(一)技术领域：
本发明涉及一种柿叶黄酮提取物及其制备方法，属于药用活性成分的提取技术领域。
(二)背景技术：
柿叶中的主要有效成分是黄酮，目前已发现的柿叶黄酮化合物有黄芪甙、异槲皮素、 山奈酚、槲皮素、山奈酚-3-o-β-D-葡萄糖甙、山奈酚-3-o-α-L-鼠李糖甙、山奈酚-3-β -D-木糖甙、山奈酚-3-o-α-L-阿拉伯糖甙、槲皮素-3-o-[2″-o-(3、4、5-三羟基苯甲酰 )]-葡萄糖甙、芦丁、金丝桃甙、杨梅树皮甙、紫云英甙等。国内外研究表明，柿叶黄酮具 有降血压、抑菌、降血脂、降低胆固醇、止血、活血化瘀、抑制肿瘤生长等功能，并有促进 植物生长的作用。
柿叶中的黄酮主要以甙类形式存在，采用不同的提取方法所得黄酮的成分以及含量高低 均存在较大差异。目前公开文献已报道的柿叶黄酮的提取工艺主要有以下几种：(1)用15 倍柿叶重的50％乙醇水溶液，在75℃下浸提3小时；此方法仅得到粗提取物，黄酮含量只有 15％左右。(2)采用水煮提取，加碱类物质助溶，过滤，滤液上吸附树脂层析，然后洗脱， 收集洗脱液；该方法得到的也是粗提取物，虽然具有降血压功能及促进植物生长的活性，但 杂质仍较多，无法作为人体药用成分。(3)CN1709542A公开了双水相萃取提取柿叶黄酮类 物质的方法，先加入乙醇溶液固液浸取，粗提液进行双水相萃取，然后用乙酸酯类反萃，蒸 馏，干燥即可；但该方法所得产品中黄酮类化合物的含量也只有12.1％左右。(4) CN1546014A和CN101194921A公开的柿叶黄酮提取物的制备方法为：水煮，过滤，醇沉，乙酸 乙酯萃取，大孔树脂吸附，乙醇洗脱，回收乙醇得浓缩物，干燥即可；所得提取物含总黄酮 为60 90％。但该方法的流程较为繁琐，提取效果依然不够理想。
(三)发明内容：
本发明所要解决的技术问题是：利用改进的工艺方法从柿叶中提取黄酮类物质，其工艺 流程简单，生产成本低，提取物中黄酮类物质含量高。
本发明的技术方案：柿叶黄酮提取物的制备方法为：将柿叶破碎，用低碳醇提取1～3次 ，每次5～180min，合并提取液，回收低碳醇、浓缩，离心，上清液过大孔树脂柱进行纯化 ，先用水再用低碳醇洗柱，收集醇洗脱液；洗脱液经浓缩、回收低碳醇后，用有机试剂萃取 2～5次，萃取液浓缩，干燥，即得柿叶黄酮提取物。所用的柿叶原料可以是新鲜或干燥的。
更具体的制备方法为：将柿叶破碎，用3～8倍重量的低碳醇提取1～3次，每次5～ 180min，合并提取液，回收低碳醇、浓缩至提取液体积的1/25～1/6倍，离心，上清液过大 孔树脂柱进行纯化，先用去离子水洗柱2～3h，再用低碳醇洗柱至洗脱液澄清、透明，收集 醇洗脱液(为树脂重量的1～3倍)；洗脱液浓缩至10～15波美度，回收低碳醇后，用浓缩液 体积3～10倍的有机试剂萃取2～5次，萃取液浓缩，喷雾干燥，即得柿叶黄酮提取物。
上述制备方法中，所述的低碳醇为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇或异丙醇，其体积浓 度为25％～100％。
所述提取方式为加热提取、超声提取或微波提取。加热提取时，提取温度为50～95℃， 提取时间为每次1～3小时；超声波提取时，工作频率15～80KHz，提取时间为每次5～120min ；微波提取时，工作频率900～2500MHz，提取时间为每次5～120min。
提取液和洗脱液浓缩时均采用真空浓缩，浓缩温度50～70℃，真空度0.06～0.1MPa；萃 取液浓缩时采用真空浓缩，浓缩温度30～50℃，真空度为0.06～0.1MPa。
提取液离心时采用管式离心，转速为18000r/min。
大孔树脂柱纯化时，液体流速为0.5～1.5BV/h。
所述的大孔树脂柱是以聚苯乙烯为骨架的D101型、D130型、AB-8型、HP-20型或ADS-7型 大孔吸附树脂。申请人经过筛选实验发现，这几种大孔吸附树脂对柿叶中黄酮类化合物的纯 化效果更好，而且其价格便宜，可以多次重复使用，成本较低。
萃取用的有机试剂为乙酸乙酯、正丁醇或正丙醇。
以上所述柿叶黄酮提取物的制备方法制备得到的柿叶黄酮提取物。
由于柿叶黄酮中的有效成分山奈酚、槲皮素、异槲皮素、黄芪甙、芦丁、金丝桃素、紫 云英甙、杨梅树皮甙等在醇中的溶解度要明显高于其在水中的溶解度，因此本发明选用低碳 醇作为提取溶剂，结果发现醇提对黄酮类物质的提取更为完全，提取物中总黄酮的含量更高 (具体见下表1)。另外，现有技术(CN101194921A)是将提取液经醇沉、萃取之后再用树 脂纯化，其萃取量大，操作繁琐，效率低。而本发明的提取液先经过大孔树脂纯化，能在去 除更多杂质的同时有效地保留柿叶黄酮；树脂纯化后再用乙酸乙酯萃取时，因杂质明显减少 ，萃取量小，更利于萃取操作，效率高，所需的乙酸乙酯量成倍减少。而且本发明因工艺设 计合理，提取液经树脂纯化和乙酸乙酯萃取便能达到提纯的目的，无须经过醇沉步骤，简化 了流程。
为了将水提和醇提的效果进行对照，申请人在同等条件下进行了实验：取柿叶，分别加 入10倍量水和不同体积浓度的乙醇，在80℃下保温提取2小时，各提取溶剂所得提取物中黄 酮类物质含量(重量百分含量)和提取物得率(重量百分比)如下表：
表1
提取溶剂 水 20％乙醇 40％乙醇 60％乙醇 80％乙醇 95％乙醇 黄酮类物质含量 6％ 8％ 13％ 15％ 16％ 18％ 黄酮提取物得率 20％ 20％ 18％ 18％ 15％ 12％
与现有技术相比，本发明采用醇提、大孔树脂纯化、乙酸乙酯萃取的工艺路线从柿叶中 提取黄酮类物质，克服了现有技术从柿叶中提取黄酮类物质收率低、含量不高的缺陷，简化 了生产工艺，容易操作，降低了生产成本，对有效成分的提取更加完全，并避免了有效成分 的损失，所得提取物中黄酮类物质的含量高，其重量含量达80～98％。
(四)具体实施方式：
本发明的实施例1：柿叶黄酮提取物的制备方法，其步骤如下：
1)前处理：取新鲜柿叶，剔除腐烂、霉变部分，去除杂质，将柿叶破碎；
2)提取：将破碎的柿叶原料投入洁净的提取罐中，加入6倍重量的65％(v/v)乙醇，控 制温度在85℃，第一次回流提取2h(从溶液沸腾开始计时)，然后压出药液，第二次再加入 4倍重量的65％(v/v)乙醇，回流提取1.5h，收取第二次提取液；
3)回收溶剂：将提取液合并，导入浓缩器中进行真空浓缩，温度控制在60℃，真空度 为0.08MPa，浓缩至提取液体积的1/20倍；
4)离心：将浓缩后的提取液通过管式离心机离心，转速为18000r/min；
5)大孔树脂纯化：离心上清液进型号为AB-8的大孔吸附树脂柱进行纯化，液体流速为 1.0BV/h；用去离子水洗柱至流出液清澈，水洗约2个小时；再用65％(v/v)乙醇洗柱至洗脱 液澄清、透明，收集带醇味的洗脱液，收集醇洗脱液约为树脂重量的2倍；
6)浓缩：醇洗脱液进行真空浓缩，温度控制在60℃，真空度为0.08MPa，浓缩至12波美 度；
7)萃取：浓缩后的洗脱液用乙酸乙酯进行萃取，总共萃取4次，每次所用乙酸乙酯的量 是浓缩液体积量的4倍；
8)回收有机试剂：对萃取液进行真空浓缩，浓缩温度40℃，真空度为0.081MPa，浓缩 至干；用去离子水溶解，真空浓缩至25～30波美度的浸膏；
9)干燥：将浸膏进行喷雾干燥，得到柿叶黄酮提取物。
本发明的实施例2：按以下步骤制备柿叶黄酮提取物：
1)前处理：取干燥柿叶，剔除腐烂、霉变部分，去除杂质，将柿叶破碎；
2)提取：将破碎的柿叶原料投入洁净的提取罐中，加入相当于原料重量4倍的80％( v/v)乙醇，控制温度在90℃，第一次回流提取2.5h(从溶液沸腾开始计时)，然后压出药 液，第二次再加入3倍重量的80％(v/v)乙醇，回流提取2h，收取第二次提取液；
3)回收溶剂：将提取液合并，导入浓缩器中进行真空浓缩，温度控制在70℃，真空度 为0.1MPa，浓缩至提取液体积的1/15倍；
4)离心：将浓缩后的提取液通过管式离心机离心，转速为18000r/min；
5)大孔树脂纯化：离心上清液进型号为D101的大孔吸附树脂进行纯化，液体流速为 1.5BV/h；用去离子水洗柱至流出液清澈，水洗约3个小时；再用80％(v/v)乙醇洗柱至洗脱 液澄清、透明，收集略带醇味的洗脱液，收集洗脱液约为树脂重量的3倍；
6)浓缩：洗脱液进行真空浓缩，温度控制在70℃，真空度为0.1MPa，浓缩至15波美度 ；
7)萃取：浓缩后的洗脱液用正丁醇进行萃取，总共萃取5次，每次所用正丁醇的量是浓 缩液体积量的3倍；
8)回收有机试剂：对萃取液进行真空浓缩，浓缩温度50℃，真空度为0.1MPa，浓缩至 干；用去离子水溶解，真空浓缩至25～30波美度的浸膏；
9)干燥：将浸膏进行喷雾干燥，得到柿叶黄酮提取物。
本发明的实施例3：按以下步骤制备柿叶黄酮提取物：
1)前处理：取新鲜柿叶，剔除腐烂、霉变部分，去除杂质，将柿叶破碎；
2)提取：将破碎的柿叶原料投入洁净的提取罐中，加入8倍重量的45％(v/v)乙醇，用 超声波提取120min，其工作频率15～80KHz；
3)回收溶剂：将提取液导入浓缩器中进行真空浓缩，温度控制在50℃，真空度为 0.06MPa，浓缩至提取液体积的1/10倍；
4)离心：将浓缩后的提取液通过离心机离心，转速为18000r/min；
5)大孔树脂纯化：离心上清液进型号为D130的大孔吸附树脂柱进行纯化，液体流速为 0.5BV/h；用去离子水洗柱至流出液清澈，水洗约2个小时；再用45％(v/v)乙醇洗柱至洗脱 液澄清、透明，收集略带醇味的洗脱液，收集洗脱液约为树脂重量的1.5倍；
6)浓缩：洗脱液进行真空浓缩，温度控制在50℃，真空度为0.06MPa，浓缩至10波美度 ；
7)萃取：浓缩后的洗脱液用正丙醇进行萃取，总共萃取3次，每次所用正丙醇的量是浓 缩液体积量的6倍；
8)回收有机试剂：对萃取液进行真空浓缩，浓缩温度30℃，真空度为0.06MPa，浓缩至 干；用去离子水溶解，浓缩至25～30波美度的浸膏；
9)干燥：将浸膏进行喷雾干燥，得到柿叶黄酮提取物。
本发明的实施例4：按以下步骤制备柿叶黄酮提取物：
1)前处理：取干燥柿叶，剔除腐烂、霉变部分，去除杂质，将柿叶破碎；
2)提取：将破碎的柿叶原料投入洁净的提取罐中，加入7倍重量的95％(v/v)甲醇，第 一次用微波提取60min，收取药液；第二次加入5倍重量的95％(v/v)甲醇，微波提取30min ，收取药液；第三次再加入3倍重量的95％(v/v)甲醇，微波提取10min，收取药液；微波工 作频率为900～2500MHz；
3)回收溶剂：将提取液合并，导入浓缩器中进行真空浓缩，温度控制在65℃，真空度 为0.075MPa，浓缩至提取液体积的1/25倍；
4)离心：将浓缩后的提取液通过离心机离心；
5)大孔树脂纯化：离心上清液进型号为HP-20的大孔吸附树脂进行纯化，液体流速为 1.2BV/h；用去离子水洗柱至流出液清澈，水洗约3个小时；再用70％(v/v)甲醇洗柱至洗脱 液澄清、透明，收集略带醇味的洗脱液，收集洗脱液约为树脂重量的3倍；
6)浓缩：洗脱液进行真空浓缩，温度控制在65℃，真空度为0.075MPa，浓缩至14波美 度；
7)萃取：浓缩后的洗脱液用乙酸乙酯进行萃取，总共萃取2次，每次所用乙酸乙酯的量 是浓缩液体积量的10倍；
8)回收有机试剂：对萃取液进行真空浓缩，浓缩温度35℃，真空度为0.075MPa，浓缩 至干；用去离子水溶解，浓缩至25～30波美度的浸膏；
9)干燥：将浸膏进行干燥，即得柿叶黄酮提取物。