联邦资助研究
本发明是根据国防高级研究计划署(Defense Advanced Research Projeats Agency)(DARPA)的批准号HR001-08-0011和医学对策研究试点中心(Center for Medical Countermeasures Research Pilot)的批准号5U19A 1067751在政府支持下作出的。因此，政府对本发明具有一定的权利。
技术领域
背景技术
人类暴露于辐射可造成严重伤害，甚至死亡。暴露可为意外的，例如由核电站的辐射泄漏引起。暴露也可为有意的，例如由恐怖活动引起。最常见的辐射暴露情况由医学干预引起，例如用于治疗癌症。这种情况下的辐射可为局部的或全身的。当局部施加时，辐射仍然可在辐射路径中对健康的组织造成不期望的损害。当全身施加(即，全身辐照)时，低剂量可导致骨髓损伤和胃肠道毒性。高剂量的全身辐照可导致永久性骨髓损伤、肠和肺毒性，且有时导致死亡。当前需要保护健康的组织以及缓和暴露于电离辐射的急性和慢性效应的有效治疗方案。
发明内容
本文中描述缓和个体(subieat，individual)中由暴露于辐射(意外的/无意的或有意的，例如治疗性的)、化学辐射疗法或疾病引起的组织损害的方法。所述方法包含向个体(称为有需要的个体)施予足以降低(部分或完全)暴露效应，由此缓和个体中由辐射暴露引起的组织损害的量的杀菌/渗透性增加蛋白(BPI)、一种(至少一种、一种或一种以上)BPI同源物或BPI和BPI同源物二者。在某些实施例中，辐射暴露是由意外暴露于辐射(例如在核电站故障事件中发生)或有意的暴露于辐射(例如治疗性辐射、化学辐射疗法或辐射疗法)引起。组织损害可为(例如)对造血组织(例如，骨髓)的损害或对胃肠(GI)道的损害。在特定实施例中，组织损害是造血毒性。所述方法中使用的BPI同源物包括(但不限于)rBPI21、rBPI23、rBPI50、rBPI(10-193)ala132和BPI的具有约20kD到约25kD的近似分子量的N端片段。
在某些实施例中，BPI和/或其同源物在个体暴露于辐射之前1天与个体暴露于辐射之后2天(48小时)之间施予。BPI和/或其同源物可经口、静脉内或皮下施予。
在一些实施例中，缓和个体中由暴露于辐射(意外的/无意的或有意的，例如治疗性的)、化学辐射疗法或疾病引起的组织损害的方法进一步包含向个体(有需要的个体)施予一种(至少一种、一种或一种以上)抗生素。抗生素可为(例如)喹诺酮抗生素，例如选自由下列组成的群组的抗生素：莫西沙星(moxifloxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、加雷沙星(garenoxacin)和德拉沙星(delafloxacin)。
在另一个方面中，所述方法是缓和个体中由暴露于辐射(意外的/无意的或有意的，例如治疗性的)、化学辐射疗法、疾病、毒素或药物或生物介导的疗法引起的造血毒性的方法。所述方法包含向个体(称为有需要的个体)施予足以缓和(部分或完全)个体的造血毒性的量的杀菌/渗透性增加蛋白(BPI)、一种(至少一种、一种或一种以上)BPI同源物或BPI和BPI同源物二者。所述方法中使用的BPI同源物包括(但不限于)rBPI21、rBPI23、rBPI50、rBPI(10-193)ala132和BPI的具有约20kD到约25kD的近似分子量的N端片段。
在某些实施例中，BPI和/或其同源物在个体暴露于辐射之前1天与个体暴露于辐射之后2天(48小时)之间施予。BPI和/或其同源物可经口、静脉内或皮下施予。
在一些实施例中，缓和个体中由暴露于辐射(意外的/无意的或有意的，例如治疗性的)、化学辐射疗法、疾病、毒素、或药物或生物介导的疗法引起的造血毒性的方法进一步包含向个体(有需要的个体)施予一种(至少一种、一种或一种以上)抗生素。抗生素可为(例如)喹诺酮抗生素，例如选自由下列组成的群组的抗生素：莫西沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、加雷沙星和德拉沙星。
另一实施例是用于个体中的骨髓恢复的方法，所述方法包含：向个体(称为有需要的个体)施予足以用于个体中的骨髓恢复的量的杀菌/渗透性增加蛋白(BPI)、一种(至少一种、一种或一种以上)BPI同源物或BPI和BPI同源物二者。所述方法中使用的BPI同源物包括(但不限于)rBPI21、rBPI23、rBPI50、rBPI(10-193)ala132和BPI的具有约20kD到约25kD的近似分子量的N端片段。
在某些实施例中，BPI和/或其同源物在个体暴露于辐射之前1天与个体暴露于辐射之后2天(48小时)之间施予。BPI和/或其同源物可经口、静脉内或皮下施予。
在某些实施例中，个体具有一种或一种以上造血细胞类型或谱系的缺陷。例如，个体可具有造血缺陷，例如淋巴细胞减少、髓细胞减少、白细胞减少、嗜中性粒细胞减少、红细胞减少、巨核细胞减少、血小板缺陷、单核细胞缺陷、淋巴细胞缺陷、红细胞缺陷、嗜中性粒细胞缺陷、T细胞缺陷、粒细胞缺陷和/或树突细胞缺陷。所述一种或一种以上造血细胞类型或谱系的缺陷可由暴露于辐射、化学辐射疗法、辐射疗法、疾病、毒素、或药物或生物介导的疗法引起。
在一些实施例中，由暴露于辐射(意外的/无意的或有意的，例如治疗性的)、化学辐射疗法、疾病、毒素、或药物或生物介导的疗法引起的个体中的骨髓恢复的方法进一步包含向个体(有需要的个体)施予一种(至少一种、一种或一种以上)抗生素。抗生素可为(例如)喹诺酮抗生素，例如选自由下列组成的群组的抗生素：莫西沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、加雷沙星和德拉沙星。
另一实施例是刺激个体中的血细胞生成的方法，所述方法包含：向个体(称为有需要的个体)施予足以刺激个体中的血细胞生成的量的杀菌/渗透性增加蛋白(BPI)、一种(至少一种、一种或一种以上)BPI同源物或BPI和BPI同源物二者。所述方法中使用的BPI同源物包括(但不限于)rBPI21、rBPI23、rBPI50、rBPI(10-193)ala132和BPI的具有约20kD到约25kD的近似分子量的N端片段。
在某些实施例中，个体具有一种或一种以上造血细胞类型或谱系的缺陷。造血缺陷可为(例如)淋巴细胞减少、髓细胞减少、白细胞减少、嗜中性粒细胞减少、红细胞减少、巨核细胞减少、血小板缺陷、单核细胞缺陷、淋巴细胞缺陷、红细胞缺陷、嗜中性粒细胞缺陷、T细胞缺陷、粒细胞缺陷和/或树突细胞缺陷。所述一种或一种以上造血细胞类型或谱系的缺陷由(例如)暴露于辐射、化学辐射疗法、辐射疗法、疾病、毒素或药物或生物介导的疗法引起。所述方法中使用的BPI同源物包括(但不限于)rBPI21、rBPI23、rBPI50、rBPI(10-193)ala132和BPI的具有约20kD到约25kD的近似分子量的N端片段。
在某些实施例中，BPI和/或其同源物在个体暴露于辐射之前l天与个体暴露于辐射之后2天(48小时)之间施予。BPI和/或其同源物可经口、静脉内或皮下施予。
在某些实施例中，刺激个体中的血细胞生成的方法进一步包含向个体(有需要的个体)施予一种(至少一种、一种或一种以上)抗生素。抗生素可为(例如)喹诺酮抗生素，例如选自由下列组成的群组的抗生素：莫西沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、加雷沙星和德拉沙星。
如本文中所描述，在某些实施例中，所述方法包含向有需要的个体施予(a)杀菌/渗透性增加蛋白(BPI)、一种(至少一种、一种或一种以上)BPI同源物或BPI和BPI同源物二者，和(b)一种(至少一种、一种或一种以上)抗生素。在这些实施例中，杀菌/渗透性增加蛋白(BPI)、BPI同源物或BPI和BPI同源物二者与抗生素可同时(一起)或顺序施予。在杀菌/渗透性增加蛋白(BPI)、BPI同源物或BPI和BPI同源物二者与抗生素同时施予的情况下，它们可在一种组合物中或在单独组合物中施予。在杀菌/渗透性增加蛋白(BPI)、BPI同源物或BPI和BPI同源物二者与抗生素顺序施予的情况下，它们可以任一次序施予且需要在足够接近的时间施予以具有所需的缓和效应。
个体是动物，通常为哺乳动物。在一个方面中，个体是狗、猫、马、绵羊、山羊、牛或啮齿类动物。在重要的实施例中，个体是人类。在上述实施例中的任一者中，个体在其它方面不需要用BPI和/或其同源物治疗。在一些所述实施例中，个体未患有传染性疾病。
参照具体实施方式将明白本发明的这些和其它方面以及各种优点和效用。如所了解，本发明的每一个方面可涵盖各个实施例。
附图说明
图1.在人类骨髓清除性HSCT之后观察到的嗜中性粒细胞(ANC)和血小板(PLT)的循环水平、mCD14和TLR4的单核细胞表面水平、内毒素、BPI和IL-6的血浆水平以及发热的发生率的改变。(A)发生严重的嗜中性粒细胞减少(n=46)及血小板减少(n=48，最低点在D7)。数据代表以原始单位标记的对数转换值的几何平均值+SEM。(B)通过内毒素活性分析(EAA)评估18名患者在基线(B；n=17)和骨髓清除之后D0(n=17)、D7(n=10)、D14(n=15)、D21(n=15)和D28(n=3)的血浆内毒素且以EAA单位报告。水平的虚线(在0.4个EA单位)指示检测下限(LLD)。通过ELISA评价在B(n=48)、D0(n=46)、D7(n=48)、D14(n=48)、D21(n=47)和D28(n=33)的血浆BPI浓度(pg/mL)。点线指示BPI ELISA的LLD(小于100pg/m1)。降到LLD水平之下的试样指定50％LLD的值。(C)通过流式细胞术测量单核细胞mCD14和TLR4表面表达表明，mCD14的最低点在D0(n=10)且同时在D0(n=9)出现峰值TLR4表达。数据代表平均荧光强度(mCD14)或结合指数(TLR4)的以原始单位标记的对数转换值的几何平均值+SEM。(D)血浆IL-6(n=37)和发热发生率(n=48)的峰值均在D7。IL-6数据代表以原始单位标记的对数转换值的几何平均值+SEM。
图2.BALB/c小鼠在7Gy下展现BM清除和死亡率。(A)6(n=10)、6.5(n=20)和7(n=20)Gy TBI之后的D30死亡率因剂量而不同(p<0.001，曼特尔-考克斯(Mantel-Cox)对数秩)。(B)TBI之后D3(n=5)的峰值结肠上皮细胞凋亡证明粘膜损伤快速发作，此与血浆瓜氨酸水平的最低点(n=7)一致，绘示正规化到TBI之前的水平(D0=100％)。数据代表平均值±SEM。与D0相比，通过1-试样t检验进行分析，*p<0.05；通过曼-惠特尼进行分析，**p<0.001。(C)代表性H&E染色的股骨切片展示在7Gy TBI之后D3BM清除(4×放大倍率)。(D)在0Gy(正常对照，n=3/时间点)、6.5Gy(n=8/时间点)和7Gy(在第3天和第10天，n=8，由于较高的死亡率，在D15，n=6)之后计数的BM MNC。数据是个别计数的平均值±SD。在7Gy对6.5Gy(D3p=0.05，D10p=0.0002，D15p=0.02)之后呈现较少的BM MNC。相同小鼠的BM中LK(E)和LSK细胞(F)的流式细胞术分析指示7Gy产生延长的祖细胞和HSC数量的降低。截止D15，6.5Gy小鼠比7Gy小鼠具有较大的LK和LSK细胞数量(对于LK和LSK二者，p=0.01)。各符号代表来自个别动物的一肢的BM内的绝对LK或LSK数量。水平条(horizontal bar)指示中值/组。通过曼-惠特尼分析血液学数据。
图3.rBPI21与ENR的组合增强7Gy TBI之后BALB/c小鼠的存活率。(A)用7Gy辐照且在辐照之后24小时给予ENR加rBPI21或VEH、单独ENR且持续30天、或未治疗(表示为7Gy)的小鼠的存活率。在三个重复实验的复合分析中，用BPI21/ENR治疗的小鼠的存活率超过其它组(通过曼特尔-考克斯对数秩，P<0.0001，n=70只小鼠/组)。rBPI21/ENR组的存活率也超过VEH/ENR、ENR和7Gy(通过成对曼特尔-考克斯对数秩，分别地，P<0.0001、0.008和<0.0001)。(B)用7Gy辐照且在辐照之后24小时给予rBPI21或VEH(持续14天或30天)加ENR(持续30天)或未治疗(表示为7Gy)的小鼠的存活率。持续rBPI21治疗不影响存活率。通过成对曼特尔-考克斯对数秩分析数据(n=20只小鼠/组)。
图4.rBPI21/ENR促进TBI诱发的发育不全后的造血恢复。在各种治疗之后第10、15和19天，评价BALB/c BM MNC计数(一个后肢)和组织病理学(来自对侧后肢)。显示的数据针对(A)未治疗的年龄匹配的对照(正常)或(B)经7Gy辐照的小鼠。其它小鼠接受7Gy TBI和在辐照之后24hr开始的以下治疗二者：(C)ENR，(D)VEH/ENR，或(E)rBPI21/ENR。左侧图：各图显示从8只个别小鼠/组的后腿冲洗的BM MNC的计数(平均值±SD)，(B)除外，其中单独给予7Gy的小鼠经历高死亡率(中值存活期为12到15天)，导致n=2到8/时间点。通过曼-惠特尼，与7Gy、ENR和VEH/ENR相比，在D10(分别地，p=0.0003、0.001和<0.0001)、D15(分别地，p=0.0007，p=0.001和p=0.001)和D19(分别地，p=0.0006，p<0.0001和p<0.0001)，rBPI21/ENR组合达成改善的BM细胞结构。从两个重复研究集合数据。在两个研究中获得类似的结果。右侧图：接受所指示治疗的动物的股骨的代表性D19H&E染色切片展示BM MNC计数与BM组织学密切相关。
图5.rBPI21/ENR治疗使得截止辐照之后D30BM细胞结构恢复到正常水平。在存活到D30的小鼠中评价BM组织病理学(一个后肢)和MNC计数(对侧后肢)。显示代表性股骨组织学：(A)未治疗的年龄匹配的对照(正常)，或(B)经7Gy辐照的小鼠。其它小鼠接受7Gy TBI和在辐照之后24hr开始的以下治疗二者：(C)ENR，(D)VEH/ENR，或(E)rBPI21/ENR。除组织学以外，测定从个别小鼠的后腿冲洗的BM MNC的对应计数(F)。各条显示平均值±SD，分别地，n=4、3、12、16和7只小鼠/组。单独7Gy和VEH/ENR治疗的小鼠的早期高死亡率限制这些队列的大小。仅rBPI21/ENR治疗达成与0Gy在统计学上不能区别的BM MNC计数。rBPI21/ENR MNC计数也不同于7Gy、ENR和VEH/ENR的计数(分别地，p=.01，p=0.0002，p=0.001)。显示来自两个重复研究的数据。在所有研究中获得类似的结果。通过曼-惠特尼分析数据。
图6.rBPI21/ENR治疗使得在7Gy TBI之后早期造血细胞更快速地扩增。使用流式细胞术来定量年龄匹配的未治疗对照(0 Gy)或施予7Gy且在其后24小时开始未治疗(7Gy)、ENR、rBPI21/ENR或VEH/ENR治疗的小鼠的BM MNC内含有的LK(左侧图)和LSK(右侧图)细胞。显示来自D10(顶部图)、D19(中间图)和D30(底部图)的结果。盒须图(Box and whisker graph)绘示来自各治疗组中各动物的一个后肢的BM内的LK或LSK表型细胞的间距(range)、第25百分位数和第75百分位数以及中值数。对于0Gy对照，在所有时间点，N=4。在D10，N=8只小鼠/治疗。在D19，N=6到8只小鼠/治疗。到D30的较大存活率差异导致n=3(7Gy)、12(ENR)、16(rBPI21/ENR)和7(VEH/ENR)只小鼠/组。与7Gy、ENR或VEH/ENR相比，rBPI21/ENR治疗使得在早期时间点LK和LSK细胞的数量较大(对于所有比较，在D10，p=0.004，且在D19，分别地，p=0.004、0.0003和0.0001)。所有组(包括对照)的D30LK和LSK含量相等。显示来自两个重复实验的数据。在所有研究中获得类似的结果。通过曼-惠特尼分析数据。
图7.对BALB/c小鼠的7Gy辐照与随后的内毒素血症有关。在所指示的天数获得血液试样以通过LAL进行内毒素分析，且显示为平均值±SEM。从D3起存在内毒素。在第0、3、12天，N=9只小鼠/时间点，在D6，n=6，且在D9，n=8。单独7Gy处理的死亡率使得在D12之后不能评估足够的小鼠进行分析。
图8.由BID注射rBPI21或VEH引起注射部位损害和发炎。在这些辐射缓和研究期间，一些经7Gy辐照的BALB/c小鼠仅接受口服ENR。其它经7Gy辐照的小鼠接受ENR并且使用具有固定28.5G针的无菌一次性胰岛素针每天注射两次250μl rBPI21或其调配物缓冲液(表示为VEH)。注射在辐射之后24小时开始并继续到直到第30天。在第15天(B)或第19天(A、C)，人道地杀死小鼠并暴露背侧皮肤的下侧，以获得局部组织损害的照片文件。用尼康(Nikon)D90数码相机摄取图像。
图9.用rBPI21/ENR治疗的小鼠的细胞BM中的三谱系血细胞生成。用7GY辐照BALB/c小鼠并在其后24小时开始rBPI21/ENR。在辐照之后第19天使小鼠无痛致死。图3中显示用rBPI21/ENR治疗的小鼠的股骨的H&E染色的冠状切片的低功耗图像。这些图像在(A)20×和(B)40×显示较高功耗图像。BM展示没有发育异常的三谱系血细胞生成、相对的髓细胞增生和稳健的巨核细胞恢复。
图10.用于通过FACS测定BALB/c小鼠的BM中的LK和LSK细胞的门控策略。在BM细胞的FSC对SSC点图上画一个门以排除小的碎片。在FL-4通道(APC阳性)中相对于SSC测定定向谱系细胞，且所画的门将这些细胞与谱系标记表达呈阴性(阴性-低APC荧光)的细胞分开。通过使用也结合到APC的匹配的同种型对照混合证实门控。在Sca-1PE x c-kit-PerCP5.5双重荧光点图上显现谱系阴性细胞，以评价小鼠BM中Lin-Sca-1-c-kit+(LK-祖细胞)和Lin-Sca-1+c-kit+(LSK-干细胞)的含量。所显示的直方图来自对正常小鼠的分析。
图11.在经历同种异体HSCT的患者中输注rBPI21的有限试点临床试验支持在骨髓清除疗法之后的耐受性。在骨髓清除性HSCT的背景下，6名招募到IRB批准的多机构I-II期rBPI21施予试点试验的第一队列中的患者中的4名患者接受基于辐射的治疗。所有患者均患有血液恶性肿瘤，年龄为50到65岁(中值为55岁)，并签署同意书。个体接受环磷酰胺和1360(n=3)或1400(n=1)分割TBI以进行骨髓清除性调节。(A)所有患者在第-1天接受4mg/kg浓注IV rBPI21，随后连续IV输注6mg/kg/天，持续72小时。根据所显示的设计逐步升高连续输注的剂量和持续时间，但当药物的研究批号(study lot)过期时，由资助者(XOMA(US)LLC)停止试验。(B)显示在HSCT进入期间经历的重大不利事件。
图12.14天和30天的rBPI21加ENR对骨髓单核细胞、LSK和LK细胞的效应是相当的。用7Gy辐照BALB/c小鼠并在其后24小时开始治疗。一些小鼠每天接受两次皮下rBPI21与ENR的组合直到D15，此时将剩余小鼠平分，在一个组(称为rBPI21(14)/ENR)中停止rBPI21，但继续ENR直到D30，且在另一组(rBPI21(30)/ENR)中继续rBPI21和ENR二者直到D30。如先前所述治疗VEH/ENR组。rBPI21(14)/ENR和rBPI21(30)/ENR在所有时间点都具有相当水平的骨髓单核细胞(图A、D)、LK(图B、E)和LSK(图C、F)。按照方法实施定量。条形图+SD绘示骨髓单核细胞，且盒须图绘示来自各治疗组中各动物的一个后肢的骨髓内的LK或LSK表型细胞的间距、第25百分位数和第75百分位数以及中值数。对于rBPI21(14)/ENR和rBPI21(30)/ENR组，D15：n=4/组，D18：n=5到6/组，且D30：8到10/组。由于早期死亡率，在D18，n=1(7Gy)和n=2(VEH/ENR)，且在D30，在这些组中没有存活者。从2只正常动物获得的值绘示为0 Gy值。显示从单一研究获得的数据。
图13.在14天或30天的rBPI21加ENR治疗之后外周血计数相当。与用rBPI21治疗30天(rBPI21(30)/ENR-灰色圆圈)相比，在用rBPI21治疗14天(rBPI21(14)/ENR-红色圆圈)的BALB/c小鼠的外周血中测量到相当水平的白血球(WBC)、嗜中性粒细胞、单核细胞、血小板和血红蛋白。治疗在7Gy辐照之后24小时开始。如方法中所述获得外周血计数。所有小鼠每天接受两次皮下rBPI21与ENR的组合直到D15，此时对4只小鼠抽血以用于外周血细胞分析。将剩余小鼠平分，在一个组(称为rBPI21(14)/ENR)中停止rBPI21，但继续ENR直到D30，且在另一组(rBPI21(30)/ENR)中继续rBPI21和ENR二者直到D30。结果显示在D18：n=5到6/组和D30：8到10/组测量的外周血计数值的平均值+标准偏差。从2只正常动物获得的值绘示为DO值。显示从单一研究获得的数据。
图14.(A到F)在辐照和未受辐照的小鼠中粒细胞刺激因子(G-CSF)的水平因应rBPI21治疗而增加。
图15.(A到C)在未受辐照的小鼠中鼠类角质形成细胞化学引诱物(鼠类KC)的水平因应rBPI21治疗而增加。先前辐照加强rBPI21治疗对鼠类KC的刺激。
图16.单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)(也称为趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2))的水平因rBPI21治疗而增加。
具体实施方式
在一个方面中，本发明涉及令人惊奇的发现：杀菌/渗透性增加蛋白(BPI)和/或其同源物单独或与抗生素组合可缓和由暴露于辐射、化学疗法或疾病引起的组织损害。如本文中所描述，BPI和/或其同源物单独或与抗生素组合可用于在暴露于意外的或偶然的辐射的个体中和/或在具有严重骨髓清除(涉及骨髓细胞的耗尽/衰竭)的个体中缓和造血毒性，刺激血液功能和帮助骨髓恢复。
如本文所用的需要BPI和/或其同源物疗法的个体是骨髓功能降低(部分或完全)的个体。在一些实施例中，个体在一种或一种以上血细胞类型或血液谱系方面具有不足的血细胞生成。在一些实施例中，个体暴露于辐射、化学辐射疗法或毒素，或患有疾病、或药物或生物介导的造血损害，导致个体中的骨髓功能降低(部分或完全)。造成骨髓功能降低(部分或完全)的疾病的实例包括(但不限于)急性和慢性发炎、感染、再生障碍性贫血、范科尼贫血(Fanconi anemia)、布卢姆综合征(Bloom syndrome)、网状细胞发育不全、科斯特曼综合征(Kostmann syndrome)、先天性良性嗜中性粒细胞减少、新生儿败血症、骨髓增生异常综合征、戴-布二氏贫血(Diamond-Blackfan anemia)以及先天性或获得性骨髓衰竭综合征。个体在其它方面不需要用BPI和/或其同源物治疗。在一些所述实施例中，个体未患有传染性疾病。
在一些实施例中，个体暴露于足以造成不期望的组织损害和/或造血毒性的水平的辐射。在一些实施例中，个体在BPI和/或其同源物疗法之前已经暴露于足以造成组织损害和/或造血毒性的辐射。在一些实施例中，个体尚未暴露于辐射，且预期以后会暴露于辐射，在足以造成组织损害和/或造血毒性的暴露辐射之前接受BPI和/或其同源物的治疗。在一些实施例中，个体在BPI和/或其同源物疗法期间暴露于辐射。辐射暴露包括(但不限于)意外的暴露、由核攻击引起的暴露和医学辐射疗法(例如局部疗法以及低和高剂量全身辐照)。在一些实施例中，个体患有癌症，且已经经历、正在经历或将经历辐射疗法、化学辐射疗法和/或化学疗法。
根据本发明的一些方面，提供缓和任一类型的辐射诱发的组织损害的方法。暴露于辐射在低剂量下具有毒性且在高剂量下威胁生命。最易受辐射诱发的损伤攻击的组织包括造血系统和胃肠道(GI)。中等剂量的辐射可造成血细胞计数快速降低，包括循环淋巴细胞的损失和有丝分裂活性造血祖细胞的减少。血细胞计数的降低尤其与感染的风险增加和癌症发生有关。较高剂量的辐射可导致由骨髓干细胞群体损失引起的更严重且通常更持久的骨髓损伤。因此，组织损害可为(例如)血细胞计数的降低、骨髓干细胞群体的损失或造血毒性。
根据本发明的一些方面，提供缓和造血毒性的方法。所述方法包含单独或与抗生素组合施予BPI和/或其同源物。术语‘造血毒性’是指大体上由不利地影响个体的造血系统的辐射暴露引起的毒性。或者，造血毒性可由个体暴露于毒素或疾病或造血损害遗传素质引起。此不利效应可在个体中广泛地表现，即由辐射暴露、化学疗法、毒素或疾病引起的许多造血细胞类型的水平改变(不同于认为正常的水平)，或所述不利效应可在个体中更具体地表现，即由暴露于辐射、化学疗法、毒素或疾病引起的仅一种或数种造血细胞类型不同于认为正常的水平。
施予BPI和/或其同源物以及抗生素以缓和组织损害，例如造血毒性。如本文所用，术语“缓和”是指疾病、化学疗法、毒素或辐射诱发的组织损伤的程度的降低(损伤的程度低于不存在BPI/同源物治疗下会发生的损伤程度)。因此，疾病、化学疗法、毒素或辐射诱发的组织损伤的程度的降低可在所治疗个体中的组织的健康改善方面进行评估。所治疗个体的组织的健康的改善可通过检查所治疗个体的组织的健康对对照个体(接受相同量的辐射暴露但不接受BPI疗法的个体)的组织的健康来测定。组织的健康可通过所属领域的技术人员已知的任一种方法来测量，包括直接和间接测量。直接测量是例如测量细胞计数的那些测量。在一些实施例中，测量的组织损害可为组织的坏死和/或血细胞计数的降低。在一些实施例中，组织健康的改善可通过使用诸如下述终点评估造血系统的功能来测量：血细胞比容、白血球计数、氚化胸腺嘧啶到骨髓DNA中的纳入、脾重量、来自脾或从肱骨或股骨获得的骨髓的爆式红系(erythroid)形成单位数或集落形成单位数(红系、粒细胞、巨噬细胞和巨核细胞形成谱系)或外周循环中循环造血干细胞或其它原始造血细胞的计数。
根据本发明的一些方面，提供骨髓恢复的方法。所述方法包含单独或与抗生素组合地施予BPI和/或其同源物。“骨髓恢复”意指已经被辐射、化学疗法、疾病或毒素损伤的骨髓恢复到其正常或接近正常状态(功能)或获得骨髓功能的可测量的改善的过程。骨髓功能是从造血(血液)干细胞产生各种血细胞类型或谱系的过程。可用于测量骨髓恢复的终点包括(但不限于)血细胞比容、白血球计数、氚化胸腺嘧啶到骨髓DNA中的纳入、脾重量、来自脾或从肱骨或股骨获得的骨髓的爆式红系形成单位数或集落形成单位数(红系、粒细胞、巨噬细胞和巨核细胞形成谱系)或外周循环中循环造血干细胞或其它原始造血细胞的计数。在一些实施例中，个体暴露于辐射或毒素，或患有疾病，或药物或生物介导的造血损害，导致个体中的骨髓功能降低(部分或完全)。造成骨髓功能降低(部分或完全)的疾病的实例包括(但不限于)急性和慢性发炎、感染、再生障碍性贫血、范科尼贫血、布卢姆综合征、网状细胞发育不全、科斯特曼综合征、先天性良性嗜中性粒细胞减少、新生儿败血症、骨髓增生异常综合征、戴-布二氏贫血以及先天性或获得性骨髓衰竭综合征。
根据本发明的一些方面，提供刺激血细胞生成的方法。所述方法包含单独或与抗生素组合施予BPI和/或其同源物。“刺激血细胞生成”通常是指一种或一种以上造血细胞类型或谱系的增加，且尤其涉及在个体具有一种或一种以上造血细胞类型或谱系的缺陷的情况下一种或一种以上造血细胞类型或谱系的刺激或增强。所述一种或一种以上造血细胞类型或谱系的缺陷可由暴露于辐射或毒素、疾病、药物或生物介导的造血损害引起。造成一种或一种以上造血细胞类型或谱系的缺陷的疾病的实例包括(但不限于)急性和慢性发炎、感染、再生障碍性贫血、范科尼贫血、布卢姆综合征、网状细胞发育不全、科斯特曼综合征、先天性良性嗜中性粒细胞减少、新生儿败血症、骨髓增生异常综合征、戴-布二氏贫血以及先天性或获得性骨髓衰竭综合征。造血缺陷可包含淋巴细胞减少、白细胞减少、嗜中性粒细胞减少、红细胞减少、巨核细胞减少、血小板缺陷、单核细胞缺陷、淋巴细胞缺陷、红细胞缺陷、嗜中性粒细胞缺陷、T细胞(或特定来说B细胞)缺陷、粒细胞缺陷和/或树突细胞缺陷。
可用于本发明方法中的化合物是BPI、其生物活性片段、类似物、变体和/或其同源物。BPI是最初在人类多形核嗜中性粒细胞的嗜天青颗粒中发现的50kDa到55kDa的阳离子抗微生物蛋白，其对多种与细菌有关且无细胞的内毒素形式具有最高亲和力(pM-nM)。结合内毒素的BPI促进杀死和清除革兰氏阴性细菌且通过阻止内毒素结合到由mCD14、MD-2和TLR4构成的细胞促炎内毒素受体复合物而抑制内毒素诱发的发炎和细胞凋亡。大多数BPI在细胞内，但BPI的血浆水平随嗜中性粒细胞的激活和脱粒而升高。稳定的BPI同源物包括(但不限于)rBPI21、rBPI23、rBPI50、rBPI(10-193)ala132和BPI的具有大约介于20kD到25kD之间的分子量的N端片段。BPI和其同源物的制备已经在业内出版物中描述，例如美国专利第6268345号、美国专利第6599880号、美国专利第5420019号、美国专利5980897和美国公开案第2008/0031874号。
BPI和/或其同源物可与抗生素(至少一种、一种或一种以上抗生素)组合给予。在一些实施例中，抗生素是喹诺酮。在一些实施例中，喹诺酮是具有附接到中心环系统的氟原子(通常在6位或7位)的氟喹诺酮。与BPI和/或其同源物组合施予的喹诺酮抗生素的实例包括(但不限于)莫西沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、加雷沙星和德拉沙星。
BPI和/或其同源物以及抗生素可同时或顺序施予。当BPI和/或其同源物以及抗生素同时施予时，它们可在相同或单独的调配物中施予，且大体上同时施予。抗生素以及BPI和/或其同源物也可顺序施予；二者仅需要在足够接近的时间施予以具有所需的对骨髓功能的效应。在某些实施例中，抗生素在BPI和/或其同源物之前或在施予BPI和/或其同源物之后施予。施予这些化合物之间的时间间隔可为几分钟、5小时、12小时、24小时、48小时或96小时，或它可较长。
本发明化合物是以有效量施予。有效量是足以提供医学上所需的结果的剂量且可由所属领域的技术人员使用常规方法来测定。在辐射诱发的组织损伤的治疗中，有效量将为抑制(部分或完全)由暴露于辐射造成的组织损伤所需要的量。在一些实施例中，有效量是达成所治疗病况的改善的量。在一些实施例中，有效量可取决于辐射暴露的类型和程度，和/或一种或一种以上其它治疗剂的使用。然而，所属领域的技术人员可基于(例如)活体外和/或活体内测试和/或关于化合物剂量的其它知识测定BPI/同源物以及抗生素的合适使用剂量和范围。应了解，在一些实施例中，本文中描述的BPI和/或其同源物以及抗生素可以抑制非癌性组织和细胞的辐射造成的损害而不实质上干扰癌性组织和细胞的杀死的剂量施予。
当施予个体时，BPI/同源物以及抗生素的有效量将取决于(例如)损害的严重程度；个别患者的参数，包括年龄、身体状况、体格和重量、并行的治疗、治疗的频率和施予方式。这些因素已为所属领域的技术人员所熟知且可在只进行常规实验下解决。在一些实施例中，使用最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。
有效量通常将在约0.001mg/kg到约1000mg/kg、约0.01mg/kg到约750mg/kg、约0.1mg/kg到约500mg/kg、约1.0mg/kg到约250mg/kg、约10.0mg/kg到约150mg/kg的范围内变化，以一次或一次以上剂量施予一天或若干天或许多天(取决于施予方式和上文所讨论的因素)。
BPI/同源物以及抗生素的实际剂量水平可变化，以获得对于特定的患者、组合物和施予方式有效达成所需治疗反应的量。所选剂量水平取决于特定化合物的活性、施予途径、辐射暴露的严重程度和所治疗患者的先前医学史。然而，此项技术涵盖以低于达成所需治疗效果所需的水平的化合物剂量开始治疗且逐渐增加剂量直到达成所需效果。
BPI和/或其同源物以及抗生素可在确诊个体骨髓功能降低(部分或完全)之后的任何时间施予。在一些实施例中，BPI和/或其同源物以及抗生素是在确诊个体与预期的正常水平相比具有降低的血细胞计数之后的任何时间施予。在一些实施例中，BPI和/或其同源物以及抗生素是在个体暴露于造成组织损伤的辐射水平之前、期间或之后施予。在一些实施例中，BPI和/或其同源物以及抗生素是在辐射暴露之前施予，但施予和辐射暴露在时间上足够接近以抑制辐射诱发的组织损伤。在一些实施例中，BPI和/或其同源物以及抗生素是在辐射暴露之前至多1天的任何时间施予。在一些实施例中，BPI和/或其同源物以及抗生素是在辐射暴露之前介于1小时与24小时之间施予。在一些实施例中，BPI和/或其同源物以及抗生素是在辐射暴露的12小时以内施予。BPI和/或其同源物以及抗生素也可在辐射暴露期间施予。在一些实施例中，BPI和/或其同源物以及抗生素是在辐射暴露之后施予，但施予和辐射暴露在时间上足够接近以具有所需的保护组织免于辐射诱发的组织损害的效应。在一些实施例中，BPI和/或其同源物以及抗生素是在暴露之后至多3天的任何时间施予。在一些实施例中，BPI和/或其同源物以及抗生素是在辐射暴露之后介于1小时到60小时之间施予。在一些实施例中，BPI和/或其同源物以及抗生素是在辐射暴露的24小时或48小时以内施予。在一些实施例中，个体患有癌症，且BPI和/或其同源物以及抗生素是在辐射疗法、化学辐射疗法或化学疗法之后至少l小时、至少12小时、至少24小时或至少48小时但不超过辐射疗法、化学辐射疗法或化学疗法之后72小时施予。
通过任一适宜途径将BPI和/或其同源物以及抗生素和含有BPI和/或其同源物以及抗生素的医药组合物施予个体。例如，组合物可以下列方式施予：经口，包括舌下、经直肠、非经肠、脑池内、阴道内、腹膜内、局部和经皮(作为粉末、软膏或滴剂)、经颊或经鼻。如本文所用的术语“非经肠”施予是指除通过胃肠道以外的施予方式，包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、乳房内、眼内、眼球后、肺内、鞘内、皮下以及关节内注射和输注。也涵盖外科植入，包括(例如)将本发明组合物包埋于体内，例如脑内。在一些实施例中，组合物可全身施予。
本发明的用于非经肠注射的医药组合物包含医药上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及在即将使用之前重构成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的水性和非水性载剂、稀释剂、溶剂或媒剂的实例包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、和其适宜混合物、植物油(例如，橄榄油)以及可注射有机酯(例如油酸乙酯)。适当流动性可通过(例如)使用包衣材料(例如，卵磷脂)、通过维持所需粒径(在分散液的情况下)和通过使用表面活性剂来维持。
这些组合物还可含有防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。微生物作用的防止可通过纳入各种抗细菌和抗真菌剂来确保，例如，对羟基苯甲酸、氯丁醇、苯酚山梨酸等。也可期望包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。可通过纳入延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)达成可注射医药形式的长效吸收。
在一些情况下，为延长药物的效应，期望减缓来自皮下或肌内注射的药物的吸收。此结果可通过使用弱水溶性的非晶形材料的液体悬浮液来达成。非经肠施予的药物的延迟吸收还可通过将药物溶解或悬浮于油性媒剂中来达成。另外，通过在生物可降解聚合物(例如，聚交酯-聚乙醇酸交酯)中形成药物的微囊基质来制备可注射储积形式。根据药物对聚合物的比率和所用特定聚合物的性质可控制药物释放速率。其它生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。可注射储积调配物还可通过将药物包裹于与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。
本发明提供经口施予本发明医药组合物的方法。口服固体剂型概括描述于雷明顿医药科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第18版，1990年(马克出版公司(Mack Publishing Co.)伊斯顿(Easton)宾夕法尼亚州(Pa.)18042)的第89章中。用于口服施予的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉末、含锭或糖锭、扁囊剂、小药丸和颗粒。而且，可使用脂质体或类蛋白质囊封来调配本发明组合物(例如，作为美国专利第4,925,673号中报道的类蛋白质微球体)。脂质体囊封可包括经各种聚合物衍生化的脂质体(例如，美国专利第5,013,556号)。
在所述固体剂型中，活性化合物与至少一种医药上可接受的惰性赋形剂或载剂混合，或者经化学改质以包括至少一种医药上可接受的惰性赋形剂或载剂。赋形剂或载剂可容许增加的化合物摄取、化合物的总体稳定性和/或化合物在体内的循环时间。赋形剂和载剂包括(例如)柠檬酸钠或磷酸二钙和/或(a)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、纤维素、改质葡聚糖、甘露糖醇和硅酸，以及无机盐，例如三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠，和市售稀释剂，例如、、STA-RX、易考瑞思和艾维素，(b)结合剂，例如，甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、胶质(例如，海藻酸盐、阿拉伯胶)、明胶、聚乙烯吡咯烷酮和蔗糖，(c)保湿剂，例如甘油，(d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐、碳酸钠、淀粉，包括基于淀粉的商业崩解剂、易科考特、羧甲淀粉钠、安柏莱特、羧甲基纤维素钠、超支化支链淀粉(ultramylopectin)、明胶、橙皮、羧甲基纤维素、天然海绵、膨润土、不溶性阳离子型交换树脂和粉末状胶质，例如琼脂、卡拉牙胶(karaya)或黄蓍胶；(e)溶液阻滞剂，例如石蜡，(f)吸收促进剂，例如季铵化合物和脂肪酸，包括油酸、亚油酸和亚麻酸，(g)润湿剂，例如，鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯，阴离子型洗涤剂表面活性剂，包括十二烷基硫酸钠、丁二酸二辛基磺酸钠和二辛基磺酸钠，阳离子型洗涤剂，例如苯扎氯铵或苄索氯铵，非离子型洗涤剂，包括聚桂醇400、聚氧乙烯(40)单硬脂酸酯(polyoxyl 40 stearate)、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、甘油单硬脂酸酯、聚山梨酯40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素；(h)吸收剂，例如高岭土和膨润土粘土，(i)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油、蜡、卡波蜡4000、6000、十二烷基硫酸镁和其混合物；(i)改善药物在调配期间的流动性质且帮助在压缩期间重排的助流剂，包括淀粉、滑石粉、热解硅胶和水合硅铝酸盐。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。
片剂、糖衣片、胶囊、丸剂和颗粒的固体剂型可制备有包衣和外壳，例如肠溶包衣和其它医药调配领域中熟知的包衣。用于口服施予的液体剂型包括医药上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性化合物以外，液体剂型可含有业内常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄基酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(具体来说，棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇、山梨醇酐脂肪酸酯和其混合物。
本文还涵盖本发明化合物的肺部递送。将化合物在吸气时递送到哺乳动物的肺。各种设计用于治疗产品的肺部递送的机械装置考虑用于实践本发明，包括(但不限于)喷雾器、定量式吸入器和粉末吸入器，所有这些与所属领域的技术人员熟悉的那些类似。所有所述装置需要使用适于分配本发明化合物的调配物。通常，各调配物对于所采用的装置类型具有特异性，且可包括使用除可用于疗法中的稀释剂、佐剂和/或载剂以外的合适推进剂材料。
利用以下实例进一步对本发明进行说明，所述实例决不应视为进一步限制。通篇本申请案中所引用的所有参考文献(包括著作文献、授权的专利、公开的专利申请案和同在申请中的专利申请案)的全部内容都明确地以引用的方式并入本文中。
实例
材料和方法
患者特征
前瞻性地招募从2005年到2009年在波士顿儿童医院(Children’s Hospital Boston)(CHB)或布莱根妇女医院(Brigham and Women’s Hospital)(BWH)经历骨髓清除性同种异体HSCT的患者(n=48)进行经机构审查委员会(Institutional Review Board)批准的研究。所有参与者和/或法定监护人都视需要表明同意和/或赞成。年龄在1岁到60岁的范围内。血液恶性肿瘤(n=46)的骨髓清除方案是用TBI的化学辐射疗法，1400 cGy(n=38)或1375 cGy(n=1)，或组合化学疗法，包括白消安(busulfan)>14mg/kg口服或IV等效(n=7)。再生障碍性贫血的骨髓清除是200mg/kg(6gm/M2)环磷酰胺(cyclophosphamide)加ATG(n=2)。16名患者接受BM且32名患者接受PB干细胞。按照机构常规进行支持性护理。(48、49)。施予预防性口服非吸收性抗生素：杆菌肽(bacitracin)以及多粘菌素(polymyxin)(BWH)或万古霉素(vancomycin)(CHB)。按照常规在临床实验室实施血液计数和培养。16名患者患有革兰氏阳性(n=15)或革兰氏阴性(n=1)生物体菌血症。使用获得试样±1天以内的最大值记录体温。当可进行内毒素活性分析(EAA)时，增加EAA测量。
血液采集和血浆制备
在调节之前(基线，B)、HSCT当天(D0)和每周±1天，将PB试样抽到K2-EDTA或肝素钠真空采血管(Vacutainers)TM(碧迪医疗(Becton-Dickinson)(BD)，富兰克林湖(Franklin Lakes)，新泽西州(NJ))中。将PB在1200g和4℃下旋转5min，回收，并以分液储存在-80℃下的无热原管中。
人类BPI ELISA
通过ELISA(赫卡特(HyCult)，乌登(Uden)，荷兰(The Netherlands))按照制造商说明书测量BPI。
人类PB中的内毒素测量
通过EAA按照制造商说明书(光谱诊断公司(Spectral Diagnostics)，多伦多(Toronto)，加拿大(Canada))测量内毒素。(27)
人类IL-6ELISA
通过流式细胞术(MoFlo，达可斯通(DakoCytomation)，格洛斯楚普(Glostrup)，丹麦(Denmark))使用涂覆抗体的荧光珠粒(细胞计数珠粒分析碧迪公司灵活套件(Cytometric Bead Array BD Flex Sets)，碧迪生物科技(BD BioSciences)，圣何塞市(San Jose)，加利福尼亚州(CA))和萨米特(Summit)v4.0软件(达可斯通)来测量IL-6。
mCD14和TLR4的测量
如先前所述使用抗原特异性或同种型对照单克隆抗体(生物科技(eBioSciences)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州)测量CD14和TLR4的单核细胞表面表达。(50)
用rBPI21和恩氟沙星(enrofloxacin)的活体内辐射缓和研究
在12周龄在辐照之前使雄性BALB/c小鼠(库存编号为028，查理斯河(Charles River)，威尔明顿(Wilmington)，马萨诸塞州(MA))适应环境。根据达纳法伯癌症研究所(Dana-Farber Cancer Institute)的经ACUC批准的政策和方案实施研究。将小鼠置于Rad DiskTM啮齿类动物微隔离辐照笼(布雷茵特里科技(Braintree Scientific)，布雷茵特里(Braintree)，马萨诸塞州)中，并通过40Exactor(贝斯特思科(Best Theratronics)，渥太华(Ottawa)，安大略省(Ontario))铯源辐照仪施予单次7Gy剂量。此后24小时，小鼠不予治疗(7Gy)，或接受以下治疗中的一种或一种以上，持续30天：1)rBPI21(XOMA(US)LLC，伯克利(Berkeley)，加利福尼亚州)，每次注射250μ1，其为以2mg/ml在调配物缓冲液中构成的原液并且每天经SC施予两次，相隔6到8小时(rBPI21/小鼠为约42mg/kg/天)；2)250μl rBPI21调配物缓冲液(表示为VEH)，其由0.33g/L柠檬酸、1.01g/L柠檬酸钠、8.76g/L氯化钠、2.0g/L泊洛沙姆(Poloxamer)P188和2.0g/L聚山梨酯80(所有都来自西格玛(Sigma)，圣路易斯(St.Louis)，密苏里州(MO))溶解于注射用水中组成，pH调节至5.0，并过滤灭菌；3)贝惠(恩氟沙星，MedVets，桑迪城(Sandy)，犹他州(UT))，经由25G喂食针(铿腾科技(Cadence Science)，克兰斯敦(Cranston)，美国罗得岛(RI))通过口服管饲法在10mg/kg/天下保持前5到7天，此后小鼠随意地继续接受存于水瓶中的抗生素，直到研究终止或死亡。所有小鼠每天至少观察两次。经由CO2窒息使垂死的小鼠无痛致死。在预定的时间点，经由异氟醚麻醉服药过量人道地杀死小鼠(-雅培实验室(Abbott Labs)，雅培公园(Abbott Park)，伊利诺州(IL))。
血液和组织制备
在Hemavet950FS血液分析仪(德鲁科技(Dfew Scientific)，沃特伯里市(Waterbury)，康涅狄格州(CT))上用经EDTA抗凝的心脏血液(碧迪医疗，富兰克林湖，新泽西州)实施CBC。通过将血液与无热原肝素(APP医药(APP Pharmaceutical)，绍姆堡(Schaumburg)，伊利诺斯州(IL))在无热原埃彭道夫管(Eppendorf tube)(USA科技(USA Scientific))中混合并在14,000rpm下离心10分钟来获得血浆。将单次使用的分液储存在-80℃下。在一些研究中，解剖来自一条腿/动物的股骨和胫骨，在10％中性缓冲福尔马林(formalin)(飞世尔科技(Fisher Scientific)，匹兹堡(Pittsburg)，宾夕法尼亚州(PA))中固定24小时，并处理，包括冠状切片以及苏木精和伊红(H＆E)染色(专门组织病理学服务-朗伍德(Specialized Histopathology Services-Longwood)，波士顿(Boston)，马萨诸塞州)。取对侧股骨和胫骨，以通过用补充有10％FBS(JRH生物科技(JRH Biosciences)，列涅萨(Lenexa)，堪萨斯市(KS))、L-谷氨酰胺、HEPES、青霉素/链霉素(pen/strep)和庆大霉素(gentamicin)(所有都来自英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州)的冷RPMI 1640培养基从骨冲洗细胞进行BM MNC计数和流式细胞术。用低渗溶解缓冲液(西格玛)溶解红血球。通过锥虫蓝染色计数BM MNC；生存力通常大于90％到95％。
瓜氨酸的测定
用玛斯塔克(MassTrak)氨基酸分析(AAA)系统(沃特世(Waters)，米尔福德(Milford)，美国马萨诸塞州)利用AccQTag(tm)衍生化和紫外/可见检测分析试样。
组织病理学评估
经委员会认证的(board-certified)血液病理学家(JK)使用奥林巴斯(Olympus)BX51显微镜和具有DP捕获软件的奥林巴斯DP71相机评价脱钙的、福尔马林固定的、H&E染色石蜡固定的切片的股骨BM细胞结构。对于各动物，针对由造血细胞占据的BM空间的百分比对两个载玻片进行评分，其中每个载玻片两个视野。经委员会认证的病理学家(J-AV)计数经H&E染色石蜡固定的结肠切片的三份相同试样中的细胞凋亡小体/400×视野。识别来自正常小鼠的试样，但所有其它试样经去识别化且以随机顺序呈现以用于分析。
鼠类血浆中的内毒素测量
使用鲎阿米巴细胞溶解产物(Limulus amoebocyte lysate)(LAL)分析按照制造商说明书(查理斯河，波士顿，马萨诸塞州)且如先前所述来测量内毒素。(51)
BM FACS分析
将BM细胞与2％大鼠抗小鼠CD16/CD32和1％正常大鼠血清一起预培育以进行Fc阻断，随后用结合APC的谱系特异性抗体或等效浓度的结合APC的同种型对照免疫球蛋白、PE-大鼠抗小鼠Sca1(克隆体D7)和PerCP-Cy5.5-大鼠抗小鼠c-Kit(克隆体2B8)的1：20稀释物的混合物(所有都来自碧迪)染色具有造血谱系标记(CD3e、CD45/B220、CD11b、Ly-6G/Ly-6C、TER119)的细胞。将细胞在4℃下染色25分钟，用冷DPBS洗涤2次，并再悬浮于0.4％多聚甲醛中。在FACScaliburTM流式细胞仪(碧迪)上获取100,000个事件并用FlowJo v.7.0.5(树星(Treestar))软件进行分析。针对BM中lin-Sca-1-c-kit+(LK)和lin-Sca-1+c-kit+(LSK)的百分比评价谱系标记表达呈阴性的细胞(图10，门控策略)。来自正常小鼠的数据与已公开的天然BALB/c小鼠中的报告一致。(52)
统计学
对于人类HSCT研究，给具有不可检测到的分析物的试样指定为检测下限一半的值。对于ANC、PLT、BPI、TLR4和IL-6，在对数转换之后分析数据，因为此获得更接近正态的分布。对于这些数据，随后将几何平均值和误差棒(指示对数值的平均值的+1标准误差(SEM))转换回原始单位并绘示于对数轴上。当比较相同患者在不同时间点的值时，使用配对威尔科克森符号秩检验(Wilcoxon signed rank test)，其中将各值与基线进行比较。使用曼-惠特尼检验评估发热或不发热个体之间的比较。当评价不同参数之间的相关性时，使用斯皮尔曼(Spearman)相关系数和来自多个时间点的数据计算个体内相关性。在不同个体范围内取所计算系数的平均值并用符号秩检验来检验显著性。除非另外说明，否则所有p值均为双侧的。使用Prism v.4.0a(格拉芙帕德软件(GraphPad Software)；圣地亚哥，加利福尼亚州)和SAS v.9.1(赛仕软件研究所(SAS Institute)，卡雷(Cary)，北卡罗来纳州(NC))产生统计学显著性和图形输出。用格拉芙帕德Prism Version5实施鼠类实验的统计学分析。使用曼特尔-考克斯对数秩比较存活曲线。除瓜氨酸数据(通过1-试样t检验分析数据，与100％理论平均值进行比较)和血液学分析(表1)(实施非成对t检验)以外，自始至终实施双尾t检验(曼-惠特尼)。非成对t检验未假设均等方差。在所有实验中，使用小于0.05的P值来拒绝零假设。在指示于图中的情况下，*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。
表1.TBI之后各治疗组的外周血计数.
阴影区域指示中值落到年龄匹配的0Gy对照的正常范围中的值。▲相对于0Gy统计学显著；●相对于7Gy统计学显著；■相对于VEH/ENR统计学显著；相对于ENR统计学显著。所有均p<0.05。
结果
人类骨髓清除性HSCT与早期嗜中性粒细胞减少、内毒素血症、BPI缺陷和宿主对内毒素的反应迹象有关
检查经历针对HSCT的骨髓清除性调节的患者中的内毒素和BPI血浆水平。48名患者中有39名患者接受化学辐射疗法，包括1375(n=1)或1400(n=38)cGy TBI，而9名患者仅接受清除性组合化学疗法。如所预期，骨髓清除疗法紧接同种异体HSC输注导致PB计数下降和恢复(图1A)。截止骨髓清除性调节完成时(D0)，可容易地检测到内毒素血症(图1B)。同时，血浆BPI浓度快速下降(D7中值降低到1/71，四分位数间距降低到1/9-193；图1B)，从而与绝对嗜中性粒细胞计数(ANC；斯皮尔曼r=0.66；p<0.001)联系起来。在ANC最低点(D7)，48名患者中有37名患者(77％)不能检测到血浆BPI(<100pg/mL)，且通过内毒素活性分析(27)评估，80％的患者患有内毒素血症。
外周血(PB)单核细胞上的TLR内毒素受体的TLR4和mCD14组份分别展现增加和降低的表面表达，此与早期PB单核细胞暴露于生物活性内毒素一致(28、29)(图1C)。在BPI最低点(D7，图1D)，后续IL-6升高和发热(内毒素连接TLR4的充分描述的下游后遗症)最严重。IL-6浓度的患者内改变与EAA正相关(斯皮尔曼0.48，p=.01)，且较高的IL-6水平浓度与BPI水平负相关(斯皮尔曼-.30，p<.0001)。发热和BPI水平在D7未显示相关，或许因为接近80％的患者具有不能检测到的BPI。然而，在D14，发热的患者比不发热的患者具有较低的BPI水平(中值：不能检测到对3475pg/mL，p=.01)。特别地，在D0在即将进行HSC输注之前较低的血浆BPI浓度与较长的到嗜中性粒细胞植入的时间(p=.03，斯皮尔曼r=-.32)和较长的到血小板恢复的时间的趋势(斯皮尔曼r=-.26，p=.08)有关。
这些发现表明，BPI缺陷加上内毒素血症可在骨髓清除之后导致内毒素相关毒性，并使BPI补充可削弱这些毒性的可能性升高。尽管施予HSC使得能够在骨髓清除之后存活，但HSC支持在无意的辐射暴露之后将不可行。因为不存在HSC下的辐射缓和不能在人类中以实验方式解决，所以采用鼠类模型来检查所述假设。
7Gy单次TBI在BALB/c小鼠中的毒性的表征
为模拟潜在致命的辐射暴露，界定与BALB/c小鼠中的BM发育不全、GI毒性和早期高死亡率有关的单次TBI剂量。单次7Gy与12周龄BALB/c截止30天95％到100％的死亡率(LD95/30)有关(图2A)。在相继进行的各缓和实验中再现性地观察到7Gy暴露的致命性：仅5/90的经7Gy辐照的小鼠(5.5％)存活到D30，且各单独实验中的中值存活期在12天到15天的范围内。在7Gy TBI之后，通过组织病理学评价的小肠上皮细胞凋亡在D3最严重，且血浆瓜氨酸水平平行降低，其与功能GI肠上皮细胞质量(enterocyte mass)成正比(30)。(图2B)。截止D6到D9，两个GI粘膜发现得以改善。截止D3，内毒素血症仍可检测到且持续直到在即将死亡之前剧烈增高(图7)。截止D3，BM是发育不全的(图2C)，其中BM单核细胞(MNC)含量并行下降接近两个对数级，包括造血干细胞(LSK、Lin-Sca-1+c-Kit+)和祖细胞(LK、Lin-Sca-1-c-Kit+)的减少(图2D、E、F)。
人类HSCT期间经历的粘膜损害、发炎和毒性的程度与骨髓清除的强度相关(引)。为确保模型充分地骨髓清除，比较7Gy和6.5Gy对血细胞生成的效应。尽管在D3，与TBI剂量无关，组织学发育不全是相同的，但与在7Gy之后3、10和15天相比，小鼠在6.5Gy之后3、10和15天具有显著较多的BM MNC、LK和LSK(图2D、E、F)。截止D15，未在7Gy队列中观察到显著恢复。在暴露于7Gy之后实施后续缓和实验。
施予rBPI21和恩氟沙星(ENR)明显降低与TBI相关的死亡率
在7Gy的LD95/30TBI剂量之后24小时开始且持续到D30的rBPI21与口服ENR(与环丙沙星类似的氟喹诺酮抗生素)的组合(rBPI21/ENR)对小鼠的D30存活率产生统计学显著改善(图3)。在两个重复实验的复合分析(集合n=50只小鼠/组)中，rBPI21/ENR组的存活率超过VEH/ENR(VEH表示rBPI21的调配物缓冲液)以及单独ENR或7Gy组(通过成对曼特尔-考克斯对数秩，分别地，<.0001、0.03和<.0001)。在两周后，36只处在风险中的rBPI21/ENR治疗小鼠中仅发生两例死亡，而在其它组中伤亡在38％到79％的处在风险中的动物的区间内。单独rBPI21(1/30存活者)或其VEH(1/30存活者)不改善7Gy之后的D30存活率。因此，rBPI21单一疗法不作为LD95/30TBI剂量下的缓和策略实行。
当通过IV浓注或皮下(SC)注射施予时，rBPI21在小鼠中具有3小时的半衰期。因为最佳的连续或q6hr IV或SC注射方案不可行，所以选择使用每天两次SC施予，在TBI之后24小时开始所有治疗且持续到D30。如图3中所图解说明，rBPI21/ENR方案的对照(VEH/ENR)与相比单独口服ENR较差的30天存活率有关(通过成对曼特尔-考克斯对数秩，对于两个相同的实验，p=0.0002，组合n=50/组)，表明SC施予中伴有的重复处理和局部皮肤创伤与显著毒性有关。与用单独ENR治疗的受辐照小鼠相比，在重复注射rBPI21或VEH的受辐照小鼠中容易地观察到局部皮肤损害(图8)。
探究一个缩短的时间表，在14天之后停止注射(在图3B中表示为rBPI21(14)和VEH(14))。鉴于口服抗生素治疗在大量伤亡背景下可更容易地运用，ENR时间表不予改变。rBPI21(14)/ENR提供与较长的时间表相同的存活优势(图3B)。六只接受rBPI21(14)/ENR的受辐照小鼠在D30之后接受随访，且在D131，六只小鼠中有五只小鼠仍然活着且看起来健康。
rBPI21/ENR施予缓和TBI之后的造血毒性
为表征对血细胞生成的效应，计数从冲洗的BM腔恢复的BM MNC(图4)。在D10，与治疗无关，所有的受辐照组与未受辐照的年龄匹配对照相比展现较少的BM MNC(p<.0001)。然而，与接受单独7Gy或用ENR或VEH/ENR治疗的小鼠相比(分别地，p=.0003、.001和<.0001)，用rBPI21/ENR治疗的小鼠中的BM MNC含量显著较高。在D15和D19重复此相同的模式，因为用rBPI21/ENR治疗的小鼠与其它组相比始终具有统计学上显著较高的BM MNC含量(图4)。仅rBPI21/ENR治疗和与单独7Gy之后观察到的相比始终较高的BM MNC含量有关。
BM MNC的此快速增加反映在D19时通过组织病理学评价的BM的细胞结构上(图4)。用rBPI21/ENR治疗的受辐照小鼠展示良好恢复的BM细胞结构，在80％到90％的范围内，而单独7Gy、用ENR和VEH/ENR治疗的小鼠估计分别在20％、小于5％和10％到50％。在所有具有足够细胞结构的小鼠中观察到三谱系血细胞生成，且小鼠子组(最尤其接受rBPI21/ENR的那些)具有髓细胞优势和增加的巨核细胞生成(图9)。截止D30，所有存活的小鼠均展示改善的细胞结构，如先前在鼠类TBI存活者中所描述(32)。然而，用rBPI21/ENR治疗的小鼠展示更稳健的细胞结构，与ENR或VEH/ENR相比具有显著较多的BM MNC(图5)。在D30，还在7Gy存活者的更有限池中观察到恢复中的细胞结构。
尽管在各时间点LSK和LK的数量仍然低于年龄匹配的未受辐照对照，但施予rBPI21/ENR与TBI之后前几周LSK和LK BM细胞的数量增加有关(图6)。在D10和D19，rBPI21/ENR小鼠的每一后肢的LSK和LK的绝对数量显著高于单独7Gy、用ENR或VEH/ENR治疗的小鼠。没有其它治疗和与未治疗的受辐照组的差异有关。在D30，在各治疗组之间或在治疗与正常对照之间存活小鼠间无差异。
BM的变化与外周血计数的变化相关。7Gy对PB计数的效应可在实质上每一个测量的血液学参数方面观察到(表1)。rBPI21/ENR治疗和截止D19与单独7Gy、用ENR或VEH/ENR治疗相比白血球(WBC)、嗜中性粒细胞、单核细胞和血小板计数的较大恢复有关。与其它组相比，用rBPI21/ENR治疗的小鼠的中值WBC、嗜中性粒细胞和单核细胞的水平在正常范围内。用rBPI21/ENR治疗的小鼠的中值血红蛋白也较高，但此差异未达到统计学显著。在D30，用rBPI21/ENR治疗的小鼠的WBC和嗜中性粒细胞仍然显著高于用ENR治疗的动物，在此时间点，存在太少的单独7Gy或VEH/ENR小鼠以致于不能与其它组进行有意义的比较。用较短的rBPI21(14)/ENR时间表观察到造血毒性的等效缓和(图12和图13)。
施予rBPI21明显增加发炎相关趋化因子
rBPI21治疗显著增加发炎相关趋化因子，例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(图14)、鼠类角质形成细胞化学引诱物(鼠类KC；人类同源物包括Gro-α、IL-8)(图15)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1，也称为趋化因子(C-C基序)配体2或CCL2)(图16)。BPI对血浆中的G-CSF和鼠类KC的刺激是通过(但不限于)先前辐射加强。不打算受限于理论，此可代表实现造血效应的一种机制。在辐照和rBPI施予之后达成的血浆水平与输注药理量的重组G-CSF IV一致。数据展示，在给予单独SC BID rBPI或与恩氟沙星的组合的受辐照小鼠中，G-CSF有高度显著的增加(增量为1到3个对数级)。因此，GCSF的提高随rBPI而变化且不依赖于BPI与ENR的组合。在给予单次注射rBPI或BID SC注射的未受辐照的小鼠中也观察到G-CSF的较不明显但统计学显著的提高。
在经历HSCT的患者中实施观察性队列研究，以识别可与骨髓清除性辐照的毒性相关的分子和细胞变化。观察到，在骨髓清除性治疗之后常见的嗜中性粒细胞减少与血浆BPI(一种衍生自嗜中性粒细胞的蛋白质，其具有有效的内毒素中和活性(25、26))的快速耗尽有关，同时伴有内毒素血症。这些改变和与增加的全身内毒素活性一致的细胞(mCD14、TLR4表面水平)、血浆(IL-6)和生理(发热)改变平行存在(24、25)。还观察到，HSC输注时(D0)较低的血浆BPI浓度与更延迟的髓细胞植入相关，表明内毒素可能在输注时和在输注后一段时间内直接或间接地对HSC施加一定的负性影响。随后探究外源性BPI补充缓和暴露于产生粘膜损害、内毒素血症和延长的BM发育不全的TBI剂量的人类中的辐射毒性的能力。
使用BALB/c小鼠的LD95/30单次骨髓清除性TBI模型，展示在辐射暴露之后24小时开始的rBPI21与ENR的组合与三分之二或三分之二以上的动物存活有关(p<0.0001)。选择rBPI21和氟喹诺酮抗生素作为即时可行策略(immediately actionable strategy)；两种药剂在健康和患病人类中均具有生物活性和高度有利的安全性质，包括具有多器官损害的那些(33到43)。单独rBPI21未改善存活，而单独ENR提供一些存活益处。单独氟喹诺酮的缓和效应变化不定，可能与包括动物模型和治疗设计在内的差异相关(15、16)。在此研究中，ENR治疗的存活益处显著小于rBPI21/ENR，尽管存在注射方案的重复损害。而且，用VEH/ENR或ENR治疗的受辐照动物的特征还在于每一个所检查的造血参数的延迟恢复。仅rBPI21/ENR始终与改善的存活以及较快速且完全的造血恢复有关。这些可为相关发现，如在D19记录的接近正常的BM细胞结构和PB计数重新建立之后97％的用rBPI21/ENR治疗的动物存活所表明。
造血综合征对人类ARS发病率和死亡率的贡献(1、2、4、44到46)强调观察到的rBPI21/ENR对血细胞生成的效应的相关性。同种异体HSCT缓和由骨髓清除引起的BM衰竭(5)，但在大量辐射暴露期间快速或成功地执行资源密集型HSCT是不可能的(44到46)。多种药剂(47)，包括氟喹诺酮(16)和TLR激动剂鞭毛蛋白(flagellin)(19、21)和内毒素(17)如果在TBI之前施予会在动物模型中提供一些辐射防护。相比之下，很少药剂在辐射之后施予时展示功效(即，辐射缓和)，且功效通常依赖于在辐射暴露之后数分钟到数小时以内施予。遗憾的是，缓和策略的所述快速运用是不可能的，从而使得高度期望可延迟24小时或更长时间的策略。
没有既定的辐射量测定技术能够准确地对暴露的个体进行分拣并确定最可能受益于缓和治疗的那些，也没有在不存在HSC支持下TBI的人类治疗应用(其中研究辐射缓和剂的功效和毒性)。这些限制突出了不可能在极小程度受累(minimally affected)或危重病(critically-iii)群体中产生毒性的选择策略的重要性。此处所研究策略的组份满足此标准。ENR(兽用氟喹诺酮)的人类等效物是环丙沙星，它在1987年被FDA批准。氟喹诺酮具有出色的口服生物利用性，良好耐受且已经在骨髓清除性化学辐射疗法之后广泛且安全地使用(42、43)。rBPI21可以可溶形式得到，且在2℃到8℃下储存时展示稳定性，从而有助于储备。其可经SC、IV和IP施予且呈鼻内形式时在动物中显示功效。除在纯内毒素血症和革兰氏阴性菌血症动物模型中具有功效以外，rBPI21可消除人类的内毒素血症体征和症状以及降低或除去伴随的细胞因子失调和凝血病(38、39)。未在招募多于1100名正常志愿者和危重病患者(包括婴儿和患有脑膜炎球菌血症或经历重大手术程序的个体)的I-III期试验中观察到显著毒性(33到引)。在试点体验(n=4)中，还向接受TBI作为骨髓清除性HSCT的一部分的患者施予rBPI21且没有任何可归属的毒性(图11)。总的来说，这些数据表明rBPI21/ENR可安全地施予证明具有较少程度辐射暴露的个体。
对由自然灾害、核冲突或恐怖活动造成的或作为有意的医学暴露的不利结果的辐射损害的增加的全球性关注促使研究补充性BPI是否可转变成有效的辐射缓和策略。数据表明，迟至可能致命的辐射暴露之后24小时开始的rBPI21和氟喹诺酮抗生素的组合具有改善存活且限制必需的支持性护理的范围和持续时间的潜力。考虑到与人类相比小鼠对内毒素的相对低的敏感性、次最佳剂量以及此模型中SC注射的重复施压和发炎反应，我们的结果可能低估此组合的潜在益处。一些其它方法也具有所观察到的在TBI之后24小时开始的治疗的功效且所述功效对其十分有利。rBPI21和氟喹诺酮的人类安全性记录提供快速采用的平台，这在由当前辐射量测定的限制引起的必不可少的过度治疗情况下尤其引人注目，并降低发生未曾料到的副作用的可能性。除中和内毒素以外，rBPI21施加抗细菌活性，即，除氟喹诺酮的抗生素活性以外，可潜在地缩减其它多药物疗法(po1ypharmacy)且使具有诸多感染原因的受辐射个体中抗性物种的出现降到最低。此报告提供寻求rBPI21影响辐射毒性的机制的基础。尽管同样需要rBPI21或类似药剂的调配、投药方案和疗法时间长短的优化，但在辐射灾难的情况下考虑批准rBPI21用于此适应症和后续储备用于组合的缓和疗法似乎是有理由的。
参考文献
1.K.L.凯尼格(K.L.Koenig)，R.E.古恩(R.E.Goans)，R.J.海彻特(R.J.Hatchett)，小F.A.梅特勒(F.A.Mettler，Jr.)，T.A.舒马赫(T.A.Schumacher)，E.K.诺记(E.K.Noji)，D.G.贾勒特(D.G.Jarrett)，辐射性伤亡的医学治疗：当前观念(Medical treatment of radiological casualties：current concepts).急诊医学年鉴(Ann Emerg Med)45，643-652(2005)
2.J.K.瓦斯伦科(J.K.Waselenko)，T.J.迈威替(T.J.MacVittie)，w.F.布莱克利(w.F.Blakely)，N.佩斯科(N.Pesik)，A.L.威利(A.L.Wiley)，w.E.迪克森(w.E.Dickerson)，H.特苏(H.Tsu)，D.L.康夫(D.L.Confer)，C.N.科尔曼(C.N.Coleman)，T.斯德(T.Seed)，P.劳里(P.Lowry)，J.O.阿米特吉(J.O.Armitage)，N.达尼科(N.Dainiak)，急性辐射综合征的医学管控：国家战略储备辐射工作组的建议(Medical management of the acute radiation syndrome：recommendations of the Strategic National Stockpile Radiation Working Group).内科医学年鉴(Ann Intern Med)140，1037-105l(2004)
3.G.H.安诺(G.H.Anno)，S.J.鲍姆(S.J.Baum)，H.R.威瑟斯(H.R.Withers)，R.w.杨格(R.w.Young)，暴露于0.5Gy到30Gy的剂量之后人类中的急性辐射效应症状学(Symptomatology of acute radiation effects in humans after exposure to doses of0.5-30Gy).健康物理学(Health Phys)56，821-838(1989)
4.H.B.斯特恩(H.B.Stone)，J.E.穆勒得(J.E.Moulder)，C.N.科尔曼(C.N.Coleman)，K.K.安格(K.K.Ang)，M.S.安斯彻(M.S.Anscher)，M.H.巴塞洛斯-霍夫(M.H.Barcellos-Hoff)，w.S.戴南(w.S.Dynan)，J.R.菲克(J.R.Fike)，D.J.葛定纳(D.J.Grdina)，J.S.格林伯格(J.S.Greenberger)，M.豪尔-延森(M.Hauer-Jensen)，R.P.海尔(R.P.Hill)，R.N.克斯尼科(R.N.Kolesnick)，T.J.迈威替(T.J.Macvittie)，C.马克斯(C.Marks)，w.H.麦克布莱德(w.H.McBride)，N.米婷(N.Metting)，T.裴尔玛(T.Pellmar)，M.普汝克(M.Purucker)，M.E.罗宾斯(M.E.Robbins)，R.H.斯彻思特(R.H.Schiestl)，T.M.斯德(T.M.Seed)，J.E.托马泽维奇(J.E.Tomaszewski)，E.L.崔维斯(E.L.Travis)，P.E.沃尔尼(P.E.Wallner)，M.沃伯特(M.Wolpert)，D.扎哈维兹(D.Zaharevitz)，用以评估打算用于预防、缓和和治疗辐射损害的药剂的模型(Models for evaluating agents intended for the prophylaxis，mitigation and treatment of radiation injuries).国家癌症研究所讲习班的报告(Report of an NCI Workshop)，2003年12月3号到4号.辐射研究(Radiat Res)162，711-728(2004)
5.E.D.托马斯(E.D.Thomas)，R.施拖布(R.Storb)，R.A.克里夫(R.A.Cliff)，A.菲氟(A.Fefer)，L.约翰逊(L.Johnson)，P.E.内曼(P.E.Neiman)，K.G.冷那(K.G.Lerner)，H.格鲁兹堡(H.Glucksberg)，C.D.巴克纳(C.D.Buckner)，骨髓移植(Bone-marrow transplantation)(两部分中的第二部分).新英格兰医学杂志(N Engl J Med)292，895-902(1975)
6.J.G.凯昂(J.G.Kiang)，w.焦(w.Jiao)，L.H.卡里(L.H.Cary)，S.R.莫格(S.R.Mog)，T.B.艾略特(T.B.Elliott)，T.C.裴勒玛(T.C.Pellmar)，G.D.勒德尼(G.D.Ledney)，伤口创伤通过激活iNOS路径和提高细胞因子浓度以及细菌感染增加辐射诱发的死亡率(Wound Trauma Increases Radiation-Induced Mortality by Activation of iNOS Pathway and Elevation of Cytokine Concentrations and Bacterial Infection).辐射研究(Radiation Research)173，319-332(2010)
7.M.V.察洛夫斯基(M.V.Konchalovsky)，A.E.巴拉诺夫(A.E.Baranov)，A.V.科尔加诺夫(A.V.Kolganov)，多器官连累和衰竭：挑选的再访的俄罗斯辐射事故病例(Multiple organ involvement and failure：selected Russian radiation accident cases re-visited).英国辐射学杂志增刊(BJR Suppl)27，26-29(2005)
8.C.P.米勒(C.P.Miller)，C.w.哈默德(C.w.Hammond)，感染在辐射损害中的角色(The role of infection in radiation injury).美国内科医师协会会报(Trans Assoc Am Physicians)63，155-160(1950)
9.C.w.哈蒙德(C.w.Hammond)，S.K.安德乐(S.K.Anderle)，C.P.米勒(C.P.Miller)，连续γ辐照小鼠对其白细胞计数和细菌感染易感性的效应(Effect of continuous gamma irradiation of mice on their leukocyte counts and susceptibility to bacterial infection).辐射研究(Radiat Res)11，242-252(1959)
10.T.松沢(T.Matsuzawa)，致命性全身X辐照之后无菌小鼠的存活时间(Survival Time in Germfree Mice after Lethal Whole Body X-Irradiation).东北实验医学杂志(Tohoku J Exp Med)85，257-263(1965)
11.M.M.麦克拉夫林(M.M.McLaughlin)，M.P.达奎斯特(M.P.Dacquisto)，D.P.雅克布斯(D.P.Jacobus)，R.E.霍洛维茨(R.E.Horowitz)，无菌态对小鼠对全身辐照的反应的效应(Effects of the Germfree State on Responses of Mice to Whole-Body Irradiation).辐射研究(Radiat Res)23，333-349(1964)
12.M.若叶(M.Onoue)，K.内田(K.Uchida)，T.横仓(T.Yokokura)，T.高桥(T.Takahashi)，M.务台(M.Mutai)，肠微生物丛对暴露于致命性全身γ辐照的小鼠的存活时间的效应(Effect of intestinal microflora on the survival time of mice exposed to lethal whole-body gamma irradiation).辐射研究(Radiat Res)88，533-541(1981)
13.P.A.克劳福德(P.A.Crawford)，J.I.戈登(J.I.Gordon)，肠辐射敏感性的微生物调控(Microbial regulation of intestinal radiosensitivity).美国科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)102，13254-13259(2005)
14.I.布鲁克(I.Brook)，R.I.沃克(R.I.Walker)，T.J.迈威替(T.J.MacVittie)，抗微生物疗法对受辐照小鼠中的肠菌群和细菌感染的效应(Effect of antimicrobial therapy on bowel flora and bacterial infection in irradiated mice).国际辐射生物学以及相关物理学、化学和医学研究杂志(Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med)53，709-716(1988)
15.I.布鲁克(I.Brook)，G.D.勒德尼(G.D.Ledney)，预防辐照之后的内源和外源感染的喹诺酮疗法(Quinolone therapy in the prevention of endogenous and exogenous infection after irradiation).抗微生物化学疗法杂志(J Antimicrob Chemother)33，777-784(1994)
16.K.吉姆(K.Kim)，J.M.珀勒阿德(J.M.Pollard)，A.J.诺里斯(A.J.Norris)，J.T.麦克唐纳(J.T.McDonald)，Y.孙(Y.Sun)，E.麦斯维奇(E.Micewicz)，K.佩提姜(K.Pettijohn)，R.达摩斯劳克斯(R.Damoiseaux)，K.S.岩本(K.S.1wamoto)，J.w.赛尔(J.w.Sayre)，B.D.普莱斯(B.D.Price)，R.A.加蒂(R.A.Gatti)，w.H.麦克布莱德(w.H.McBride)，高通量筛选识别两类抗生素作为辐射防护剂：四环素和氟喹诺酮(High-throughput screening identifies two classes of antibiotics as radioprotectors：tetracyclines and fluoroquinolones).临床癌症研究(Clin Cancer Res)15，7238-7245(2009)
17.E.安斯沃斯(E.Ainsworth)，从内毒素到更新的免疫调节剂：微生物多糖复合物在受辐照动物中的存活促进效应(From endotoxins to newer immunomodulators：survival-promoting effects of microbial polysaccharide complexes in irradiated animals).药理学与治疗学(Pharmacology＆Therapeutics)39，223-241(1988)
18.S.S.格斯(S.S.Boggs)，S.M.威尔逊(S.M.Wilson)，w.w.史密斯(w.w.Smith)，内毒素对受辐照和未受辐照的W/Wv小鼠的血细胞生成的效应(Effects of Endotoxin on Hematopoiesis in Irradiated and Nonirradiated W/Wv Mice).辐射研究(Radiation Research)56，481-493(1973)
19.L.G.博得亚(L.G.Burdelya)，V.I.瑞科瑞森克(V.I.Krivokrysenko)，T.C.塔兰特(T.C.Tallant)，E.斯特罗姆(E.Strom)，A.S.格雷伯曼(A.S.Gleiberman)，D.古普塔(D.Gupta)，O.V.库纳索(O.V.Kurnasov)，F.L.福特(F.L.Fort)，A.L.奥斯特曼(A.L.Osterman)，J.A.帝都那特(J.A.Didonato)，E.范斯特(E.Feinstein)，A.V.古阔夫(A.V.Gudkov)，铎样受体5的激动剂在小鼠和灵长类动物模型中具有辐射防护活性(An agonist of toil-like receptor5has radioprotective activity in mouse and primate models).科学(Science)320，226-230(2008)
20.C.D.帕基(C.D.Packey)，M.A.乔尔伯(M.A.Ciorba)，微生物影响小肠对辐射损害的反应(Microbial influences on the small intestinal response to radiation injury).胃肠病学当前观点(Curr Opin Gastroentero1)26，88-94(2010)
21.M.维杰-库马尔(M.Vijay-Kumar)，J.D.艾特金(J.D.Aitken)，C.J.桑德斯(C.J.Sanders)，A.弗里亚斯(A.Frias)，V.M.斯洛娜(V.M.Sloane)，J.徐(J.Xu)，A.S.尼什(A.S.Neish)，M.罗哈斯(M.Rojas)，A.T.葛维兹(A.T.Gewirtz)，鞭毛蛋白治疗对抗化学品、细菌、病毒和辐射(Flagellin treatment protects against chemicals，bacteria，viruses，and radiation).免疫学杂志(J Immuno1)180，8280-8285(2008)
22.R.E.罗塞斯(R.E.Roses)，M.徐(M.Xu)，G.K.科斯基(G.K.Koski)，B.J.泽尼奇(B.J.Czerniecki)，辐射疗法和铎样受体信号传导：用于治疗癌症的暗示(Radiation therapy and Toll-like receptor signaling：implications for the treatment of cancer).癌基因(Oncogene)27，200-207(2008)
23.G.R.海尔(G.R.Hill)，J.M.克劳福德(J.M.Crawford)，K.R.库克(K.R.Cooke)，Y.S.布林森(Y.S.Brinson)，L.潘(L.Pan)，J.L.菲拉拉(J.L.Ferrara)，全身辐照和急性移植物抗宿主病：胃肠损伤和发炎细胞因子的角色(Total body irradiation and acute graft-versus-host disease：the role of gastrointestinal damage and inflammatory cytokinesl.血液(Blood)90，3204-3213(1997)
24.B.伯特勒(B.Beutler)，E.T.瑞彻尔(E.T.Rietschel)，先天免疫传感和其本质：内毒素的故事(Innate immune sensing and its roots：the story of endotoxin).自然综述.免疫学(Nat Rev Immuno1)3，169-176(2003)
25.R.S.芒福德(R.S.Munford)，传感革兰氏阴性细菌脂多糖：人类疾病的决定因素?(Sensing gram-negative bacterial lipopolysaccharides：a human disease determinant？)传染与免疫(Infect Immun)76，454-465(2008)
26.T.L.焦安尼尼(T.L.Gioannini)，J.P.外斯(J.P.Weiss)，对革兰氏阴性细菌内毒素与哺乳动物细胞之间相互作用的调控(Regulation of interactions of Gram-negative bacterial endotoxins with mammalian cells).免疫学研究(Immunol Res)39，249-260(2007)
27.J.C.马歇尔(J.C.Marshall)，P.M.沃克(P.M.Walker)，D.M.福斯特(D.M.Foster)，D.哈里斯(D.Harris)，M.里贝罗(M.Ribeiro)，J.派斯(J.Paice)，A.D.罗马辰(A.D.Romaschin)，A.N.德兹克(A.N.Derzko)，使用全血嗜中性粒细胞依赖性化学发光测量危重病患者中的内毒素活性(Measurement of endotoxin activity in critically ill patients using whole blood neutrophil dependent chemiluminescence).危重病护理(Crit Care)6，342-348(2002)
28.V.巴吉尔(V.Bazil)，J.L.施特罗命格(J.L.Strominger)，脱落作为受刺激的人类单核细胞上的CD14的下调机制(Shedding as a mechanism of down-modulation of CD14 on stimulated human monocytes).免疫学杂志(J Immunol)147，1567-1574(1991)
29.C.马斯克(C.Marsik)，F.麦尔(F.Mayr)，F.卡多纳(F.Cardona)，U.德哈彻尼格(U.Derhaschnig)，O.F.瓦格纳(O.F.Wagner)，B.玖玛(B.Jilma)，内毒素血症调节人类白细胞上的铎样受体(Endotoxaemia modulates Toil-like receptors on leucocytes in humans).英国血液病学杂志(British Journal of Haematology).121(4)，653-656(2003)
30.P.科里尼(P.Crenn)，B.梅辛(B.Messing)，L.赛诺伯(L.Cynober)，瓜氨酸作为由肠上皮细胞质量降低引起的肠衰竭的生物标记(Citrulline as a biomarker of intestinal failure due to enterocyte mass reduction).临床营养(Clin Nutr)27，328-339(2008)
31.w.J.范德费尔登(w.J.van der Velden)，A.H.赫博斯(A.H.Herbers)，T.福斯(T.Feuth)，N.P.夏普(N.P.Schaap)，J.P.唐纳利(J.P.Donnelly)，N.M.伯利范斯(N.M.Blijlevens)，肠损伤决定接受针对干细胞移植的调节的患者中的发炎反应和早期并发症(Intestinal damage determines the inflammatory response and early complications in patients receiving conditioning for a stem cell transplantation).公共科学图书馆·综合(PLoS One)5，e15156(2010)
32.Y.王(Y.Wang)，B.A.舒尔特(B.A.Schulte)，A.C.拉吕(A.C.LaRue)，M.奥佳华(M.Ogawa)，D.周(D.Zhou)，全身辐照选择性地诱发鼠类造血干细胞衰老(Total body irradiation selectively induces murine hematopoietic stem cell senescence).血液(Blood)107，358-366(2006)
33.R.J.鲍尔(R.J.Bauer)，N.韦德尔(N.Wedel)，N.蒙夫里诺(N.Havrilla)，M.怀特(M.White)，A.科亨(A.Cohen)，S.F.卡罗尔(S.F.Carroll)，健康志愿者中杀菌/渗透性增加蛋白(rBPI21)的重组改质氨基端片段的药代动力学(Pharmacokinetics of a recombinant modified amino terminal fragment of bactericidal/permeability-increasing protein(rBPI21)in healthy volunteers).临床药理学杂志(J Clin Pharmacol)39，1169-1176(1999)
34.D.德米瑞德斯(D.Demetriades)，J.S.史密斯(J.S.Smith)，L.E.雅各布森(L.E.Jacobson)，M.蒙丘尔(M.Moncure)，J.米内(J.Minei)，B.J.纳尔逊(B.J.Nelson)，P.J.施康能(P.J.Scannon)，患有由创伤引起的出血的患者中的杀菌/渗透性增加蛋白(rBPI21)：多中心II期临床试验的结果(Bactericidal/permeability-increasing protein(rBPI21)in patients with hemorrhage due to trauma：results of a multicenter phase II clinical trial).rBPI21急性出血性创伤研究组(rBPI21Acute Hemorrhagic Trauma Study Group).创伤杂志(J Trauma)46，667-676；讨论676-667(1999)
35.B.P.吉鲁尔(B.P.Giroir)，P.A.昆特(P.A.Quint)，P.巴顿(P.Barton)，E.A.克施(E.A.Kirsch)，L.基钦(L.Kitchen)，B.戈德斯坦(B.Goldstein)，B.J.纳尔逊(B.J.Nelson)，N.J.韦德尔(N.J.Wedel)，S.F.卡罗尔(S.F.Carroll)，P.J.施康能(P.J.Scannon)，患有严重脑膜炎球菌性败血症的儿童中的人类杀菌/渗透性增加蛋白的重组氨基端片段的初步评估(Preliminary evaluation of recombinant amino-terminal fragment of human bactericidal/permeability-increasing protein in children with severe meningococcal sepsis).柳叶刀(Lancet)350，1439-1443(1997)
36.B.P.吉鲁尔(B.P.Giroir)，P.J.施康能(P.J.Scannon)，M.莱文(M.Levin)，杀菌/渗透性增加蛋白-从rBPI21用于患有严重脑膜炎球菌血症的儿童的辅助治疗的III期随机化临床试验学到的知识(Bactericidal/permeability-increasing protein-lessons learned from the phase III，randomized，clinical trial of rBPI21for adjunctive treatment of children with severe meningococcemia).危重病护理医学(Crit Care Med)29，S130-135(2001)
37.M.莱文(M.Levin)，P.A.昆特(P.A.Quint)，B.戈德斯坦(B.Goldstein)，P.巴顿(P.Barton)，J.S.布莱德利(J.S.Bradley)，S.D.施密尔(S.D.Shemie)，T.叶赫(T.Yeh)，S.S.吉姆(S.S.Kim)，D.P.卡法罗(D.P.Cafaro)，P.J.施康能(P.J.Scannon)，B.P.吉鲁尔(B.P.Giroir)，重组杀菌/渗透性增加蛋白(rBPI21)作为患有严重脑膜炎球菌性败血症的儿童的辅助治疗：随机化试验.rBPI21脑膜炎球菌性败血症研究组(rBPI21Meningococcal Sepsis Study Group)[参见注释].柳叶刀(Lancet)356，961-967(2000)
38.M.A.范德莫仑(M.A.von der Mohlen)，A.N.季明思(A.N.Kimmings)，N.I.韦德尔(N.I.Wedel)，M.L.米维森(M.L.Mevissen)，J.詹森(J.Jansen)，N.弗里德曼(N.Friedmann)，T.J.劳伦兹(T.J.Lorenz)，B.J.纳尔逊(B.J.Nelson)，M.L.怀特(M.L.White)，R.鲍尔(R.Bauer)等人，通过使用重组杀菌/渗透性增加蛋白抑制人类中内毒素诱发的细胞因子释放和嗜中性粒细胞激活(Inhibition of endotoxin-induced cytokine release and neutrophil activation in humans by use of recombinant bactericidal/permeability-increasing protein).传染性疾病杂志(J Infect Dis)172，144-151(1995)
39.M.A.范德莫仑(M.A.von der Mohlen)，S.J.范代芬特尔(S.J.van Deventer)，M.利瓦伊(M.Levi)，B.范德英德(B.van den Ende)，N.I.韦德尔(N.I.Wedel)，B.J.纳尔逊(B.J.Nelson)，N.弗里德曼(N.Friedmann)，J.w.腾卡特(J.w.ten Cate)，使用重组内毒素结合蛋白(rBPI23)抑制内毒素诱发的凝结激活和纤维蛋白溶解路径(Inhibition of endotoxin-induced activation of the coagulation and fibrinolytic pathways using a recombinant endotoxin-binding protein(rBPI23)).血液(Blood)85，3437-3443(1995)
40.M.J.维泽(M.J.Wiezer)，S.I.朗根杜恩(S.I.Langendoen)，C.梅杰(C.Meijer)，R.J.鲍尔(R.J.Bauer)，M.L.怀特(M.L.White)，S.F.卡罗尔(S.F.Carroll)，S.梅耶(S.Meyer)，L.G.泰斯(L.G.Thi.is)，P.A.范雷文(P.A.van Leeuwen)，在大鼠和人类中肝手术后杀菌/渗透性增加蛋白(rBPI21)的重组氨基端片段的药代动力学(Pharmacokinetics of a recombinant amino terminal fragment of bactericidal/permeability increasing protein(rBPI21)after liver surgery in rats and humans).休克(Shock)10，161-166；讨论167-168(1998)
41.M.J.维泽(M.J.Wiezer)，C.梅杰(C.Meijer)，C.斯耶特斯(C.Sietses)，H.A.普林斯(H.A.Prins)，M.A.库耶斯塔(M.A.Cuesta)，R.H.比伦(R.H.Beelen)，S.梅杰(S.Meijer)，P.A.范雷文(P.A.van Leeuwen)，杀菌/渗透性增加蛋白在大部分肝切除后保持白细胞功能(Bactericidal/permeability-increasing protein preserves leukocyte functions after major liver resection).外科学年鉴(Ann Surg)232，208-215(2000)
42.P.B.爱恩尼尼(P.B.Iannini)，莫西沙星和其它氟喹诺酮在特殊患者群体中的安全性质(The safety profile of moxifloxacin and other fluoroquinolones in special patient populations).当代医学研究与见解(Curr Med Res Opin)23，1403-1413(2007)
43.U.B.斯卡德(U.B.Schaad)，在婴儿和儿童中的氟喹诺酮抗生素(Fluoroquinolone antibiotics in infants and children).北美传染性疾病临床学(Infect Dis Clin North Am)19，617-628(2005)
44.A.巴拉诺夫(A.Baranov)，R.P.嘎勒(R.P.Gale)，A.古斯科娃(A.Guskova)，E.派特金(E.Piatkin)，G.塞里度金(G.Selidovkin)，L.穆拉维耶娃(L.Muravyova)，R.E.钱普林(R.E.Champlin)，N.丹尼洛娃(N.Danilova)，L.耶维塞娃(L.Yevseeva)，L.佩托斯言(L.Petrosyan)，切尔诺贝利核事故之后的骨髓移植(Bone marrow transplantation after the Chernobyl nuclear accident).新英格兰医学杂志(N Engl J Med)321，205-212(1989)
45.R.钱普林(R.Champlin)，骨髓移植对于核事故的作用：切尔诺贝利灾难的启示(The role of bone marrow transplantation for nuclear accidents：implications of the Chernobyl disaster).血液病学论文集(Semin Hematol)24，1-4(1987)
46.N.达尼科(N.Dainiak)，R.C.里克斯(R.C.Ricks)，造血细胞移植在辐射损害中的逐步演进的作用：潜力和限制(The evolving role of haematopoietic cell transplantation in radiation injury：potentials and limitations).英国辐射学杂志增刊(BJR Suppl)27，169-174(2005)
47.J.S.格林伯格(J.S.Greenberger)，辐射防护(Radioprotection).活体内(In Vivo)23，323-336(2009)
48.I.索恩利(I.Thornley)，L.E.莱曼(L.E.Lehmann)，L.桑格(L.Sung)，C.霍尔摩斯(C.Holmes)，J.M.斯皮尔(J.M.Spear)，L.布伦南(L.Brennan)，M.范格尔(M.Vangel)，L.J.贝尔夏(L.J.Bechard)，P.理查德森(P.Richardson)，C.达根(C.Duggan)，E.C.姬兰(E.C.Guinan)，降低经历同种异体造血干细胞移植的儿童中的方案相关毒性的多药剂策略(A multiagent strategy to decrease regimen-related toxicity in children undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation).血液生物学和骨髓移植(Biol Blood Marrow Transplant)10，635-644(2004)
49.P.阿曼德(P.Armand)，S.甘纳曼妮(S.Gannamaneni)，H.T.吉姆(H.T.Kim)，C.S.卡特勒(C.S.Cutler)，V.T.霍(V.T.Ho)，J.阔利斯(J.Koreth)，E.P.阿里耶(E.P.Alyea)，A.S.拉卡色(A.S.LaCasce)，E.D.雅各布森(E.D.Jacobsen)，D.C.费希尔(D.C.Fisher)，J.R.布朗(J.R.Brown)，G.P.卡纳罗斯(G.P.Canellos)，A.S.弗里德曼(A.S.Freedman)，R.J.索菲尔(R.J.Soiffer)，J.H.安亭(J.H.Antin)，在强度降低的调节下同种异体造血干细胞移植之后接受西罗莫司用于移植物抗宿主病预防的淋巴瘤患者的改善存活(Improved survival in lymphoma patients receiving sirolimus for graft-versus-host disease prophylaxis after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation with reduced-intensity conditioning).临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol)26，5767-5774(2008)
50.O.乐瓦伊(O.Levy)，K.A.泽里姆博(K.A.Zarember)，R.M.罗伊(R.M.Roy)，C.塞韦斯(C.Cywes)，P.J.古都维奇(P.J.Godowski)，M.R.维塞尔斯(M.R.Wessels)，选择性损害人类新生儿中TLR介导的先天免疫：新生儿血浆降低细菌脂肽、脂多糖和咪喹莫德的单核细胞TNF-o诱发，但保持对R-848的反应(Selective impairment of TLR-mediated innate immunity in human newborns：neonatal blood plasma reduces monocyte TNF-alpha induction by bacterial lipopeptides，lipopolysaccharide，and imiquimod，but preserves the response to R-848).免疫学杂志(J Immunol)173，4627-4634(2004)
51.K.E.纳特(K.E.Nathe)，R.帕拉德(R.Parad)，L.J.烦马特(L.J.Van Marter)，C.A.隆德(C.A.Lund)，E.E.苏特(E.E.Suter)，S.赫尔南德斯-迪亚兹(S.Hernandez-diaz)，E.B.鲍西(E.B.Boush)，E.伊科诺穆(E.Ikonomu)，L.嘎林格顿(L.Gallington)，J.A.莫雷(J.A.Morey)，A.M.泽曼(A.M.Zeman)，M.麦克纳马拉(M.McNamara)，O.乐瓦伊(O.Levy)，机械换气的人类新生儿的气管抽吸物中内毒素引导的先天免疫(Endotoxin-directed innate immunity in tracheal aspirates of mechanically ventilated human neonates).儿科研究(Pediatr Res)66，191-196(2009)
52.P.张(P.Zhang)，D.A.威尔士(D.A.Welsh)，R.w.斯格因斯二世(R.w.Siggins，2nd)，G.J.巴格比(G.J.Bagby)，C.E.拉斯彻(C.E.Raasch)，K.I.哈佩尔(K.I.Happel)，S.纳尔逊(S.Nelson)，急性酒精中毒抑制谱系-c-kit+Sca-1+细胞对大肠杆菌菌血症的反应(Acute alcohol intoxication inhibits the lineage-c-kit+Sca-1+cell response to Escherichia coli bacteremia).免疫学杂志(J Immunol)182，1568-1576(2009)