技术领域
本申请是名称为“知母皂苷AI作为二肽基肽酶Ⅳ抑制剂及制备方法和用途”发明专利申请的分案申请，申请号：201610092985.4，申请日：2016.2.20。
本发明涉及中药化学领域，具体涉及知母皂苷AI作为二肽基肽酶Ⅳ抑制剂及制备方法和用途。
背景技术
糖尿病是一种以高血糖为特征的常见内分泌代谢性疾病。近年来，随着人民生活水平的提高、生活方式的改变及人口老龄化，糖尿病的发病率不断升高。另外，餐后高血糖和高胰岛素血症是发生糖尿病大血管并发症的独立危险因素。虽然有用于治疗糖尿病综合征的药物，但是今天在对糖尿病病人的治疗中最具有挑战的目标仍然是使血糖水平尽可能地接近正常。
近年来，在糖尿病新药开发领域，从胰岛素的新剂型，到降糖药的新作用机制，如GLP-1类似物，DPP-IV 抑制剂和SGLT-2 抑制剂等，都取得了极大的进展。
人体摄入的碳水化合物经过小肠上皮细胞的酶(如淀粉酶和α-葡萄糖苷酶)的水解作用生成葡萄糖之后，才被吸收进入血液循环。DPP-4作为一种丝氨酸蛋白酶，在肠道中高表达，它能够分解肠道细胞分泌的肠促胰岛素(GLP-1)。通过抑制DPP-4活性，而阻断其分解GLP-1，使GLP-1能够持续发挥刺激胰岛素分泌、抑制升糖素、抑制胃排空和让胰岛细胞重生等作用，从而降低血糖。
自2009年至今，我国相继批准引进了全球新一代二肽基肽酶Ⅳ(DPP-4)抑制剂类药物西格列汀、维格列汀、沙格列汀、利格列汀、阿格列汀和西格列汀双胍等6个药物。DPP-4抑制剂是近年研发的一种新型口服降糖药，目前在临床使用越来越广泛，不同的DPP-4抑制剂在结构和药物代谢动力学上虽存在明显差异，但所有DPP-4抑制剂均显示出相近的降糖效果和良好的安全性，因此这一类药物也被越来越多地应用在降血糖临床治疗上。从而推动了国内糖尿病治疗市场的快速发展。
现有的DPP-4抑制剂大多为化学合成小分子，源于中药的DPP-4抑制剂还少见报道。
从已知的具有一定降糖效果的中药方中提取有效成分，进而分析有效成分的化学组成、作用机理，是筛选药用化合物的一种有效途径。消渴安胶囊是目前治疗2型糖尿病的临床经验方，具有清热生津、益气养阴、活血化瘀的功效，具有一定的降血糖作用。其处方包括地黄、知母、黄连、地骨皮、枸杞子、玉竹、人参、丹参八味药材。本课题组在前期研究中从消渴安胶囊内容物中分析得到一种化合物知母皂苷AI。
知母具有滋阴润澡、生津止渴功效。知母主要药用成分为皂甙，根茎含总皂甙约6%。知母皂苷应用于降糖降脂食品中，如公告号为CN 101564163 B的专利文献公开了一种降糖降脂食品，由苦荞麦全粉、大豆蛋白粉、燕麦麸粉、枸杞多糖、知母皂甙、灵芝多糖、维生素和食用碳酸钙制成，但是具体作用机制尚不清楚。本发明所述的知母皂苷AI，是在大量筛选研究中得到的一种DPP-4抑制剂，其防治糖尿病的作用尚未见有报道。
发明内容
本发明提供了知母皂苷AI在抑制DPP-4活性方面的新用途，为糖尿病的防治提供新的药物选择。
本发明提供了知母皂苷AI的制备方法。
研究证明，知母皂苷AI具有抑制DPP-4活性的作用。采用课题组建立的DPP-4抑制剂筛选方法，检测到知母皂苷AI在25 mg/L浓度下对DPP-4抑制率为84.94%。
本发明提供了知母皂苷AI在制备治疗糖尿病药物中的应用。
本发明还提供了一种治疗糖尿病的药物组合物，包含作为有效成分的知母皂苷AI。
作为优选，还包括药剂学上接受的药物赋形剂或载体。药物赋形剂或载体可以赋予药物一定剂型，有效保证药物有效成分的释放和吸收。具体制剂按照药剂学上记载的方法制备即可。
作为优选，所述药物组合物为口服给药的剂型。口服给药方式简便，不直接损伤皮肤或黏膜，减少感染风险。由于糖尿病患者需要长期用药，故口服给药是一种经济安全的方式。口服给药的剂型可以为溶液剂、片剂、胶囊剂或颗粒剂。
作为优选，所述口服给药的剂型为滴丸剂。滴丸与其他剂型相比具有提高药物生物利用度、增加药物稳定性、缓释效应、减少药物在体内灭活等优点，并且制备滴丸剂的设备简单、操作简便、工艺周期短、生产率高，所以本发明选用滴丸剂为优选剂型。
本发明还提供了一种药物组合物的制备方法，取知母皂苷AI 与聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融得到混合药液，混合药液滴至液体石蜡中，除油，制得滴丸。
本发明还提供了一种药物组合物的制备方法，取知母皂苷AI 0.5g与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融得到混合药液，混合药液滴至液体石蜡中，除油，制得滴丸。
本发明在前期研究中，从消渴安胶囊内容物中分离提取到一种具有抑制DPP-4活性的化合物知母皂苷AI，知母皂苷AI来源于草本植物知母，因此，本发明提供了一种从知母中提取知母皂苷AI的方法以及知母皂苷AI作为DPP-4抑制剂开发降糖药物的应用。
一种知母皂苷AI的制备方法，包括以下步骤：
(1) 将知母粉碎后加入甲醇中，超声提取，获得提取液。
(2) 将提取液浓缩成浸膏，与大孔树脂进行拌样，装柱后用乙醇-水洗脱，合并知母皂苷AⅠ流分的洗脱液，浓缩干燥后得粗品。
(3) 将粗品溶解在无水乙醇中，采用制备液相色谱纯化，对目标流分进行浓缩、干燥，得到所述知母皂苷AI。
利用超声波振动使甲醇快速进入胶囊内容物中，将内容物中的有机成分完全地溶于甲醇中。作为优选，步骤(1)中，加入5~10倍量的甲醇超声提取进行1~3次，合并滤液得提取液。
作为优选，大孔树脂为反相硅胶。步骤(2)中，依次用水、浓度≤40%的乙醇洗脱杂质，再收集浓度≥95%的乙醇洗脱的洗脱液。
作为优选，步骤(3)中，制备液相色谱条件为：色谱柱填料SB-C18，21.2 mm × 250 mm，7 μm；流动相为水-乙腈，两者的体积比为70:30，流速为5~10 mL/min；柱温为25~35℃；收集21~24 min时间段内的流分即为目标流分。
本发明采用大孔树脂与制备液相色谱相结合的提取分离工艺，能够有效地除去糖、蛋白质、氨基酸等杂质，提高有效成分的含量。采用本发明的提取方法得到的中药有效组分化学成分简单明确，在药理研究上易于阐明其作用机制，在生产应用中易于药物的质量控制。
本发明具备的有益效果：(1) 本发明提供的中药有效成分知母皂苷AI具有抑制DPP-4活性的作用，为糖尿病的防治提供新的药物选择；(2) 本发明采用大孔树脂与制备液相色谱相结合的提取工艺，可以快速准确地得到知母皂苷AI。
附图说明
图1为中药有效组分的LC-MS分析图。
图2为中药有效组分中知母皂苷AI的质谱图。
图3为中药有效组分对DPP-4的抑制作用，其中C07为知母皂苷AI。
图4为知母皂苷AI抑制DPP-4量效关系图。
图5为知母皂苷AI对3T3-L1细胞诱导分化的影响（油红O染色照片）。
图6为知母皂苷AI对胰岛素抵抗BNL CL2细胞葡萄糖消耗作用的影响。
具体实施方式
本发明结合实施例进一步详细说明本发明的实质内容，该实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。
实施例一 消渴安有效组分的制备
取120g消渴安胶囊内容物加入10倍量甲醇，超声提取得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与反相硅胶进行拌样，用反相硅胶柱对其进行分离，首先用去离子水作为流动相，得洗脱液I，弃去，再用40%乙醇作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品0.145 g。
实施例二 消渴安有效组分的制备
取120g消渴安胶囊内容物加入10倍量甲醇，超声提取得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与反相硅胶进行拌样，用反相硅胶柱对其进行分离，首先用去离子水作为流动相，得洗脱液I，弃去，再用40%乙醇作为流动相，得洗脱液II，弃去，然后改换95%乙醇为流动相，得洗脱液III，将洗脱液III浓缩干燥后得样品0.225 g。
实施例三 消渴安有效组分的制备
取实施例一、二的样品用制备液相色谱继续分离。制备色谱的分离条件：色谱柱为Agient制备柱(Zorbax SB-C18; 21.2 mm × 250 mm, 7 μm)，流动相为水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序如下：0 min，30%B；60 min，75%B；63 min，80% B；65 min，100% B；流速10mL/min；检测波长210、230、254、280、310nm；柱温为30 ℃。
样品用100%乙醇溶解，在21～24 min时间段收集溶液，浓缩干燥后得到消渴安有效组分0.03 g。
实施例四 消渴安有效组分LC-MS分析
色谱条件：色谱柱Agilent Zorbax SB-C18柱 (4.6 mm×250 mm，5 µm)。采用梯度洗脱，流动相A相为0.5%甲酸水溶液，流动相B相为含0.5％甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱程序如下：0min，5%B；20min，20%B；25min，26%B；50min，33%B；60min，40%B；70 min，80% B； 80 min，100%B。进样量：5 µL；流速：0.5 mL/min；柱温：35℃。
质谱条件：正负离子扫描模式，正离子扫描范围100～1500，负离子扫描范围 300～1500；干燥气(N2气)流速10 L/min，离子喷雾电压-3000 V，雾化温度350℃，毛细管电压3500V，裂解电压100V。
供试品溶液的制备：称取消渴安有效组分适量于量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，10000 rpm离心10 min，取上清液制成浓度为1.0mg/ml的供试品溶液，即得。
测定方法：精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱质谱分析条件测定，即得。结果如图1、图2所示。
分析结果：消渴安有效组分的LC-MS离子流图，图中的A峰，是化合物知母皂苷AI。相对保留时间为69.38 min。
实施例五 中药有效组分制剂
取实施例三的中药有效组分0.5g与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6~8℃液体石蜡中，除油，制得滴丸400粒。
实施例六 DPP-4抑制活性的测定
采用课题组建立的DPP-4抑制剂筛选方法，将消渴安有效组分制成0.5 g/L浓度的溶液；将阳性药抑二肽素A制成1 mmol/L浓度的溶液。取96孔板，加50 μmol/L底物20µL，消渴安有效成分溶液5µL，0.1 U/mL DPP-4酶溶液5 µL，混匀后37℃下孵育30min，在激发波长320 nm，发射波长450 nm处测定其荧光强度值。计算消渴安有效组分对DPP-4活性的抑制率。其中酶溶液，样品溶液，反应底物溶液均以0.5mmol/L，pH 7.0 HEPES缓冲液配制。
I样品组：含底物和酶，并且加入待测样品反应后的荧光强度值。
I样品对照组：含底物和待测样品，不加酶的荧光强度值。
I对照组：含底物和酶，但不加入待测样品反应后的荧光强度值。
I空白组：只含有底物，不含酶和待测样品的荧光强度值。
结果如图3所示，阳性药物抑二肽素A在5 μmol/L浓度下抑制率为49.72%。
相同条件下，消渴安有效组分在25 mg/L浓度下抑制率为84.94%。
实施例七 知母皂苷AI对DPP-4抑制活性的量效考察
取96孔板，加50 μmol/L 底物20µL，0.1 U/mL DPP-4酶溶液5 µL以及一定体积浓度为1 mmol/L知母皂苷AI溶液，使得知母皂苷AI终浓度分别为5、10、25、35、50 μmol/L，反应总体积为100 µL。混匀后37℃下孵育30min，在激发波长320 nm，发射波长450 nm处测定其荧光强度值。计算知母皂苷AI各浓度对DPP-4活性的抑制率。其中酶溶液，样品溶液，反应底物溶液均以0.5 mmol/L，pH 7.0 HEPES缓冲液配制。
结果如图4所示，知母皂苷AI在5、10、25、35、50 μmol/L浓度下抑制率分别为26.94%、31.70%、38.55%、45.07%、66.30%。
实施例八知母皂苷AI对3T3-L1细胞诱导分化的影响
3T3-L1前脂肪细胞20000个/孔接种于24孔板，每孔1 mL培养液。待细胞长满80%左右后，将培养液换成含1 μM地塞米松、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、10 μg/mL胰岛素、10% FBS的高糖DMEM培养液培养2天；随后将培养液换成含10 μg/mL胰岛素、10% FBS的高糖DMEM培养液培养2天；最后将培养液换成含10% FBS的高糖DMEM培养液，每2天换一次培养液。诱导分化10-12天后，约80%的3T3-L1细胞分化为成熟脂肪细胞。更换诱导液的同时给予25 μM知母皂苷AI。
细胞诱导分化成熟后，弃去旧培养液，PBS漂洗2次，加入4%多聚甲醛固定细胞1 h。之后用PBS漂洗1遍，油红O染色30 min后，70%乙醇水溶液漂洗2次，显微镜下获取图片。结果如图5所示。
实施例九知母皂苷AI对胰岛素抵抗BNL CL2细胞葡萄糖消耗作用的影响
小鼠胚胎肝细胞（BNL CL2）20000个/孔接种于96孔板，每孔100 μL培养液。24 h后，将培养液换成含25 μM知母皂苷AI、1 μM胰岛素、不含血清的低糖、无酚红DMEM培养液，实验另设无细胞空白组（只含低糖、无酚红DMEM培养液）、对照组（不含胰岛素和药液）、模型组（含1 μM胰岛素）和阳性药组（含1 μM胰岛素和250 μM西他列汀）。孵育24 h后，每孔取10 μL上清液，用葡萄糖测定试剂盒（葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法）测定每孔的葡萄糖消耗量。之后将96孔板中的培养液吸尽，加入含0.5 mg/mL的MTT培养液100 μL，4 h后吸去MTT溶液，加入100 μL DMSO，580 nm处测定各孔吸光度值。
以无细胞空白组的葡萄糖含量减去接种细胞的测试孔中的葡萄糖含量，即得各组样品的葡萄糖消耗量。同时，除以各组细胞的MTT值进行细胞数量的校正。结果如图6所示，知母皂苷AI能显著促进胰岛素抵抗的BNL CL2细胞的葡萄糖消耗（**表示与模型组相比，P<0.01）。