13、435226 B 3 0012 (2)在步骤(1)中的二氧化硅乙醇溶液中加入3-氨基丙基三甲氧基硅烷， 95回 流反应1-3小时后离心处理， 样品分散在无水乙醇中， 形成氨基化二氧化硅乙醇溶液； 0013 (3)氮气氛围中， 在碱性水溶液中加入四羟甲基氯化磷溶液， 搅拌4-7 分钟， 加入 氯金酸溶液， 水浴20-28， 搅拌8-12小时， 形成金种溶液， 0-4密封保存； 0014 优选的， 在高纯水中加入NaOH， 搅拌， 形成碱性水溶液， 再加入四羟甲基氯化磷溶 液， 搅拌5分钟， 加入氯金酸溶液， 水浴25， 搅拌8-12小时， 形成金种溶液， 4密封保存。 优 选的， 高纯水和NaO。

14、H的加入量配比为150mL： 1mmol。 0015 (4)向步骤(3)中的金种溶液中加入步骤(2)的氨基化二氧化硅乙醇溶液， 超声处 理3-6分钟， 20-28水浴静置1-3小时， 离心沉淀， 并将固体分散在超纯水中形成Au-APTMS- SiO2溶液； 0016 (5)将18-26的搅拌条件下， 在碳酸钾和氯金酸的混合溶液中滴加步骤 (4)中的 Au-APTMS-SiO2溶液， 搅拌3-6分钟后加入甲醛， 继续搅拌9-11 分钟后进行离心处理， 并将 离心的固体分散在超纯水中， 得到SiO2Au水溶液； 0017 (6)在18-26条件下， 向SiO2Au水溶液中， 加入聚乙二醇修饰剂溶液。

15、， 搅拌20- 40s后， 将反应液在0-4条件下静置8-12小时； 0018 (7)超声条件下， 向步骤(6)的反应液中加入氧化石墨烯溶液， 18-26条件下搅拌 8-12小时， 离心， 分散在超纯水中， 形成SiO2AuGO分散液。 0019 所述步骤(1)中， 甲醇、 正丁醇、 正硅酸乙酯和氨水的体积比为 1:3:0.01-0.08: 0.1-0.5。 优选的， 所述甲醇、 正丁醇、 正硅酸乙酯和氨水的体积比为1:3:0.05:0.2。 合适的 加入量配比， 对于制备出的二氧化硅纳米粒子的均匀度和粒径都有影响。 0020 所述正硅酸乙酯与无水乙醇的体积比为1:50-200。 优选的,所述。

16、正硅酸乙酯与无 水乙醇的体积比为1:200。 0021 所述步骤(2)中， 二氧化硅乙醇溶液与3-氨基丙基三甲氧基硅烷的体积比为450- 550:1。 优选的， 二氧化硅乙醇溶液与3-氨基丙基三甲氧基硅烷的体积比为500:1。 0022 所述步骤(3)中， 四羟甲基氯化磷与氯金酸的摩尔比为1:30-40， 四羟甲基氯化磷 的浓度为1.2mmol/L， 氯金酸的浓度为25mmol/L。 优选的， 四羟甲基氯化磷与氯金酸的摩尔 比为1:34-36。 0023 所述步骤(4)中， 金种溶液和氨基化二氧化硅乙醇溶液体积比为5:1-3。 0024 所述步骤(5)中， 碳酸钾和氯金酸的体积比为60-70：。

17、 1， 氯金酸与 Au-APTMS-SiO2 溶液的加入量比为110-310-3mmol： 5mL。 优选的， 碳酸钾的浓度为25mmol/L， 氯金酸的浓 度为1.8mmol/L， 氯金酸与Au-APTMS-SiO2溶液的加入量比为1.210-3-210-3mmol： 5mL。 合 适的氯金酸与 Au-APTMS-SiO2溶液的加入量比， 有利于Au-APTMS-SiO2纳米粒子表面生成致 密均匀的金层， 从而制备出粒径均一且分散性良好的SiO2Au核壳纳米粒子。 本步骤中制备 得到的纳米粒子具有光热作用。 0025 所述步骤(6)中， SiO2Au水溶液与聚乙二醇(NH2-PEG-COOH。

18、)修饰剂的加入量比为 1mL： 510-7-510-9mol。 优选的， SiO2Au水溶液与聚乙二醇 (NH2-PEG-COOH)修饰剂的加 入量比为1mL： 510-8mol。 进一步优选的， 所述聚乙二醇修饰剂溶液的浓度为510-4mol/ L。 0026 所述步骤(7)中， 反应液和氧化石墨的加入量80-120: L： 1 g。 优选的， 所述反应液 说 明 书 2/4 页 4 CN 105435226 B 4 和氧化石墨烯的加入量100 L： 1 g。 进一步优选的， 所述氧化石墨烯溶液的浓度为1000 g/ mL。 反应液和氧化石墨烯溶液的合适的配比， 有利于SiO2Au纳米粒子的。

19、外表面均匀包覆石 墨烯层， 提高粒子的生物相容性及载药量。 0027 上述抗肿瘤纳米复合粒子可以用在抗肿瘤药物载体中。 其应用方法为， 室温条件 下， 向2mL 1mg/mL的SiO2AuGO分散液中加入0.2mL 5mmol/L 的抗肿瘤药物溶液， 比如多 西他赛的二甲基亚砜， 搅拌24h。 将反应液进行离心处理， 以除去未溶解和未吸附的固体药 物， 离心后进行真空冷冻干燥， 得到具有光热作用的SiO2AuGO载药纳米粒子。 0028 与现有技术相比， 本发明的有益效果在于： 0029 1、 所述抗肿瘤纳米复合粒子的分散性好， 可搭载抗肿瘤药物， 且载药量大。 0030 2、 所述抗肿瘤纳米。

20、复合粒子生物相容性高、 副作用小， 且光热转换效率高， 可用于 光热治疗， 对于肿瘤细胞的杀伤力显著。 0031 3、 本发明的制备工艺简单、 反应温和、 绿色环保。 附图说明 0032 图1是实施例1中制得的二氧化硅纳米粒子的扫描电镜图。 0033 图2是实施例1中制得的Au-APTMS-SiO2纳米粒子的透射图。 0034 图3是实施例1中制得的二氧化硅金核壳纳米粒子的紫外吸收图谱。 0035 图4是实施例1中制得的SiO2AuGO纳米粒子的透射图。 0036 图5是实施例2中的SiO2AuGO纳米粒子在应用在前列腺癌DU145 中， 荧光显微镜 观察的对照组与实验组的前列腺癌DU145细。

21、胞形态图。 其中， 图5a和图5b 分别为对照组的 暗场和明场， 图5c和图5d分别为实验组的暗场和明场。 具体实施方式 0037 下面结合实施例， 对本发明作进一步说明： 0038 实施例1 0039 (1)制备二氧化硅纳米粒子(SiO2) 0040 室温搅拌条件下， 向10ml甲醇和30ml正丁醇的混合液中， 分别滴入一 0.5mL的正 硅酸乙酯(TEOS)和2mL的氨水(NH4OH)， 反应2h后离心处理， 样品分散在100mL无水乙醇中， 备用。 图1中是制备得到的二氧化硅纳米粒子的扫描电镜图片， 图中粒子粒径为220nm左右， 而且粒径均一、 呈规则的球形。 0041 (2)制备氨基。

22、化的二氧化硅纳米粒子(APTMS-SiO2) 0042 搅拌条件下， 向上述制备的100mL的二氧化硅乙醇溶液中加入50ul的3- 氨基丙基 三甲氧基硅烷(APTMS)， 95 回流反应2h后进行离心， 样品分散在无水乙醇中， 备用。 0043 (3)金种的制备(THPC-Au) 0044 搅拌条件下， 氮气氛围中， 向180ml高纯水中加入1.2ml 1mol/L的NaOH， 将溶液搅 拌， 再向其中加入4ml 1.2mmol/L的四羟甲基氯化磷(THPC)溶液， 继续搅拌5min后再加入 6.75mL 25mmol/L的HAuCl4,水浴25搅拌过夜， 反应后的金种溶液4密封保存， 备用。。

23、 0045 (4)金种吸附在二氧化硅表面(Au-APTMS-SiO2) 0046 超声条件下， 向步骤(3)中的5mL金种溶液中滴加1mL氨基化二氧化硅 (APTMS- 说 明 书 3/4 页 5 CN 105435226 B 5 SiO2)的乙醇溶液， 继续超声5min后水浴静置2h。 离心处理所得固体分散在5mL的超纯水中， 备用。 具体如图2所示， 图2为Au-APTMS-SiO2纳米粒子的透射图。 0047 (5)二氧化硅金核壳纳米粒子的制备(SiO2Au) 0048 室温搅拌条件下， 向60mL碳酸钾(K2CO3， 25mmol/L)和氯金酸(HAuCl4， 1.8mmol/L) 的。

24、混合溶液(K2CO3和氯金酸体积比为67： 1)中滴加5ml Au-APTMS-SiO2溶液,搅拌5min后加 入200 L甲醛， 继续搅拌10min后进行离心处理， 所得样品分散在5mL的超纯水中， 备用。 0049 图3为本实施例中制备的二氧化硅金核壳纳米粒子的紫外吸收图谱。 0050 (6)用NH2-PEG-COOH修饰SiO2Au纳米粒子 0051 室温条件下， 向1ml SiO2Au水溶液中， 加入100 L 510-4mol/L的 NH2-PEG-COOH (聚乙二醇修饰剂)溶液， 搅拌30s后， 将反应液在4条件下静置过夜， 备用。 0052 (7)二氧化硅金核壳纳米粒子表面包覆。

25、石墨烯(SiO2AuGO) 0053 超声条件下， 向步骤(6)中的200 L的NH2-PEG-COOH修饰SiO2Au 纳米粒子溶液中 加入20 L 1000 g/mL的氧化石墨烯溶液， 室温条件下搅拌过夜。 离心后的固体分散在超纯 水中， 形成SiO2AuGO分散液， 以备下步使用。 图4为本实施例中制备的SiO2AuGO纳米粒子 的透射图片， 从图中可看出， 在SiO2Au纳米粒子的表面均匀包覆了一层石墨烯层。 0054 实施例2 0055 室温条件下， 向2mL 1mg/mL的SiO2AuGO分散液中加入0.2mL 5mmol/L的多西他 赛的二甲基亚砜溶液， 搅拌24h。 将反应液进。

26、行离心处理， 以除去未溶解和未吸附的固体药 物， 离心后进行真空冷冻干燥， 得到具有光热作用的SiO2AuGO载药纳米粒子。 0056 SiO2AuGO载药纳米粒子对前列腺癌细胞DU145的光热治疗的测试： 0057 将处于对数生长期的前列腺肿瘤DU145细胞按4000个/孔的密度接种于 96孔板， 共培养10孔， 每孔均加入150 L F-12全培养基， 在5CO2、 37、 饱和湿度的培养箱中培养 24h后吸弃培养皿中的培养液， 用100 L PBS冲洗 2次。 然后向其中5孔加入150 L正常F-12 全培养基作为对照组， 另外5孔加入150 L含SiO2AuGO载药纳米粒子的F-12全。

27、培养基作为 实验组。 利用近红外激光780nm， 以35W/cm2功率分别照射对照组和实验组10min。 激光照射 结束后， 将细胞放入5CO2、 37、 饱和湿度的培养箱中培养2h后取出， 吸弃培养皿中的培 养液， 用100 L PBS冲洗2次。 然后向每孔中加入150 L 4 M碘化丙啶染色溶液， 其中碘化丙 啶染色液使用PBS配制。 将两组细胞放入培养箱中孵育2h。 荧光显微镜观察两组细胞形态变 化及染色情况。 图5为荧光显微镜观察的对照组与实验组前列腺癌DU145细胞形态图， 其中 图5a和图5b分别为对照组的暗场和明场， 图5c和图5d分别为实验组的暗场和明场。 0058 从图5中可看出， 实验组的DU145细胞明显减少， 说明所制备的 SiO2AuGO纳米颗 粒搭载多西他赛后， 在780nm的近红外激光照射下， DU145细胞明显减少， 说明其能用于肿 瘤的光热治疗。 说 明 书 4/4 页 6 CN 105435226 B 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 7 CN 105435226 B 7 图3 图4 说 明 书 附 图 2/3 页 8 CN 105435226 B 8 图5 说 明 书 附 图 3/3 页 9 CN 105435226 B 9 。