技术领域
本发明属药剂学领域，具体涉及重组纳豆激酶口服制剂及其制备方法和应用。
背景技术
重组纳豆激酶是蛋白质/多肽类药物，直接口服，容易被胃酸、胃肠道蛋白酶破坏 而失去生物学活性，临床应用范围有限。胃肠道对蛋白质/多肽类药物口服吸收构成三 大屏障：酶的降解、黏液层的扩散屏障以及粘膜的吸收屏障。常规制剂工艺需使用高 温、水、有机溶剂，容易使蛋白质降解或活性丧失，以致将蛋白质/多肽类药物制成口 服制剂难度很大，但近年来口服结肠靶向给药系统和超临界流体包衣技术在理论和实 践上的发展能较有效地解决蛋白质/多肽类药物口服吸收的靶向部位及工艺敏感性问 题。
结肠部位蛋白水解酶少、活力低，可避免蛋白质/多肽类药物的降解；结肠对大分 子药物的吸收屏障作用较小肠小、药物在结肠滞留时间长、结肠部位水分少使药物浓 度高等因素也有利于蛋白质/多肽类药物的吸收。因此结肠是蛋白质/多肽类药物口服 给药在胃肠道吸收的最佳部位。
常规结肠靶向制剂工艺使用的传统包衣工艺使蛋白质/多肽类药物变性失活。近年 发展起来的超临界流体技术工作环境温和，不用或少用水及有机溶剂、在室温常压下 呈气态而易与产品分离，是一种绿色工艺，较适合作蛋白质/多肽类药物的制剂。
CO2超临界包衣技术的主要原理是在一定的温度和压力下，CO2形成流体，非极性 的包衣材料可溶解在CO2流体中，而蛋白质/多肽类药物是极性分子，不能溶解在CO2流体中，呈固体状态。改变反应体系的温度和压力，CO2流体汽化，CO2释放，包衣材 料从流体中析出，在蛋白质/多肽类药物颗粒表面形成均匀的包衣。由于这种包衣材料 能抵抗胃酸的破坏，并且崩解的时间较长，口服后需6-8小时才崩解，蛋白质/多肽 类药物达到结肠后吸收。
目前，最常用的超临界流体是CO2，无毒、不易燃、价廉易得，而且临界点(Tc＝31℃， Pc＝7.38Mpa)参数低，在室温常压下呈气态而易与所制得产品分离。CO2超临界流体早 年已应用于天然有机物萃取工艺；近年来发展了超临界流体快速膨胀法、超临界流体 抗溶剂法、气溶胶溶剂萃取系统和超临界流体强制分散技术等用于超细药物颗粒的制 备及药物的微囊化和包衣。
因此，研究开发重组纳豆激酶的口服缓释制剂具有重要意义。异丁烯酸-丙烯酸乙 酯共聚物(L100-55)作为包衣材料，具有安全无毒性，可生物降解等特 点，是很好的包封蛋白质/多肽类药物的辅料。经查阅文献，目前尚无重组纳豆激酶口 服制剂及其相关研究报道。
发明内容：
本发明的目的是提供一种重组纳豆激酶口服制剂及其制备方法。
本发明的进一步目的是提供所述的口服制剂的应用，本发明的口服制剂能克服现 有技术的缺陷，扩展重组纳豆激酶的临床适应症和临床使用范围。
所述的重组纳豆激酶口服制剂，由包衣材料和载药丸芯及辅料组成，所述的包衣 材料选自异丁烯酸-丙烯酸乙酯共聚物，重组纳豆激酶为载药丸芯，其中，包衣材料与 载药丸芯的质量比为1∶2。
本发明利用超临界CO2流体包衣技术，以异丁烯酸-丙烯酸乙酯共聚物 (L100-55)为包衣材料包覆重组纳豆激酶药物颗粒，制成口服制剂。
本发明解决的主要技术问题是实现了重组纳豆激酶口服制剂的抵抗胃酸和缓释作 用。本发明利用超临界流体抗溶剂技术，将结肠靶向性聚合物异丁烯酸-丙烯酸乙酯共 聚物(L100-55)先溶于溶剂中形成溶液，将该溶液迅速喷洒在流化的重 组纳豆激酶载药药芯颗粒表面，由于温度和压力的变化，聚合物的溶解度降低而包覆 在重组纳豆激酶的表面上。通过实验，结果表明CO2超临界包衣处理后重组纳豆激酶 口服制剂具有抵抗胃酸和缓释作用。
本发明的技术方案通过下述方法和步骤实现：
1.重组纳豆激酶的基因克隆：筛选纳豆芽孢杆菌，制备纳豆芽孢杆菌基因组DNA，通 过PCR，克隆纳豆激酶全长基因、构建枯草杆菌表达质粒，转化枯草杆菌，筛选阳 性克隆。
2.重组纳豆激酶的表达和纯化：挑取阳性单克隆，接种与新鲜含卡那霉素LB平板上， 37℃培养过夜。单克隆种子菌接种于含卡那霉素LB培养液中，37℃震荡培养 12h，1∶1000稀释，34.5℃震荡培养20h，收集培养液上清，经超滤浓缩，分子 筛过滤层析，阳离子交换层析，获得纯度达到95％的重组纳豆激酶。以BCA法测 定蛋白浓度，以酪蛋白降解试验测定纳豆激酶的比活性。
3.重组纳豆激酶载药药芯的制备：将淀粉-乳糖空白丸芯放入流化床包衣机中，重组 纳豆激酶浓缩液均匀包在淀粉-乳糖空白丸芯之上。干燥后待用。
4.CO2超临界包衣：将包衣材料放入超临界CO2包衣反应器的萃取釜中，将重组纳豆 激酶载药药芯放入流化床。CO2经处理后，加入萃取釜，反应30min后，将萃取 釜中的流体导入流化床，在这一过程中，将温度和压力恢复到正常状态，包衣材料 重新析出晶体，在重组纳豆激酶载药药芯表面形成包衣。
5.重组纳豆激酶口服肠溶制剂抗酸能力考察：制剂置于盐酸溶液，37℃振荡放置，取 样，经微孔滤膜过滤；沉淀物物置于磷酸盐缓冲液中，研磨后，经微孔过滤；测定 磷酸盐缓冲液滤液中纳豆激酶活性；以未包衣微丸作为对比。
6.重组纳豆激酶口服肠溶制剂药物释放度测定：称取制剂，先以盐酸为溶出介质， 37±0.5℃ 50rpm振荡，分别于0.5、1.0、1.5、2.0hr取样；然后用20％NaOH溶 液调节释放介质pH至6.8，分别于2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0hr取 样。每次取样1ml，同时补加1ml同温释放介质。样品经微孔过滤，弃去初滤液， 精密量取续滤液，BCA法测定蛋白含量。
7.数据统计：SSPS软件。
本发明所制备重组纳豆激酶制剂颗粒规则，表面光滑，外观均匀，无粘连，平均 粒径在135±30μm，载药量、包封率高。
附图说明
图1是重组质粒pBLNK转化蛋白酶缺陷型枯草杆菌。
图2是NK基因在枯草杆菌中的表达，表达产物进行A：SDS-PAGE，和B：纤维蛋白 平板活性分析。
图3是实施例1的微丸表面形态分析图，
其中的光镜及扫描电镜照片观察显示包衣微丸表面有致密而完整的包衣层包裹， 微丸剖面扫描照片可见丸芯和包衣层之间的清晰分层。
图4是实施例1的微丸抗酸能力考察结果。
图5是实施例1的肠溶微丸药物释放度曲线。
图6是实施例2的微丸表面形态分析图，
其中的光镜及扫描电镜照片观察显示包衣微丸表面有致密而完整的包衣层包裹， 微丸剖面扫描照片可见丸芯和包衣层之间的清晰分层。
图7实施例2的微丸抗酸能力考察结果，
其中，以L100-55包衣材料进行包衣的纳豆激酶载药微丸暴露于模拟 胃酸环境中6个小时后仍保留有81.5％的药物活性；而未包衣微丸药物迅速失活，在 半小时时仅残留活性不足20％，随后迅速降至0。
图8是实施例2的肠溶微丸药物释放度曲线，
其中，肠溶制剂在模拟胃酸环境中2小时内药物仅释放12.3％，转入模拟肠液环 境中后开始迅速释放，2小时内释放度近71％，6小时后释放度达87％；未包衣微丸 药物迅速释放，1小时即达80％左右，2小时基本完全释放。
具体实施方式
下面通过实施实例对本发明的技术方案作进一步的描述，
实施例1：克隆纳豆激酶全长基因、构建枯草杆菌表达质粒
1.提取Bacillus natto基因组DNA(序列1)，设计克隆引物，以上游引物5’…GCG GGA TTC GTA TGA AAA TAG TTA…3’和下游引物5’…GTA GTC GAC TCC GGT GCT TGT GAA…3’进行PCR扩增，获得纳豆激酶基因，构建质粒 pBL NK。
2.pBL NK在枯草杆菌表达系统中的表达：原生质体法转化pBL NK质粒于蛋白酶缺 陷型枯草杆菌中，挑取转化菌落接种于3ml含10μg卡那霉素的LB培养液中， 34.5℃振摇15h，收集培养液进行SDS-PAGE及活性分析，筛选种子工程菌。
3.重组纳豆激酶的纯化：挑取新鲜划板的单克隆种子菌，接种于3ml含10μg卡 那霉素的LB培养液中，37℃振摇12h后，1∶1000接种于1L培养液中，34.5℃振 摇15h，8000rpm离心后留取上清，1L上清液经Millipore超滤至50ml。超滤液 上Sephacryl S 200柱(2.6cm×100cm，用1mmol/L CaCl2、10mmol/L PB，pH 6.2平 衡)，用1mmol/L CaCl2、10mmol/L PB(pH 6.2)洗脱，流速为1ml/min，分部收集。 活性流出液过SP Sepharose Fast Flow柱(2.0cm×15cm，用1mmo/L CaCl2、10mmol/L PB，pH 6.2平衡)，用1mmol/L CaCl2、10mmol/L PB(pH 6.2)洗至基线，再用0-1mol/L NaCl连续梯度洗脱，分部收集。活性组分对1mmol/L CaCl2、10mmol/L PB(pH7.2)缓 冲液透析12hr后冻干待用。
4.纤溶活性测定及蛋白质含量测定：用纤维蛋白法测定表达产物的纤溶活性，蛋白质 含量测定采用Lowry法。
5.重组纳豆激酶载药药芯的制备：将淀粉-乳糖空白丸芯放入流化床包衣机中，在热 风进风温度38-40℃，床内温度34-37℃，流化压力0.5bar，雾化压力1.2bar，空 气泵压0.6MPa，重组纳豆激酶溶液流速0.5ml/min的条件下，将50ml(20mg/ml)重 组纳豆激酶浓缩液均匀包在淀粉-乳糖空白丸芯之上。干燥后待用。
6.肠溶包衣制剂的制备：将一定比例的包衣材料、载药药芯和辅料放入沉积室，然后 用高压柱塞泵不断通入CO2达到实验要求的压力，用恒温水浴控制实验要求的温度。 在达到一定的压力和温度条件后，维持该状态并开启搅拌棒反应30min；然后调节背 压阀降压排气，CO2由液态变为气体，包衣材料的溶解度降低，使其析出并沉积在载药 药芯表面形成包衣，从而达到包衣的目的。
表1是各工艺参数取值水平表。
表1：
项目 取值 包衣材料∶载药丸芯(质量比) 1∶2 助溶剂乙醇∶包衣材料(体积质量比) 1∶10 抗粘剂滑石粉∶包衣材料(质量比) 1∶10 增塑剂柠檬酸三乙酯∶包衣材料(体积质量比) 1∶10 压力 20Mpa 温度 35℃
7.肠溶微丸粒径测定：根据显微镜法测定微球粒径，每组不少于200个粒子数。
8.微丸抗酸能力考察：1g肠溶制剂置于5ml 0.1mol/L盐酸溶液中，共7管，37℃ 振荡放置，在预先确定的各时间点(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0hr)取1管， 经0.8μm微孔过滤；沉淀物置于5ml磷酸盐缓冲液(pH6.8)，研磨后，经0.8μm微 孔过滤；测定磷酸盐缓冲液滤液中纳豆激酶活性；以未包衣微丸作为对比。以发色底 物法测定药物活性。
9.微丸药物释放度测定：称取纳豆激酶肠溶包衣微丸5g，按《中华人民共和国国药 典》2005年版二部溶出度测定第2法进行测定，首先以0.1mol/L盐酸(人工胃 液，pH 1.2)150mI为溶出介质，温度(37±0.5)℃，转速50rpm，分别于0.5、1.0、 1.5、2.0hr取样；然后用20％的NaOH溶液调节释放介质的pH值至6.8，分别于 2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0hr取样。每次取样1ml，同时补加1ml同温释 放介质。样品用0.8μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，精密量取续滤液100μl，以二 喹啉甲酸(BCA)法测定其蛋白含量。
结果显示：
1.光镜及扫描电镜照片观察显示包衣微丸表面有致密而完整的包衣层包裹，微丸 剖面扫描照片可见丸芯和包衣层之间的清晰分层。
2、表2是微丸粒径测定结果。
表2
粒径大小范围(μm) 中间值(d) 每组粒子数(n) nd 90-105 97.5 12 1170 105-120 112.5 41 4612.5 120-135 127.5 74 9435 135-150 142.5 95 13537.5 150-165 157.5 54 8505 165-180 172.5 11 1897.5 287 39157.5
表中数值为光镜下的读数，乘以放大倍数5倍，肠溶包衣微丸平均直径为：682.1μm
3.微丸抗酸能力考察结果显示：以L100-55包衣材料进行包衣的纳 豆激酶载药微丸暴露于模拟胃酸环境中6个小时后仍保留有83％的药物活性；而未 包衣微丸药物迅速失活，在半小时时仅残留活性18％，随后迅速降至0。
4、肠溶微丸药物释放度曲线
肠溶制剂在模拟胃酸环境中2小时内药物仅释放9.7％，转入模拟肠液环境中 后开始迅速释放，2小时内释放度近75％，6小时后释放度达93.5％左右；未包衣微 丸药物迅速释放，1小时即达80％左右，2小时基本完全释放。
实施例2：
1.提取Bacillus natto基因组DNA，以上游引物5’…GCG GGA TTC GTA TGA AAA TAG TTA…3’和下游引物5’…GTA GTC GAC TCC GGT GCT TGT GAA…3’进行PCR扩增，获得纳豆激酶基因，构建质粒pBL NK
2.pBL NK在枯草杆菌表达系统中的表达：原生质体法转化pBL NK质粒于蛋白酶缺 陷型枯草杆菌中，挑取转化菌落接种于3ml含10μg卡那霉素的LB培养液中， 34.5℃振摇15h，收集培养液进行SDS-PAGE及活性分析，筛选种子工程菌。
3.重组纳豆激酶的纯化：挑取新鲜划板的单克隆种子菌，接种于3ml含10μg卡 那霉素的LB培养液中，37℃振摇12h后，1∶1000接种于1L培养液中，34.5℃振 摇15h，8000rpm离心后留取上清，1L上清液经Millipore超滤至50ml。超滤液 上Sephacryl S 200柱(2.6cm×100cm，用1mmol/L CaCl2、10mmol/L PB，pH 6.2平 衡)，用1mmol/L CaCl2、10mmol/L PB(pH 6.2)洗脱，流速为1ml/min，分部收集。 活性流出液过SP Sepharose Fast Flow柱(2.0cm×15cm，用1mmo/L CaCl2、10mmol/L PB，pH 6.2平衡)，用1mmol/L CaCl2、10mmol/L PB(pH 6.2)洗至基线，再用0-1mol/L NaCl连续梯度洗脱，分部收集。活性组分对1mmol/L CaCl2、10mmol/L PB(pH7.2)缓 冲液透析12hr后冻干待用。
4.纤溶活性测定及蛋白质含量测定：用纤维蛋白法测定表达产物的纤溶活性，蛋白质 含量测定采用Lowry法。
5.重组纳豆激酶载药药芯的制备：将淀粉-乳糖空白丸芯放入流化床包衣机中，在热 风进风温度38-40℃，床内温度34-37℃，流化压力0.5bar，雾化压力1.2bar，空 气泵压0.6MPa，重组纳豆激酶溶液流速0.5ml/min的条件下，将50ml(20mg/ml)重 组纳豆激酶浓缩液均匀包在淀粉-乳糖空白丸芯之上。干燥后待用。
6.肠溶包衣微丸的制备：将一定比例的包衣材料和辅料放入萃取釜中、载药药芯放入 流化床中，然后用高压柱塞泵不断通入CO2进入萃取釜中，达到实验要求的压力，并 用恒温水浴控制实验要求的温度。在达到一定的压力和温度条件后，维持该状态反应 60min；然后调节阀门，将超临界CO2液体导入流化床，进入流化床后，改变压力、 温度，超临界CO2液体发生相变，由液态变为气体，包衣材料的溶解度降低而使其析 出沉淀，沉积在载药药芯表面，从而达到包衣的目的。表3是各因素取值水平。
表3：
项目 取值 包衣材料∶载药丸芯(质量比) 1∶2 助溶剂乙醇∶包衣材料(体积质量比) 1∶10 抗粘剂滑石粉∶包衣材料(质量比) 1∶5 增塑剂柠檬酸三乙酯∶包衣材料(体积质量比) 1∶10
压力 15Mpa 温度 35℃
7.肠溶微丸粒径测定：根据显微镜法测定微球粒径，每组不少于200个粒子数。
8.微丸抗酸能力考察：1g肠溶制剂置于5ml 0.1mol/L盐酸溶液中，共7管，37℃ 振荡放置，在预先确定的各时间点(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0hr)取1管， 经0.8μm微孔过滤；沉淀物置于5ml磷酸盐缓冲液(pH6.8)，研磨后，经0.8μm微 孔过滤；测定磷酸盐缓冲液滤液中纳豆激酶活性；以未包衣微丸作为对比。以发色底 物法测定药物活性。
9.微丸药物释放度测定：称取纳豆激酶肠溶包衣微丸5g，按《中华人民共和国国药 典》2005年版二部溶出度测定第2法进行测定，首先以0.1mol/L盐酸(人工胃 液，pH 1.2)150mI为溶出介质，温度(37±0.5)℃，转速50rpm，分别于0.5、1.0、 1.5、2.0hr取样；然后用20％的NaOH溶液调节释放介质的pH值至6.8，分别于 2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0hr取样。每次取样1ml，同时补加1ml同温释 放介质。样品用0.8μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，精密量取续滤液100μl，以二 喹啉甲酸(BCA)法测定其蛋白含量。
表4是微丸粒径测定结果。
表4
粒径大小范围(um) 中间值(d) 每组粒子数(n) nd 90-105 97.5 18 1755 105-120 112.5 46 5175 120-135 127.5 79 10072.5 135-150 142.5 97 13822.5 150-165 157.5 53 8347.5 165-180 172.5 12 2070 305 41242.5
表中数值为光镜下的读数，乘以放大倍数5倍，肠溶包衣微丸平均直径为：676.1μm
序列表
<110>申请人：复旦大学
<120>超临界CO2流体技术制备纳豆激酶口服肠溶包衣
<160>1
<210>1
<211>381
<212>DNA
<213>纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)
<400>1
atg aga agc aaa aaa ttg tgg atc agc ttg ttg ttt gcg tta acg tta
Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu
-105 -100 -95
atc ttt acg atg gcg ttc agc aac atg tct gcg cag gct gcc gga aaa
Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Ala Gly Lys
-90 -85 -80 -75
agc agt aca gaa aag aaa tac att gtc gga ttt aag cag aca atg agt
Ser Ser Thr Glu Lys Lys Tyr Ile Val Gly Phe Lys Gln Thr Met Ser
-70 -65 -60
gcc atg agt tcc gcc aag aaa aag gat gtt att tct gaa aaa ggc gga
Ala Met Ser Ala Ala Lys Lys Lys Asp Val Ile Ser Glu Lys Gly Gly
-55 -50 -45
aag gtt caa aag caa ttt aag tat gtt aac gcg gcc gca gca aca ttg
Lys Val Gln Lys Gln Phe Lys Tyr Val Asn Ala Ala Ala Ala Thr Leu
-40 -35 -30
gat gaa aaa gct gta aaa gaa ttg aaa aaa gat ccg agc gtt gca tat
Asp Glu Lys Ala Val Lys Glu Leu Lys Lys Asp Pro Ser Val Ala Tyr
-25 -20 -15
gtg gaa gaa gat cat att gca cat gaa tat gcg caa tct gtt cct tat
Val Glu Glu Asp His Ile Ala His Glu Tyr Ala Gln Ser Val Pro Tyr
-10 -5 1 5
ggc att tct caa att aaa gcg ccg gct ctt cac tct caa ggc tac aca
Gly Ile Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gln Gly Tyr Thr
10 15 20
ggc tct aac gta aaa gta gct gtt atc gac agc gga att gac tct tct
Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile Asp Ser Ser
25 30 35
cat cct gac tta aac gtc aga ggc gga gca agc ttc gtt cct tct gaa
Hid Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro Ser Glu
40 45 50
aca aac cca tac cag gac ggc agt tct cac ggt acg cat gtc gcc ggt
Thr Asn Pro Tyr Gln Asp Gly Ser Ser His Gly Thr His Val Ala Gly
55 60 65 70
acg att gcc gct ctt aat aac tca atc ggt gtt ctg ggc gta gcg cca
Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ala le Gly Val Leu Gly Val Ala Pro
75 80 85
agc gca tca tta tat gca gta aaa gtg ctt gat tca aca gga agc ggc
Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Leu Val Asp Ser Thr Gly Ser Gly
90 95 100
caa tat agc tgg att att aac ggc att gag tgg gcc att tcc aac aat
Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ser Asn Asn
105 110 115
atg gat gtt atc aac atg agc ctt ggc gga cct act ggt tct aca gcg
Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Thr Gly Ser Thr Ala
120 125 130
ctg aaa aca gta gtt gat aaa gcg gtt tcc agc ggt atc gtc gtt gct
Leu Lys Thr Val Val Val Lys Ala Val Ser Ser Gly Ile Val Val Ala
135 140 145 150
gcc gca gcc gga aac gaa ggt tca tcc gga agc aca agc aca gtc ggc
Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser Gly Ser Thr Ser Thr Val Gly
155 160 165
tac cct gca aaa tat cct tct act att gca gta ggt gcg gta aac agc
Tyr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser Thr Ile Ala Val Gly Ala Val Asn Ser
170 175 180
agc aac caa aga gct tca ttc tcc agc gta ggt tct gag ctt gat gta
Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ser Glu Leu Asp Val
185 190 195
atg gct cct ggc gtg tcc atc caa agc aca ctt cct gga ggc act tac
Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr Leu Pro Gly Gly Thr Tyr
200 205 210
ggc gct tat aac gga acg tcc atg gcg act cct cac gtt gcc gga gca
Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
215 220 225 230
gca gcg cta att ctt tct aag cac ccg act tgg Aca aac gcg caa gtc
Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Thr Trp Thr Asn Ala Gln Val
235 240 245
cgt gat cgt tta gaa agc act gca aca tat ctt gga aac tct ttc tac
Arg Asp Arg Leu Glu Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Asn Ser Phe Tyr
250 255 260
tat gga aaa ggg tta atc aac gta caa gca gct gca caa taa
Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala Ala Ala Gln *
265 270 275
Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu
-105 -100 -95
Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Ala Gly Lys
-90 -85 -80 -75
Ser Ser Thr Glu Lys Lys Tyr Ile Val Gly Phe Lys Gln Thr Met Ser
-70 -65 -60
Ala Met Ser Ala Ala Lys Lys Lys Asp Val Ile Ser Glu Lys Gly Gly
-55 -50 -45
Lys Val Gln Lys Gln Phe Lys Tyr Val Asn Ala Ala Ala Ala Thr Leu
-40 -35 -30
Asp Glu Lys Ala Val Lys Glu Leu Lys Lys Asp Pro Ser Val Ala Tyr
-25 -20 -15
Val Glu Glu Asp His Ile Ala His Glu Tyr Ala Gln Ser Val Pro Tyr
-10 -5 1 5
Gly Ile Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gln Gly Tyr Thr
10 15 20
Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile Asp Ser Ser
25 30 35
His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro Ser Glu
40 45 50
Thr Asn Pro Tyr Gln Asp Gly Ser Ser His Gly Thr His Val Ala Gly
55 60 65 70
Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ala le Gly Val Leu Gly Val Ala Pro
75 80 85
Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Leu Val Asp Ser Thr Gly Ser Gly
90 95 100
Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ser Asn Asn
105 110 115
Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Thr Gly Ser Thr Ala
120 125 130
Leu Lys Thr Val Val Val Lys Ala Val Ser Ser Gly Ile Val Val Ala
135 140 145 150
Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser Gly Ser Thr Ser Thr Val Gly
155 160 165
Tyr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser Thr Ile Ala Val Gly Ala Val Asn Ser
170 175 180
Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ser Glu Leu Asp Val
185 190 195
Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr Leu Pro Gly Gly Thr Tyr
200 205 210
Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
215 220 225 230
Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Thr Trp Thr Asn Ala Gln Val
235 240 245
Arg Asp Arg Leu Glu Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Asn Ser Phe Tyr
250 255 260
Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala Ala Ala Gln *
265 270 275