技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种免疫增强剂及其在多克隆抗 体制备中的应用。
背景技术
免疫增强剂是指单独或同时与抗原使用时能增强机体免疫应答的物质。 免疫增强剂的种类繁多，包括矿物质类，如硒、锌等；中草药类，如黄芪、 白芍、芦荟、当归等；免疫佐剂类，如蜂胶、弗氏佐剂等；微生物制剂类， 如卡介苗、霍乱毒素B亚单位等；维生素类，如维生素A、维生素E等；氨 基酸类，如精氨酸、亮氨酸等；激素或激素样物质类，如生长激素、胸腺肽 等；核酸制剂类，如多(聚)核苷酸、免疫核糖核酸等；抗寄生虫药物类， 如左旋咪唑、甲硝唑等；其它免疫增强剂，如干扰素、蜂花粉、热休克蛋白 等。
目前的免疫增强剂通常采用单类物质，如公开号为CN101554476A的专 利中使用黄芪多糖、人参皂苷、甘草次酸作为免疫增强剂，
发明人在实验中发现单类免疫增强剂使用时增加机体免疫应答的作用有 限，仅使用单类免疫增强剂有时不能满足实际需要。使用单类免疫增强剂时， 免疫时间较长，往往要5～6次免疫才能达到较高的效价，其耗时严重。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明提供一种免疫增强剂及其在多克隆抗体 制备中的应用，解决了现有技术中单类免疫增强剂效果不佳，不能满足实 际需要的问题。
本发明的技术方案如下：
在上述技术方案中，所述IL-6、LPS脂多糖、胸腺肽、蜂胶液在使用 前分别放置。
以上所述的免疫增强剂在多克隆抗体制备中的应用，包括如下步骤：
1)将所述IL-6,LPS脂多糖，胸腺肽的母液与蜂胶液混合，得到免疫 增强剂；
2)将步骤1)所得免疫增强剂与抗原按照1:9的体积比混合得到抗原 混合物；
3)将步骤2)所述抗原混合物与弗氏佐剂按照1:1的体积比混合，在 注射器中推拉乳化形成乳剂；
4)免疫方法采用颈背部皮下多点注射步骤3)所得乳剂，每个点皮下 注射0.2ml，共计免疫3次，每次免疫的间隔时间为7～14天；
5)不同时间采血，分离血清，检测抗体效价。
在上述技术方案中，所述步骤4)中第1次免疫使用的乳剂是通过所 述抗原混合物用弗氏完全佐剂乳化得到，第2～3次免疫使用的乳剂是通 过所述抗原混合物用弗氏不完全佐剂乳化得到。
本发明通过添加复方的免疫增强剂来增加免疫效果，综合激素类(IL-6、 胸腺肽)、微生物类(LPS脂多糖)和佐剂类(蜂胶液)等免疫增强剂的优 点，可得到高亲和力的抗体。免疫动物所用时间也大为缩短，使用单类免疫 增强剂时，免疫时间较长，往往要5～6次免疫才能达到较高的效价,使用本发 明复合免疫增强剂免疫2～3次即可达到较高效价，增加了获得高质量抗体的 机率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细描述。
实施例1多克隆抗体的制备
(一)抗原的制备
1.TIMP1表位分析：按NCBI网站GeneBank数据库提供的人金属蛋 白酶抑制剂1基因序列，根据抗原表位软件DNAstar分析选择合适的目的 片段用于蛋白表达。
2.根据序列表所述序列设计引物，引物序列如下，在上下游引物的5′ 端分别插入BamHI和salI内切酶位点，运用PrimerPremier5.0和DNAMAN 软件对引物进行分析：
上游引物：ATGCGGATCCACCTGTGTCCCACCCCA
下游引物：ATGCGTCGACGGCTATCTGGGACCGC
3.提取EC109细胞总RNA，用随机引物反转录获得cDNA，以此cDNA 为模板，2所述的引物为引物进行PCR扩增获取目的基因，将目的基因回 收后连接转化到表达载体pET28a得到表达克隆，经测序分析表达克隆序 列正确以后，进行蛋白表达。
4.将上述获得的表达质粒，转化大肠杆菌BL21，获得人TIMP1表达 菌株。取表达菌株，振荡培养37℃，振荡培养至OD600≈0.6，加入IPTG 诱导，继续诱导培养3小时。
5.离心收集菌体。PBS清洗菌体后离心收集菌体，用PBS，4℃超声破 菌。10000rpm离心，分别收集上清与沉淀，进行SDS-PAGE电泳，结果 表明hTIMP1以上清可溶形式存在。
6.镍离子亲和层析，咪唑梯度洗脱纯化hTIMP1蛋白。平衡缓冲为PBS。 结果表明目的蛋白hTIMP1主要集中于200mM咪唑洗脱峰，纯度大于90％。 (二)动物的免疫
购买6～8周龄Balb/c小鼠，将纯化的TIMP1蛋白用来免疫Balb/c小 白鼠，免疫原用量约50ug/只/次。首次免疫用弗氏完全佐剂乳化的抗原颈 背部皮下多点注射，首次免疫后间隔3周，以后每隔2周左右改用由等体 积的弗氏不完全佐剂乳化的免疫原进行第2、3次免疫，免疫剂量同首免。 三次免疫之后眼静脉丛采血，测定抗血清效价。加强免疫不加佐剂，腹腔 注射50ug/只，3天后摘除小鼠眼球取血，收集血液。37℃放置约1h，4℃ 过夜，离心，取上清，少量于4℃暂时储存备用。其余抗血清加等体积甘 油，混匀后于–20℃储存备用。
表1免疫小鼠的方法及剂量
经过大量的实验和数据支持，我们在免疫阶段加入了免疫增强剂混合 液(重组IL-6、500ng/mL,LPS脂多糖800ng/mL，胸腺肽500ng/mL，蜂 胶液10％体积)，按照1:9的比例和抗原混合，再以(免疫增强剂混合液+ 免疫原)：佐剂＝1：1，大大提高抗血清的效价，从而增加了获得高质量 抗体的机率，另外在免疫途径上也打破常规免疫，增加免疫途径，提高成 功率。
实施例2多克隆抗体的制备
(一)抗原的制备
1.TIMP1表位分析：按NCBI网站GeneBank数据库提供的人金属蛋 白酶抑制剂1基因序列，根据抗原表位软件DNAstar分析选择合适的目的 片段用于蛋白表达。
2.根据序列表所述序列设计引物，引物序列如下，在上下游引物的5′ 端分别插入BamHI和salI内切酶位点，运用PrimerPremier5.0和DNAMAN 软件对引物进行分析：
上游引物：ATGCGGATCCACCTGTGTCCCACCCCA
下游引物：ATGCGTCGACGGCTATCTGGGACCGC
3.提取EC109细胞总RNA，用随机引物反转录获得cDNA，以此cDNA 为模板，2所述的引物为引物进行PCR扩增获取目的基因，将目的基因回 收后连接转化到表达载体pET28a得到表达克隆，经测序分析表达克隆序 列正确以后，进行蛋白表达。
4.将上述获得的表达质粒，转化大肠杆菌BL21，获得人TIMP1表达 菌株。取表达菌株，振荡培养37℃，振荡培养至OD600≈0.6，加入IPTG 诱导，继续诱导培养3小时。
5.离心收集菌体。PBS清洗菌体后离心集菌体，用PBS，4℃超声破菌。 10000rpm离心，分别收集上清与沉淀，进行SDS-PAGE电泳，结果表明 hTIMP1以上清可溶形式存在。
6.镍离子亲和层析，咪唑梯度洗脱纯化hTIMP1蛋白。平衡缓冲为PBS。 结果表明目的蛋白hTIMP1主要集中于200mM咪唑洗脱峰，纯度大于90％。
(二)动物的免疫
购买6～8周龄Balb/c小鼠，将纯化的TIMP1蛋白用来免疫Balb/c小 白鼠，免疫原用量约50ug/只/次。首次免疫用弗氏完全佐剂乳化的抗原颈 背部皮下多点注射，首次免疫后间隔3周，以后每隔2周左右改用由等体 积的弗氏不完全佐剂乳化的免疫原进行第2、3次免疫，免疫剂量同首免。 三免之后眼静脉丛采血，测定抗血清效价。加强免疫不加佐剂，腹腔注射 50ug/只，3天后摘除小鼠眼球取血，收集血液。37℃放置约1h，4℃过夜， 离心，取上清，少量于4℃暂时储存备用。其余抗血清加等体积甘油，混 匀后于-20℃储存备用。
表2免疫小鼠的方法及剂量
经过大量的实验和数据支持，我们在免疫阶段加入了免疫增强剂混合 液(重组IL-6、200ng/mL,LPS脂多糖600ng/mL，胸腺肽400ng/mL，蜂胶 液10％体积)，按照1:9的比例和抗原混合，再以(免疫增强剂混合液+ 免疫原)：佐剂＝1：1，大大提高抗血清的效价，从而增加了获得高质量 抗体的机率，另外在免疫途径上也打破常规免疫，增加免疫途径，提高成 功率。
实施例3多克隆抗体的制备
(一)抗原的制备
1.TIMP1表位分析：按NCBI网站GeneBank数据库提供的人金属蛋 白酶抑制剂1基因序列，根据抗原表位软件DNAstar分析选择合适的目的 片段用于蛋白表达。
2.根据序列表所述序列设计引物，引物序列如下，在上下游引物的5′ 端分别插入BamHI和salI内切酶位点，运用PrimerPremier5.0和DNAMAN 软件对引物进行分析：
上游引物：ATGCGGATCCACCTGTGTCCCACCCCA
下游引物：ATGCGTCGACGGCTATCTGGGACCGC
3.提取EC109细胞总RNA，用随机引物反转录获得cDNA，以此cDNA 为模板，2所述的引物为引物进行PCR扩增获取目的基因，将目的基因回 收后连接转化到表达载体pET28a得到表达克隆，经测序分析表达克隆序 列正确以后，进行蛋白表达。
4.将上述获得的表达质粒，转化大肠杆菌BL21，获得人TIMP1表达 菌株。取表达菌株，振荡培养37℃，振荡培养至OD600≈0.6，加入IPTG 诱导，继续诱导培养3小时。
5.离心收集菌体。PBS清洗菌体后离心集菌体，用PBS，4℃超声破菌。 10000rpm离心，分别收集上清与沉淀，进行SDS-PAGE电泳，结果表明 hTIMP1以上清可溶形式存在。
6.镍离子亲和层析，咪唑梯度洗脱纯化hTIMP1蛋白。平衡缓冲为PBS。 结果表明目的蛋白hTIMP1主要集中于200mM咪唑洗脱峰，纯度大于90％。 (二)动物的免疫
购买6～8周龄Balb/c小鼠，将纯化的TIMP1蛋白用来免疫Balb/c小 白鼠，免疫原用量约50ug/只/次。首次免疫用弗氏完全佐剂乳化的抗原颈 背部皮下多点注射，首次免疫后间隔3周，以后每隔2周左右改用由等体 积的弗氏不完全佐剂乳化的免疫原进行第2、3次免疫，免疫剂量同首免。 三次免疫之后眼静脉丛采血，测定抗血清效价。加强免疫不加佐剂，腹腔 注射50ug/只，3天后摘除小鼠眼球取血，收集血液。37℃放置约1h，4℃ 过夜，离心，取上清，少量于4℃暂时储存备用。其余抗血清加等体积甘 油，混匀后于–20℃储存备用。
表3免疫小鼠的方法及剂量
经过大量的实验和数据支持，我们在免疫阶段加入了免疫增强剂混合 液(重组IL-6、800ng/mL,LPS脂多糖900ng/mL，胸腺肽600ng/mL，蜂 胶液10％体积)，按照1:9的比例和抗原混合，再以(免疫增强剂混合液+ 免疫原)：佐剂＝1：1，大大提高抗血清的效价，从而增加了获得高质量 抗体的机率，另外在免疫途径上也打破常规免疫，增加免疫途径，提高成 功率。
实施例4免疫效果的比较
对照设置为添加免疫增强剂(重组IL-6、500ng/mL,LPS脂多糖 800ng/mL，胸腺肽500ng/mL，蜂胶液10％体积)的佐剂组和未添加免疫 增强剂的佐剂实验组，其他免疫方法一致，比较两种免疫方法的抗体效价， 1～10号小鼠免疫时添加了免疫增强剂，11～20号小鼠免疫时未添加免疫增 强剂，采用免疫扩散方式来检测抗体效价。三次免疫的抗体效价检测见表 4-6。
表4首次免疫小鼠后的血清抗体效价
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 抗体效价(添加) 8 8 8 16 8 16 8 8 8 16 编号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 抗体效价(未加) 4 4 2 2 0 4 4 4 2 4
表5二次免疫小鼠后的血清抗体效价
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 抗体效价(添加) 32 32 16 8 16 16 8 16 8 16 编号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 抗体效价(未加) 8 8 4 4 4 2 8 4 4 4
表6第三次免疫小鼠后的血清抗体效价
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 抗体效价(添加) 16 16 32 64 32 32 16 32 32 32 编号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 抗体效价(未加) 8 4 8 8 8 4 4 4 4 4
由上述结果可以看出，添加了免疫增强剂剂的抗原在小鼠上免疫后， 产生的特异性抗体水平远远高于佐剂组产生的抗体水平。这体现了该免疫 增强剂潜在的实际应用价值。
实施例5免疫效果的比较
对照设置为添加免疫增强剂(重组IL-6、200ng/mL,LPS脂多糖 600ng/mL，胸腺肽400ng/mL，蜂胶液10％体积)的佐剂组和未添加免疫 增强剂的佐剂实验组，其他免疫方法一致，比较两种免疫方法的抗体效价， 1～10号小鼠免疫时添加了免疫增强剂，11～20号小鼠免疫时未添加免疫增 强剂，采用免疫扩散方式来检测抗体效价。三次免疫的抗体效价见表7-9。
表7首次免疫小鼠后的血清抗体效价
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 抗体效价(添加) 4 8 8 16 4 16 8 8 8 4 编号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 抗体效价(未加) 4 4 2 2 0 4 4 4 2 4
表8第二次免疫小鼠后的血清抗体效价
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 抗体效价(添加) 16 32 8 8 16 16 8 16 8 8 编号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 抗体效价(未加) 8 8 4 4 4 2 8 4 4 4
表9第三次免疫小鼠后的血清抗体效价
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 抗体效价(添加) 16 16 32 32 16 32 16 32 16 32 编号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 抗体效价(未加) 8 4 8 8 8 4 4 4 4 4
由上述结果可以看出，添加了免疫增强剂剂的抗原在小鼠上免疫后， 产生的特异性抗体水平远远高于佐剂组产生的抗体水平。这体现了该免疫 增强剂潜在的实际应用价值。
实施例6免疫效果的比较
对照设置为添加免疫增强剂(重组IL-6、800ng/mL,LPS脂多糖 900ng/mL，胸腺肽600ng/mL，蜂胶液10％体积)的佐剂组和添加未免疫 增强剂的佐剂实验组，其他免疫方法一致，比较两种免疫方法的抗体效价， 1～10号小鼠免疫时添加了免疫增强剂，11～20号小鼠免疫时未添加免疫增 强剂，采用免疫扩散方式来检测抗体效价。三次免疫的抗体效价见表 10～12。
表10首次免疫小鼠后的血清抗体效价
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 抗体效价(添加) 8 4 8 4 8 16 8 8 8 4 编号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 抗体效价(未加) 4 4 2 2 0 4 4 4 2 4
表11第二次免疫小鼠后的血清抗体效价
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 抗体效价(添加) 32 8 16 8 16 16 8 16 8 8 编号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 抗体效价(未加) 8 8 4 4 4 2 8 4 4 4
表12第三次免疫小鼠后的血清抗体效价
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 抗体效价(添加) 16 16 32 32 16 32 16 32 16 32 编号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 抗体效价(未加) 8 4 8 8 8 4 4 4 4 4
由上述结果可以看出，添加了免疫增强剂剂的抗原在小鼠上免疫后， 产生的特异性抗体水平远远高于佐剂组产生的抗体水平。这体现了该免疫 增强剂潜在的实际应用价值。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术实施方案而 非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域技术人员 应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本 发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围当中。