技术领域
本发明涉及一种组合物及其应用，特别涉及一种含大麻提取物、透明质酸或其药学上可接受的盐的组合物及其应用。
背景技术
大麻(学名：Cannabis sativa L.)大麻科、大麻属植物，又名麻、汉麻、火麻、山丝苗、黄麻，具有重要的农用及医用价值。大麻植株，不同部位均有良好的应用价值，常见使用部位有大麻根、大麻籽、大麻秆、大麻花及大麻叶等。
大麻秆具有和硬木类似的物理机械性能，大麻秆芯是大麻秆去除韧皮纤维后剩余的部分，形态为中空结构，中腔呈线形或椭圆形，常与外形不一，纤维横截面有许多微细孔隙，这种结构使得大麻秆芯富含氧气较多，使厌氧菌无法生存。大麻秆及秆芯产量较高，有利于工业化应用。
大麻花，又称“麻勃”，雄株花絮疏松，为复总状花序，有花柄，风媒传粉，开阔地能传播近12km；雌株花序紧密，为穗状花序，雌花很小，无花柄、花瓣，每朵花只有一个雌蕊，由一片绿色苞叶包着。
大麻叶有单叶和复叶，且多为掌状复叶，叶序为对生和互生，叶片绿色，上有短茸毛，容易脱落。叶子由叶柄支撑，叶柄长度一般在3-15cm之间，生长旺盛时，叶子的质量占整个植株质量的25％左右；在生长后期，由于叶子的脱落等因素，叶子质量仅占整个植株质量的8-14％。
大麻花、叶中含有多酚、黄酮和植物碱等活性成分，大麻花、叶的提取物具有较好的清除自由基的能力，对UVB和UVA的吸收率都超过80％，这表明大麻花、叶含有抗氧化和抗紫外线的活性成分。
大麻素是大麻中特有的萜类次生代谢产物，具有复杂的生物活性，目前已分离得到70多种大麻素，其中主要活性成分为四氢大麻酚(THC)和大麻二酚(CBD)。THC与CBD均具有神经保护作用。THC因具有强致幻性其应用受限，CBD无成瘾性且具有抗痉挛、抗风湿关节炎及抗焦虑作用，越发成为研究热点。
透明质酸，又名玻璃酸，是一种酸性粘多糖。它是肌肤水嫩的重要基础物质，本身也是人体的一种成分，它具有特殊的保水作用，份量更高达其本身重量的100倍，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子。它可以改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老，在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂。与其他营养成分配合使用，可以起到促进营养吸收的理想效果。
痤疮是一种常见的皮肤炎症性疾病，以粉刺、丘疹、脓疱、结节、囊肿及瘢痕为其特征，常伴皮脂溢出。正值青春期发育的群体，是患痤疮的高发年龄段，特别是油性肤质的人群。一般症状较为轻微，但是处理不当常常遗留有不同程度的凹陷或增生性瘢痕。中医辨瘢痕为血瘀之证，故治疗药物多取活血化瘀之品；现代医学则认为瘢痕形成的具体机制尚不明确，一般认为瘢痕形成过程中存在成纤维细胞过度增殖及凋亡抑制。
在痤疮的治疗方面，市售中成药以口服为主，外用较少，多以清热解毒、活血祛瘀为主要功效，西药方面外用产品居多，如他莫替芬、维A酸类药物、肉毒碱、博来霉素、TNF-α等大多从抑制成纤维细胞角度在瘢痕治疗上发挥作用，但由于作用不明确、疗效差、复发率较高、难根治等问题，影响了在治疗中的推广应用。
本申请发明人通过工艺探索，将大麻植株各部位以提取物形式，与透明质酸或其药学上可接受的盐相组合，并结合药学或化妆品领域可接受的载体或赋形剂，制成药品或化妆品。发现其对细菌有明显的杀灭、抑制作用，尤其是对引发痤疮的丙酸杆菌有显著抑制、杀灭作用。除此以外，该组合物还能促进细胞增殖、抗氧化、对痤疮引起的瘢痕有明显的修复功效，取得了意想不到的、有益技术效果。
发明内容
结合目前治疗痤疮的药品或化妆品的研究现状，本发明所要解决的技术问题在于：如何提供一种新的，基于植物提取物的治疗和/或预防痤疮的药物。
为了实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明提供了一种药品或化妆品，其主要包括如下成份：大麻提取物、透明质酸或其药学上可接受的盐、一种或多种药品或化妆品领域可接受的载体或赋形剂。
优选地，本发明所述的大麻提取物，在所述药品或化妆品中的质量含量为1-60％。
优选地，本发明所述的大麻提取物，其提取部位是植物大麻Cannabis sativaL.的秆芯、花、叶、根中的一种或任意两种及以上以任意比例的组合。
进一步优选的，所述大麻提取物，可以是将不同的植物部位分别提取形成的提取物或提取物的组合，如大麻秆芯提取物、大麻花提取物、大麻叶提取物、大麻根提取物，或，大麻秆芯提取物、大麻花提取物、大麻叶提取物、大麻根提取物中两种或两种以上的组合；
进一步优选的，所述大麻提取物，可以是将不同的植物部位或其组合同时提取，得到的提取物或提取物的组合，即秆芯、花、叶和根中的一种或两种及以上的组合的提取物或提取物的组合。如大麻花与叶的提取物，大麻秆芯与花、叶的提取物，大麻秆芯和花的提取物，大麻秆芯和叶的提取物，大麻花与根的提取物，大麻秆芯、叶与根的提取物，大麻花、叶、秆芯与根的提取物。
优选的，所述大麻提取物中，大麻二酚CBD的质量含量为0.1-99％，优选质量含量为0.5-80％，更优选为5-60％。
优选的，所述的大麻提取物可采用现有技术中常规的植物提取方法来制备，如溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、升华法、超临界流体萃取、膜提取分离技术、等等；优选的，可采用溶剂提取法，提取溶剂可为：低分子醇(如甲醇、乙醇、丁醇或者丙醇)、乙酸酯(如乙酸甲酯或者乙酸乙酯)、酮(如丙酮)、醚(如甲醚或者乙醚)、低沸点的脂肪烃或者芳香烃或者氯化烃等；提取的工艺可为加热回流，还可结合其他提取分离方式如萃取、蒸馏、结晶、色谱分离等中的一种或多种的组合对提取物进行进一步的提纯分离。
优选地，本发明所述的大麻提取物为大麻花、叶提取物，更优选为大麻叶提取物。
优选地，本发明所述的透明质酸或其药学上可接受的盐在所述药品或化妆品中的质量含量为0.1-10％，所述盐优选为透明质酸钠。
优选地，本发明所述透明质酸可以是分子量范围180万-220万的大分子透明质酸、分子量范围100万-180万的中分子透明质酸、分子量范围1万-100万的小分子透明质酸中的一种或任意两种及以上以任意比例的组合。
更优选地，本发明提供了一种药品或化妆品，其由1-60％的大麻提取物大麻二酚、0.1-10％的透明质酸或其盐、一种或多种药学或化妆品领域可接受的载体或赋形剂组成。
优选地，本发明所述的组合物，其剂型可以是药学或者化妆品领域可接受的任何剂型，优选为膏剂、乳剂、喷雾剂、凝胶剂、贴剂。
优选地，本发明所述的药品或者化妆品的应用，所述的应用是指用于人所患痤疮的治疗和/或预防。
优选地，本发明所述的药品或者化妆品的应用，所述的应用尤其包括在治疗痤疮引起的瘢痕修复方面的应用。
本发明的优点和效果在于：本品以植物提取物为主要活性成分能抑制成纤维细胞生成，使皮肤愈后不留痕迹。本品无任何刺激和不良反应，适宜各种皮质和各年龄段人群使用。
附图说明
图1：倒置显微镜观察瘢痕成纤维细胞形态学变化，左图为对照组，右图为本发明所得产物组。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：大麻提取物的制备
(1)将原材料大麻秆芯、大麻花、大麻叶和/或大麻根洗净风干；
(2)将上述风干后的原材料粉碎至10-40目；
(3)将所得粉末，用4-8倍量、30％-60％的乙醇冷浸提取1-3次，每次0.5-2小时；
(4)合并提取液，经0.1-1wt％活性炭吸附脱色；
(5)70℃温度条件下，减压浓缩至相对密度1.01-1.03；
即得大麻提取物浸膏，如大麻秆芯提取物、大麻花提取物、大麻叶提取物，或其中两种或三种提取物的组合。
实施例2：大麻提取物的制备
(1)使用约8-10倍重量的提取溶剂或其混合物对大麻的秆芯、花、叶和/或根加热回流至少1小时；
(2)过滤除去残余物，真空条件下除去溶剂；
(3)将获得的浸膏在温度约110-135℃加热约40分钟；
(4)随后进行色谱分离。
所述提取溶剂可以为低分子醇(如甲醇、乙醇、丁醇或者丙醇)；乙酸酯(如乙酸甲酯或者乙酸乙酯)；酮(如丙酮)；醚(如甲醚或者乙醚)；低沸点的脂肪烃或者芳香烃或者氯化烃。
所述色谱分离，用于色谱法的流动相混合物由甲醇/水和乙酸或者乙醇/水和乙酸组成。
实施例3：大麻提取物的制备
(1)使用约3-10倍重量的提取溶剂或其混合物对大麻的秆芯、花、叶和/或根加热回流至少1小时；
(2)过滤除去残余物；
(3)用1％-10％的氢氧化钠水溶液至少萃取两次，所述氢氧化钠水溶液中含有约20wt％的乙醇；
(4)将萃取液与5％的硫酸溶液混合以使pH值约2-4；
(5)然后使用低沸点溶剂(如低沸点脂肪烃、芳香烃、氯代烃、乙酸甲酯、乙酸乙酯或者其混合物)提取至少两次，低温真空下除去溶剂；
(6)随后进行色谱分离.
所述提取溶剂可以为低分子醇(如甲醇、乙醇、丁醇或者丙醇)；乙酸酯(如乙酸甲酯或者乙酸乙酯)；酮(如丙酮)；醚(如甲醚或者乙醚)；低沸点的脂肪烃或者芳香烃或者氯化烃。
所述色谱分离，用于色谱法的流动相混合物由甲醇/水和乙酸或者乙醇/水和乙酸组成。
经检测，上述实施例1、实施例2、或实施例3方法制得的大麻提取物，其中大麻二酚CBD的含量在0.1-99％之间。
实施例4：本发明所述药品的制备
配方：大麻提取物0.5g、透明质酸0.5g、预胶凝淀粉2g、微晶纤维素(赋形剂)4g、硬脂酸镁0.5g、乳糖1g。
制法：按照本领域普通人员熟知的制备方法，制备含上述配方的片剂，记为产物1。
实施例5：本发明所述化妆品的制备
配方：
A相：大麻叶提取物(CBD含量0.1％)60％、透明质酸0.1％、1,3-丁二醇4％、卡波姆0.15％、去离子水19.75％
B相：鲸蜡硬脂基葡糖苷3％、辛酸/癸酸甘油三酯5％、霍霍巴油3％、甘油硬脂酸酯类2％、小麦胚芽油2％
C相：10％氢氧化钠0.15％
D相：苯氧乙醇0.6％、乙基己基甘油0.15％、香精0.1％
制法：将A相和B相分别在良好搅拌下加热至85℃和80℃，充分溶解均匀后，将B相缓慢加入到A相中，搅拌均质并使两相充分均匀混合，然后加入C相调节pH至6-7，搅拌冷却到40℃加入D相各料，继续搅拌冷却到30℃，检测合格，过滤出料即可，记为产物2。
实施例6：本发明所述化妆品的制备
配方：
A相：大麻叶提取物(CBD含量99％)1％、透明质酸钠10％、尼泊金甲酯0.12％、甘油5％、1,3-丁二醇5％、去离子水76.08％
B相：库拉索芦荟叶粉0.5％、双(羟甲基)咪唑烷基脲0.3％
C相：聚丙烯酸钠2％
制法：将A相搅拌下加热至80℃，加入C相混合均匀，降温、搅拌冷却到40℃，加入B相各料，搅拌均匀后，继续降温至30℃,检测合格后，过滤即得，记为产物3。
实施例7：本发明所述化妆品的制备
配方：
A相：尼泊金甲酯0.12％、甘油5％、去离子水64.58％
B相：大麻叶提取物(CBD含量30％)20％、透明质酸钠5％
C相：聚丙烯酸钠5％
D相：双(羟甲基)咪唑烷基脲0.3％
制法：将A相搅拌加热至80℃，充分溶解后，加入B相、C相各料，混合均匀后，降温至45℃，加入D相搅拌均匀，继续降温至30℃,检测合格后，过滤即得，记为产物4。
实施例8：本发明所得产物抗菌试验
一、实验原理
通过体外抑菌实验，以最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)指标评价本发明制备的产物对常见菌株的抗菌作用。
二、实验方法
菌液制备：挑取斜面菌种接种于20％牛浸汁培养基中，37℃培养过夜，再用20％牛浸汁培养基将菌液稀释至10cfu/mL，立即接种。
MIC测定：采用液体试管连续稀释法，用20％牛浸汁培养基将样品作连续对倍稀释。将1.0mL加入灭菌试管中，每管加入0.05mL标准新鲜菌液，并设菌株对照及溶媒对照组，37℃培养18-24小时，观察细菌生长情况，以无菌生长的最高稀释度为MIC，平行三次，取平均值。
MBC测定：采用平板划线接种法，从被判为MIC及MIC相邻两管的培养基中挑取培养液接种至10％血清MH肉汤琼脂平板上，37℃培养18-24小时，以生长菌落≤5个的最高稀释度为MBC，平行三次，取平均值。
试验结果见表1本发明所得产物体外抗菌试验结果。
表1本发明所得产物体外抗菌试验结果
由表1可知，本发明所得的产物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、丙酸杆菌、白色念珠菌，均具有不同程度的抑制和杀灭作用，适宜应用于痤疮的治疗及预防。
实施例9：透明质酸酶活性抑制实验
一、实验原理
高分子量透明质酸在调节伤口愈合的无疤痕修复中起重要作用，可以明显减少炎症反应。但透明质酸的降解产物可以增加伤口愈合过程中的炎症反应，透明质酸的降解反应取决于透明质酸酶的活性，对透明质酸酶活性的抑制作用，可以作为物质抗炎症反应的指标。同时，由于透明质酸是保湿类护肤品中公认且广泛使用的功效添加原料，对透明质酸酶活性的直接抑制，也可起到协同保湿的功效。透明质酸酶在酸性环境下，可以将底物透明质酸水解，转化成N-乙酰基葡糖胺。N-乙酰基葡糖胺与二甲基氨基苯甲醛产生呈色反应，根据颜色深浅，确定透明质酸酶的活性大小。
二、实验方法
在样品管和样品对照管中各加入400ul对应产物的样品溶液(pH3.5乙酸缓冲液配置，产物浓度0.2g/mL)，阴性对照管和空白对照管中以400ul乙酸缓冲液代替；样品管和阳性对照管内加入50ul(16000U/ml)透明质酸酶溶液混匀，样品对照管和阴性对照管加入等体积乙酸缓冲液混匀，37℃水浴20分钟。各反应管分别加入12.5mM氯化钙100ul，37℃水浴20分钟。加入0.24％透明质酸钠250ul，37℃水浴40分钟。加入0.4M盐酸100ul和0.4M四硼酸钠100ul，煮沸3分钟，冷却至室温。加入1％二甲基氨基苯甲醛溶液3ml，37℃水浴20分钟，在分光光度计585nm比色测定吸光值(Abs)。
计算对透明质酸酶活性的抑制率：
抑制率(％)＝(1-(T-T0)/(C-C0))×100％
式中：T-样品管Abs；T0-样品对照管Abs；C-阴性对照管Abs；C0-空白对照管Abs。
在此试验浓度下(产物浓度0.2g/mL)，抑制率达到50％以上，即可认定为有效。
三、实验结果
表2本发明所得不同产物的透明质酸酶活性抑制情况
物质 抑制率(％) 产物1 65.8 产物2 62.4 产物3 79.5 产物4 68.3
由表2可知：本发明所得产物，对透明质酸酶活性抑制率均在50％以上，具有较强的抗炎及协同保湿效果。
实施例10：本发明所得产物的抗瘢痕增生活性测定
1、实验样品和对照样品制备
将本发明所述实施例4所得产物1，用1％DMSO培养基溶液溶解，并稀释成0.1mg/ml，0.5mg/ml和1.0mg/ml浓度的样品。
细胞株：HSF细胞株(人增生性瘢痕成纤维细胞株)
2、瘢痕成纤维细胞形态学观察
选取处于对数生长期的第4-6代人增生性瘢痕成纤维细胞株。用0.25％胰酶消化，血清中和，并吹打成细胞悬液。将所得细胞悬液转移到离心管中，1500r/min转数、离心5min，弃上清。向离心管中加入4ml DMEM反复吹打，并在显微镜下计数。以10000个细胞/ml的浓度接种至96孔板，每孔100μl；留5孔仅加培养液作为空白孔。CO2恒温培养箱中培养24h(5％CO2，37℃)。待细胞贴壁后吸出原液，设立对照组与本发明产物组，每个样本均设5个复孔。对照组换液，每孔加入1％DMSO溶液培养基100μl；实验组分别加入含不同浓度的样品溶液各100μl，在CO2恒温培养箱中继续培养。分别在16h和32h两个时间段在倒置显微镜下摄像。
3、MTT比色法观测瘢痕成纤维细胞活力
分别在培养16h和32h摄像后，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl继续培养4h。每孔加入100μl三联溶解液，置37℃恒温箱放置过夜(避光)培养，以空白孔调零，在酶联免疫分光仪波长上检测为570nm处的吸收值(OD值)。
统计方法：计量资料用x±s描述，实验结果如表3所示。
表3本发明所得产物对瘢痕成纤维细胞增殖的抑制作用
倒置显微镜观察瘢痕成纤维细胞形态学变化(如图1所示)：
由左图可知，对照组细胞外形狭长，胞核呈梭形、走向趋于一致，多呈平行排列并有一定弧度。细胞中央有圆形或卵圆形核，部分细胞可见向外伸出2-3个长短不一的突起，为成纤维细胞。随着培养时间的增加，细胞数量增多，细胞间隙变窄，呈条索状分布。
由右图可知，本发明所述产物组在浓度达到0.5mg/ml后可见细胞变短，数量减少，细胞间隙增大，与邻近细胞接触减少，显示本发明所得产物对成纤维细胞有一定的抑制作用。
实施例9：人体安全试验
本试验符合《化妆品安全技术规范》中人体安全性检验方法的相关规定.本试验前已完成必要的毒理学检验，检验结果为合格。
人体皮肤斑贴试验-皮肤封闭型斑贴试验
1.试验目的
检测受试物引起人体皮肤不良反应的潜在可能性。
2.试验材料
2.1试验物质
本发明所述实施例所得产物2、3、4，共3个产品。
2.2斑试材料
面积不超过50mm2、深度约1mm的合格斑试器材。
3.受试者的选择
符合要求的社会志愿者150名，年龄20-45岁，男、女各半，按产品分为3组，每组50名，按组分别试用实施例产物2、3、4。
4.试验方法
4.1分别取受试产品0.020g-0.025g(固体或半固体)或0.020ml-0.025ml(液体)，放入斑试器小室内。
4.2对照孔不做任何处理。
4.3将加有受试物的斑试器用低致敏胶带贴敷于受试者的背部或前臂曲侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24h。
4.4分别于去除受试物斑器后30min(待压痕消失后)、24h和48h按表4标准观察皮肤反应。
表4皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准
5.试验结果
表5皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应结果
样品 评分等级 皮肤反应 产物2 0 阴性反应 产物3 0 阴性反应 产物4 0 阴性反应
6.结论
本发明实施例所得产物的试验结果均呈现阴性反应，证明本发明提供的化妆品安全性有保证，不会产生皮肤刺激性、致敏性(易过敏人群或对本品过敏的人群除外)等不良反应。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。