本发明涉及水溶性喜树碱的类似物，包含抑制肿瘤细胞所需量的 这种类似物的药物组合物，以及在需用这种药物的动物体内抑制对这 种类似物敏感的肿瘤细胞的生长的方法。
真核细胞内的DNA螺旋结构带来了一些局部解剖学的问题，细 胞组织必须破裂以便用其遗传物质作为一种模板。DNA链的分离对 细胞演变过程诸加DNA复制和转录是十分重要的。由于真核DNA 是通过染色体蛋白组成染色质，所以其末端被束缚，如果不借助于各 种改变解剖学的酶的帮助，其两条链不能解链。长期以来人们已认识 到，沿着DNA螺旋的转录或复制复合体的增长通过一个转点而变得 方便，转点解除了这些过程中产生的扭转张力。局部异构酶就是能够改 变真核细胞中DNA解剖学的酶。这些酶对各种重要的细胞功能和细 胞增生是井然有序的。
在真核细胞中存在有两种类型的局部异构酶，类型I和类型II。 局部异构酶I是分子量大约为100,000的单体酶。该酶与DNA相 连接导致一种暂时的单链断裂，使双螺旋解链(或允许其解链)，随 后在脱离DNA链前断裂口重新修复。
局部异构酶II是由两个相同的分子量为170,000的亚单元组 成。局部异构酶II使两条螺旋链暂时断裂并使另一个双链段通过该断 裂口。
喜树碱是从中国特有的Camptotheca accuminata(喜 树)树和印度特有的Nothapodytes foetida树中得到的一种 水不溶的细胞毒生物碱。喜树碱和其几种相近的同类物是唯一已知能 抑制局部异构酶I的一类化合物。
重要的商业用溶瘤细胞剂如：足叶乙甙(etoposide)阿霉素 (doxorubicin)和mitoxantrone，以及其它在发展的溶瘤 细胞剂的主要目标是抑制局部异构酶II。喜树碱(和它的已知同类 物)对局部异构酶II没有任何作用，而已知的局部异构酶II抑制剂中 没有一种对局部异构酶I有任何明显的作用。
由于临床效果不佳，不可接受的剂量限定的毒性，不可预期毒 性，水溶性不好和/或不可接受的储存期限的稳定性，人们还没有证 明喜树碱和它的已知的局部异构酶I抑制同类物作为溶瘤细胞剂对临 床药物发展具有吸引力。因此，需要有一种能避免喜树碱和其它已知的 有关局部异构酶I抑制同类物的不期望性质的局部异构酶I抑制剂。 本发明的化合物能满足这一需要。
本发明涉及式(I)化合物或其可药用的盐，水合物或溶剂合 物： 其中
X为羟基；氢；氰基；-CH2NH2或甲酰基；
R为氢(当X为氰基时)；CH2NH2或甲酰基； 或者R为-CHO或-CH2-R1(当X为氢或羟基时)；
R1为-O-R2；-S-R2；-N-R2(R3)；或 -N+-R2(R3)(R4)，但如果R1为-N+-R2(R3)(R4)， 该化合物就可与一个可药用的负离子相结合。
R2，R3和R4是相同或不同的，且选自H；C1-6烷基； C2-6羟烷基；C1-6二烷基氨基；C1-6二烷基氨基- C2-6烷基；C1-6烷基氨基-C2-6烷基；C2-6氨基烷基 或一个3-7元未取代或取代的碳环；而当R为-N-R2(R3)时，R2和R3可以同时接到同一个氮原子上形成一个取代的或未取代的杂环， 该杂环可以含有其它杂原子。
本发明也涉及下式化合物 式(II)化合物用于制备式(I)化合物，
术语“碳环”是指一个完全饱和的，部分饱和的或完全不饱和的 环系。
较好的式(I)化合物包括这些化合物，其中当X为羟基时，R 为二甲基氨基甲基，N-吗啉基甲基，N-甲基哌嗪基甲基，(4′ -哌啶)N-哌啶基甲基，(2′-羟乙基)氨基甲基，三甲基铵甲 基，环己基氨基甲基，N-甲基苯胺基甲基，乙氧基甲基，环丙基氨 基甲基，N，N-二甲基氨基乙氧基甲基，N，N-二甲基氨基乙硫 基甲基，N，N-二甲基氨基乙基氨基甲基，氰基甲基，氨基乙基或 甲酰基。较好的式(I)化合物也包括这些化合物，其中当R为氢 时，X为氰基，甲酰基或氨基甲基，其它较好的式(I)化合物为这 些化合物，其中X为氢，而R为二甲基氨基甲基或N-吗啉基甲基。 特别好的是其中R为二甲基氨基甲基的式(I)化合物，尤其是其S -异构体。
本发明还涉及一种药物组合物，其中包含一个有效的，肿瘤细胞 生长抑制量的式(I)化合物和一种惰性可药用载体或稀释剂。
本发明也涉及抑制对式(I)化合物敏感的肿瘤细胞生长的方 法，其中包括给受所述肿瘤细胞之害的动物(包括人)服以有效的， 肿瘤细胞生长抑制量的这种化合物。
我们知道，由于式(I)化合物的E环上的不对称碳原子(即 20号碳原子)，化合物将出现光学异构体。较好的异构体是S- 异构体，但R-异构体和外消旋混合物(外消旋物)也包括在式(I) 化合物的范围内。
可药用的盐和它们的制备，对本专业技术人员是熟知的。较好的 式(I)化合物的可药用盐包括醋酸盐，甲烷磺酸盐和盐酸盐诸如单 和二盐酸盐，以及式(I)化合物的碱金属盐如钠盐，其E环内酯经 受了碱的水解。
可药用的季铵盐中的负离子对本专业技术人员是熟知的。其中R1为-N+-R2(R3)(R4)的式(I)化合物的较好的可药用 的盐包括甲烷磺酸盐和氯化物。
式(I)化合物可以形成水合物或溶剂化物。本技术领域专业人 员都知道，荷电化合物与水冷冻干燥时形成水合物，或在溶液中浓缩 时与合适的有机溶剂形成溶剂化物。
式(II)化合物可以按照概括在实施例22中的方法制备。
式(I)化合物可以经过Mannich反应从10-羟基喜树碱 制备。10-羟基喜树碱与甲醛和一级或二级胺缩合(Mannich 反应)得到了除化合物(其中X为氢，氰基或甲酰基，R1为 -N-R2(R3)，而R2和R3相同，并都为氢)以外的所有式 (I)化合物。或者，可将10-羟基喜树碱进行甲酰化(Duff反 应)，得到9-甲酰基-10-羟基喜树碱，然后与胺缩合，再进行 氰基硼氢化钠化学还原或催化还原(Pd/C，H2)，得到与经 由Mannich反应相似的产物，以及其中R1为-N-R2(R3)而 R2和R3一样且都为H的化合物。R1为-N+-R2(R3)(R4)而 R2，R3和R4不是氢的式(I)化合物通过用烷基化试剂处理其 中R1为-N-R2(R3)的相应的式(I)化合物制备。本Mannich 反应由Magarian等人公开发表，J.pharm.Sci.，56， S87(1967)。Duff反应由Duff等人公开发表，J.Chem. Soc.，547(1941)。
R1为O-R2或S-R2的式(I)化合物可以通过在惰性溶 剂如二甲基甲酰胺中将9-二甲基氨基甲基-10-羟基喜树碱或它 的盐与合适的醇或硫醇加热而制备。当使用游离碱时，加入少量强酸 如盐酸。当Mannich反应混合物中存在有醇或硫醇，并加入了强酸 时，或胺组分处于强酸盐形式时，也可以直接地从Mannich反应混 合物中得到这些衍生物。
X为氢、氰基、甲酰基或氨基甲基的式(I)化合物可以通过钯 催化羰基化反应从式(II)化合物制备。三氟甲磺酸芳基酯(aryl triflates)的钯催化羰基化反应，发表在下述文献中：Cacchi 等人，Tetrahedron Letters，27，3931，5541， (1986)；Petrakis等人，J.Amer.Chem.Soc.， 109，2831(1987)及Chatani等人，J.Org.Chem.， 51，4714(1986)。
制备式(I)化合物的起始原料，即10-羟基喜树碱，是一种 与喜树碱存在于同一植物的天然产物〔参见：Wani等人，J.Org. Chem.，34，1364(1969)〕。已经从喜树碱存在的植物中 分离出了10-甲氧基喜树碱，并且通过与氢溴酸回流可以将其转化成 10-羟基喜树碱。喜树碱本身也可以通过先还原其吡啶环，再用四 醋酸铅氧化而转化成10-羟基喜树碱〔参见：Yakult Honsha K.K.，于1982年6月30日提出的日本专利申请 9005188〕。外消旋的10-羟基喜树碱也可以按Wani等人的 方法制备，J.Med.Chem.，23，554(1980)。有关喜 树碱的许多合成方法已有报导。参见如：Hutchinson， Tetrahedron，37，1047(1981)及Suffness和 Coldel的综述，“The Alkaloids.Chemistry and Pharmacology”，Brossi，A.，Vol.25，Academic Press，Orlando Floride，73(1985)。生产在20位碳 原子外消旋的喜树碱的最实用的路线(在下文称作Wani路线)由 Wani等人作了描述，J.Med.Chem.，23，554(1980)。 式(I)化合物的应用。
a细胞毒性
R为二甲基氨基甲基的式(I)化合物的醋酸盐(S异构体) (下文中称作“化合物1S”)在各种培养细胞系上显示出很强抗增 生活性(表1)。在八种体外培养的人结肠肿瘤细胞系系列中，化合 物1S的细胞毒性效能是非常一致的。当短暂暴露于药物时(2小 时)，50％抑制的浓度范围为0.12-2.1μg/ml，如果使 药物在培养基中保留整整七天，在此期间细胞会发生增生的，这时 IC50值的范围为3.9-75ng/ml。
三株啮齿动物肿瘤细胞系和两株“正常”啮齿动物细胞系对化合 物1S的敏感性也进行了评价。用在人结肠肿瘤细胞试验中所用的终 点同样的试验，对K12/Tr大鼠结肠癌和大鼠肾和肠上皮细胞系 进行了评价。这些啮齿动物细胞与最不敏感的人结肠肿瘤细胞系 CACO-2和WIDR在敏感性方面是相似的。小鼠肿瘤细胞系 L1210白血病和B16黑色素瘤，对于化合物1S不比人直肠肿瘤 细胞系更敏感。事实上，B16黑色素瘤细胞系似乎比所试验的其它 细胞系敏感性小得多。值得注意，B16和L1210在带瘤小鼠体内 治疗试验中对化合物1S都是非常敏感的。
用于评价表1所列的细胞系对化合物1S的细胞毒性的方案一般 如下：
细胞系以单层培养物形式使用和保存在最小必需培养基(Grand Island Biological Co.，Grand Island，N. Y.)中，该最小必需培养基补充10％胎牛血清，保存在含5％ CO2的湿润的37℃培养箱中。在无菌条件下使各种浓度的式(I) 化合物反应2小时，接着吸出介质，或连续暴露在其中。将平皿于37℃ 在CO2培育箱中培育7天。吸出介质，固定细胞并用乙醇和 Geisma染剂染色。用一个影像分析器扫描平皿来测定存活细胞密 度。相对于没有药物存在时培育的细胞，测定增生百分抑制，而 50％抑制浓度(IC50)用内插法测定。
表1 化合物1S对培养物中肿瘤细胞的细胞毒性 细胞系 IC50(μg/ml)
2小时 持续暴露
暴露 人结肠肿瘤细胞系 SW-620 0.12 0.0065 SKCO-1 0.23 0.0039 SW-948 0.26 0.016 DLD-1 0.44 0.015 LOVO 0.58 0.0097 HT-29 0.58 0.016 CACO-2 1.7 0.075 WIDR 2.1 0.025 啮齿动物肿瘤细胞系 L1210白血病 1.4 n.d. K12/Tr结肠癌 3.9 0.084 B16黑色素瘤 n.t.* 0.62 啮齿动物“正常”细胞系 NRK52E鼠肾上皮 1.2 0.052 IEC-6鼠肠上皮 3.9 0.017 *n.t.＝未试验
对各种式(I)化合物对生长在悬浮液培养物中的L1210白血 病细胞的细胞毒性进行了评价，(表2)将细胞持续暴露，无性繁殖于 含0.2％Noble琼脂的培养基。于37℃在CO2培育箱培育3天 后，用能使特异细胞存活的formazan染剂给菌落染色，24小时 后，用调节得可鉴定含50个细胞以上的菌落的菌落记数器 (BiotranII，New Brunswick Scientific Co.， Edison，NJ)记数。用内插法测定降低50％单细胞无性生殖效 能的浓度(IC50)。式(I)化合物的IC50值为12- 690nM，即表示细胞毒活性的IC50值。有关的天然产物10- 羟基喜树碱的IC50为18nM。式(I)细胞毒化合物是纯化的 局部异构酶I的强抑制。剂正如下述有关体内活性的部分表明的，许多 式(I)化合物，尽管一般不如10-羟基喜树碱细胞毒性高，但它 们在体内对L1210白血病具有抗肿瘤活性，这种活性等于或者高于 10-羟基喜树碱。例如，化合物1S就体外对L1210白血病细胞 的细胞毒性效能而言，比10-羟基喜树碱低约3倍，但它显示出体 内肿瘤细胞生长抑制活性，这种活性在各种啮齿动物可移植的肿瘤模 型中高于10-羟基喜树碱。
表2 式(I)化合物在体外和在经受腹膜内 植入肿瘤的小鼠体内抗L1210白血病的活性
表2(续) 式(I)化合物在体外和在经受腹膜内植入肿瘤 的小鼠体内抗L1210白血病的活性
表2(续) 式(I)化合物在体外和在经受腹膜内植入 肿瘤的小鼠体内的抗L1210白血病活性 R X 体外活性 体内抗肿瘤活性
％ IC50 MTO ILS 化合物序号 (nM) (mg/kg) (％) 195 氢 -CHO 62 未试验 205 氢 -CH2NH2 90 92 112 215 -CH2N(CH3)2 羟基 未试验 54 ＞200
(钠盐) 225 -CH2CH2NH2 羟基 360 100 75 对于体内研究，是将L1210细胞腹膜内植入(106/每只小鼠)，在第1天和第5天腹膜内给药， 寿命增加(ILS)是基于用最大承受剂量的药物处理过的各组中6只小鼠存活时间中间值。 *试验的最大剂量(再增大剂量时，可能活性程度更高) 对于体外研究，L1210细胞生长在悬浮液培养物中，并持续暴露于药物，细胞在软琼脂中无性繁殖。 测定无性繁殖效能。通过插入法测定50％抑制浓度(IC50)。 列在上面的所有化合物都是有效的局部异构酶I抑制剂，局部异构酶I是从人直肠癌纯化的。
b.体内肿瘤细胞生长抑制
最初，用腹膜内(ip)植入L1210白血病的小鼠来评价式 (I)化合物体内抗肿瘤活性。化合物1S和化合物4S-13S在 各自的最大耐受剂量水平使患肿瘤的小鼠寿命延长了＞40％。三种 化合物——化合物1S、6S和11S是特别有效的，使寿命延长 ＞200％，并且得到长期不患肿瘤的幸存者。在结构上与10-羟基 喜树碱相关的式(I)化合物中有许多化合物的活性都高于天然产物 10-羟基喜树碱。对于其中两种化合物——化合物7S和13S， 所试验的最高剂量都没毒性，因此这些化合物在更高剂量水平可能有 更大活性。然而，在试验的剂量下，这些化合物是有活性的。
基于化合物1S在体内的高活性和效能(即低的最大耐受剂 量)，在各种接种的小鼠肿瘤模型中对之进行了评价。在各种动物肿 瘤模型包括白血病和各种组织型实体肿瘤中，化合物1S在其最大耐 受剂量具有高的活性。化合物1S的活性谱总结在表3中。可以看 出，对于大多数肿瘤模型具有高度活性，只有一种模型，腹膜内结肠 癌26证明对该药物几乎是无效的。还有两种皮下模型，结肠癌 26和Madison肺癌，证明对该药物效果不太明显，即在这些模型 中，当用化合物1S处理皮下接种肿瘤小鼠时，有明显的中等活性， 即大于70％肿瘤生长抑制。在另一种皮下sc肿瘤模型中显示出高 活性(大于90％抑制)。值得注意，化合物1S腹膜内给药，不仅 对腹膜内肿瘤模型而且对在静脉(iv)或皮下接种了肿瘤的小鼠体 内也显示出高活性。在一些肿瘤模型中，包括腹膜内和静脉接种 P388和L1210白血病以及静脉和皮下接种Lewis肺癌，治疗 活性是明显的。在动物肿瘤模型中，化合物1S的活性水平和活性 谱比最广谱的已知抗肿瘤药如环磷酰胺，顺氯氨铂和阿霉素都好。
表4较详细地总结了这些接种小鼠肿瘤模型研究的结果，其中给 出了在最佳时间以化合物1S的最佳剂量和最佳方案给药所达到的存 活期延长(ILS)或可测量的(即皮下)实体肿瘤生长抑制百分 率。表4还给出了对于这些肿瘤模型用天然产物母体化合物喜树碱和 10-羟基喜树碱进行比较研究所获得的结果。这些结果是通过间歇 时间(即每隔3天或6天)进行腹膜内或静脉给化合物1S而得到 的。在某些情况下，这些结果是通过最佳治疗方案获得的，其中化合 物1S在一天治疗中以分散剂量方式(每隔3小时一次，共4次) 给药，关于这一点将在后面更详细地描述。由于喜树碱和10-羟 基喜树碱在水介质中的不溶解性，它们总是悬浮液腹膜内给药。
从表4明显地看出，所有三种化合物对各种动物肿瘤模型具有 广谱活性。对几种肿瘤模型，化合物1S显示出较高活性，这些肿 瘤模型包括：ip L1210白血病，ip B16黑色素瘤，iv P388白血病，iv L1210白血病，sc Lewis肺瘤，sc B16黑色素瘤，sc B16黑色素瘤/F10亚系，sc结肠癌 51以及sc Madison肺癌。10-羟基喜树碱对ip接种的 肿瘤模型是非常有效的，但对接种肿瘤部位远离给药部位的肿瘤模 型来说其活性较差；这种药对sc接种的实体肿瘤模型至多显示微 弱活性。这看来并非由于10-羟基喜树碱的溶解性不好所致，因 为喜树碱与之有相同的不溶解性，但对某些sc肿瘤模型是非常有 效的。这很可能是由于10-羟基喜树碱的芳香羟基对第一次排泄 结合(first pass conjugation)和胆排泄是敏感的， 因此，该化合物就不能在系统循环中达到足够浓度。值得注意，化 合物1S也具有10-羟基，它对sc及iv肿瘤模型却具有高活 性。这可能是由于化合物1S的9位存在碱性侧链，它可以通过空 间阻碍、氢键或形成内盐来抑制10-羟基的代谢。10-羟基喜 树碱对ip结肠瘤26是高活性的，而该肿瘤模型对化合物1S不 敏感，对喜树碱敏感性也极小。然而，对于同样肿瘤采用sc接种 时，10-羟基喜树碱没有活性，而化合物1S具有中等活性。
除了表4所示的化合物1S的高活性和广谱性外，当该化合物 口服时，也能保持完全抗肿瘤活性。这可用sc接种Lewis肺癌 的小鼠来说明并详述于后。化合物1S的另一特性是对P388白血 病细胞亚系保持活性，如下所述该亚系对多种抗肿瘤药物具有抗 性。癌症化疗学中的一个主要问题是抗性细胞群的出现。抗性细胞 群对最初有效的用药方案以及二线治疗方案均没有反应，利用抗性 细胞不产生交叉抗性的药物，应该对癌症治疗具有重大影响。
化合物1S对于已试验过的每种肿瘤模型的活性详述如下： ip肿瘤模型
表5给出了在各种治疗方案中对经过ip接种肿瘤的小鼠ip 或sc给化合物1S时的活性。数据表明了化合物1S对6种ip 接种的肿瘤模型所用剂量与抗肿瘤效果的依赖关系。
P388白血病：对ip接种P388白血病的小鼠在第1和第5 天给药时，化合物1S在其最大耐受剂量15mg/Kg时产生 200％的ILS，包括4/6长期存活者(治愈)，较低剂量也具 有延长存活期125％和92％的高活性。这种高活性被下面描述的 另一实验(见表8)所证实，该实验中，最大耐受量产生了228％ ILS，并有2/6长其存活者这样，化合物1S对带有ip接 种P388白血病的小鼠具有治疗活性。
L1210白血病：对ip接种L1210白血病的小鼠在第1和第 5天ip给药时，化合物1S具有可重现的活性。表5所示的典型 试验中，在最大耐受量15mg/Kg时得到219％ILS，并且 2/6治患。用两个较低剂量时也看到了好的活性。按照这一方 案，通过研究其它8个剂量的反应，对化合物1S进行了评价。在 这些试验中用最大耐受剂量得到的ILS百分率和长期存活率如 下：44％(0/6)，＞300％(5/6)，119％(0/6)， 156％(1/6)，138％(0/6)，156％(2/6)， 350％(2/6)及138％(1/6)。这样，8/9试验中化 合物1S产生了大于100％ILS而6/9试验中存在长期存活者。
B16黑色素瘤：在本肿瘤模型中，化合物1S明显地优于喜 树碱和10-羟基喜树碱(见表4)，该药以其最大耐受剂量 15mg/Kg在第1，5，9和13天ip给药时可产生152％ ILS。这一结果得到了第二次试验(试验的最高剂量9.6mg/Kg， 产生130％ILS)的支持。
B16黑色素瘤/F10亚系：B16黑色素瘤的F10亚系 是通过单细胞无性繁殖选择的这种肿瘤中的一种高转移性亚系。化 合物1S以其最大耐受剂量15mg/Kg在第1，5，9和13 天ip给药后，产生105％ILS。对两个较低剂量，其活性(ILS 增加大于40％)是明显的。
M5076肉瘤：M5076肉瘤是一种转移性网状组织细胞肉瘤它 存在于C57BL/6小鼠的卵巢中，它已确定作为一种移植肿瘤。
当化合物1S以sc及ip方式给药时，ip接种的这种肿瘤 对它是敏感的。按照两种给药途径，采用在第1，5和9天，每隔 3小时一次，一天4次的分剂量方案给药，得到的活性实际上是一 样的，98％ILS和105％ILS。这种方案(描述于后)在许多 肿瘤模型中对化合物1S来说可以认为是最佳的。通过另外三组对 ip接种M5076肉瘤的小鼠的剂量—反应研究。对化合物1S进行 了评价。在这些研究中，采用下列方式给药：在第1，5和9天ip 一次给药(75％ILS，其中1/8治愈)，在第1，5，9和 13天ip一次给药(71％ILS，其中1/8治愈，及在第1， 5和9天sc一次给药(57％ILS)。至于对iv和sc肿瘤模 型(如下所述)，当按分散剂量治疗方案给药时，化合物1S对 ip M5076肉瘤可以认为是最有效的。但是，不管给药方式如何， 化合物1S对这一肿瘤模型有可重现的活性。
结肠癌26：结肠癌26是一种高侵袭和转移性的不分化的结 肠肿瘤模型。按照试验方案，这种肿瘤在对化合物1S最大耐受剂 量下证明是不易产生疗效的。 iv肿瘤模型
对患有全身(iv接种的)白血病或Lewis肺癌的小鼠以ip 或iv给药后化合物1S的活性表示在表6中。这些研究清楚地表 明化合物1S的剂量反应和方案相关性。对三种肿瘤模型中的每一 种，化合物1S都显示出治疗活性。
P388白血病：P388白血病当iv植入时一般比ip接种时 具有低得多的药物敏感性。然而，化合物1S在第1和第5天(以 其最大耐受剂量与否)给药时对iv P388白血病具有高活性， 无论是ip给药(279％ILS，其中2/6治愈)还是iv给药 (250％ILS，其中2/6治愈)。在对该肿瘤模型第三个试验 中，化合物1S在第1和第5天以最大耐受剂量15mg/Kg ip给药时，产生125％ILS，其中1/6治愈。
L1210白血病：化合物1S对iv植入L1210白血病证明是 有可重现的高活性的。通过iv给药对这种肿瘤模型进行了广泛的 方案相关研究。如表6所示，以分散剂量方式给药在较宽的剂量范 围得到了较高的活性。当在第2和第6天以单剂量或4次剂量(3 小时同隔)通过iv给药时，可以看出治疗活性。除了表6所示数 据外，还对iv接种L1210白血病的小鼠通过iv给化合物1S 进行了10次剂量—反应研究。结果如下：第2和第6天给药，得 到171％ILS，其中2/6治愈；第2和第6天给药，3小时间 隔，一日4次，得到大于300％的ILS，6/6治愈；在第2和 第6天给药，6小时间隔，一日3次，得到200％ILS，其中 2/7治愈；第2和第6天给药，12小时间隔，一日2次，得到 229％ILS，其中2/7治愈；从第2天到第6天一次性给药， 得到143％ILS和129％ILS；从第2天到第6天分两次给 药，12小时间隔，得到193％ILS和171％ILS； 在第2天给单剂量，得到114％ILS；以及在第2天，3小 时间隔，分4次给药，得到244％ILS，其中1/6治愈。当 按3小时间隔方案给药时，化合物1S显示出最好的效果。每日给 药不如每隔4天给药效果好。从这些研究中得到的最佳方案可用于某 些实体肿瘤，如上述的ip M5076肉瘤，和下述肿瘤。在各种肿瘤 系统中，若将化合物1S采用分散剂量(即隔3小时一次，分4次) 方案给药，那么活性可以增加，并且有效剂量范围更宽。
Lewis肺癌：Lewis肺癌是一种高转移性的未分化肺癌，它 已经被广泛地用于药物评价。这种肿瘤模型对许多已知的抗肿瘤药 物是难以奏效的，当使用这种模型作为一个筛选体系时，只有很少 几种化合物被鉴别是有活性的。化合物1S对这种化学难以奏效的 肿瘤模型是有治疗作用的，其中肿瘤是通过iv接种，并在肺中形 成肿瘤结节。对于这种肿瘤模型的治疗活性是一个不寻常的发现。
从所有三种iv接种的肿瘤模型看出，当通过ip和iv给药 时，化合物1S对全身肿瘤是非常有效的。 sc肿瘤模型
用10种实体肿瘤模型对化合物1S进行评价，在这些模型 中肿瘤是通过sc植入的，给药途径是通过ip，iv或口服(po)。 在这些模型中，抗肿瘤活性是通过肿瘤植入部位肿瘤生长的抑制程度 来估价的。肿瘤的测量一般是在肿瘤植入2-3周进行，这时在未 处理过的对照动物体内大肿瘤(大于500mm3)是明显的。对于高 转移性实体肿瘤，存活时间也可用来测定药物活性。对于转移性较小 的肿瘤模型，未处理动物的存活时间是高度可变的，并且动物可带着 很大肿瘤长期存活，这些肿瘤往往溃烂并感染，化合物1S对10种 sc实体肿瘤模型中的8种具有高的有效性，在其最大耐受剂量时， 对肿瘤生长的抑制率超过了90％(表7)。对高转移性肿瘤(包括 Lewis肺癌、B16黑色素瘤、B16黑色素瘤/F10亚系以 及M5076肉瘤)的肿瘤生长的完全抑制伴随着寿命延长。既使对于 较小反应的肿瘤模型(Madison肺癌和结肠瘤26)，化合物1S 在其最大耐受剂量时明显具有大于70％抑制肿瘤生长的活性。
Lewis肺癌：这种高转移性肺肿瘤是所试验的肿瘤模型中对化 合物1S最敏感的。用于Lewis肺癌已经被广泛地用于抗肿瘤药研 究，并且对大多数已知抗肿瘤药物是难以奏效的，所以这是一个不寻 常发现。当在第1，5，9和13天以15或9mg/Kg量ip给 药时，化合物1S可完全抑制实际试验的所有小鼠的Lewis肺瘤生 长。在最大耐受量时，有4/8的小鼠被治愈。在测定肿瘤时(14 天)，未处理的对照组的肿瘤平均体积为1685mm3。在第二个试 验中，化合物1S在第1，5和9天采用iv和po给药。按两种给 药途径，都可得到99％肿瘤生长抑制(TGI)，其中半数或更多 动物在测定时间(13天)观察不到肿瘤迹象。而且，以最大耐受剂 量按两个给药途径给药，效果实际上是相同的，说明了口服给药，化 合物1S具有良好的生物利用度。在本试验中，肿瘤实际上是在植入 部位生长，这表明对这种肿瘤模型最好的疗法，是通过ip给药治 疗，或者要取得治疗活性，需要进行较长时间的持续治疗。
B16黑色素瘤：这种转移性黑色素瘤模型已被广泛地用于评价 和筛选抗肿瘤药物。当sc植入时，这种肿瘤对多数抗肿瘤药物是难 以奏效的。对sc接种B16黑色素瘤的小鼠，通过三组剂量反应研 究，对化合物1S进行评价。当将化合物1S以其最大耐受量在第 1，5和9天以单剂量给药(ip或iv)时，在两次试验中都可 产生99％肿瘤生长抑制(TGI)，其中多数动物在16或14天 没有任何可测量的肿瘤存在，而此时的对照小鼠肿瘤大小平均为 864和758mm3。当按上述最佳分散剂量治疗方案给药时，化 合物1S在较宽剂量范围内可产生肿瘤生长完全抑制。这与在其它肿 瘤模型中获得的结果一致。在sc B16黑色素瘤模型中，肿瘤实 际上在所有试验动物体内都生长，而且没有治愈者。然而，在这一转 移性肿瘤模型中，可看到与肿瘤生长完全抑制同时存在的寿命延长。 按照分散剂量方案，得到52％ILS，而在笫1，5和9天把 24mg/Kg作为单剂量ip给药，可使寿命延长39％。按后一 种方案，iv给药得到53％ILS。
B16黑色素瘤/F10亚系：为增加转移性而选择的B16黑色 素瘤的这种亚系，在其对化合物1S的敏感性方面与其母体B16黑 色素瘤相似。在第1，5，9和13天以最大耐受剂量ip给药后， 肿瘤生长得到了完全的抑制。在第1，5和9天以两种剂量iv给药。 得到97％肿瘤生长抑制。在这些试验中，肿瘤是在第16天测量， 对照小鼠的肿瘤非常大，平均为1927和1196mm3。在所有治疗 组中实际上都生长有肿瘤并且没有治愈。然而，以25mg/Kg- ip给药存活期增加了70％(ILS)，以同样的剂量iv给药得 到38％的ILS。
ADJ-PC6浆细胞瘤：这种肿瘤模型与多发性骨髓瘤这种人 体癌最接近。这种模型对于在第1，5，9和13天ip给药的化合 物1S是高度敏感的。在第19天测量肿瘤，对照小鼠的平均肿瘤大 小为828mm3。在最大耐受量或低于此量时，分四个剂量组给 药，化合物1S产生大于90％的肿瘤生长抑制。在三个剂量组中的 每一个高剂量给药时，有1/8长期不带肿瘤的存活者。由于这一肿 瘤不是高度转移性的，所以没有测定平均存活时间。
M5076肉瘤：sc植入的M5076肉瘤对化合物1S是非常敏感 的，在最大耐受量或低于此量时有3个剂量组产生大于90％TGI。 在第17天时测量肿瘤，此时对照肿瘤平均大小为1045mm3。在 第1，5，9和13天ip给药，对这种模型，该药物不是治愈性 的，而是存活期延长31％。
乳腺癌16/C：这种乳瘤模型是可移植的C3H小鼠的自发乳 瘤亚系。化合物15在第1，5，9和13天以最大耐受量10mg/ Kg ip给药后可抑制96％肿瘤生长。第19天时测量肿瘤，此 时对照小鼠的平均肿瘤大小为630mm3。在按同样的治疗方案进 行的第二个试验中，化合物1S对乳腺癌16/C产生了73％肿瘤 生长抑制(TGI)。由于这种肿瘤不是高转移性的，所以没有进行 动物存活试验。
结肠腺癌38：这种非转移性的结肠肿瘤模型已经广泛地用于药 物评价，并且被认为是药物更难以奏效的肿瘤模型之一。化合物1S 在第3，10，17和24作为单剂量或按分散剂量方案ip给药。 之所以选择较长的治疗方案是因为这种实体肿瘤生长缓慢。在第31 天时测量肿瘤，而未治疗的对照组的平均值只有349mm3。如对 于其它肿瘤模型，化合物1S以分散剂量给药时是更有效的，在两个 剂量组均产生了大于90％的抑制。好的活性(89％TGI)对于 单剂量方案也是明显的。
结肠腺癌51：这是另一种生长缓慢的、证明对多数抗肿瘤药物 难以奏效的结肠肿瘤模型。用于这种模型的治疗方案与结肠腺癌38 相似。化合物1S对结肠腺癌51是有效的，采用单剂量给药方案产 生88％TGI，而采用分散剂量给药后产生92％TGI。如对其 它肿瘤，当采用分散剂量方案时，化合物1S在较宽剂量范围有效， 在第24天测量结肠腺癌51，此时对照肿瘤平均为766mm3。
Madison肺癌：Madison肺癌，与Lewis肺癌一样，是一 种具有高转移活性的、生长迅速的未分化肿瘤模型。与Lewis肺癌 不同，Madison肺癌对化合物1S不是高度敏感的。在第1，5和 9天以最大耐受量按单剂量方案iv给药，实际上没有产生肿瘤生 产抑制(28％TGI)。按照同样的治疗方案通过ip给药来进行 另外两个试验，化合物1S仅产生50％和23％TGI。然而，按 照最佳分散剂量方案采用iv给药时，化合物1S确实显示出抗 Madison肺癌活性，以其最大耐受量给药，得到85％TGI。按 这一治疗方案采用ip给药时，该药的有效性略有降低(以最大耐受 量给药得到74％TGI)。对两个独立的试验，在第12或第13 天测定Madison肺肿瘤，此时对照小鼠肿瘤的平均大小分别为 1571和942mm3，这反映了这种肿瘤的迅速生长率。这样，既 使对于难以奏效的肿瘤，按最佳治疗方案服用化合物1S，也可以导 致明显的肿瘤生长抑制。
结肠癌26：对这一高侵袭性和转移性的未分化结肠肿瘤，当在 第1，5，9和13天以其最大耐受量ip给药时，化合物1S仅产 生边界的肿瘤生长抑制(72％TGI)。在第19天进行肿瘤测 量，此时对照肿瘤平均大小为1052mm3。若按最佳分散剂量方案 给药，化合物1S是否能对这一肿瘤模型显示出好的活性尚不清楚。 对多种药物具有耐药性的亚系
虽然癌症治疗学中最主要的问题是普通瘤对所有可利用化疗试剂 或联合治疗方案的内在不敏感性，而另一个主要问题是从先前敏感的 肿瘤中出现了耐药性肿瘤细胞。患有“化学敏感的”肿瘤诸如非小细 胞肺癌、卵巢腺癌、急性非淋巴细胞白血病、乳癌及某些淋巴癌的多 数病人可经过联合治疗方案得到缓解，联合方案已经确立作为对这些 不同疾病的一线治疗方案。然而，在多数情况下，病人会产生疾病的 复发，并且，既使采用高度深入细致的联合方案，也会使诱发预后有 意义缓解的能力大大降低。在特征上，这些复发肿瘤证明对那些药物 是难以奏效的。这些药物在结构和/或机理上与最初用来诱发缓解的 药物无关。这种对多种药物具有耐药性的现象，许多试验室目前正在 深入细致地研究。最近结果表明对多种药物耐药性(mdr)基因的 扩大和表达和mdr基因产物(P170膜糖蛋白)的存在与多种药 物耐药性有关。P170原意是作为具有令人难以置信的多样化的底 物专一性的溢出物转移泵。最近文章指出，在某些预先未处理过的肿 瘤如嗜铬细胞瘤和结肠腺癌中mdr基团的有力表达对于这些肿瘤内 在的药物难以奏效的遗传表型至少有部分是敏感的。
因此，鉴别新试剂是重要的，而这些新试剂对多种药物具有耐药 性的遗传表型的肿瘤保持有高度活性。这些试剂对于化学敏感性肿瘤 治疗的进一步发展可能是具有希望的(即，或者对先前治疗过的病人 表现出效力或作为一线联合方案中的一个组分杀死mdr亚群)，这 些试剂对现在非敏感性肿瘤也可能是有希望，这些肿瘤由于mdr基因 的inate表达而对可利用的药物不敏感。在这一方面，喜树碱已经 证明是不寻常的，它是少数几种天然产物细胞毒剂中的一种，这些细 胞毒剂对呈现mdr遗传表型的非常特征的肿瘤亚系，即对阿霉素、长 春新碱、安吖啶(amsacrine)椭圆玫槐树碱或mitoxantrone 具有抗性的P388亚系还没有出现交叉抗药性。由于对多种药物具 有耐药性细胞系呈现交叉抗药性的多数药物是碱性的，因此，我们可 以期望如在化合物1S中那样，在喜树碱分子中引入一碱性侧链而得 到一个化合物，这种化合物可被P170糖蛋白转移到细胞外，这样 证明了对mdr基因表达的肿瘤的无效性。
用接种P388和其耐阿霉素和mitoxantrone的亚系的小 鼠对化合物1S进行评价(表8)。阿霉素和丝裂霉素C用来作为比 较。P388/阿霉素和P388/mitoxantrone保持了对化 合物1S的敏感性。这些对多种药物耐药的细胞系对阿霉素表现出预期的 抗药性。P388/阿霉素对丝裂霉素C也具有抗药性。这样，化合 物1S对具有对多种药物耐药的细胞系保持有抗肿瘤活性，这正是喜 树碱的一个特性。 化合物1的外消旋体
上述所有生物学研究都是用化合物1的S型异构体进行的，C- 20构型存在于天然的喜树碱和10-羟基喜树碱分子之中。通过全 合成制备了化合物1的外消旋体，并评价其对ip接种P388白血 病小鼠的抗肿瘤活性(表9)。化合物1的外消旋体(下文称作化合 物1RS)对P388白血病是具有高活性的，在第1和5天按29 mg/Kg剂量给药后，得到165％ILS，其中1/6长期存 活。尽管活性并不完全与化合物1S相同(参见表5和8)，但化合 物1RS对这一肿瘤模型具有良好活性。 化合物1S的不同形式的盐
由于9位上碱性侧链的存在，化合物1S是水溶性的，碱性侧链 可与酸如乙酸、盐酸和甲磺酸形成盐。在表2至9中所描述的试验或 者是用化合物1S的乙酸盐或者是用其盐酸盐进行的。可溶形式的化 合物1S也可以通过化合物1S的E环内酯的碱性水解形成该化合物 的水溶性碱金属羧酸盐形式来制备。化合物1S的乙酸盐、盐酸盐、 二盐酸盐和钠盐的直接比较是用iv接种L1210白血病的小鼠进行 的(表10)。这些化合物在第1和第5天以5％葡萄糖溶液iv给 药。二盐酸盐通过加入过量盐酸而形成，这可能是由于B环中喹啉氮 以及二甲基氨基甲基的氮质子化的结果。每种盐形式对这种肿瘤模型 都是有活性的：100％ILS(乙酸盐)，175％ILS(盐酸 盐)133％ILS(二盐酸盐)以及208％ILS(钠盐)。三 种酸的盐是等效的，即它们具有相同的最大耐受剂量15mg/Kg。 然而，钠盐按其最大耐受剂量54mg/Kg给药时，其效力约低 3.5倍。
表3 化合物1S对动物肿瘤模型的活性谱 肿瘤模型 最大耐受量时的活性
ip肿瘤模型 P388白血病 +++ L1210白血病 +++ B16黑瘤 ++ B16黑瘤/F10亚系 ++ M5076肉瘤 ++ 结肠癌26 -
(iv肿瘤模型) P388白血病 +++ L1210白血病 +++ Lewis肺癌 +++
(sc肿瘤模型) Lewis肺癌 +++ B16黑瘤 ++ B16黑瘤/F10亚系 ++ ADJ-PC6浆细胞瘤 ++ M5076肉瘤 ++ 乳腺癌16/C ++ 结肠腺癌38 ++ 结肠腺癌51 ++ Wadison肺癌 + 结肠癌26 + 化合物1S每隔3或6天通过ip或iv给药，在肿瘤植入后1- 3天开始，进行2-4个疗程。 +++＝治疗性的(＞200％寿命增加(ILS)) ++＝＞100％寿命增加(ILS)或＞90％肿瘤抑制(TGI) +＝＞50％ILS或＞70％TGI -＝＜50％ILS或＜70％TGI
表4 化合物1S与喜树碱和10-羟基喜树碱对动物肿瘤模型
的活性比较 肿瘤模型 化合物上S 喜树碱 10-羟基喜树碱
寿命增加(ILS)或肿瘤生长抑制(TGI)
ip肿瘤模型 P388白血病 治疗性的 治疗性的 治疗性的 L1210白血病 治疗性的 172％ILS 94％ILS B16黑瘤 152％ILS 36％ILS 95％ILS B16黑瘤/F10亚系 105％ILS 68％ILS 100％ILS M5076肉瘤 105％IIS 81％ILS 98％ILS 结肠癌26 25％ILS 50％ILS 治疗性的
iv肿瘤模型 P388白血病 治疗性的 75％ILS 40％ILS L1210白血病 治疗性的 136％ILS 100％ILS- Lewis肺癌 治疗性的 未试验 未试验
sc肿瘤模型 Lewis肺癌 治疗性的 92％TGI 4％TGI B16黑瘤 100％TGI 78％TGI 未试验 B16黑瘤/F10亚系 100％TGI 90％TGI 58％TGI ADJ-PC6浆细胞瘤 100％TGI 100％TGI 76％TGI M5076肉瘤 100％TGI 100％TGI 66％TGI 乳腺癌16/C 96％TGI 99％TGI 61％TGI 结肠腺癌38 96％TGI 100％TGI 未试验 结肠腺癌51 92％TGI 75％TGI 未试验 Madison肺癌 85％TGI 63％TGI 33％TGI 结肠癌26 72％TGI 66％TGI 37％TGI 给出的活性是在最大耐受量时得到的，药物通过ip或iv使接种肿 瘤小鼠服用，在肿瘤植入以后1-3天开始，每隔3或6天给药， 进行2-4个疗程。值的测量是基于完全剂量反应研究中各组中的 6-8只小鼠的存活时间中值和平均肿瘤体积。
表5
化合物1S对带有ip植入肿瘤的小鼠的活性 肿瘤模型 治疗方案/给 剂量(mg/ ILS 长期存活者
药途径 Kg/注射) (％) P388 白血病 A/ip 30 毒性的
15 ＞200 4/6
7.5 125
3.8 92 L1210 白血病 A/ip 25 毒性的
15 219 2/6
9 138
5.4 81
3.2 31 B16 黑色素瘤 B/ip 25 毒性的
15 152
9 100
5.4 52
3.2 43 B16黑色素瘤 B/ip 25 毒性的 F10亚系 15 105
9 68
5.4 63
3.2 37 M5076 肉瘤 C/ip 10 毒性的
5 毒性的
2.5 105
1.2 75 1/8
0.62 70 1/8 M5076 肉瘤 C/sc 10 毒性的
5 毒性的
2.5 98
1.2 70 1/8
0.62 36 结肠癌 26 B/ip 40 毒性的
20 毒性的
10 25
5 5
2.5 7 治疗方案是：A＝第1和5天给药；B＝第1，5，9和13天给药；C＝ 第1，5和9天给药，每3小时一次，每天4次。 寿命增加(ILS)基于各组中的6～8只小鼠相对于未处理对照的中值存活 时间。长期存活者是指对于白血病45天，对于固体肿瘤60天不受肿瘤影响的。
表6
化合物1S对带有iv植入肿瘤小鼠的活性 肿瘤模型 治疗方案/给药 剂量(mg/ ILS 长期存活者
途径 Kg/注射) (％) P388 白血病 A/ip 25 279 2/6
15 132
9 100
5.4 58
3.2 42 P388 白血病 A/iv 25 毒性的
19 250 2/6
14 145
10 110
7.9 65 L1210 白血病 A/ip 25 毒性的
15 171 1/6
9 136
5.4 93
3.2 57 L1210 白血病 D/iv 40 毒性的
24 ＞300 4/7
14 157
8.6 129
5.2 71 L1210 白血病 E/iv 6 毒性的
3.6 ＞300 5/7
2.2 ＞300 1/7
1.3 243 2/7
0.78 186 Lewis 肺癌 B/ip 25 毒性的
15 ＞200 7/7
9 111 1/7
5.4 37
3.2 16 治疗方案是：A＝在第1和5天给药；B＝在第1，5，9和13天给药； D＝在2和6天给药；E＝在第2和6天给药，每隔3小时一次，每天4次。 寿命增加(ILS)基于各组中的6～8只小鼠相对于未处理对照的中值存活时间。 长期存活者是指对于白血病45天，对于固体肿瘤60天不受肿瘤影响的。
表7
化合物1S对带有sc植入肿瘤小鼠的活性 肿瘤模型 治疗方案/给药 剂量(mg/ TGI 没有明显肿瘤
途径 Kg/注射) (％) 的小鼠 Lewis 肺癌 B/ip 25 毒性的
15 100 8/8*
9 99 7/8**
5.4 68 2/8
3.2 31 Lewis 肺癌 F/iv 25 99 5/8
15 95 3/8
9 93 1/8
5.4 87 4/8 Lewis 肺癌 F/po 45 毒性的
27 99 4/8
16 90 1/8
9.7 89 2/8
5.8 51 B16 黑色素瘤 F/ip 24 99 7/8
14 57 3/8
8.6 63 3/8
5.2 20 1/8
3.1 63 2/8 B16 黑色素瘤 F/iv 25 毒性的
15 99 7/8
9 96 6/8
5.4 79 3/8
3.2 54 2/8 B16 黑色素瘤 C/ip 6 100 7/7
3.6 100 7/7
2.2 92 2/8
1.3 64 1/8
0.78 46 1/8
表7(续)
化合物1S对带有sc植入肿瘤小鼠的活性 肿瘤模型 治疗方案/给药 剂量(mg/ TGI 没有明显肿瘤
途径 Kg/注射) (％) 的小鼠 B16黑色素瘤/ B/ip 25 100 7/8 F10亚系 15 87
9 57
5.4 62
3.2 52 B16黑色素瘤/ F/iv 25 97 6/8 F10亚系 15 97 7/8
9 60 2/8
5.4 34 1/8
3.2 22 1/8 ADJ-PC6 B/ip 25 毒性的 浆细胞瘤 15 100 7/7***
9 100 8/8***
5.4 92 4/8***
3.2 93 3/8 M5076肉瘤 B/ip 25 毒性的
15 100 8/8
9 98 6/8
5.4 92 3/8
3.2 64 2/8 乳腺癌16/C B/ip 20 毒性的
10 96 5/8
5 61 2/8
2.5 59 1/8 结肠腺癌38 G/ip 24 89 4/7
14 78 5/7
8.6 55 3/7
5.2 0 1/7
3.1 0 2/7
表7(续)
化合物1S对带有sc植入肿瘤小鼠的活性 肿瘤模型 治疗方案/给药 剂量(mg/ TGI 没有明显肿瘤
途径 Kg/注射) (％) 的小鼠 结肠腺癌38 H/ip 6 96 5/7
3.6 93 6/7
2.2 74 4/7
1.3 68 4/7
0.78 53 2/7 结肠腺癌51 G/ip 24 88 3/8
14 76 1/8
8.6 53 1/8
5.2 36
3.1 34 结肠腺癌51 H/ip 3.6 92 4/8
2.2 89 4/8
1.3 88 3/8
0.78 73 1/8
0.47 37 Madison肺癌 F/iv 24 28 1/8
12 0
6 21
3 0
1.5 0 Madison肺癌 C/iv 3 毒性的
1.5 85 3/8
0.75 63 1/8
0.38 41
0.19 0
表7(续)
化合物1S对带有sc植入肿瘤小鼠的活性 肿瘤模型 治疗方案/给药 剂量(mg/ TGI 没有明显
途径 Kg/注射) (％) 的肿瘤的
小鼠 结肠癌26 B/ip 20 毒性的
10 72
5 39
2.5 38 治疗方案是：B＝在笫1，5，9和13天给药；C＝在第1，5和 9天给药，每隔3小时一次，每天4次，F＝在笫1，5和9天给 药；G＝在第3，10，17和24天给药，H＝在第3，10，14和 24天给药，每隔3小时一次，每天4次。 *4/8长期不受肿瘤影响的存活者 **2/8长期不受肿瘤影响的存活者 ***1/8长期不受肿瘤影响的存活者 肿瘤生长抑制(TGI)基于各组中7或8只小鼠，相对于未处理对照 的平均肿瘤体积。肿瘤在第12～19天测量(但结肠51在第24 天，结肠38在第31天测量)。在所有试验(有两个除外)中， 所有未处理对照小鼠(每组21或24只)都具有可测量肿瘤。对于 B16/F10，按方案F，21/24对照小鼠具有可测量肿瘤。 在对于结肠腺癌38的试验中，19/21对照小鼠具有可测量肿 瘤。
表8 P388白血病多重抗药亚系对化合物1S
缺乏交叉抗药性
剂量 P388 P388/阿霉素 P388/Mitoxantrone 化合物 (mg/kg，ip，ILS NCK ILS NCK ILS NCK
天1 and 5) (％) (log) (％) (log) (％) (log) 化合物 25 毒性的 毒性的 毒性的
15 228 6.5 176 6.0 107 5.7
9 211 6.5 90 2.2 79 3.6
5.4 128 3.5 33 0 57 2.1
3.2 67 1.0 14 0 29 0 阿霉素 9 233 6.5 14 0 7 0
5.4 156 4.6 19 0 4 0
3.2 172 5.3 24 0 0 0
1.9 167 5.1 24 0 0 0
1.2 117 3.0 19 0 0 0 丝裂霉素
7.5 178 5.5 52 0.5 104 5.5
4.5 156 4.6 62 1.0 136 6.5
2.7 128 3.5 52 0.5 54 1.8
1.6 106 2.6 48 0.3 29 0
1.0 83 1.7 29 0 14 0
寿命增加(ILS)基于各组中6只小鼠的平均存活时间。由于存 活时间是肿瘤细胞对数的线性函数，所以净肿瘤细胞杀死(NCK) 是按标准方法从平均存活时间计算。由于耐mitoxantrone亚 系具有比其它两种用于本试验的细胞系较长doubling时间所以有较小 的ILS，并具有比P388或耐阿霉素的细胞系大的NCK。
表9 化合物1S外消旋混合物对接种ip P388
白血病小鼠的活性 化合物 剂量 ILS
(mg/kg，ip， (％) 长期存活者
天：1&5) 1RS 29 165 1/6
14 135
7.2 80
3.6 30 将106细胞通过ip植入动物体内。寿命增加(ILS)基于各 组中的6只小鼠相对于未处理对照的平均存活时间。长期存活者是 指45天不受肿瘤影响。
表10 不同盐形式的化合物1S对接种iv L1210白血病
小鼠的活性比较
剂量 ILS
化合物 (mg/kg，ip， (％)
天：1&5) 1S 25 毒性的
乙酸盐 15 100
9 83
5.4 67
3.2 50 1S 盐酸盐 25 毒性的
15 175
9 125
5.4 92
3.2 50 1S 二盐酸盐 25 毒性的
15 133
9 83
5.4 50
3.2 50 1S 钠盐 90 毒性的
54 208
32 133
19 100
12 67
6.5 33 用106个细胞通过iv对动物接种。寿命增加(ILS)基于各 组6只小鼠相对于未处理的对照的平均存活时间。 药物组合物和治疗方法
本发明的药物组合物包含一种抑制肿瘤细胞生长有效量的式 (I)化合物和一种惰性的可药用载体或稀释剂。这些组合物制备 成适合于非肠道给药或口服给药的剂量单位形式。
式(I)化合物以常规剂型服用，这些剂型是按照常规方法将 治疗有效量(即肿瘤生长有效抑制量)的式(I)化合物(“活性 成分”)与标准药物载体或稀释剂混合制成的。为了得到所期望的合 适的制剂，制造程序可以包括混合、造粒和压片或溶解各种成分。
使用的药用载体可以是，例如，固体或者液体。固体载体的例子 有乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬 脂酸镁、硬脂酸及类似物。液体载体的例子有糖浆、花生油、橄榄 油、水以及类似物。相似地，载体或稀释剂可以包括技术上熟知的延 时物质，诸如单独的或与蜡一起使用的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘 油酯、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯以及类似 物。
可以使用很多种药物形式。这样，如果使用的是固体载体，可将 制剂压片、以粉末或小丸形式置于硬胶囊中或制成园形或菱形锭剂。 固体载体的用量可有很大变化，但最好约在25mg-1g之间。如 果使用的是液体载体，可将制剂做成糖浆、乳液、软胶囊、装在安瓿 或药瓶中的无菌注射液或悬浮液、或非水液体悬浮液。
为了得到稳定的水溶液剂型，可将式(I)化合物可药用的盐溶 于有机酸或无机酸的水溶液，例如0.3M琥珀酸或更好是柠檬酸溶 液。如果不能使用可溶性盐形式，可将式(I)化合物溶于合适的共 溶剂或其结合物中。这些合适的共溶剂的例子包括乙醇、丙二醇、聚 乙二醇300、聚山梨酸酯80、甘油以及类似物，其浓度为总体积 的0～60％。但是，合适的共溶剂并不仅限于此。
药物组合物也可以是将活性成分的盐溶于合适的含水载体诸如水 或等渗的盐或葡萄糖溶液。对于9位上无碱性侧链的那些式(I)化 合物诸如化合物2S和10S(结构见表2)，通过E环内酯碱性水 解可以形成一种可溶性碱金属羧酸盐。化合物1S的钠盐可作为例 子。
可以理解，用于本发明组合物的式(I)化合物的实际首选剂量 将随下述诸条件而变化：所用的特殊复合体、配制的特殊组合物、给 药方式以及治疗的特殊部位、宿主和疾病。对于给定的一系列条件 最佳剂量可以由技术人员按照上述试验数据用常规剂量测定方法来确 定。对于非肠道给药，一般所用剂量每天约为20-150mg/ m2体表面积给药1-5天，最好每隔4周进行重复，共4个疗程。 对于口服给药，一般所用剂量约为每天20-150mg/m2体表 面积，给药1-5天按适当的间隔重复数个疗程。
按照本发明，抑制对式(I)化合物敏感的动物肿瘤细胞生长的 方法，包括给患有所述肿瘤的宿主动物服用抑制肿瘤生长有效量的式 (I)化合物。如上所述，治疗期间，活性成分通过非肠道或口服每 天给药，所给剂量选为约20-150mg/m2体表面积，给药1 -5天，按适当的间隔重复数个疗程。
下述实例阐明(a)用于评价各种式(I)化合物对移植小鼠肿 瘤模型的活性的实验方案，(b)用于本发明的药物配方的式(I) 化合物的化学制备以及治疗方法，以及(c)本发明的供口服和非肠 道给药的药物配方。
无须进一步说明，相信本领域专业人员能够按上面所述，而充分 实施本发明。因此，下述实例仅仅是用于说明本发明，而绝不是对本 发明范围的限制。
实例 I.用于移植小鼠肿瘤模型的实验方案
用于评价式(I)化合物抗肿瘤活生的实验方案早已被确立，并 且被专业人员广泛应用在临床前肿瘤模型中进行药物活性的评价。这 些研究通常是依据国家癌症研究所建立的、并由Geran等人在 “Cancer Chemotherapy Reports，Part3，- Vol.3，1-103，1972.”上所述的实验方案而实施的。 A).腹膜内肿瘤模型：
在这些研究中所应用的肿瘤，是通过在同种小鼠中连续接种而传 代保持的，这些肿瘤包括有：P388白血病和其对阿霉素，及对 mitoxanrone耐药的亚系，L1210白血病，B16黑色素瘤、 B16黑色素瘤/F10亚系、M5076肉瘤和结肠癌26。对各 种白血病，这些肿瘤是在DBA/2小鼠传代保持的。M5076肉 瘤、B16黑色素瘤和它的F10亚系是在C57Bl/6小鼠中传 代保持的，而结肠癌26BALB/C小鼠中传代保持的。白血病和 M5076肉瘤可以腹水细胞悬浮剂连续地移植到腹膜内，而B16 黑色素瘤系和结肠癌26可以皮下实体肿瘤而连续移植。
在治疗试验中，肿瘤被无菌地从授体小鼠中移出，并制备成悬浮 液，通过腹膜内植入到受试动物中。用于结肠癌26的试验动物是雌 性BALB/c小鼠(20～25克)。用于其它肿瘤模型的试验动物 是同种的雌性F1杂种B6D2F1小鼠(C57Bl/6×DBA /2)。接种物用量随肿瘤类型而变化：P388白血病每只小鼠接 种106个细胞，L1210白血病每只小鼠接种105或106个 细胞，M5076肉瘤每只小鼠接种5×106个细胞。在B16黑 色素瘤系和结肠癌26的植入实验中，取自授体小鼠的皮下肿瘤被切 碎，并在特氟隆—玻璃匀浆器中磨均匀，得到一种肿瘤浆。接种物用 量是0.5毫升10％(重量：体积)的B16黑色素瘤系的匀浆和 0.5毫升5％(重量：体积)结肠癌26的匀浆。肿瘤接种后，小 鼠随机分组，每组有6～8只小鼠。在每次试验中，有3组未处理的 对照小鼠。将药物溶解或悬浮在适宜的水载体中，并在一定的剂量范 围内，通过各种给药途径和方案给药。动物装在鞋盒状的笼中，并每 天监视其死亡率，L1210监视30天，P388监视45天， B16、M5076和结肠26监视60天。活性的终点就是平均存 活时间，存活期相对于未给药的对照组有所延长如果存活期延长大于 和等于40％，则认为此药物在这些肿瘤模型中是有效的。 B.静脉肿瘤模型：
在本研究中使用的肿瘤，包括P388白血病，L1210白血 病和Lewis肺癌，都是通过在同种小鼠中连续接种传代而保持的， 对白血病使用的小鼠为DBA/2，对Lewis肺癌为C57Bl/ 6小鼠。白血病以腹水细胞悬浮液连续地移植到腹膜内，而Lewis 肺癌可以皮下实体瘤而连续移植。在治疗试验中，肿瘤被无菌地从授 体小鼠中移出，并制备成悬浮剂而植入试验动物中，对每种肿瘤试验 动物都是同种雌性F1杂种B6D2F1小鼠(C57Bl/6× DBA/2)。接种物用量随肿瘤类型而异：P388白血病每只小 鼠接种106个细胞，L1210白血病每只小鼠接种105或106个细胞，Lewis肿瘤接种0.25毫升10％(重量/体积)，Lewis 肺癌匀浆的制备如上述B16黑色素瘤。肿瘤接种后，小鼠随机地分 组，每组有6～8只小鼠。在每次试验中，有三组未处理的对照小 鼠。
药物溶解或悬浮在适宜的水赋形剂中，并在一种剂量范围内，以 各种活疗方案，腹膜内或静脉给药。动物装在鞋盒状笼中，并每天监 视死亡率，对L1210监视30天，P388监视45天，Lewis 肺癌监视60天。活性的终点就是平均存活时间和存活期相对于未处 理的对照组有所增长。如果可延长存活期大于和等于40％，则认为 此药物对这些肿瘤有活性。 C.皮下肿瘤模型：
在本研究中应用的肿瘤是通过在同种小鼠中连续接种传代而保持 的：C57Bl/6适用于Lewis肺癌、B16黑色素瘤及其F10 亚系、M5076肉瘤和结肠腺癌38；BALB/c适用于结肠癌 26、ADJ-PC6浆细胞瘤、Madison肺癌和结肠腺癌51； C3H用于乳腺癌16/C。除了M5076肉瘤是以腹水细胞悬浮 液，腹膜内移植以保持传代外，所有肿瘤都是以皮下实体肿瘤连续移 植的。
在治疗试验中，肿瘤被无菌地从授体小鼠中移出，制备成为用来 皮下植入试验动物的制品。对Lewis肺癌、B16黑色素瘤及其 F10亚系、M5076肉瘤和结肠腺癌38，试验动物是同种雌性 F1杂种B6D2F1小鼠(C57Bl/6×DBA/2)。ADJ- PC6浆细胞瘤和结肠癌26是用雌性BALB/c小鼠评价的。 Madison肺癌和结肠腺癌51是用同种的雌性F1杂种CD2F1小 鼠(BALB/c×DBA/2)来评价的。乳腺癌16/C是用雌性 C3H小鼠评价的。接种物随肿瘤而不同。结肠腺癌38是用套针以 2毫米碎片而植入。M5076肉瘤和ADJ-PC6浆细胞瘤是以 细胞悬浮物植入的，每只小鼠分别植入5×106和2×106个细 胞。结肠癌26、结肠腺癌51、Lewis肺癌、Madison肺癌和 B16黑色素瘤及其F10亚系是以按上述方法制备的肿瘤匀浆 0.5毫升植入的，匀浆浓度为10％(重量：体积)，而结肠癌 26匀浆浓度是5％(重量：体积)。肿瘤接种后，小鼠随机分组， 每组有7或8只小鼠。在每次试验中，有3组未处理的对照小鼠。
药物溶解或悬浮在适宜水赋形剂中，在某个剂量范围内以各种给 药途径和活疗方案给药。动物装在鞋盒状笼中，每天监视死亡率。当 未处理的对照动物长有大的可以测量的肿瘤(通常大于500毫米3) 时，所有动物的肿瘤是用游标尺测径器测量垂直直径，肿瘤体积按下 式计算：长度×(宽度)2×0.5。肿瘤测量的时间根据不同种肿 瘤的不同增长速度而决定。增长速度最快的肿瘤，例如Lewis和 Madison肺癌，B16黑色素瘤及其F10亚系，是在第12天和 16天之间测量的。生长较慢的肿瘤的测量时间比较晚些：M5076 肉瘤是17天，乳腺癌16/c是16或19天，ADJ-PC6浆 细胞瘤和结肠癌26是19天，结肠腺癌51是24天，结肠腺癌 38是31天。活性的各个终点相对于未处理对照组的肿瘤体积和肿 瘤生长抑制百分比的平均值，以及测量那天，有多少不可触知肿瘤的 动物数量。如果以最大或低于可耐受的剂量给药，产生大于和等于 70％肿瘤生长抑制作用，则认为此药物对这些肿瘤模型有活性。
对于具有高度转移性的肿瘤，包括Lewis和Madison肺癌， 结肠癌26和B16黑色素瘤及其F10亚系，带病小鼠也要监测存 活时间。对于低转移的肿瘤模型，测量肿瘤的大小，处死带瘤小鼠。 用这种方法，存活期延长大于和等于30％，药物的活性就被认为是 明显的。 II.式(I)化合物的合成
在下列合成实例中，温度是以摄氏温度(℃)表示。除非另有说 明，所有的起始原料可以从商业市场得到。
实例1 (20S)1，2，6，7-四氢喜树碱的制备
喜树碱(32.0克，0.092摩尔)与铂和乙酸(1.6升)混 合。此喜树碱是从Tainjain-SK&F公司(天津.中国)购 得。铂是由8.0克无定形二氧化铂在800毫升乙酸中，并在1个 大气压的氢气下预先还原1.5小时而制得。还原反应在1个大气压 的氢气下进行8.5小时，同时剧烈地搅拌混合物。在反应接近结束 时，理论量的氢气(略大于4.1升)被吸收，并且氢气的吸收明显 地减慢。此反应用氢气流脱气约10分钟，然后通过用乙酸(200 毫升)洗过的硅藻土垫过滤。
所得到的溶液直接用于实例2所述的反应中。 实例2 (20S)10-羟基喜树碱的制备
向实例1所制备的剧烈搅拌的1，2，6，7-四氢喜树碱溶液 中一次加入四乙酸铅(64克，0.144摩尔)。此反应物在氩气下 搅拌30分钟，所有的四乙酸铅溶解。浓缩得到一种胶质残余物，此 残余物用冰水(1升)研磨而得到淡褐色固体。将固体过滤出来，再 用冰水(200毫升)洗涤，用橡胶板压干并空气干燥过夜。根据高 效液相色谱法(HPLC)分析(Whatman Partisil 5 ODS3 RacII60％(H3OH/H2O)，所得到部分湿产物含 有44.3％10-羟基喜树碱，26.9％10-乙酰氧基喜树碱 和23.1％喜树碱。
此粗混合物与1.7升50％含水乙酸混合，并回流过夜。将反 应物冷却，浓缩至大约50～100毫升。加入冰水(1升)，然后 过滤出沉淀物，再用冰水(200毫升)洗涤，用橡胶板压干，高真 空下干燥2天，得到21.16克产物。根据HPLC分析，此产物含 有70.9％10-羟基喜树碱，1.2％10-乙酰氧基喜树碱和 21.3％喜树碱。 实例3
(20S)9-二甲基氨基甲基-10-羟基喜树碱乙酸盐的制 备
用实例2所述的10-羟基喜树碱(20克，经测定含有62％ 10-羟基喜树碱，因而含有12.4克，34.1毫摩尔10-羟 基喜树碱)与乙酸(620毫升)、37％的甲醛水溶液(12.4毫 升，大约149毫摩尔)和40％二甲胺水溶液(12.4毫升，大 约109毫摩尔)混合，并搅拌大约18小时，薄层色谱法(TLC) (硅胶，9∶1的二氯甲烷/甲醇)测定表明有一些残留的起始物。这 种体系适用于跟踪10-羟基喜树碱的消失，而不适用于产物形成的 监测。再加入37％甲醛水溶液(6毫升，大约72毫摩尔)和 40％二甲胺水溶液(6毫升，大约53毫摩尔)，并继续搅拌24 小时。将反应物浓缩至干，用0.5％乙酸水溶液(1升)研磨，过 滤，固体物再用0.5％乙酸水溶液(500毫升)洗涤。干的固体 物重6.3克，用HPLC(Whatman Partisil 10 ODS 350％CH3OH/H2O，保留时间9分钟)得到94％回收的 喜树碱。合并的含水滤液用乙酸乙酯(3×600毫升)和石油醚 (600毫升)提取，然后冻干。
粗残余物的色谱法是注入在溶剂A中的所得物(溶剂A是99％ 水、1％乙酸)(600毫升)，通过一个装有680克 Whatman Partisil 40 ODS3的50毫米×600毫 米的钢柱，以350毫升/分钟的速度进行34分钟线性梯度洗脱从 100％溶剂A洗脱至40％溶剂B(溶剂B是99％甲醇，1％乙 酸)。色谱法是在410nm监测并且以每一升作为一个馏分收集。 用分析型HPLC(Whatman Partisil 10 ODS 3 50％ CH3OH/H2O，保留时间9分钟)测定，将纯度大于或等于 99％的组分收集在一起、浓缩、再溶解在最小量的0.5％乙酸水 溶液中，冻干，得到10.58克(62％)标题产物。 IR(KBr)3400，2960，1740，1650， 1590cm-1.1H NMR (CDCl3/CD3OD)1.04(t，3，J＝7Hz，C18)， 1.96(q，2，J＝7Hz，C19)，2.01(s，3，CH3CO2) 2.50(s，6，(CH3)2NH)，4.20(s，2，ArCH2N)，5.28 (d，1，J＝19Hz，C17)，5.29(s，2，C5)，5.50(d，1，J＝19Hz，C17)， 7.42(d，J＝9Hz，C11)，7.67(s，1，C14)，8.05(d，J＝9Hz，C12)， 8.51(s，C7).计算C23H23N3O51 HOAc 1 H2O(mw＝515.5)：C，58.24；H，5.67；N，8.15.测定：C，58.55； H5.22；N，8.54.pb分析＜14.5ppm.
用HPLC(参见上述)测定大于90％纯度的另外标题产物浓缩 至干，干燥物与其它批次分离出的类似产物一起再次进行色谱分离。 实例4
(20S)9-吗啉代甲基-10-羟基喜树碱乙酸盐的制备
如实例2所述制备的10-羟基喜树碱(100毫克，0.27 毫摩尔)，37％甲醛水溶液(0.5毫升)，吗啉(0.1毫升) 和2∶1乙酸/乙醇(10毫升)混合，搅拌过夜。10-羟基喜树 碱发生了反应(TLC，硅胶，9∶1CH2Cl2/CH3OH)， 反应物浓缩至干，溶解在大约5毫升含有几滴乙酸的水中，不溶物过 滤出。将滤液冻干。冻干物进行色谱分离(15毫米×250毫米硅 胶中压液相色谱(MPLC)，用含有0～2％甲醇的二氯甲烷洗脱) 得到一残余物，此残余物溶解在稀乙酸水溶液中，冻干，得到53毫 克(38％)标题化合物。 IR(KBr)3400，3100，2960，2920，2840，1740，1650，1590 cm-1H NMR(CDCl3/CD3OD) 1.94(q，2，J＝7Hz，C19)，2.73(m，4，吗啉基 CH2N)，3.83(m，4，吗啉基-CH2O)4.19(s，2，ArCH2N)， 5.26(s，2，C5)，5.25(d，1，J＝16Hz，C17)，576(d1，J＝16Hz，C17)， 7.27(s，1，C14)，7.40(d，1，J＝8Hz，C11)，8.07(d1，J＝8Hz，C12)， 8.36(s，1，C7).计算C25H25N3O6CH3CO2H(mw＝525.6)：C，61.71；H，5.95；N，8.00.测定：C，61.30；H，5.44； N，8.35.
实例5 (20S)9-N-甲基哌嗪基甲基-10-羟基喜树碱乙酸盐的制 备
实例2所述制备的10-羟基喜树碱(100毫克，0.27毫 摩尔)，2∶1醋酸/乙醇(10毫升)，37％甲醛水溶液(0.5 毫升)和N-甲基哌嗪(0.1毫升)混合，搅拌20小时。10- 羟基喜树碱已反应(tlc：9∶1 CH2Cl2/CH3OH)， 反应物浓缩，溶解在水(50毫升)中，用乙酸乙酯(5×20毫 升)和石油醚(20毫升)洗涤将水相冻干。残余物再溶解在稀乙酸 水溶液中，在中压液相色谱进行分离(Whatman Partisil 40 ODS3 9毫米×250毫米柱)，用含有0.02％乙酸的0- 20％甲醇水溶液洗脱。所需产物合并，并浓缩，将残余物冻干，得 到67毫克(46％)标题化合物。IR (KBr)3400，2960，2910，1740，1650，1590cm-1.1H NMR (CDCl/CD OD) 1.89(q，2，J＝7Hz)，2.02(s，＞3，CH3CO2H)，2.37(s，3，NCH3)， 2.65(m，8，哌啶子基-CH2)，4.21(s，2，ArCH2)， 5.26(s，2，C5)，5.30(d，1，J＝16Hz，C17)，5.71(d，1，J＝16Hz，C17)， 7.45(d，1，J＝7Hz，C11)，8.05(d，1，J＝7Hz，C12)，8.47(s，1，C7). 计算C26H28N4O511/2HOAc1/4H2O(mw＝528.1)；C，61.41；H，6.01，N，10.61测定C，61.62；H，5.74， N，10.93.
实例6
(20S)9-(4′-哌啶基哌啶)甲基-10-羟基喜树碱乙酸 盐的制备
实例2所述制备的10-羟基喜树碱(100毫克，0.27毫 摩尔)，4-哌啶子基哌啶(100毫克，0.60毫摩尔)，37％ 甲醛水溶液(0.5毫升)和2∶1乙酸/乙醇(10毫升)混合搅 拌20小时。10-羟基喜树碱已反应(tlc，硅胶，9∶1 CH2Cl2/CH3OII)，反应物浓缩，溶解在1％乙酸水溶液 中，过滤，冻干。用MPLC(Whatman Partisil 40 ODS3，9毫米×250毫米柱)进行色谱分离，先用水(100毫 升)，然后用0～80％甲醇(溶在0.02％乙酸水溶液)洗脱，冻干后得 到44毫克(30％)标题化合物。IR(KBr)3400，2940，1745， 1660，1590cm-1.1H NMR(CDCl3/CD3OD) (t，3，J＝7Hz，C18)，1.3-3.3(m，19，哌啶C19)，4.11 (s，2，CH2N)，5.21(s，2，C5)，5.25(d，1，J＝16Hz，C17)，5.70 (d，1，J＝16Hz，C17)，7.85(d，1.J＝7Hz，C11)，7.59(s，1，C14)， 8.00(d，1，J＝7Hz，C12)，8.35(s，1，C7). 计算 C31H36.N4O511/2H2O(mw＝631.7)：C，58.94； H，6.22；N，8.81.测定C，59.02；H，6.44；N，8.53.
实例7
(20S)9-(2′-羟乙基氨基)甲基-10-羟基喜树 碱乙酸盐的制备
实例2所述制备的10-羟基喜树碱(200毫克，0.55毫 摩尔)，多聚甲醛(16毫克，0.55毫摩尔)，乙醇胺(61毫 克，1.1毫摩尔)和乙酸(6毫升)一起搅拌48小时，大部分 10-羟基喜树碱已发生反应。反应物浓缩，再溶解在稀释乙酸 (200毫升)中，用乙酸乙酯(4×30毫升)和石油醚(30毫 升)洗涤，将所得水溶液冻干。粗冻干物溶解在水(50毫升)中。 中压液相色谱MPLC(Whatman Partisil 40 ODS3， 15毫米×250毫米柱)分离，用水(100毫升)，再用0～ 10％甲醇(在0.02％乙酸水溶液中)洗脱，冻干后得到88毫克 (33％)的标题化合物。
IR(KBr)3400，2980，2940，1750，1570 cm-1.1H NMR(CDCl3/CD3OD) 7Hz，C18)，1.89(q，2，J＝7Hz，C19)，2.00(s，3，HOAc)， 3.03(m，2，CH2NH)，3.75(m，2，CH2OH)，4.49(s，ArCH2NH)， 5.24(s，2，C5)，5.30(d，1，J＝16，C17)，5.70(d，1，J＝16Hz，C17)， 7.41(d，1，J＝8Hz，C11)，7.61(s，1，C14)，8.00(d，1，J＝8Hz，C12)， 8.48(s，1，C7).计算C23H23N3O6HOAc17/8H2O(mw＝531.3)：C，56.52；H，5.83；N，7.91测定：C，56.07； H，5.40；N，8.27.
实例8
(20S)9-三甲基铵甲基-10-羟基喜树碱甲烷磺酸盐的 制备
按实例3制备的9-二甲基氨基甲基-10-羟基喜树碱乙酸盐 (65毫克，0.14毫摩尔)溶解在二氯甲烷(大约70毫升) 中，然后过滤。滤液与甲磺酸甲酯(1毫升)混合，冷却，在氩气流 中部分浓缩。4小时后，此溶剂浓缩至一半体积，并冷却。滤出沉淀 物，溶解在水(10毫升)中，先用乙酸乙酯(3×10毫升)，再 用石油醚(10毫升)洗涤，冻干，得到50毫克(60％)标题化 合物。IR (KBr)3400，2950，2900，1760，1660，1600cm-1.1H NMR (CDCl/CD OD) 2.01(q，2，J＝7Hz，C19)，2.78(s，＞3，CH3SO3)， 2.94(s，9，N(CH3)3)，4.72(s，2，ArCH2N)，5.20(s，2，C5)， 5.22(d，1，J＝16Hz，C17)，5.67(d，1，J＝16Hz，C17)， 7.62(d，J＝7Hz，C11)，7.71(s，C14)，8.16(d，1，J＝7Hz，C12)， 8.89(s，1，C7).计算 C24H25N3O5测定C，49.36；H，5.15；N，7.53.
实例9
(20S)9-甲酰基-10-羟基喜树碱的制备
按实例2制备的10-羟基喜树碱(100毫克， 0.27毫 摩尔)，六亚甲基四胺(0.80克，5.5毫摩尔)和三氟乙酸 (TFA)(15毫升)在氩气氛中回流20小时。反应物浓缩，与 水(15毫升)混合，并搅拌1小时。加入水(75毫升)，加入碳 酸氢钠调节pH至8.4。水相用乙酸乙酯(3×75毫升)洗涤， 用3N盐酸酸化至pH值为1.5，然后用乙酸乙酯15×75毫升) 提取。合并有机提取物，用1N盐酸(5×75毫升)、水(75毫 升)和饱和的盐水(25毫升)洗涤，再浓缩。残余物用闪式色谱法 纯化(1厘米×15厘米硅胶，与粗产物预先吸附在1厘米×1厘米 的硫酸钠填塞物)。产物用1％甲醇在二氯甲烷的溶液洗涤，得到50 毫克(47％)的标题化合物。通过在大约含25％甲醇的二氯甲烷 中慢慢冷却而分级沉淀并在氮气流中浓缩，而得到供分析的纯试样。 IR(KBr)3400，3100，2950，1755，
-1 1 (t，3，J＝7Hz，C18)，1.96(d，2，J＝7Hz C19)，5.32(d，1，J＝14Hz， C17)，5.33(s，2，C5)，5.68(d，1，J＝14Hz，C17)，7.50 (d，1，J＝9Hz，C11)，7.67(s，1，C14)，8.33(d，1，J＝9Hz，C12)， 9.34(s，1，C7)，10.85(s，1，CHO).计算 C21H16N2O61H2O(mw＝410.38)：C，61.46；H，4.42； N，6.83测定C，61.09；H，4.17；N，6.52.
实例10
(20S)9-环丙基氨基甲基-10-羟基喜树碱盐酸盐的制 备
将按实例2制备的10-羟基喜树碱(254毫克，0.7毫摩 尔)，37％甲醛水溶液(1.0毫升)，环丙胺(400毫克、 0.7毫摩尔)、冰醋酸(16毫升)和乙醇(8毫升)的混合物在室 温下搅拌过夜，然后真空下浓缩至干。残余物用水研磨，过滤，干燥 得到260毫克(75％产率)标题化合物醋酸盐，此化合物用 0.1N盐酸研磨可转化为标题化合物盐酸盐。 分析：(C24H23N3O5C，55.01；H，5.57；N，8.02.测定C，54.94；H，5.18，N， (m，1)，4.6(s，2)，4.8(s，2)，5.2(s，2)，7.2(s，1)， 7.5(q，2)，8.6(s，1).
实例11
(20S)9-乙氧基甲基-10-羟基喜树碱的制备
将按实例2制备的10-羟基喜树碱(364毫克，1.0毫摩 尔)，二甲胺盐酸盐(90毫克，1.1毫摩尔)和37％甲醛水溶 液(1.5毫升)的混合物在95％乙醇(25毫升)中回流5.5 小时。将反应物浓缩至很小体积，收集沉淀的产物并干燥。用硅胶色 谱法纯化，以含3％甲醇的二氯甲烷洗脱得到85毫克(20％产 率)的标题化合物。 分析： (C23H22N2O6) 计算：C，62.08；H，5.27；N，6.29.测定C，61.80；H， 5.22；N，6.12.FAB质谱：m/e 423(MH+).1H NMR(DMSO)0.85(t，3)，1.1(t，3)，1.9(m，2)，3.5 (s，2)，4.8(s，2)，5.2(s，2)，5.4(s，2)，7.2(s，1)， 7.7(m，2)，8.6(s，1).
实例12
(20S)9-(N-甲基苯胺甲基)-10-羟基喜树碱的制 备
将按实例2制备的10-羟基喜树碱(254毫克，0.7毫摩 尔)，37％甲醛水溶液(1.0毫升)和N-甲基苯胺(0.75 毫升，0.7毫摩尔)与冰醋酸(16毫升)和乙醇(8毫升)的混 合物，在室温下搅拌40小时。浓缩成油状物后，用硅胶色谱法，用 含1，2和3％甲醇的二氯甲烷洗脱，可得到部分纯化产物。此产物 组份中仍含有N-甲基苯胺。用硅胶MPLC柱进一步纯化，产物用含 2％甲醇的二氯甲烷洗脱。将产物各组份合并，并在真空下浓缩，得 到77毫克(24％)的黄色固体的标题化合物。
分析： (C28H25N3O55.47；N，8.32.Found：C，66.97；H，5.69；N，7.91.DCI-
质谱：m/e484(MH+).1H NMR(CDCL) 2)，5.5(q，2)，6.9(m，5)，7.5(s，1)，7.9(q，2)，8.4 (s，1). 实例13
(20S)9-环己基氨基甲基-10-羟基喜树碱盐酸盐的制 备
将按实例2制备的10-羟基喜树碱(364毫克，1.0毫摩 尔)，37％甲醛水溶液(1.5毫升)，环己胺(1.3毫升， 10毫摩尔)与冰醋酸(25毫升)和乙醇(12毫升)的混合物在 室温下搅拌过夜，并真空浓缩至干，残余物用反相柱(MPLC)纯 化，用含有0.02％冰醋酸的15％甲醇水溶液洗脱。浓缩至很小 体积并冻干，可得到成为乙酸盐的标题化合物(250毫克，47％)。 此乙酸盐加入0.1N盐酸可转化成标题化合物盐酸盐，此盐用过滤 法收集。
分析(C27H29N3O5H2O).计算：C，60.93；H，6.11，N，7.89.测定C， 1.0-2.0(m，10)，3.1(s，1)，4.5(s，2)，5.2(s，2)，5.4 (s，2)，7.2(s，1)，7.9(q，2)，8.9(s，1). 实例14
(20S)9-N，N-二甲基氨基乙基-氧甲基-10-羟基 喜树碱盐酸盐的制备
将依实例21制备的9-二甲基氨基甲基-10-羟基喜树碱游 离碱(100毫克，0.2毫摩尔)与含有3滴3N盐酸的2-二甲 基氨基乙醇(4毫升)混合物在氩气中在80℃加热24小时。半固 体状反应混合物用水(5毫升)和异丙醇(10毫升)处理，搅拌并 过滤，得到60毫克(59％)标题化合物。 分析(CHNOHCl58.77；H，5.72；N，8.25.测定：C，58.94，H，4.92；N， (s，6)，3.3(s，2)，4.1(s，2)，5.2(s，2)，5.4(s，2)，7.3 (s，1)，7.4(d，1)，8.0(d，1)，8.7(s，1).
实例15
(20S)9-N，N-二甲基氨基乙基-硫代甲基-10-羟 基喜树碱盐酸盐的制备
将基本上按实例18制备的9-二甲基氨基甲基-10-羟基喜 树碱盐酸盐(100毫克，0.2毫摩尔)和2-二甲基氨基乙硫醇 (13毫升)的混合物在氩气中于85℃加热5小时。不溶的固体物 (过量硫醇)过滤除去，滤液在真空中浓缩成为油状残余物，此残余 物用反相MPLC纯化。产物用含5％和10％的甲醇水溶液洗脱，得 到45毫克(41％)黄色固体标题化合物。 分析.(C25H28N3O5S49.34；H，5.79；N，6.90.测定：C，48.98；H，5.82；N，
1 (s，6)，4.4(s，2)，5.3(s，2)，7.1(d，1)，7.2(s，1)，7.6 (d，1)，8.2(s，1).
实例16
(20S)9-N，N-二甲基氨基乙基-氨基甲基-10-羟 基喜树碱二盐酸盐的制备
按实例2制备的10-羟基喜树碱(364毫克，1.0毫摩 尔)，N，N-二甲基 乙二胺(100毫克，1.1毫摩尔)， 37％甲醛水溶液(1.5毫升)与冰醋酸(25毫升)和乙醇 (10毫升)的混合物，在室温下搅拌64小时。溶剂在真空下除 去，固体残余物用水(10毫升)和含有3N盐酸(3ml)的异丙醇 (10毫升)处理，收集较细的沉淀固体，用异丙醇洗涤，干燥，得 到218毫克(40％产率)标题化合物。 (C25H28N4O5N，10.42.测定：C，55.91；H，5.72；N，9.86.1H NMR (CD OD) 5.1(m，4)，5.4(q，2)，7.3(d，1)，7.5(s，1)，7.8(d，1)，8.4 (s，1).
实例17
(20R，S)-9-二甲基氨基甲基-10-羟基喜树碱乙酸 盐的制备
此标题化合物按实例3所述制备，不同之处是起始物是根据 Wani等人(J.Med.Chem，23，554，(1980))的 方法制备的外消旋10-羟基喜树碱
实例18
(20S)9-二甲基氨基甲基-10-羟基喜树碱单盐酸盐的 制备
将按实例3所述制备、经分析为2.5当量乙酸和0.75当量 水的9-二甲基氨基甲基-10-羟基喜树碱乙酸盐(8.5克，以 分子量为585计算为14.5毫摩尔)溶解在0.1N盐酸(170 毫升，17毫摩尔)中，冻干，在高真空下抽吸3天，得到8.3克 标题化合物。 J＝7.5)，1.98(q，2，J＝7.5)，2.95(s，6)，4.77(s，2)， 5.33(s，2)，5.36(d，1，J＝16)，5.62(d，1，J＝16)， 7.59(d，1，J＝9)，7.66(s，1)，8.20(d，1，J＝9)，8.86 (s，1).分析.(CHNO1HCl计算：C，53.96；H，5.91；N，8.21；Cl，6.92.测定：C， 53.68；H，5.61；N，8.16；Cl，6.84.
实例19
(20S)9-二甲基氨基甲基-10-羟基喜树碱二盐酸盐的 制备
将按实例3制备的9-二甲基二甲基氨基甲基-10-羟基喜树 碱乙酸盐(0.389克，由HPLC分析为1.07毫摩尔)溶解在 0.4N盐酸(6毫升，2.4毫摩尔)中，冻干并在高真空下抽吸 40小时，得到0.269克的标题化合物。 1HNMR(CDCl/3CD O3D). (q，2J＝7.5)，3.01(s，6)，4.85(s，2)，5.31(d，1， J＝16)，5.36(s，2)，5.65(d，1，J＝16)，7.64(d，1， J＝9)，7.73(s，1)，8.23(d，1，J＝9)，9.07(s，1). 分析(CHNO50.37；H，5.70；N，7.66；Cl，12.93.测定：C，50.76；H， 5.64；N，7.57；Cl，12.61.
实例20
(20S)9-二甲基氨基乙基-10-羟基喜树碱钠盐的制备
将按实例3制备的9-二甲基氨基甲基-10-羟基喜树碱乙酸 盐(100毫克，0.2毫摩尔)用0.1N氢氧化钠(4.5毫 升，0.45毫摩尔)处理，将此溶液通过HP-20树脂柱(2× 22厘米)。此树脂用水(250毫升)洗涤。产物用1∶1的水和 甲醇混合物洗脱。将含有产物的组份合并，浓缩至较小体积，冻干， 得到98毫克(98％)的标题化合物。IR(液体石蜡)
-10.65(m， 1 3)，1.8(m，2)，2.8(s，6)，3.0(m，2)，4.21(s，2)，4.5 (s，2)，7.1(q，2)，7.2(s，1)，7.8(s，1).分析 (C23H24N3O6Na5.57；N，8.60.测定：C，56.21；H，5.65；N，8.44.
实例21
(20S)9-二甲基氨基甲基-10-羟基喜树碱游离碱的制 备
将按实例2制备的10-羟基喜树碱(728毫克，2.0毫摩 尔)与冰醋酸(50毫升)、乙醇(20毫升)、37％甲醛水溶液 (3毫升)和40％二甲胺水溶液(3毫升)的混合物在室温下搅拌 20小时。溶剂在减压下除去，残余物在50℃高真空下加热2小 时，用异丙醇(10毫升)研磨，从而沉淀出黄色固体标题化合物 (561毫克，64％)。FAB质谱m/e422(MH+). 1H NMR(CDCl3/CD3OD) (s，6)，4.3(s，2)，5.2(s，2)，5.4(q，2)，7.6(s，1)， 7.7(q，2)，8.5(s，1).
实例22
(20S)10-羟基喜树碱三氟甲磺酸酯(三氟化物)的制备
向按实例2制备的10-羟基喜树碱(1.44克，4.0毫摩 尔)在二甲基甲酰胺(40毫升)中的混合物中加入三乙胺(1.2 克，12毫摩尔)，然后加入N-苯基-三氟甲基磺酸酰亚胺 (2.0克，6毫摩尔)。反应物在50℃下加热3小时。真空下除 去溶剂，残余物用水研磨、过滤并干燥。按理论产率而获得的粗品，在 薄层层析(TLC)上基本上为一个斑点、表明有小量原有杂质。用 硅胶柱闪式色谱法纯化少量试样，用含2％甲醇的二氯甲烷洗脱产 物。 分析(C21H15N2O7SF3).计算：C，50.81；H，3.05； N，564.测定：C，51.38；H，3.42；N，4.99.1HNMR(CDCl3) 7.6-7.9(m，2)，8.2(d，2)，8.5(s，1)FAB 质谱m/e 497(MH+)，495(M-H)- 实例23
(20S)9-二甲基氨基甲基喜树碱的制备
(20S)9-二甲基氨基甲基-10-羟基喜树碱乙酸盐的三 氟甲基磺酸盐按如下方法制备：按实例3制备的9-二甲基氨基甲基 -10-羟基喜树碱乙酸盐(482毫克，1毫摩尔)在N，N-二 甲基甲酰胺(DMF)中的混合物在氩(40毫升)中，用2，6- 二甲基吡啶(268毫克，2.5毫摩尔)和N-苯基三氟甲基磺酰 亚胺(0.54克，1.5毫摩尔)处理。反应混合物室温下搅拌过 夜。然后，往上述制成的三氟化物中加入三乙胺(0.4毫升， 3.0毫摩尔)，乙酸钯(8毫克，0.04毫摩尔)，三苯基膦 (20毫克，0.08毫摩尔)和浓的甲酸(0.08毫升，2毫 摩尔)。反应在60℃加热8小时。真空下除去溶剂，残余物用少量 的水研磨，过滤。干的粗不溶固体物重550毫克。用硅胶柱闪式色 谱法纯化，洗脱除去带有三苯基磷酸盐的某些三氟化物，而得到25 毫克(7％)9-甲基喜树碱，88毫克(20％)标题化合物游离 碱(含4％甲醇的二氯甲烷)和一些10-羟基喜树碱的三氟甲基磺酸 盐(用含10％甲醇的二氯甲烷洗脱。用稀乙酸处理，一些标题化合 物可转化为乙酸盐。 分析(C25H27N3O6.2.5H2O).计算：C，58.81； H，6.12；N，8.23.测定：C，58.60；H，5.88；N，7.88； 1HNMR(CDCl3) (s，2)，5.2(s，2)，5.4(q，2)，7.3(d，1)，7.5(d，1)7.6 (2，1)，8.0(d，1)，3.3(s，1)
质谱m/e406(MH+) 实例24
10-氰基喜树碱的制备
将三丁基氰化锡(444毫克，1.4毫摩尔)和四(三苯磷) 钯(276毫克，0.6毫摩尔)在1，2-二氯乙烷(20毫升) 的溶液在氩气下加热回流2小时，形成钯-锡-氰化物络合物。然后 加入按实例22制备的10-羟基喜树碱的三氟甲基磺酸盐(266 毫克，0.6毫摩尔)，继续回流3.5小时。将反应物浓缩至其原 有体积的三分之一，用等体积的二乙醚研磨。收集沉淀出的黄色固体 并干燥得到82％粗品产率的标题化合物(183毫克)。用闪式色 谱法纯化后，用含2％甲醇的二氯甲烷洗脱，得到115毫克 (67％)标题化合物。 分析(C21H15N3O4.1/2H2O 计算：C，65.96； H，4.22；N，10.99. 测定：C，65.89；H，4.06；N，10.66.1HNMR (CDCl3-MeOD4) (q，2)，7.7(s，1)，7.7-8.4(m，3)，8.6(s，1).
质谱m/e374(MH+)
实例25
(20S)10-甲酰基喜树碱的制备
在用火焰烘干的烧瓶中，装入按实例22制备的10-羟基喜树 碱三氟甲基磺酸酯(100毫克，0.22毫摩尔)，新蒸馏出的四 氢呋喃(THF)(10毫升)和四(三苯磷)钯(10毫克，9毫 摩尔)。将一氧化碳气泡通入反应物中3分钟，然后反应混合物用一 个装有一氧化碳气球的塞子塞好，浸入50℃的油浴中。边搅拌并使 用一注射器泵，边在4小时内滴加入Bu3SnH(0.73毫升) 在无水四氢呋喃(3毫升)的溶液。然后，真空下除去溶剂，残余物 用闪式色谱法(1～2％甲醇，二氯甲烷)纯化，最后再用 Chromatotron(Harrison Research，Palo. Alto，California)纯化。用含2％甲醇的二氯甲烷洗脱出 标题化合物(20毫克，24％)。 分析：(C21′H16′N2O5′1-1/3H2O).计算： C，61.84；H，4.69；N，6.86. 测定：C，61.83；H，4.53；N，6.37. 1H NMR(CDCl3) s，2)，5.4(q，2)，7.7(d，1)，7.8-8.3(m，3)，8.5(s，1)， 9.9(s，1).质谱m/e377(MH+).
实例26
(20S)10-氨基甲基喜树碱乙酸盐的制备
将依实例24制备的10-氰基喜树碱(160毫克，0.4毫 摩尔)在冰醋酸(45毫升)中的溶液用活泼的兰尼镍处理，并在 10磅/英寸2(1785.8克/厘米2)的压力下氢化7小时。 催化剂通过特制过滤槽过滤除去，滤液真空下浓缩。固体残余物用反 相柱中压色谱法纯化，用含10％甲醇的水洗脱产物。冻干后，可得 到25毫克(15％)吸湿的标题化合物。 分析：(C23H23N3O6·6H2O).计算：C， 50.63；H，6.46；N，7.73. 测定：C，50.11；H，6.57；N，7.64. 1 5.2(s，2)，5.4(s，2)，7.5(s，1)，7.7-8.1(m，3)，8.6 (s，1).
实例27
(20S)10-氨基甲基喜树碱乙酸盐的制备
将依实例24制备的10-氰基喜树碱(160毫克，0.42 毫摩尔)的冰醋酸(45毫升)溶液用活泼的兰尼镍处理，并在10 磅/英寸2(1785.8克/厘米2)的压力下氢化7小时。催化 剂通过特制过滤器(95％SiO2)，真空下浓缩，用反相柱纯化。 产物用含10％甲醇的水(含有0.02％乙酸)洗脱。收集各组份 后，浓缩至较小体积并冻干，得到26毫克(14％)标题化合物。 分析：(CHNOH，6.46；N，7.73. 测定：C，50.11；H，6.57；N，7.64. 1 5.2(s，2)，5.5(s，2)，7.5(s，1)，8.0(m，3)，8.6(s，1).
实例28
(20S)9-吗啉代甲基喜树碱的制备
将1毫摩尔依实例23制备的10-羟基-9-吗啉代甲基喜树 碱的三氟甲基磺酸盐的无水二甲基甲酰胺(DMF)(25毫升)溶 液与三乙胺(0.4毫升)，二乙酸钯(8毫克，0.04毫摩尔) P3(20毫克，0.08毫摩尔)和99％甲酸(0.08毫升， 2毫摩尔)反应。此反应在氩气中于60℃加热6小时，真空下浓 缩，用水处理。所需的标题化合物和主要付产物，9-甲基喜树碱， 沉淀析出(300毫克)，过滤收集，用硅胶闪式色谱法纯化。9- 甲基喜树碱可通过含1％甲醇的二氯甲烷洗脱而分离析出(45毫 克，13％)。用含2％甲醇的二氯甲烷洗脱而得到标题化合物 (93毫克，20％)。 分析：(C25H25N3O565.78；H，5.74；N，9.20. 测定：C，65.87；H，5.96；N.9.00. 质谱m/e448(MH+) 1 (m，4)，3.7(m，4)，4.0(s，2)，5.3(3，2)，5.6(q，2)，7.5 (d，1)，7.6(s.1)，7.7(d，1).8.2(d，1)，9.0(s，1).
实例29
(20S)10-羟基-9-氰基甲基喜树碱的制备
将依实例8制备的9-三甲基铵甲基-10-羟基喜树碱甲磺酸 盐(0.42克，0.8毫摩尔)与95％乙醇(35毫升)和氰化 钠(1.26克，25毫摩尔)的混合物，在氩气氛中，回流3小 时。溶剂在真空下除去。加入水(20毫升)，用3N盐酸将pH值 调至1.5。收集沉淀的粗固体物，干燥。用闪式硅胶柱色谱法纯 化。产物用含4％和5％甲醇的二氯甲烷洗脱，得到110毫克 (33％)的标题化合物。 分析(CHNO测定：C，60.63；H，4.64；N，9.60. 1 0.9(t，3)，1.8(m，2)，4.2 (s，2)，5.2(s，2)，5.3(q，2)，7.5(d，1)，7.6(s，1)，7.9 (d，1)，8.4(s，1). 实例30
(20S)10-羟基-9-氨基甲基喜树碱乙酸盐的制备
将依实例29制备的60毫克(0.15毫摩尔)10-羟基- 9-氰基甲基喜树碱的冰醋酸(30毫升)溶液，用大约1克(湿 重)的活泼兰尼镍处理，在10磅/英寸2(1785.8克/厘 米2)的压力下氢化6小时。过滤除去催化剂，滤液在真空下浓缩成 为固体残余物。然后将浓缩的过滤物溶解在水中，用反相柱色谱法纯 化，用含10％甲醇的水(含有0.02％冰醋酸)洗脱产物。收集 所要的组份。浓缩至较小体积，冻干过夜，得23毫克(33％)的 标题化合物。 分析：CHNOH，6.90；N6.38. 测定：C，43.82；H，6.89；N，5.79. 1 5.0(3，2)，5.1(s，2)，5.4(s，2)，7.2(s，1)，7.5(q，2)，8.4(s，1)， III.药物组合物实例：
实例A
非经肠胃给药的组合物
为制备适用于注射给药的本发明的非经肠胃给药的药物组合物。 将100毫克式(I)化合物的水溶性盐与10毫升0.9％无菌盐 水混合，将此混合物分装成适用于注射给药的一个剂量单位。
实例B
口服药物组合物
为制备本发明的口服药物组合物，将100毫克式(I)化合物 与750毫克乳糖混合，将此混合物分装成一口服剂量单元中，例如 硬胶囊，以适用于口服给药。