技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及三七与化药阿司匹林联合或组合应用于心、脑血管疾病的预防和治疗，尤其涉及三七药材(根、剪口、筋条、茎叶等各种药材制成品)、三七提取物、三七有效部位及其三七制剂与阿司匹林在防治心、脑血管疾病的应用，同时减轻阿司匹林所致大鼠胃粘膜损伤，降低出血风险，显示增效减毒的作用。
背景技术
心、脑血管疾病二级预防，指对已经发生冠心病、脑梗塞和其它动脉粥样硬化性血管疾病的患者早发现、早诊断、早治疗，目的是改善症状、降低病死病残率，防止病情进展、改善预后，同时防止冠心病、脑梗塞等疾病的复发。目前临床常用的心、脑血管病二级预防药物是阿司匹林，主要目的是抗血小板聚集和释放，改善前列腺素与血栓素A2的平衡，预防动脉硬化血栓形成，防止冠心病或脑梗塞的复发。但是，阿司匹林存在一些不良反应如消化道出血，颅内出血以及阿司匹林抵抗等，影响了其使用。
中药具有多途径、多靶点的作用效果，对心、脑血管疾病的控制有其独特的优势，由于其重视整体调节，毒副作用小，因此得到临床医生的普遍认可。
三七作为五加科多年生草本植物三七的根，其味甘微苦，性湿，归肝、胃经，生品化瘀止血，消肿定痛，用于咯血吐血、跌打肿痛、外伤出血；熟品补血活血，用于失血、贫血。因此，三七是中医传统用于体内外各种出血之证及跌打损伤、瘀滞肿痛的要药。三七总皂苷是三七中的有效活性组分，国内外研究证明其具有抗氧化应激、抗炎作用，并具有明确的体内体外神经保护作用，可用于改善脑缺血、抑制血小板聚集、降低血液粘度、抗血栓等。但对三七总皂苷用于心、脑血管疾病作用机制未进行深入研究，更未见与阿司匹林等抗血小板药物联合应用的发现创造，研究开发三七总皂苷与阿司匹林联合应用可以充分发挥药物协同增效减毒的使用效果，提高其效用，为临床治疗与预防心脑血管性疾病提供一种更为安全有效的药物组合及使用方法。
发明内容
本发明提供了三七与阿司匹林联合或组合在防治心、脑血管疾病中的应用。特别在一级或二级预防中的应用。
本发明提供了三七与阿司匹林联合或组合在防治心、脑血管疾病、同时减轻阿司匹林所致大鼠胃粘膜损伤中的应用。
本发明将三七与阿司匹林联合或组合用于心、脑血管疾病预防及治疗，两者发挥协同增效作用，对于防治心、脑血管疾病具有良好效果，且同时减轻阿司匹林所致大鼠胃粘膜损伤。
本发明所述的三七包括市售产品，三七药材(根、剪口、筋条、茎叶等各种药材制成品)，由原药材按常规方法提取制备的三七提取物、三七有效组分及其三七制剂(含注射剂、口服各种制剂)。
本发明的三七提取物制备可以采用以下方法：水提法，水提醇沉法，萃取法，浸渍法，渗漉法，回流提取法，连续回流提取法，打孔树脂吸附法等。为更好发挥药效，优选对三七采用如下方法提取，但是这不能限制本发明的保护范围：取三七根粉碎后经乙醇提取，提取液回收乙醇并浓缩后加于大孔吸附树脂柱上，依次用水和乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇后干燥制得。
三七提取物中三七总皂苷的重量百分含量为55-90％。
本发明优选的技术方案为三七总皂苷与阿司匹林联合或组合用于心、脑血管疾病预防及治疗，且同时减轻阿司匹林所致大鼠胃粘膜损伤。
本发明提供了一种药物组合物：三七与阿司匹林及药学上可接受的载体制备成临床上任何可接受的剂型。优选三七总皂苷与阿司匹林组合。
本发明所述三七总皂苷与阿司匹林联合应用时，三七总皂苷的剂量范围是25-500mg/d，阿司匹林剂量范围是20-700mg/d。优选为，三七总皂苷的剂量范围是250-500mg/d，阿司匹林剂量范围是81-100mg/d。
本发明所述三七总皂苷与阿司匹林组合应用时：三七总皂苷与阿司匹林重量比为3-94：6-97。优选为，三七总皂苷与阿司匹林重量比为71-86：14-29。
本发明用药周期是1周至长期。
本发明所述药物组合物剂型选自片剂包括口崩片、缓释片、口崩片、缓释片、控释片；胶囊包括缓释胶囊、控释胶囊；口服液、糖浆、颗粒、滴丸、水针、冻干粉针、无菌粉针、或输液。
所述药学上可接受的载体选自填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、表面活性剂、吸附载体；溶剂、抗氧剂、助溶剂、吸附剂、渗透压调节剂、pH调节剂。
本发明三七与阿司匹林联合或组合在防治心、脑血管疾病中应用。两者发挥协同增效减毒作用，对于防治心、脑血管疾病且同时减轻阿司匹林所致大鼠胃粘膜损伤具有良好效果。
附图说明
图1三七总皂苷能显著减轻阿司匹林所致大鼠胃粘膜损伤
图2三七总皂苷可显著减轻阿司匹林所致大鼠十二指肠微绒毛损伤
具体实施方式
以下通过实验例来进一步阐述发明所述药物的有益效果，这些实验例包括了本发明组合物对脑血管疾病的防治作用。
实施例1：三七总皂苷与阿司匹林合用对大鼠心肌缺血再灌注损伤的协同增效作用。
1.试验动物
健康雄性SD大鼠(体重280-300g)由北京维通利华实验动物公司提供，于中国医学科学院药用植物研究所动物中心进行饲养。动物适应性饲养1周后进行试验。实验开展前经过中国医学科学院/北京协和医学院药用植物研究所实验动物管理与动物福利委员会审查批准。
2.试验方法
2.1动物分组和药物处理
240只雄性SD大鼠随机分为8组，每组30只，分别为：假手术组、心肌缺血再灌注损伤模型组、三七总皂苷(50mg/kg)组、阿司匹林(10mg/kg)组、阿司匹林(5mg/kg)组、三七总皂苷(50mg/kg)+阿司匹林(5mg/kg)组。三七总皂苷和阿司匹林处理组于前一周每日灌胃给药，假手术组和模型组大鼠则灌胃等量体积的蒸馏水。
2.2模型制作
戊巴比妥钠(按体重40mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，经口插管连接小动物呼吸机，呼吸频率70次/分，呼吸比例1:1，潮气量1mL，并采用AD Instruments多导生理记录仪实时记录大鼠心电图。将大鼠行胸廓切开术，于胸骨左侧约0.5cm处，3至4肋间剪开约2～3cm，用扩胸器撑开肋骨，呼气时剪开心包膜，暴露心脏。以左冠状静脉主干为标志，于肺动脉圆锥与左心耳之间，约左心耳下方2mm处，用6-0丝线进针穿过心肌表层约1～1.5mm，跨度为2～3mm。待稳定5min之后，将丝线穿过一根长约3.5cm的一次性静脉输液软管，线穿出后轻提线头，向下推软管，用止血钳夹紧后固定。缺血30min后，松开止血钳，除去结扎线后复灌1d、3d、7d以及14d，建立心肌缺血再灌注损伤模型。判断结扎成功的标准为：心电图中ST段抬高，局部心肌组织颜色由红变灰白；再灌注30min后，ST段回落50％以上，心肌颜色由灰白变红。
2.3心肌梗塞体积测量
心肌梗塞体积用四氮唑红(TTC)染色测定。大鼠(n＝5)于再灌注24h断颈处死，迅速取出心脏，置于-20℃冰箱短暂冷冻后，置于冰盘上切成厚度为2mm的5片，将心脏切片置于1.5mL 2％TTC溶液中避光孵育30min，再将心脏切片置10％多聚甲醛中固定过夜，再进行拍照分析。使用Image-Pro plus 5.1软件对心肌梗塞体积进行测量计算。
2.4心肌三酶指标检测
复灌结束后，腹主动脉取血，用全自动生化仪检测血浆中的心肌三酶(AST、LDH、CK)水平。
3.实验结果
3.1三七总皂苷与阿司匹林合用能够减少心肌缺血再灌注损伤诱导心肌梗死体积
如表-1所示，与假手术组比较，心肌缺血再灌注损伤模型组心肌梗死体积显著增加；与模型组比较，三七总皂苷和阿司匹林处理组心肌梗死体积显著减少。与阿司匹林(10mg/kg)单用组比较，三七总皂苷(50mg/kg)与阿司匹林(5mg/kg)合用组心肌梗死体积显著减少。
表-1三七总皂苷与阿司匹林合用能够减少心肌缺血再灌注损伤诱导心肌梗死体积(n＝10,)
注：##，P<0.01vs假手术组；**，P<0.01vs模型组；&&，P<0.01vs三七总皂苷或阿司匹林组。
3.2三七总皂苷与阿司匹林合用能够降低缺血再灌注损伤心肌组织的AST、LDH、CK活性
如表-2所示，与假手术组比较，缺血再灌注损伤模型组心肌组织中AST、LDH、CK显著增加；与模型组比较，三七总皂苷和阿司匹林处理组心肌组织中AST、LDH、CK显著减少。与阿司匹林(10mg/kg)单用组比较，三七总皂苷(50mg/kg)与阿司匹林(5mg/kg)合用组心肌组织中AST、LDH、CK显著减少。
实施例2：三七总皂苷与阿司匹林合用对大鼠脑缺血再灌注损伤的协同增效作用。
1.试验动物
健康雄性SD大鼠由北京维通利华实验动物公司提供，于中国医学科学院药用植物研究所动物中心进行饲养。动物适应性饲养1周后进行试验。实验开展前经过中国医学科学院/北京协和医学院药用植物研究所实验动物管理与动物福利委员会审查批准。
2.试验方法
2.1动物分组和药物处理
240只雄性SD大鼠随机分为8组，每组30只，分别为：假手术组、脑中动脉栓塞(MCAO/R)模型组、三七总皂苷(50mg/kg)组、阿司匹林(10mg/kg)组、阿司匹林(5mg/kg)组、三七总皂苷(50mg/kg)+阿司匹林(5mg/kg)组。三七总皂苷和阿司匹林处理组于MCAO前一周每日灌胃给药，假手术组和MCAO模型组大鼠则灌胃等量体积的蒸馏水。
2.2大脑中动脉阻塞(MCAO)模型
采用线栓法制作大脑中动脉阻塞(MCAO)模型，手术过程严格无菌操作，主要手术过程如下：氯胺酮(80mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，分离出颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，用微动脉夹夹闭颈总动脉，用双极电凝笔电凝颈外动脉的分支。游离颈外动脉主干，在距颈总动脉分叉3～4mm处结扎。微动脉夹暂时夹闭颈内动脉，眼科剪将颈外动脉剪一小口，插入甲聚硅氧烷涂布的4-0单丝尼龙线，在颈外动脉剪口处打一松节以阻断颈内动脉的血液返流，去除颈内动脉的微动脉夹，轻推尼龙线进入颈内动脉，到达颅内的大脑前动脉，阻断大脑中动脉(MCA)的开口，插入深度约18-22mm。去除颈总动脉的微动脉夹，消毒后逐层缝合皮下组织和皮肤，于术后2h缓慢抽出尼龙线进行再灌注24h。假手术组除了不插入尼龙线外,其它一切操作相同。所有大鼠在整个实验过程中的直肠温度维持在37℃。
2.3神经功能评价
按照Longa的5级评分方法对所有大鼠进行神经行为评分。Longa评分标准:0，正常，无神经功能缺损；1,左前肢伸展障碍，功能减弱；2，向左打圈，左前肢瘫痪，功能严重减弱,提起大鼠尾巴后，大鼠不停的扭向受损区；3,行走时向左侧倾倒；4,肢体瘫痪，意识昏迷；5，死亡。
2.4脑含水量测量
干湿重法测定脑组织含水量，首先取大鼠(n＝10)脑组织置于坩埚内，称重后，分别记录，然后将已编号的脑组织置于110℃的烤箱中烘烤24h以上至恒重后，称取干脑重量，根据以下公式计算脑组织含水量百分比：脑组织含水量＝(湿重-干重)/湿重×100％
2.5脑梗塞体积测量
脑梗塞体积用四氮唑红(TTC)染色测定。大鼠(n＝5)于再灌注24h断颈处死，迅速取出全脑，置于-20℃冰箱短暂冷冻后，置于冰盘上去掉嗅球，将前脑沿冠状面切成厚度为2mm的5片，将脑片置于1.5mL 2％TTC溶液中避光孵育30min，再将脑片置10％多聚甲醛中固定过夜，再进行拍照分析。使用Image-Pro plus 5.1软件对脑梗塞体积进行测量计算。
2.5血小板最大聚集率测定
动物(n＝10)取血3.6mL，用3.8％枸橼酸钠抗凝(9:1)，150g离心10min，分离出富血小板血浆，再以1500g离心10min，取上清液得到贫血小板血浆。取富血小板血浆0.3mL于比浊管内，以贫血小板血浆调透光度，二磷酸腺苷(ADP)作诱导剂(终浓度为2μmo l/L)，用血液凝聚仪检测富血小板血浆中血小板在5min内的最大聚集和最大聚集时间。
2.6氧化应激指标、犬尿素和炎症因子检测
动物(n＝8)腹主动脉取血5mL，3000转离心10min取血清。取脑组织，分离海马和大脑皮层，组织匀浆，3000转离心10min取上清。南京建成试剂盒检测血清MDA、SOD、CAT和GSH-Px水平；ELISA试剂盒检测犬尿素以及炎症反应指标MCP-1、TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6和IL-10水平。
2.7数据统计
利用SPSS统计软件进行统计分析。采用非配对的t检验和One-way ANOVA对计量数据进行统计分析，P<0.05为具有统计学差异。
3.实验结果
3.1三七总皂苷与阿司匹林合用能够改善MCAO/R诱导大鼠神经功能缺损
如表-3所示，与假手术组比较，MCAO/R模型组神经功能缺损评分显著增加；与MCAO/R模型组比较，三七总皂苷和阿司匹林处理组神经功能缺损评分显著减少。与阿司匹林(10mg/kg)单用组比较，三七总皂苷(50mg/kg)与阿司匹林(5mg/kg)合用组神经功能缺损评分显著减少。
表-3三七总皂苷与阿司匹林合用能够改善MCAO/R诱导大鼠神经功能缺损(n＝10,)
注：#，P<0.05vs假手术组；##，P<0.01vs假手术组；*，P<0.05vs MCAO/R模型组；**，P<0.01vs MCAO/R模型组；&，P<0.05vs三七总皂苷或阿司匹林组。
3.2三七总皂苷与阿司匹林合用能够减少MCAO/R诱导大鼠脑梗死体积
如表-4所示，与假手术组比较，MCAO/R模型组脑梗死体积显著增加；与MCAO/R模型组比较，三七总皂苷和阿司匹林处理组脑梗死体积显著减少。与阿司匹林(10mg/kg)单用组比较，三七总皂苷(50mg/kg)与阿司匹林(5mg/kg)合用组脑梗死体积显著减少。表-4三七总皂苷与阿司匹林合用能够改善MCAO/R诱导大鼠脑梗死体积(n＝10,)
注：#，P<0.05vs假手术组；##，P<0.01vs假手术组；*，P<0.05vs MCAO/R模型组；**，P<0.01vs MCAO/R模型组；&&，P<0.01vs三七总皂苷或阿司匹林组。
3.3三七总皂苷与阿司匹林合用能够降低血小板最大聚集率
如表-5所示，与假手术组比较，MCAO/R模型血小板最大聚集率显著增加；与MCAO/R模型组比较，三七总皂苷和阿司匹林处理组能显著降低血小板最大聚集率。与阿司匹林(10mg/kg)单用组比较，三七总皂苷(50mg/kg)与阿司匹林(5mg/kg)合用组血小板最大聚集率增加，无显著性差异。
表-5三七总皂苷与阿司匹林合用能够减少血小板最大聚集率(n＝10,)
注：#，P<0.05vs假手术组；##，P<0.01vs假手术组；*，P<0.05vs MCAO/R模型组；**，P<0.01vs MCAO/R模型组。
3.4三七总皂苷与阿司匹林合用能够降低血清中的炎症因子和增加抗炎症因子
如表-6所示，与假手术组比较，MCAO/R模型大鼠的血清IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、MCP-1均显著增加；与MCAO/R模型组比较，三七总皂苷和阿司匹林处理组大鼠的血清IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1显著减少，IL-4和IL-10显著增加；与阿司匹林(10mg/kg)单用组比较，三七总皂苷(50mg/kg)与阿司匹林(5mg/kg)合用组IL-6、MCP-1显著减少，IL-10显著增加。
3.5三七总皂苷与阿司匹林合用能够降低血清、海马和大脑皮层组织中的犬尿素水平
如表-7所示，与假手术组比较，MCAO/R模型血清、海马和大脑皮层组织中的犬尿素水平显著升高；与MCAO/R模型组比较，三七总皂苷和阿司匹林处理组能够显著降低血清、海马和大脑皮层组织中的犬尿素水平。与阿司匹林(10mg/kg)单用组比较，三七总皂苷(50mg/kg)与阿司匹林(5mg/kg)合用组血清、海马和大脑皮层中犬尿素水平显著降低。
实施例3：三七总皂苷可抑制阿司匹林诱发胃肠粘膜损伤作用
1.试验动物
健康雄性SD大鼠(体重280-300g)由北京维通利华实验动物公司提供，于中国医学科学院药用植物研究所动物中心进行饲养。动物适应性饲养1周后进行试验。实验开展前经过中国医学科学院/北京协和医学院药用植物研究所实验动物管理与动物福利委员会审查批准。
2.试验方法
2.1动物分组和药物处理
40只雄性SD大鼠随机分为4组，每组10只，分别为：空白对照组、阿司匹林(10mg/kg)组、三七总皂苷(100mg/kg)+阿司匹林(10mg/kg)组、三七总皂苷(100mg/kg)组。三七总皂苷和阿司匹林处理组于每日灌胃三七总皂苷和阿司匹林，共给药4周，空白对照组大鼠则每日灌胃等量体积的生理盐水。
2.2HE染色检测胃粘膜病理改变
给药4周后，取各组大鼠的胃组织，4％甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片、HE染色观察组织的炎症病变程度。
2.3透射电镜检测十二指肠绒毛超微结构
给药4周后，取各组大鼠的十二指肠，在2.5％戊二醛缓冲液中固定2h，然后使用PH7.4缓冲液清洗3次，再使用1％四氧化锇浸泡30min，分级酒精和丙酮脱水，然后嵌入环氧树脂812中；制备超薄切片，取200网格单位的铜网格，再次用醋酸双氧铀及柠檬酸铅浸染，然后在电镜下观察各组大鼠的十二指肠超微结构变化。
3.实验结果
3.1三七总皂苷能显著减轻阿司匹林所致大鼠胃粘膜损伤
如图1所示，与空白对照组比较，阿司匹林组大鼠胃粘膜上皮细胞坏死，炎性细胞浸润。与阿司匹林组比较，三七总皂苷可显著减轻阿司匹林所致胃粘膜上皮细胞坏死和炎性细胞浸润。三七总皂苷单用对大鼠胃粘膜无显著影响。
3.2三七总皂苷可显著减轻阿司匹林所致大鼠十二指肠微绒毛损伤
如图2所示，与空白对照组比较，阿司匹林组大鼠十二指肠表面微绒毛减少。与阿司匹林组比较，三七总皂苷可显著减轻阿司匹林所致十二指肠表面微绒毛减少。三七总皂苷单用对大鼠胃粘膜无显著影响。
显然，本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所做的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。