一种以电压门控质子通道 Hv1 作为乳腺癌治疗的靶向位点 的基因药物 【所属技术领域】
本发明属于生物医药技术领域， 涉及一种抑制电压门控质子通道 Hv1 表达的药物 用途发明， 其本质为电压门控质子通道 Hv1 的 cDNA 干扰片段。本发明采用基因沉默的方法 抑制电压门控质子通道 Hv1 的表达， 从而抑制乳腺癌细胞的转移， 这类药物可在乳腺癌的 诊断和治疗中得到广泛的应用。 【背景技术】
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一， 据资料统计， 发病率占全身各种恶性肿瘤 的 7-10％， 在妇女仅次于子宫癌。 它的发病常与遗传有关， 严重影响妇女身心健康甚至危及 生命。
寻找乳腺癌细胞的生物标志物， 对于诊断乳腺癌， 尤其是早期诊断乳腺癌和判断 预后有极大帮助。 这个标志物在正常组织中极少表达， 而在乳腺癌组织中大量特异表达， 不 仅仅可用来诊断乳腺癌或判断预后、 协助分期等， 同时还可以被用作免疫导向治疗的靶位 点。 可以说， 乳腺癌的生物标志物在乳腺癌的诊断、 预防、 治疗、 判断预后等方面均起着重要 的作用。乳腺癌的标志物要具备以下几个条件 ： 1) 该标志物特异地表达于乳腺癌组织或细 胞， 就是说该标志物的特异性要高， 在正常组织中极少表达， 而在多数甚至绝大多数乳腺癌 组织或细胞中表达。特异性高不仅为采用该标志物诊断乳腺癌奠定了必要的基础， 同时也 为以该标志物为靶点的免疫导向治疗的有效性和安全性提供了保障。 2) 该标志物应该与乳 腺癌细胞的发生、 发展、 迁移及浸润有密切关系， 这样才能使基于该标志物的免疫导向治疗 药物通过相应的抗体特异地识别乳腺癌细胞。3) 该标志物对于人体来说属于抗原性物质， 可以激起人体的免疫反应， 这将使该标志物 ( 抗原 ) 具备作为乳腺癌预防性疫苗和治疗性 疫苗的潜力。
目前已经发现的乳腺癌标志物有十几种， 它们或与人源乳腺癌内分泌直接相 关， 或可辅助乳腺癌诊断， 或与乳腺癌预后相关。这些抗原包括 ： 雌激素受体 (estrogen receptor ER)、孕 激 素 受 体 (progesterone receptor PR)，雄 激 素 受 体 (androgen receptor AR)， PS2 基因又称乳腺癌雌激素诱导基因 (breast cancer estrogen induced， BCEI)， CA15 ～ 3 抗 原， 癌 胚 抗 原 (carcinoembryonic antigen， CEA)， 泌 乳 素 (prolactin， PRL)， 肿瘤易感基因 (BreastPovariancancer susceptibility gene， BRCA1)， p53 抑癌基 因， 增殖细胞核抗原 (proliferating cellnuclear antigen， PCNA)， C-erbB-2(HER-2/neu) 基因， 组织蛋白酶 D(Cathepsin-D， Cath-D)， p27 抑癌基因， p21 抑癌基因， 转移抑癌基因 nm23 等。
在已经发现的抗原中， 有些虽然可作为免疫导向治疗的靶位点， 但是特异性不高， 可能存在于很多种腺癌中， 例如 CA15 ～ 3。
综上所述， 目前已知的乳腺癌生物标志物中， 尚缺乏一种针对乳腺癌特异性高， 而 阳性率也高的标志物 ； 对于乳腺癌主动免疫治疗来说， 也缺乏一种较佳的细胞抗原靶点。 因而寻找一种特异性高、 在乳腺癌中表达阳性率高、 对人具有抗原性的乳腺癌抗原对于人乳 腺癌的早期诊断具有十分重要的意义。
本 专 利 工 作 得 到 了 国 家 自 然 科 学 基 金 (No.30840028 和 No.30970579)、 天 津 市 基 础 科 学 和 高 新 技 术 研 究 项 目 (No.08JCYBJC25800) 及 教 育 部 博 士 点 基 金 (No.200800551035) 的资助， 在此表示最衷心的谢意。 【发明内容】
本发明目的是解决现有抗原作为免疫导向治疗的靶位点特异性不高的问题， 提供 一种以电压门控质子通道 Hv1 作为乳腺癌治疗的靶向位点的基因药物。
电压门控质子通道 Hv1 蛋白全长为 273 个氨基酸残基， 依据该通道各氨基酸残基 的疏水特性， 可将 Hv1 蛋白全长划分为 3 个结构域 ： N- 端胞外结构域、 跨膜结构域和 C- 端 胞外结构域。Hv1 对质子具有特异高选择性， 能够高效地跨膜转运质子。癌细胞周围 pH 值 为 6.85-6.95， 癌细胞在缺氧低 pH 值的酸性体液环境中易生长与扩散 ； 当人体体液的 pH 值 正常时， 免疫细胞的活性最强， 能够吞噬和消灭癌细胞， 而在酸性体液环境中， 免疫细胞的 吞噬及识别功能显著下降。这暗示了电压门控质子通道 Hv1 极有可能和人类重大疾病有 关。因此， 在本发明中我们的几种基因药物都是以电压门控质子通道 Hv1 为靶位点， 通过抑 制其表达， 从而抑制癌细胞迁移和浸润的能力。 本发明是以编码电压门控质子通道 Hv1 的基因作为靶向位点， 运用慢病毒感染的 方法来治疗乳腺癌的。电压门控质子通道 Hv1 的基因序列如序列表序列 1 所示。
本发明提供的一对以电压门控质子通道 Hv1 作为乳腺癌治疗的靶向位点药物的 cDNA 干扰片段， 它的序列为 ：
Hv1-SiRNA-PLVTHM
5′ -CGCGTCCCCCTACAAGAAATGGGAGAATTTCAAGAGAATTCTCCCATTT
CTTGTAGTTTTTGGAAAT-3′ ( 序列 2)
5′ -CGATTTCCAAAAACTACAAGAAATGGGAGAATTCTCTTGAAATTCTCCCA
TTTCTTGTAGGGGGA-3′ ( 序列 3)
将它们通过 pLVTHM 载体包装入慢病毒， 用来感染乳腺癌细胞， 抑制了乳腺癌细胞 株的迁移和浸润能力， 从而用于乳腺癌治疗、 预防药剂中。
本发明还提供了上述药物包装有 cDNA 干扰片段的慢病毒在制备基因治疗和基因 工程药物中的应用。
本发明的优点和积极效果 ：
本发明提供的作为乳腺癌治疗的靶向位点即电压门控质子通道 Hv1 是一种在乳 腺癌中的表达阳性率高， 在正常细胞不表达的蛋白， 因而利用电压门控质子通道 Hv1 为靶 位点， 利用本发明提供的前述抗电压门控质子通道 Hv1 表达的相应 cDNA 干扰片段制成的药 物， 可以用于乳腺癌的治疗， 在乳腺癌的治疗中发挥很大的作用， 前景十分广阔。
【附图说明】
图 1 是检测乳腺癌细胞中 Hv1 分布状况的免疫组化图， 其中 A B 图显示乳腺癌细 胞被染成褐色， C 图显示正常乳腺细胞未被染色。图 2 是琼脂糖电泳检测电压门控质子通道 Hv1 的沉默情况， 其中 MB-231 是未用慢 病毒感染细胞， siMB-231 是用慢病毒感染细胞。Hv1 是电压门控质子通道， GAPDH 是管家基 因。
图 3 是用 western blotting 检测电压门控质子通道 Hv1 的表达， 其中 MB-231 是 未用慢病毒感染细胞， siMB-231 是用慢病毒感染细胞。Hv1 是电压门控质子通道， β-actin 是管家基因。
图 4 是划痕试验， 其中 ABC 分别是未用慢病毒感染的 MDA-MB-231 细胞在划痕 0 小 时， 12 小时， 24 小时的生长迁移状态。DEF 分别是用慢病毒感染的 MDA-MB-231 细胞在划痕 0 小时， 12 小时， 24 小时的生长迁移状态。 【具体实施方式】
实施例 1
电压门控质子通道 Hv1( 人源乳腺癌重组蛋白抗原 ) 的制备
首先设计出新的人源乳腺癌抗原 Hv1 的 c 端引物， 序列如下 ：
C-Hv1BamH I-F ： 5’ CGCGGATCC AAGACACGTTCAGAACGGC( 序列 4)
EcoR I-R ： 5’ CGGAATTCCTAGTTCACTTCACCAAGAAG( 序列 5)
通 过 PCR 扩 增， 双 酶 切 PCR 产 物 和 载 体 pGEX6p-1 并 回 收， 连 接， 得到重组质 粒。这个克隆就是含有本发明提到的电压门控质子通道 Hv1( 人源乳腺癌抗原 )DNA 序列 的重组表达质粒的克隆， 它命名为 pGEX6p-1-c-Hv1。将 pGEX6p-1-c-Hv1 转化到感受态 E.coliBL21(DE3) 大肠杆菌， 使用 0.5mM IPTG 诱导剂， 进行蛋白表达。 通过离子交换柱纯化 得到电压门控质子通道 Hv1( 人源乳腺癌重组蛋白抗原 )， 基因序列如序列表序列 1 所示。
实施例 2
抗人源乳腺癌抗原 Hv1 鼠多克隆抗体的制备
采用 50ug/ 每只人源乳腺癌抗原 Hv1 的重组蛋白抗原混合完全福氏佐剂多点皮下 免疫 Balb/c 小鼠， 10 天后采用 50ug/ 每只人源乳腺癌抗原 Hv1 的重组蛋白抗原混合不完全 福氏佐剂多点皮下第二次免疫 Balb/c 小鼠。第二次免疫后， 间隔一周进行第三次免疫。第 6 三次免疫后 10 天采血测效价， 当效价＞ 1 ∶ 10 ， 处死动物采血， 采用凝结法收集血清， 低速 离心去沉淀。用生理盐水 1 ∶ 2 稀释， 上 Protein A 亲和层析柱纯化， pH2.8 的 0.1M 甘氨 酸缓冲液洗脱， 1M Tris 中和后对 PBS 透析 3 次， 检测 OD280 定抗体含量， 获得抗人源乳腺癌 6 抗原 Hv1 的鼠多克隆抗体。如果效价＜ 1 ∶ 10 ， 则继续免疫至效价＞ 1 ∶ 106。
实施例 3 ：
采用电压门控质子通道 Hv1 的抗体作为药物诊断乳腺癌
采用常规免疫组化方法， 石蜡切片， 以山羊血清封闭， 一抗采用小鼠抗人乳腺癌抗 原 Hv1 多克隆抗体， 二抗采用山羊抗小鼠 IgG-HRP， DAB 显色， 苏木精染。
结果如图 1 所示， 在乳腺癌组织上着色密集， 同时在正常的乳腺组织未被染色。证 明电压门控质子通道 Hv1 在乳腺癌细胞中高表达。
实施例 4 ：
慢病毒感染沉默电压门控质子通道 Hv1
培 养 293T 细 胞，用 含 有 电 压 门 控 质 子 通 道 Hv1 的 cDNA 干 扰 片 段Hv1-SiRNA-PLVTHM( 其序列如序列 2 和序列 3) 的 pLVTHM 载体与包装混合质粒 1 ∶ 3(w/w) 混合， 感染正常的 293T 细胞， 感染 6-8 小时后换成新鲜的培养液， 37℃， 5％ CO2 培养箱培养 48 小时， 收集上清， 0.45nm 过滤， 高速离心得到病毒， 加入无血清无抗性的培养液中， -70℃ 保存待用。将重组慢病毒加入到正常培养的 MDA-MB-231 细胞中， 37℃， 5％ CO2 培养箱培养 16 小时， 加入强力霉素， 培养 5 天后收集细胞。
(1) 基因水平检测电压门控质子通道 Hv1 的基因
采用 RT-PCR 的方法， 分别用 RNAiso Reagent 提取用慢病毒感染的细胞和未用慢 病毒感染细胞的总 RNA， 反转录成相应的 cDNA， 再用合成的 Hv1 引物和管家基因 GAPDH 引物 分别扩增 Hv1 和 GAPDH， 通过琼脂糖电泳检测。
结果如图 2 所示， 未用慢病毒感染的乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 含有表达电压门控 质子通道 Hv1 的基因， 而用慢病毒感染的乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 基本不含有表达电压门 控质子通道 Hv1 的基因。
(2) 蛋白水平检测电压门控质子通道 Hv1 的表达
采用免疫印迹的方法， 分别提取用慢病毒感染的细胞和未用慢病毒感染细胞的 总蛋白， 经过 BCA 定量后， 12.5 ％ (v/v) 的 SDS-PAGE， 并将蛋白转到醋酸纤维素膜上， 5％ (w/v) 的脱脂奶粉封闭后， 用小鼠抗人乳腺癌抗原 Hv1 多克隆抗体做一抗， 用山羊抗小鼠 IgG-HRP 做二抗， 再经化学发光法， 使用胶片感光。 结果如图 3 所示， ， 未用慢病毒感染的乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 表达电压门控质 子通道 Hv1 蛋白， 用慢病毒感染的乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 基本不表达电压门控质子通道 Hv1 蛋白。
(3) 划痕试验
将正常的 MDA-MB-231 细胞和用慢病毒感染后的 MDA-MB-231 细胞分别加入 24 孔 板中， 待细胞长满后用枪头划痕， 枪头要垂直， 不能倾斜， 用 PBS 洗细胞 3 次， 去除划下的细 胞， 加入培养基， 放入 37℃， 5％ CO2 培养箱培养， 按 O， 6， 12， 24 小时取样， 拍照。
结果如图 4 所示， ， 用慢病毒感染后的 MDA-MB-231 细胞迁移能力明显低于正常的 MDA-MB-231 细胞。
(4)Transwell 实验
将正常的 MDA-MB-231 细胞和用慢病毒感染后的 MDA-MB-231 细胞分别加入铺好 matrigel 的 Transwell 中， 再将 Transwell 放入 24 孔板中， 在 Transwell 和 24 孔板中加入 相同的培养液， 37℃， 5％ CO2 培养 24 小时， 多聚甲醛固定细胞， 结晶紫染色， 计数。
结 果 显 示， 用 慢 病 毒 感 染 后 的 MDA-MB-231 细 胞 浸 润 能 力 明 显 低 于 正 常 的 MDA-MB-231 细胞。
根据实验的结果表明， 电压门控质子通道 Hv1 的 cDNA 干扰片段可以抑制高转移乳 腺癌细胞的迁移和侵润能力， 从而抑制肿瘤的转移。
本发明属于生物医药技术领域， 涉及一种抑制电压门控质子通道 Hv1 表达的药物 用途发明， 其本质为电压门控质子通道 Hv1 的 cDNA 干扰片段。本发明采用基因沉默的方法 抑制电压门控质子通道 Hv1 的表达， 从而抑制乳腺癌细胞的转移， 这类药物可在乳腺癌的 诊断和治疗中得到广泛的应用。 【背景技术】
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一， 据资料统计， 发病率占全身各种恶性肿瘤 的 7-10％， 在妇女仅次于子宫癌。 它的发病常与遗传有关， 严重影响妇女身心健康甚至危及 生命。
寻找乳腺癌细胞的生物标志物， 对于诊断乳腺癌， 尤其是早期诊断乳腺癌和判断 预后有极大帮助。 这个标志物在正常组织中极少表达， 而在乳腺癌组织中大量特异表达， 不 仅仅可用来诊断乳腺癌或判断预后、 协助分期等， 同时还可以被用作免疫导向治疗的靶位 点。 可以说， 乳腺癌的生物标志物在乳腺癌的诊断、 预防、 治疗、 判断预后等方面均起着重要 的作用。乳腺癌的标志物要具备以下几个条件 ： 1) 该标志物特异地表达于乳腺癌组织或细 胞， 就是说该标志物的特异性要高， 在正常组织中极少表达， 而在多数甚至绝大多数乳腺癌 组织或细胞中表达。特异性高不仅为采用该标志物诊断乳腺癌奠定了必要的基础， 同时也 为以该标志物为靶点的免疫导向治疗的有效性和安全性提供了保障。 2) 该标志物应该与乳 腺癌细胞的发生、 发展、 迁移及浸润有密切关系， 这样才能使基于该标志物的免疫导向治疗 药物通过相应的抗体特异地识别乳腺癌细胞。3) 该标志物对于人体来说属于抗原性物质， 可以激起人体的免疫反应， 这将使该标志物 ( 抗原 ) 具备作为乳腺癌预防性疫苗和治疗性 疫苗的潜力。
目前已经发现的乳腺癌标志物有十几种， 它们或与人源乳腺癌内分泌直接相 关， 或可辅助乳腺癌诊断， 或与乳腺癌预后相关。这些抗原包括 ： 雌激素受体 (estrogen receptor ER)、孕 激 素 受 体 (progesterone receptor PR)，雄 激 素 受 体 (androgen receptor AR)， PS2 基因又称乳腺癌雌激素诱导基因 (breast cancer estrogen induced， BCEI)， CA15 ～ 3 抗 原， 癌 胚 抗 原 (carcinoembryonic antigen， CEA)， 泌 乳 素 (prolactin， PRL)， 肿瘤易感基因 (BreastPovariancancer susceptibility gene， BRCA1)， p53 抑癌基 因， 增殖细胞核抗原 (proliferating cellnuclear antigen， PCNA)， C-erbB-2(HER-2/neu) 基因， 组织蛋白酶 D(Cathepsin-D， Cath-D)， p27 抑癌基因， p21 抑癌基因， 转移抑癌基因 nm23 等。
在已经发现的抗原中， 有些虽然可作为免疫导向治疗的靶位点， 但是特异性不高， 可能存在于很多种腺癌中， 例如 CA15 ～ 3。
综上所述， 目前已知的乳腺癌生物标志物中， 尚缺乏一种针对乳腺癌特异性高， 而 阳性率也高的标志物 ； 对于乳腺癌主动免疫治疗来说， 也缺乏一种较佳的细胞抗原靶点。 因而寻找一种特异性高、 在乳腺癌中表达阳性率高、 对人具有抗原性的乳腺癌抗原对于人乳 腺癌的早期诊断具有十分重要的意义。
本 专 利 工 作 得 到 了 国 家 自 然 科 学 基 金 (No.30840028 和 No.30970579)、 天 津 市 基 础 科 学 和 高 新 技 术 研 究 项 目 (No.08JCYBJC25800) 及 教 育 部 博 士 点 基 金 (No.200800551035) 的资助， 在此表示最衷心的谢意。 【发明内容】
本发明目的是解决现有抗原作为免疫导向治疗的靶位点特异性不高的问题， 提供 一种以电压门控质子通道 Hv1 作为乳腺癌治疗的靶向位点的基因药物。
电压门控质子通道 Hv1 蛋白全长为 273 个氨基酸残基， 依据该通道各氨基酸残基 的疏水特性， 可将 Hv1 蛋白全长划分为 3 个结构域 ： N- 端胞外结构域、 跨膜结构域和 C- 端 胞外结构域。Hv1 对质子具有特异高选择性， 能够高效地跨膜转运质子。癌细胞周围 pH 值 为 6.85-6.95， 癌细胞在缺氧低 pH 值的酸性体液环境中易生长与扩散 ； 当人体体液的 pH 值 正常时， 免疫细胞的活性最强， 能够吞噬和消灭癌细胞， 而在酸性体液环境中， 免疫细胞的 吞噬及识别功能显著下降。这暗示了电压门控质子通道 Hv1 极有可能和人类重大疾病有 关。因此， 在本发明中我们的几种基因药物都是以电压门控质子通道 Hv1 为靶位点， 通过抑 制其表达， 从而抑制癌细胞迁移和浸润的能力。 本发明是以编码电压门控质子通道 Hv1 的基因作为靶向位点， 运用慢病毒感染的 方法来治疗乳腺癌的。电压门控质子通道 Hv1 的基因序列如序列表序列 1 所示。
本发明提供的一对以电压门控质子通道 Hv1 作为乳腺癌治疗的靶向位点药物的 cDNA 干扰片段， 它的序列为 ：
Hv1-SiRNA-PLVTHM
5′ -CGCGTCCCCCTACAAGAAATGGGAGAATTTCAAGAGAATTCTCCCATTT
CTTGTAGTTTTTGGAAAT-3′ ( 序列 2)
5′ -CGATTTCCAAAAACTACAAGAAATGGGAGAATTCTCTTGAAATTCTCCCA
TTTCTTGTAGGGGGA-3′ ( 序列 3)
将它们通过 pLVTHM 载体包装入慢病毒， 用来感染乳腺癌细胞， 抑制了乳腺癌细胞 株的迁移和浸润能力， 从而用于乳腺癌治疗、 预防药剂中。
本发明还提供了上述药物包装有 cDNA 干扰片段的慢病毒在制备基因治疗和基因 工程药物中的应用。
本发明的优点和积极效果 ：
本发明提供的作为乳腺癌治疗的靶向位点即电压门控质子通道 Hv1 是一种在乳 腺癌中的表达阳性率高， 在正常细胞不表达的蛋白， 因而利用电压门控质子通道 Hv1 为靶 位点， 利用本发明提供的前述抗电压门控质子通道 Hv1 表达的相应 cDNA 干扰片段制成的药 物， 可以用于乳腺癌的治疗， 在乳腺癌的治疗中发挥很大的作用， 前景十分广阔。
【附图说明】
图 1 是检测乳腺癌细胞中 Hv1 分布状况的免疫组化图， 其中 A B 图显示乳腺癌细 胞被染成褐色， C 图显示正常乳腺细胞未被染色。图 2 是琼脂糖电泳检测电压门控质子通道 Hv1 的沉默情况， 其中 MB-231 是未用慢 病毒感染细胞， siMB-231 是用慢病毒感染细胞。Hv1 是电压门控质子通道， GAPDH 是管家基 因。
图 3 是用 western blotting 检测电压门控质子通道 Hv1 的表达， 其中 MB-231 是 未用慢病毒感染细胞， siMB-231 是用慢病毒感染细胞。Hv1 是电压门控质子通道， β-actin 是管家基因。
图 4 是划痕试验， 其中 ABC 分别是未用慢病毒感染的 MDA-MB-231 细胞在划痕 0 小 时， 12 小时， 24 小时的生长迁移状态。DEF 分别是用慢病毒感染的 MDA-MB-231 细胞在划痕 0 小时， 12 小时， 24 小时的生长迁移状态。 【具体实施方式】
实施例 1
电压门控质子通道 Hv1( 人源乳腺癌重组蛋白抗原 ) 的制备
首先设计出新的人源乳腺癌抗原 Hv1 的 c 端引物， 序列如下 ：
C-Hv1BamH I-F ： 5’ CGCGGATCC AAGACACGTTCAGAACGGC( 序列 4)
EcoR I-R ： 5’ CGGAATTCCTAGTTCACTTCACCAAGAAG( 序列 5)
通 过 PCR 扩 增， 双 酶 切 PCR 产 物 和 载 体 pGEX6p-1 并 回 收， 连 接， 得到重组质 粒。这个克隆就是含有本发明提到的电压门控质子通道 Hv1( 人源乳腺癌抗原 )DNA 序列 的重组表达质粒的克隆， 它命名为 pGEX6p-1-c-Hv1。将 pGEX6p-1-c-Hv1 转化到感受态 E.coliBL21(DE3) 大肠杆菌， 使用 0.5mM IPTG 诱导剂， 进行蛋白表达。 通过离子交换柱纯化 得到电压门控质子通道 Hv1( 人源乳腺癌重组蛋白抗原 )， 基因序列如序列表序列 1 所示。
实施例 2
抗人源乳腺癌抗原 Hv1 鼠多克隆抗体的制备
采用 50ug/ 每只人源乳腺癌抗原 Hv1 的重组蛋白抗原混合完全福氏佐剂多点皮下 免疫 Balb/c 小鼠， 10 天后采用 50ug/ 每只人源乳腺癌抗原 Hv1 的重组蛋白抗原混合不完全 福氏佐剂多点皮下第二次免疫 Balb/c 小鼠。第二次免疫后， 间隔一周进行第三次免疫。第 6 三次免疫后 10 天采血测效价， 当效价＞ 1 ∶ 10 ， 处死动物采血， 采用凝结法收集血清， 低速 离心去沉淀。用生理盐水 1 ∶ 2 稀释， 上 Protein A 亲和层析柱纯化， pH2.8 的 0.1M 甘氨 酸缓冲液洗脱， 1M Tris 中和后对 PBS 透析 3 次， 检测 OD280 定抗体含量， 获得抗人源乳腺癌 6 抗原 Hv1 的鼠多克隆抗体。如果效价＜ 1 ∶ 10 ， 则继续免疫至效价＞ 1 ∶ 106。
实施例 3 ：
采用电压门控质子通道 Hv1 的抗体作为药物诊断乳腺癌
采用常规免疫组化方法， 石蜡切片， 以山羊血清封闭， 一抗采用小鼠抗人乳腺癌抗 原 Hv1 多克隆抗体， 二抗采用山羊抗小鼠 IgG-HRP， DAB 显色， 苏木精染。
结果如图 1 所示， 在乳腺癌组织上着色密集， 同时在正常的乳腺组织未被染色。证 明电压门控质子通道 Hv1 在乳腺癌细胞中高表达。
实施例 4 ：
慢病毒感染沉默电压门控质子通道 Hv1
培 养 293T 细 胞，用 含 有 电 压 门 控 质 子 通 道 Hv1 的 cDNA 干 扰 片 段Hv1-SiRNA-PLVTHM( 其序列如序列 2 和序列 3) 的 pLVTHM 载体与包装混合质粒 1 ∶ 3(w/w) 混合， 感染正常的 293T 细胞， 感染 6-8 小时后换成新鲜的培养液， 37℃， 5％ CO2 培养箱培养 48 小时， 收集上清， 0.45nm 过滤， 高速离心得到病毒， 加入无血清无抗性的培养液中， -70℃ 保存待用。将重组慢病毒加入到正常培养的 MDA-MB-231 细胞中， 37℃， 5％ CO2 培养箱培养 16 小时， 加入强力霉素， 培养 5 天后收集细胞。
(1) 基因水平检测电压门控质子通道 Hv1 的基因
采用 RT-PCR 的方法， 分别用 RNAiso Reagent 提取用慢病毒感染的细胞和未用慢 病毒感染细胞的总 RNA， 反转录成相应的 cDNA， 再用合成的 Hv1 引物和管家基因 GAPDH 引物 分别扩增 Hv1 和 GAPDH， 通过琼脂糖电泳检测。
结果如图 2 所示， 未用慢病毒感染的乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 含有表达电压门控 质子通道 Hv1 的基因， 而用慢病毒感染的乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 基本不含有表达电压门 控质子通道 Hv1 的基因。
(2) 蛋白水平检测电压门控质子通道 Hv1 的表达
采用免疫印迹的方法， 分别提取用慢病毒感染的细胞和未用慢病毒感染细胞的 总蛋白， 经过 BCA 定量后， 12.5 ％ (v/v) 的 SDS-PAGE， 并将蛋白转到醋酸纤维素膜上， 5％ (w/v) 的脱脂奶粉封闭后， 用小鼠抗人乳腺癌抗原 Hv1 多克隆抗体做一抗， 用山羊抗小鼠 IgG-HRP 做二抗， 再经化学发光法， 使用胶片感光。 结果如图 3 所示， ， 未用慢病毒感染的乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 表达电压门控质 子通道 Hv1 蛋白， 用慢病毒感染的乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 基本不表达电压门控质子通道 Hv1 蛋白。
(3) 划痕试验
将正常的 MDA-MB-231 细胞和用慢病毒感染后的 MDA-MB-231 细胞分别加入 24 孔 板中， 待细胞长满后用枪头划痕， 枪头要垂直， 不能倾斜， 用 PBS 洗细胞 3 次， 去除划下的细 胞， 加入培养基， 放入 37℃， 5％ CO2 培养箱培养， 按 O， 6， 12， 24 小时取样， 拍照。
结果如图 4 所示， ， 用慢病毒感染后的 MDA-MB-231 细胞迁移能力明显低于正常的 MDA-MB-231 细胞。
(4)Transwell 实验
将正常的 MDA-MB-231 细胞和用慢病毒感染后的 MDA-MB-231 细胞分别加入铺好 matrigel 的 Transwell 中， 再将 Transwell 放入 24 孔板中， 在 Transwell 和 24 孔板中加入 相同的培养液， 37℃， 5％ CO2 培养 24 小时， 多聚甲醛固定细胞， 结晶紫染色， 计数。
结 果 显 示， 用 慢 病 毒 感 染 后 的 MDA-MB-231 细 胞 浸 润 能 力 明 显 低 于 正 常 的 MDA-MB-231 细胞。
根据实验的结果表明， 电压门控质子通道 Hv1 的 cDNA 干扰片段可以抑制高转移乳 腺癌细胞的迁移和侵润能力， 从而抑制肿瘤的转移。
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