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对萼猕猴桃叶总黄酮提取物及其制备方法和用途.pdf

  • 上传人：C***
  • 文档编号：8423806
  • 上传时间：2020-06-25
  • 格式：PDF
  • 页数：14
  • 大小：743.05KB
    • 摘要
    申请专利号：

    CN201510213327.1

    		 申请日：

    20150429
    公开号：

    CN104784226B

    		 公开日：

    20180209
    当前法律状态：

    		有效性：

    有效
    法律详情：

    IPC分类号：

    A61K36/185,A61P9/10,A23L33/105

    		 主分类号：

    A61K36/185,A61P9/10,A23L33/105
    申请人：

    中国人民解放军第二军医大学
    发明人：

    辛海量
    地址：

    200433 上海市杨浦区翔殷路800号
    优先权：

    CN201510213327A
    专利代理机构：

    上海卓阳知识产权代理事务所(普通合伙)

    		 代理人：

    马伟
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    内容摘要

    本发明涉及一种对萼猕猴桃叶总黄酮提取物及其制备方法和用途，所述的制备方法包括制备提取液、浓缩、除杂、干燥、粉碎步骤。本发明的制备方法具有对山柰酚‑3‑O‑α‑L‑鼠李糖基‑(1→3)‑α‑L‑鼠李糖基‑(1→6)‑β‑D‑吡喃半乳糖苷、对萼猕猴桃苷E和F提取得率高、工艺简便、成本低廉、安全高效、有机溶剂残留低等显著优点。本发明的对萼猕猴桃叶总黄酮提取物经药理实验证实具有显著的抗心肌缺血作用，因此可用于制备抗心肌缺血相关病症的药物、保健品及食品。

    权利要求书

    1.一种对萼猕猴桃叶总黄酮提取物，其特征在于，所述的对萼猕猴桃叶总黄酮提取物的制备方法包括以下步骤：(A)制备提取液将对萼猕猴桃叶原料用提取溶剂提取，合并，过滤，即得提取液；所述的提取溶剂为体积分数10％-40％的乙醇或甲醇水溶液；(B)浓缩将上述提取液回收至无醇味，即得浓缩液；(C)除杂将上述浓缩液过大孔树脂吸附，用乙醇或甲醇水溶液洗去杂质，再以洗脱剂洗脱药用部位，收集洗脱液；所述的大孔吸附树脂型号选自HPD300、D101、AB-8、D1400、HPD100、D860、DM301、DM1300、D4020、HPD500、DM130、HPD600、D520、D4006、D4006和H103；本步骤除杂所用乙醇或甲醇水溶液为体积分数10％-95％的乙醇或甲醇水溶液；所述的洗脱剂为体积分数40％-95％乙醇或甲醇水溶液；(D)干燥、粉碎将上述洗脱液浓缩、干燥、粉碎，即得所述的对萼猕猴桃叶总黄酮提取物。 2.根据权利要求1所述的对萼猕猴桃叶总黄酮提取物，其特征在于，所述的大孔吸附树脂型号选自HPD300、D101和AB-8。 3.根据权利要求2所述的对萼猕猴桃叶总黄酮提取物，其特征在于，所述的大孔吸附树脂型号选自HPD300。 4.根据权利要求1所述的对萼猕猴桃叶总黄酮提取物，其特征在于，除杂所用乙醇或甲醇水溶液为体积分数10％-30％的乙醇或甲醇水溶液。 5.根据权利要求4所述的对萼猕猴桃叶总黄酮提取物，其特征在于，除杂所用乙醇或甲醇水溶液为体积分数20％的乙醇或甲醇水溶液。 6.根据权利要求1所述的对萼猕猴桃叶总黄酮提取物，其特征在于，所述的洗脱剂为体积分数60％乙醇或甲醇水溶液。 7.权利要求1-6任一所述的对萼猕猴桃叶总黄酮提取物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：(A)制备提取液将对萼猕猴桃叶原料用提取溶剂提取，合并，过滤，即得提取液；所述的提取溶剂为体积分数10％-40％的乙醇或甲醇水溶液；(B)浓缩将上述提取液回收至无醇味，即得浓缩液；(C)除杂将上述浓缩液过大孔树脂吸附，用乙醇或甲醇水溶液洗去杂质，再以洗脱剂洗脱药用部位，收集洗脱液；所述的大孔吸附树脂型号选自HPD300、D101、AB-8、D1400、HPD100、D860、DM301、DM1300、D4020、HPD500、DM130、HPD600、D520、D4006、D4006和H103；本步骤除杂所用乙醇或甲醇水溶液为体积分数10％-95％的乙醇或甲醇水溶液；所述的洗脱剂为体积分数40％-95％乙醇或甲醇水溶液；(D)干燥、粉碎将上述洗脱液浓缩、干燥、粉碎，即得提取物。 8.权利要求1-6任一所述的对萼猕猴桃叶总黄酮提取物在制备抗心肌缺血的药物、保健品或食品中的用途。

    说明书

    技术领域

    本发明涉及医药技术领域，具体地说，涉及一种对萼猕猴桃叶总黄酮提取物及其制备方法和用途。

    背景技术

    心肌缺血是指各种原因引起的冠状动脉血流量降低，致使心肌氧等物质供应不足和代谢产物清除减少的临床状态。临床显示，引起心肌缺血最主要、最常见的病因是冠状动脉(偶见肺动脉)狭窄，而引起冠状动脉狭窄的主要原因是动脉粥样硬化，冠状动脉粥样硬化引起的心脏病即为冠心病，因此可以说冠心病是心肌缺血的“罪魁祸首”。心肌缺血对心脏和全身都可能带来许多不利影响。氧是心肌细胞活动必不可少的物质，而氧是通过血液输送给细胞的。缺氧的直接后果是心肌细胞有氧代谢减弱，产能减小，使心脏活动时必需的能量供应不足，引起心绞痛、心律失常、心功能下降。同时，代谢的废物也不能被有效及时地清除，易产生不利影响。缺血、缺氧、缺能量，最终会影响心脏的收缩功能。若有20％～25％的心肌停止收缩，通常会出现左室功能衰竭；若有40％以上的心肌不能收缩，就会有重度心泵功能衰竭。如果这种情况突然发生，就会出现非常危险的心源性休克。急性心肌梗死就常与这种情况相关。因此治疗抗心肌缺血药物具有非常巨大的临床需求，该类药物研发具有非常好的前景，蕴藏着巨大的经济和社会效益。

    对萼猕猴桃(Actinidia valvata Dunn)为猕猴桃科猕猴桃属植物，又名镊合猕猴桃，主要分布于浙江、江西、江苏等华东地区，其根入药即为猫人参，临床用于治疗恶性肿瘤，为华东地区常用抗肿瘤中药。目前，仅见很少的关于猫人参化学成分、药理作用的研究报道[张亚妮,刘岭,凌昌全.猫人参有效部位对小鼠移植性肿瘤H22的抑制作用及机制探讨.中国中药杂志,2006,36(11):918-920；陆胤,陈绍瑗,吴平,等.药用植物猫人参有效成分研究(I)-无机元素分析.浙江大学学报,2004,30(2):185-188]。而对于对萼猕猴桃叶则无药用记载和研究报道。近年来，发明人长期从事中药学领域的研究，对对萼猕猴桃根(猫人参)进行了相关研究[辛海量,吴迎春,徐燕丰,张亚妮,凌昌全.对萼猕猴桃根与茎的比较研究.第二军医大学学报,2008,29(3):298-302]，不仅如此，发明人还结合系统开发思路，充分利用植物资源，对其叶也进行了深入研究[Hai-Liang Xin,Ying-Chun Wu,Yong-Hua Su,Jia-Yu Sheng,Chang-Quan Ling.Novel flavonoids from leaves of Actinidia valvata Dunn:structural elucidation and anti-oxidative activity.Planta medica,2011,77(1):70-73；辛海量,苏永华,凌昌全,吴迎春.对萼猕猴桃叶的高效液相色谱指纹图谱研究.时珍国医国药,2011,22(1)15-17]。在对对萼猕猴桃叶的药理作用进行广泛筛选的过程中，出人意料地发现从该植物中提取的新化学成分具有显著的抗心肌缺血作用，并对其化合物结构、用途、制备方法申请了3项专利(发明人：辛海量，凌昌全，苏永华，吴迎春，盛佳钰，周俊，黄酮苷类化合物及制备方法和用途，ZL201010138085.1；发明人：辛海量，凌昌全，曲丽萍，苏永华，李同明，对萼猕猴桃苷E、F在制备抗心肌缺血药物中的应用，ZL201110271050.X；发明人：辛海量，凌昌全，曲丽萍，苏永华，从对萼猕猴桃叶中分离制备高纯度黄酮苷类化合物的方法，ZL201210022834.3)。由于单体成分制备成本高，工艺复杂，因此开展对萼猕猴桃叶提取物的研究，以期获得具有显著抗心肌缺血作用的活性提取物是十分必要的。

    发明内容

    发明人在抗心肌缺血天然药物、中药筛选过程中，发现对萼猕猴桃叶具有较强的抗心肌缺血作用，进而研究了其活性提取物及其制备方法，经分离鉴定表明此提取物含有对山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、对萼猕猴桃苷E、对萼猕猴桃苷F等黄酮类成分。

    本发明的目的在于提供一种以对萼猕猴桃叶为原料制备的提取物及其制备方法，以及该提取物在制备抗心肌缺血药物及食品中的应用。

    本发明提供了一种对萼猕猴桃叶总黄酮提取物，所述的对萼猕猴桃叶总黄酮提取物的制备方法包括以下步骤：

    (A)制备提取液

    将对萼猕猴桃叶原料用提取溶剂提取，合并，过滤，即得提取液；所述的提取溶剂为体积分数10％-95％的乙醇或甲醇水溶液；

    (B)浓缩

    将上述提取液回收至无醇味，即得浓缩液；

    (C)除杂

    将上述浓缩液过大孔树脂吸附，用乙醇或甲醇水溶液洗去杂质，再以洗脱剂洗脱药用部位，收集洗脱液；所述的大孔吸附树脂型号选自HPD300、D101、AB-8、D1400、HPD100、D860、DM301、DM1300、D4020、HPD500、DM130、HPD600、D520、D4006、D4006和H103；本步骤除杂所用乙醇或甲醇水溶液为体积分数10％-95％的乙醇或甲醇水溶液；所述的洗脱剂为体积分数40％-95％乙醇或甲醇水溶液；

    (D)干燥、粉碎

    将上述洗脱液浓缩、干燥、粉碎，即得所述的对萼猕猴桃叶总黄酮提取物。

    优选地，所述的提取溶剂为体积分数10％-80％的乙醇或甲醇水溶液；更优选地，所述的提取溶剂为体积分数10％-60％的乙醇或甲醇水溶液；更优选地，所述的提取溶剂为体积分数10％-40％的乙醇或甲醇水溶液；最优选地，所述的提取溶剂为体积分数40％的乙醇或甲醇水溶液。考虑到有机溶剂残留、生产中的安全因素以及生产成本因素，优选的提取溶剂为乙醇水溶液。

    步骤(A)的提取方式可以选择常规热回流提取、渗漉提取或浸泡提取，以及其他药学上可接受的提取方式。如热回流提取可以选择12倍、10倍、10倍，1.5小时、1小时、1小时，也可选择其他可接受的提取溶剂用量、提取次数、提取时间。渗漉提取、浸泡提取可以选择5-100倍提取溶剂。

    步骤(B)的浓缩方式可以采用40-100℃减压浓缩、烘干浓缩以及其他药学上可接受的浓缩方式。优选地，选用减压浓缩的浓缩方式。考虑到过高温度可能对提取物中化学成分稳定性造成不良影响，优选地，选用50-75℃温度浓缩。

    优选地，所述的大孔吸附树脂型号选自HPD300、D101和AB-8；更优选地，所述的大孔吸附树脂型号选自HPD300。

    优选地，除杂所用乙醇或甲醇水溶液为体积分数10％-50％的乙醇或甲醇水溶液；更优选地，除杂所用乙醇或甲醇水溶液为体积分数10％-30％的乙醇或甲醇水溶液；最优选地，除杂所用乙醇或甲醇水溶液为体积分数20％的乙醇或甲醇水溶液。

    优选地，所述的洗脱剂为体积分数30％-70％乙醇或甲醇水溶液；更优选地，所述的洗脱剂为体积分数60％乙醇或甲醇水溶液。

    除杂和洗脱时，考虑到有机溶剂残留、生产中的安全因素以及生产成本因素，优选使用乙醇水溶液除杂和洗脱。

    步骤(D)的干燥方式可以采用50-100℃常压烘干、真空干燥及其他可接受的干燥方式。粉碎方式可以采用球磨机、冲击式粉碎机、流能磨粉碎以及其他可接受的粉碎方式。如将喷雾干燥、冷冻干燥技术用于本步骤，可同时实现烘干、粉碎，应用更为方便。

    优选地，所述的对萼猕猴桃叶总黄酮提取物中，山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、对萼猕猴桃苷E、对萼猕猴桃苷F的含量分别在3.12％以上、16.33％以上和17.24％以上。

    更优选地，所述的对萼猕猴桃叶总黄酮提取物中，山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、对萼猕猴桃苷E、对萼猕猴桃苷F的含量范围分别在3.12％-8.81％、16.33％-34.58％和17.24％-35.721％。

    本发明还提供了所述的对萼猕猴桃叶总黄酮提取物的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：

    (A)制备提取液

    将对萼猕猴桃叶原料用提取溶剂提取，合并，过滤，即得提取液；所述的提取溶剂为体积分数10％-95％的乙醇或甲醇水溶液；

    (B)浓缩

    将上述提取液回收至无醇味，即得浓缩液；

    (C)除杂

    将上述浓缩液过大孔树脂吸附，用乙醇或甲醇水溶液洗去杂质，再以洗脱剂洗脱药用部位，收集洗脱液；所述的大孔吸附树脂型号选自HPD300、D101、AB-8、D1400、HPD100、D860、DM301、DM1300、D4020、HPD500、DM130、HPD600、D520、D4006、D4006和H103；本步骤除杂所用乙醇或甲醇水溶液为体积分数10％-95％的乙醇或甲醇水溶液；所述的洗脱剂为体积分数40％-95％乙醇或甲醇水溶液；

    (D)干燥、粉碎

    将上述洗脱液浓缩、干燥、粉碎，即得提取物。

    本发明还提供了所述的对萼猕猴桃叶总黄酮提取物在制备抗心肌缺血的药物、保健品或食品中的用途。

    所述的心肌缺血相关病症为急性心肌梗塞、心绞痛或冠心病；作为本发明的一种具体实施方式，所述的心肌缺血相关病症为急性心肌梗塞。

    本文中，所述的山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、对萼猕猴桃苷E、对萼猕猴桃苷F的化学结构式分别如I、II和III所示：

    本发明优点在于：

    1、本发明的制备方法获得的提取物富含山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、对萼猕猴桃苷E、对萼猕猴桃苷F，且三者的提取得率高；

    2、本发明的制备方法采用对萼猕猴桃叶作为原料，自然更替快，价廉，易得，有利于生态环境保护，具有显著的优势；本发明的制备方法还具有工艺简便、安全有效、有机溶剂残留低等显著优点；

    3、本发明的对萼猕猴桃叶总黄酮提取物经药理实验证实具有显著的抗心肌缺血作用，且与等量对萼猕猴桃苷E或对萼猕猴桃苷F单用的抗心肌缺血作用相当，但是相比于获得对萼猕猴桃苷E、对萼猕猴桃苷F的单体，本发明的对萼猕猴桃叶总黄酮提取物制备方法更简便、成本更低，因此在制备抗心肌缺血相关病症的药物、保健品或食品中具有广阔的应用前景。

    具体实施方式

    下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

    实施例1 制备对萼猕猴桃叶总黄酮(一)

    对萼猕猴桃叶药材2kg，分别以15倍、10倍、10倍的40％乙醇水溶液作为溶剂，回流提取3次，提取时间分别1.5小时、1小时、1小时，提取液趁热过滤，合并提取液，减压回收溶剂至无醇味，调节相对密度为1.05g，过HPD300大孔树脂吸附，以6倍柱床体积20％(V/V)乙醇水溶液洗去杂质，再以6倍柱床体积60％(V/V)乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥，得总黄酮提取物76.3g，经HPLC方法检测，山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、对萼猕猴桃苷E、对萼猕猴桃苷F的含量分别为8.12％、32.14％、32.50％。

    实施例2 制备对萼猕猴桃叶总黄酮(二)

    对萼猕猴桃叶药材2kg，以50倍的40％乙醇水溶液作为溶剂，渗漉提取，合并提取液，减压回收溶剂至无醇味，调节相对密度为1.05，过HPD300大孔树脂吸附，以6倍柱床体积20％(V/V)乙醇水溶液洗去杂质，再以6倍柱床体积60％(V/V)乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥，得总黄酮提取物76.3g，经HPLC方法检测，山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、对萼猕猴桃苷E、对萼猕猴桃苷F的含量分别为7.84％、31.85％、33.69％。

    实施例3 制备对萼猕猴桃叶总黄酮(三)

    提取步骤以95％乙醇水溶液作为提取溶剂，其余同实施例1，得总黄酮提取物32.4g，经HPLC方法检测，山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、对萼猕猴桃苷E、对萼猕猴桃苷F的含量分别为3.12％、16.33％、17.24％。

    实施例4 制备对萼猕猴桃叶总黄酮(四)

    提取步骤以60％乙醇水溶液作为提取溶剂，其余同实施例1，得总黄酮提取物61.2g，经HPLC方法检测，山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、对萼猕猴桃苷E、对萼猕猴桃苷F的含量分别为7.23％、28.41％、27.65％。

    实施例5 制备对萼猕猴桃叶总黄酮(五)

    提取步骤以10％乙醇水溶液作为提取溶剂，其余同实施例1，得总黄酮提取物83.6g，经HPLC方法检测，山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、对萼猕猴桃苷E、对萼猕猴桃苷F的含量分别为5.43％、24.41％、23.82％。

    实施例6 制备对萼猕猴桃叶总黄酮(六)

    除杂步骤以50％乙醇水溶液洗去杂质，其余同实施例1，得总黄酮提取物57.3g，经HPLC方法检测，山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、对萼猕猴桃苷E、对萼猕猴桃苷F的含量分别为8.81％、34.58％、35.72％。

    实施例7 制备对萼猕猴桃叶总黄酮(七)

    除杂步骤以30％乙醇水溶液洗去杂质，其余同实施例1，得总黄酮提取物63.51g，经HPLC方法检测，山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、对萼猕猴桃苷E、对萼猕猴桃苷F的含量分别为7.68％、28.43％、28.06％。

    实施例8 制备对萼猕猴桃叶总黄酮(八)

    除杂步骤以10％乙醇水溶液洗去杂质，其余同实施例1，得总黄酮提取物81.46g，经HPLC方法检测，山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、对萼猕猴桃苷E、对萼猕猴桃苷F的含量分别为5.91％、26.56％、25.48％。

    实施例9 制备对萼猕猴桃叶总黄酮(九)

    除杂步骤以95％乙醇水溶液洗脱药用部位，其余同实施例1，得总黄酮提取物123.4g，经HPLC方法检测，山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、对萼猕猴桃苷E、对萼猕猴桃苷F的含量分别为4.32％、18.60％、18.72％。

    实施例10 制备对萼猕猴桃叶总黄酮(十)

    除杂步骤以70％乙醇水溶液洗脱药用部位，其余同实施例1，得总黄酮提取物92.6g，经HPLC方法检测，山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、对萼猕猴桃苷E、对萼猕猴桃苷F的含量分别为6.12％、24.63％、24.72％。

    实施例11 制备对萼猕猴桃叶总黄酮(十一)

    除杂步骤以30％乙醇水溶液洗脱药用部位，其余同实施例1，得总黄酮提取物24.8g，经HPLC方法检测，山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、对萼猕猴桃苷E、对萼猕猴桃苷F的含量分别为7.74％、33.52％、33.80％。

    实施例12 制备对萼猕猴桃叶总黄酮(十二)

    除杂步骤选用D101大孔树脂，其余同实施1，得总黄酮提取物71.8g，经HPLC方法检测，山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、对萼猕猴桃苷E、对萼猕猴桃苷F的含量分别为7.88％、30.54％、31.70％。

    实施例13 制备对萼猕猴桃叶总黄酮(十三)

    除杂步骤选用AB-8大孔树脂，其余同实施例1，得总黄酮提取物70.4g，经HPLC方法检测，山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、对萼猕猴桃苷E、对萼猕猴桃苷F的含量分别为7.46％、29.68％、30.17％。

    实施例14 制备对萼猕猴桃叶总黄酮(十四)

    除杂步骤选用D101大孔树脂，其余同实施例3，得总黄酮提取物60.62g，经HPLC方法检测，山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、对萼猕猴桃苷E、对萼猕猴桃苷F的含量分别为7.04％、28.60％、26.45％。

    实施例15 制备对萼猕猴桃叶总黄酮(十五)

    除杂步骤选用D101大孔树脂，其余同实施例7，得总黄酮提取物117.5g，经HPLC方法检测，山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、对萼猕猴桃苷E、对萼猕猴桃苷F的含量分别为3.84％、18.44％、18.86％。

    实施例16 对萼猕猴桃叶总黄酮提取物抗心肌缺血的药理实验

    (一)灌胃给药对大鼠急性心肌缺血的保护作用

    1、实验目的

    通过本试验观察对萼猕猴桃叶总黄酮提取物灌胃给药1周，对大鼠急性心肌梗死的保护作用。

    2、实验时间

    开始给药时间：2013年7月18日；手术时间：2013年7月24日。

    3、受试药物

    溶媒DMSO，分析纯，购自国药集团。

    普萘洛尔(Propranolol，Prop)，由江苏省金坛市江南化工厂生产，生产批号：20021011，白色粉末，3mg/kg。

    对萼猕猴桃叶总黄酮1、2、3、4分别为采用实施例1、2、3、4制备。

    以上药物均在固定时间给药1周，第7天，冠状动脉结扎前30分钟，灌胃给药。给药容积均为2ml/kg，使用DMSO配制。

    4、实验动物

    健康SD雄性大鼠(由第二军医大学实验动物中心提供)112只，体重180－220g，随机分为10组，如表1所示。

    表1 实验分组情况及给药剂量

    注：各组给药容积与溶媒组DMSO相同，2ml/kg/d，均灌胃给药。

    5、手术器械

    (1)冠状动脉结扎手术：一把剃毛电推剪、一把手术直剪、两把弯镊、两把大止血弯钳、一把持针器、一根带线缝合针(5-0号医用锦纶单丝线，上海浦东金环医疗用品有限公司)。

    (2)心肌梗死范围测定：一把圆头小剪刀、一把组织切片刀。

    6、仪器设备

    数码相机(COOLPIX-P6000，日本Nikon)、电子称(精确到1mg，HANGPING JA2003，上海天平仪器厂)、电热恒温水温箱(上海医疗器械厂)。

    7、其他试剂和材料

    (1)冠状动脉结扎手术

    乙醚、结扎线(5-0号医用锦纶单丝线)、手术缝合线(3-0号)、牛皮筋、鼠板、玻璃密封罐。

    (2)心肌梗死范围测定

    用冰预冷的生理盐水500ml、0.1％氯化硝基四氮唑蓝(NBT，购自上海浩然生物有限公司，用0.2M磷酸盐缓冲液配制)、6、24孔细胞培养板、滤纸。

    8、实验方法

    给药6天后，第7天，手术前30分钟灌胃给予以上药物。动物称重后以乙醚麻醉动物，手术区剃毛，消毒，快速开胸，剪断第3、4肋骨暴露心脏。撕开心包将心脏轻轻挤出，在左心耳下1mm，肺动脉圆锥旁开0.5mm处用微创缝合针穿过冠状动脉前降支将其结扎，轻轻提拉切口皮肤将心脏送回胸腔，缝合切口。手术后3分钟内腹腔注射给予各组药物。手术后5小时，脱臼处死动物，迅速取心脏，生理盐水冲洗，滤纸吸干，称全心室重量，然后将全心室沿着心脏纵轴相隔2mm切成5片，置37℃0.1％NBT液染色。10-20分钟后立即用生理盐水冲去多余染料。梗死心肌不着色，非梗死心肌被染成着黑色，拍照，然后剪去着色部分，将未着色的梗死区称重。

    9、观察指标

    心肌梗死程度：

    梗死区(g)：即NBT染色未着色心肌；

    梗死率(％)：梗死心肌重量/全心室重量×100％。

    10、统计分析

    试验结果以表示，采用非配对t检验法统计，P<0.05为具有显著性统计学差异。

    11、实验结果：对大鼠急性心肌梗死范围的影响

    手术后，根据染色情况，最后分析结果见表2，可以看出对萼猕猴桃苷总黄酮提取物可以显著地降低动物的心肌梗死重量，并降低心肌梗死率。

    表2 对萼猕猴桃总黄酮对SD大鼠急性心肌梗死模型心肌梗死范围的影响

    注：*P<0.05，vs溶媒对照组。

    12、实验结论

    对萼猕猴桃叶总黄酮提取物灌胃给药治疗7天，可明显减轻SD大鼠冠状动脉结扎后的心肌缺血损伤程度。

    (二)腹腔注射给药对大鼠急性心肌缺血的保护作用

    1、实验目的

    通过本试验观察对萼猕猴桃叶总黄酮提取物腹腔注射给药，对大鼠急性心肌梗死的保护作用。

    2、实验时间

    开始给药时间：2013年8月10日；手术时间：2013年8月13日。

    3、受试药物

    溶媒DMSO，分析纯，购自国药集团。

    对萼猕猴桃叶总黄酮1、2、3、4分别为采用实施例1、2、3、4制备。

    硝酸异山梨醇酯(Isosorbide mononitrate，IM)，由鲁南贝特制药有限公司生产，批号：090201。

    以上药物均在固定时间给药3天后，第4天，冠状动脉结扎前15分钟内，经腹腔注射给药。给药容积：2ml/kg，DMSO配制。

    4、实验动物

    健康SD雄性大鼠(由第二军医大学实验动物中心提供)105只，体重180－220g，随机分为10组，如表3所示。

    表3 实验分组情况及给药剂量

    注：各组给药容积与溶媒组DMSO相同，2ml/kg/d，均为腹腔注射给药。

    5、手术器械

    (1)冠状动脉结扎手术：一把剃毛电推剪、一把手术直剪、两把弯镊、两把大止血弯钳、一把持针器、一根带线缝合针(5-0号医用锦纶单丝线，上海浦东金环医疗用品有限公司)。

    (2)心肌梗死范围测定：一把圆头小剪刀、一把组织切片刀。

    6、仪器设备

    数码相机(COOLPIX-P6000，日本Nikon)、电子称(精确到1mg，HANGPING JA2003，上海天平仪器厂)、电热恒温水温箱(上海医疗器械厂)。

    7、其他试剂和材料

    (1)冠状动脉结扎手术

    乙醚、结扎线(5-0号医用锦纶单丝线)、手术缝合线(3-0号)、牛皮筋、鼠板、玻璃密封罐。

    (2)心肌梗死范围测定

    用冰预冷的生理盐水500ml、0.1％氯化硝基四氮唑蓝(NBT，购自上海浩然生物有限公司，用0.2M磷酸盐缓冲液配制)、6、24孔细胞培养板、滤纸。

    8、实验方法

    给药3天后，第4天，手术前15分钟再次腹腔注射给予药物。动物称重后以乙醚麻醉动物，手术区剃毛，消毒，快速开胸，剪断第3、4肋骨暴露心脏。撕开心包将心脏轻轻挤出，在左心耳下1mm，肺动脉圆锥旁开0.5mm处用微创缝合针穿过冠状动脉前降支将其结扎，轻轻提拉切口皮肤将心脏送回胸腔，缝合切口。手术后3分钟内腹腔注射给予各组药物。手术后5小时，脱臼处死动物，迅速取心脏，生理盐水冲洗，滤纸吸干，称全心室重量，然后并将全心室沿着心脏纵轴相隔2mm切成5片，置37℃0.1％NBT液染色。10-20分钟后立即用生理盐水冲去多余染料。梗死心肌不着色，非梗死心肌被染成着黑色，拍照，然后剪去着色部分，将未着色的梗死区称重。

    9、观察指标

    心肌梗死程度：

    梗死区(g)：即NBT染色未着色心肌；

    梗死率(％)：梗死心肌重量/全心室重量×100％。

    10、统计分析

    试验结果以表示，采用非配对t检验法统计，P<0.05为具有显著性统计学差异。

    11、实验结果：对大鼠急性心肌梗死范围的影响

    手术后，根据染色情况，最后分析结果见表4，可以看出药物对萼猕猴桃叶总黄酮治疗后，可以显著地降低动物的心肌梗死重量，并降低心肌梗死率。

    表4 对萼猕猴桃提取物对SD大鼠急性心肌梗死模型心肌梗死范围的影响

    注：*P<0.05，vs溶媒对照组。

    12、实验结论

    对萼猕猴桃叶总黄酮提取物腹腔注射给药4天，可明显减轻SD大鼠冠状动脉结扎后的心肌缺血损伤程度。

    以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

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