蟾毒它灵在制备治疗颅内肿瘤药物中的应用.pdf

《蟾毒它灵在制备治疗颅内肿瘤药物中的应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蟾毒它灵在制备治疗颅内肿瘤药物中的应用.pdf（7页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)授权公告号 CN 102204919 B (45)授权公告日 2013.04.10 CN 102204919 B *CN102204919B* (21)申请号 201010136041.5 (22)申请日 2010.03.30 A61K 31/585(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 上海现代药物制剂工程研究中心 有限公司 地址 201203 上海市浦东新区张江高科技园 区哈雷路 1111 号 (72)发明人 侯惠民 于垂亮 (74)专利代理机构 上海光华专利事务所 31219 代理人 冯珺 CN 101176739 A,2008.05.14,。

2、 CN 101485666 A,2009.07.22, CN 1072183 A,1993.05.19, CN 101016326 A,2007.08.15, 张英等 . 蟾酥和蟾皮活性成分研究 .中国 优秀硕士学位论文全文数据库 - 医药卫生科技 辑 .2007,E057-71. (54) 发明名称 蟾毒它灵在制备治疗颅内肿瘤药物中的应用 (57) 摘要 本发明公开了蟾毒它灵在制备治疗颅内肿瘤 药物中的应用， 蟾毒它灵体外抗肿瘤实验证明， 蟾 毒它灵对人胶质瘤及其它颅内肿瘤细胞株具有较 强的抑制活性， IC50在 50 200ng/ml， 并且具有 较好的量效关系。实验结果显示蟾毒它灵的抑制。

3、 肿瘤生长效果优于临床现在应用的药物。动物给 药后， 测其体内药物分布发现， 脑内药物浓度均高 于起效药物浓度， 具有很大开发应用前景。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 樊婵娟 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 1/1 页 2 1. 蟾毒它灵在制备治疗颅内肿瘤药物中的应用 ； 所述颅内肿瘤为脑胶质瘤。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述药物包括治疗有效量的蟾毒它灵和 医药学上可接受的载体。 3. 根据权利要求 2 所述的应用， 其特征在于， 所述药物为注射剂、 。

4、颗粒剂、 胶囊、 膏剂、 霜剂、 透皮贴剂或其他口服剂。 权 利 要 求 书 CN 102204919 B 2 1/5 页 3 蟾毒它灵在制备治疗颅内肿瘤药物中的应用 技术领域 0001 本发明涉及蟾毒它灵及其组合物的新用途， 具体是涉及蟾毒它灵及其组合物在制 备治疗颅内肿瘤药物中的应用。 背景技术 0002 颅内肿瘤又称脑肿瘤， 是临床常见疾病， 一般分为原发和继发两大类。 原发性颅内 肿瘤可发生于脑组织、 脑膜、 颅神经、 垂体、 血管残余胚胎组织等。继发性肿瘤指身体其它 部位的恶性肿瘤转移或侵入颅内形成的转移瘤。脑肿瘤每年的发病率在我国为 4-10 万， 近年来， 颅内肿瘤发病率呈上升趋。

5、势， 据统计， 颅内肿瘤约占全身肿瘤的 5， 占儿童肿瘤的 70， 而其它恶性肿瘤最终会有 20-30转入颅内， 由于其膨胀的浸润性生长， 在颅内一旦 占据一定空间时， 不论其性质是良性还是恶性， 都势必使颅内压升高， 压迫脑组织， 导致中 枢神经损害， 危及患者生命。颅内肿瘤可发生于任何年龄， 以 20-50 岁为最多见。少儿以颅 后窝及中线肿瘤较多见， 主要为髓母细胞瘤， 颅咽管瘤及室管膜瘤。 成人以大脑半球胶质瘤 为最多见， 如星形细胞瘤、 胶质母细胞瘤、 室管膜瘤等， 其次为脑膜瘤、 垂体瘤及颅咽管瘤、 神经纤维瘤、 海绵状血管瘤、 胆脂瘤等。 0003 目前， 国内外对颅内肿瘤的治疗。

6、多采用手术、 化疗、 放疗、 X 刀、 刀等， 但大多难 以治愈。恶性肿瘤病程短， 发展快， 根据恶性程度高低手术切除的多少或放化疗的敏感度， 复发有早有晚， 生长在脑干、 丘脑等重要部位的肿瘤难以手术或不能手术 ； X 刀、 放射等治 疗后的肿瘤可有缩小或短时间内控制增长， 以后瘤体不再生长、 复发。 生长在脑干等重要部 位的脑瘤手术只能部分或大部分切除， 手术后瘤体还会再复发、 再生长。 颅内恶性肿瘤手术 后放、 化疗平均存活率不足一年。 偏良性的胶质瘤， 垂体瘤、 颅咽管瘤、 胆脂瘤等颅内良性肿 瘤手术不易切除干净， 刀、 X 刀、 放射治疗并不可能彻底杀死肿瘤， 因此大部分患者手术 后。

7、仍然会再复发。除此之外作为化疗手段， 现有的化疗药物因多数不能有效通过血脑屏障 (BloodBrain Barrier， BBB)， 因此也就不能有效发挥治疗颅内肿瘤的作用。 0004 中药蟾酥及蟾酥类制剂在临床中用于治疗肿瘤多有报道， 主要报道用于治疗肺 癌、 肝癌、 消化道肿瘤、 白血病、 宫颈癌及阴茎癌、 乳腺癌及皮肤癌等。对蟾酥的活性成分的 研究也十分广泛， 但大部分研究局限于蟾毒灵、 脂蟾毒配基、 华蟾素毒基等。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是公开蟾毒它灵在制备治疗颅内肿瘤药物中的应用， 以满足临床应用的需要。 0006 蟾毒它灵， 是从中药蟾酥或蟾皮以及蟾蜍分泌物中。

8、提取分离得到的一种化合物， 其结构式为 ： 0007 说 明 书 CN 102204919 B 3 2/5 页 4 0008 所述蟾毒它灵可采用文献报道的方法进行制备 ( 杨秀伟等， 华蟾毒精和羟基华蟾 毒精的人肠内细菌代谢研究 J. 北京大学学报 ( 医学版 )， 2001， 33(3) ： 199-204. ； 张英 等 . 中华大蟾蜍皮的化学成分 J. 沈阳药科大学学报， 2007， 24(8) ： 484-487.)， 或者可采 用商业化的产品， 如 J&K CHEMICAL LTD. 公司提供 CAS 号为 471-95-4 的产品。 0009 发明人发现， 蟾毒它灵体外具有很好的抑。

9、制脑肿瘤细胞生长的活性， 动物给药研 究发现， 蟾毒它灵可以很好透过血脑屏障， 并且脑内药物浓度高于有效药物浓度数倍， 因此 可将蟾毒灵及其组合物作为活性成分用以制备治疗脑部肿瘤药物。 0010 可以以组合物的形成， 通过口服、 静脉注射或者是透皮渗透方式， 施加于需要治疗 的患者， 剂量一般为 0.05 3mg/ 天 /Kg， 具体可根据病人的病情、 年龄等， 由医师决定 ； 0011 所述组合物， 包括治疗有效量的蟾毒它灵和医药学上可接受的载体， 所述载体包 括稀释剂、 赋形剂如水等， 填充剂， 如淀粉、 蔗糖等， 粘合剂， 如纤维素衍生物明胶、 聚乙烯吡 咯烷酮等， 润滑剂， 如滑石粉等。

10、。 0012 含有蟾毒它灵的组合物中， 蟾毒它灵的重量含量为 0.01 99.9 ； 优选的重量 含量为 0.1 99.0。 0013 可采用本领域公知的方法， 将含有蟾毒它灵的组合物， 制备成为粉针剂、 颗粒剂、 胶囊、 膏剂、 霜剂、 透皮贴剂或其他口服剂。 0014 蟾毒它灵体外抗肿瘤实验证明， 蟾毒它灵对人胶质瘤及其它颅内肿瘤细胞株具有 较强的抑制活性， IC50在 50 200ng/ml， 并且具有较好的量效关系。实验结果显示蟾毒它 灵的抑制肿瘤生长效果优于临床现在应用的药物。动物脑内药物浓度均高于起效药物浓 度， 具有很大开发应用前景。 具体实施方式 0015 实施例 1 0016。

11、 化合物蟾毒它灵的分离精制 0017 将蟾酥药材敲碎后利用粉碎机打成细小颗粒， 称取300g置于5L圆底烧瓶中， 加入 3L体积浓度为95的乙醇， 水浴加热回流6h， 提取液过滤 ； 药渣再加5L体积浓度为95的 乙醇同上操作， 共提取 3 次， 合并全部滤液在 55水浴旋转浓缩至约 250ml 时， 转移至大梨 型瓶中再加入 500ml 纯水， 加入 500ml 氯仿， 盖塞振摇并超声 2h， 放置过夜分层， 分取氯仿 层 ； 剩余水层再加入氯仿同上操作， 共萃取多次。合并全部氯仿层减压浓缩至干， 得固体。 0018 取氯仿萃取物， 用适量氯仿溶解后加薄层层析硅胶 G 拌样， 用硅胶 H 上。

12、柱， 用石油 醚和乙酸乙脂梯度洗脱层析分离， 得到多个流份。将含有蟾毒它灵的流份以体积浓度 55 说 明 书 CN 102204919 B 4 3/5 页 5 的甲醇为流动相进行分离收集相应组分并浓缩至干， 即可获得蟾毒它灵纯品。 0019 实施例 2 0020 配制蟾毒它灵注射液 ： 0021 配方 ： ( 以重量比例计 ) 0022 蟾毒它灵 1-10 份， 0023 药用级乙醇 5 100 份 0024 Cremophor EL 5 100 份 . 0025 维生素 C 0.001 2 份 . 0026 采用公知的方法， 配制成为注射液。 0027 实施例 3 0028 片剂 ： ( 以。

13、重量比例计 ) 0029 蟾毒它灵 1-10 份 0030 淀粉 5-100 份 0031 羟丙甲纤维素 0.1-10 份 0032 微粉硅胶 0.01-0.5 份 0033 硬脂酸镁 0.01-0.5 份 0034 采用公知的方法， 制备成为片剂。 0035 实施例 4 0036 蟾毒它灵对人脑胶质瘤 U-251 的抑制作用 0037 采用文献(黄银久， 等SRB法和MTT法抗肿瘤药物筛选结果相关性研究.生物 学杂志 (04) ： 13-16.) 报道相同的 SRB 法， 对人脑胶质瘤 U-251 进行体外抑制活性测试。 0038 人脑胶质瘤 U-251 细胞株由中国科学院上海细胞库提供。 。

14、0039 蟾毒它灵由 J&K CHEMICAL LTD 提供。 0040 试验药物 ： 将蟾毒它灵溶解在甲醇或 DMSO 中配制成不同浓度的溶液， 其中， 蟾毒 它灵由 J&K CHEMICAL LTD 提供。将不同浓度的药物分别加样测其对人脑胶质瘤 U-251 细 胞生长的抑制活性， 加样量不超过 1。试验结果见表 1。 0041 采用 SRB 法， 对人脑胶质瘤 U-251 进行体外抑制活性测试。实验结果显示蟾毒它 灵对人脑胶质瘤U-251具有较强的抑制作用， 呈现了较好的量效关系， 其IC50在0.1g/ml。 0042 表 1 对人脑胶质瘤 U-251 细胞生长的抑制率 0043 00。

15、44 实施例 5 0045 蟾毒它灵及其组合物对原代人脑胶质瘤细胞的体外活性测定 0046 方法和材料 ： 手术中即刻获得的新鲜人脑胶质瘤样本 ( 复旦大学附属华山医院 神经外科提供 ) 直径 1cm 左右， 置入 RMPI1640 培养液中， 立即送实验室， 用不含血清的 说 明 书 CN 102204919 B 5 4/5 页 6 RPM11640 培养液冲洗干净， 去掉血污， 剪切成 1mm3大小的小块， 再用无血清的培养液洗涤 2 3 次， 至液体澄清。弃去培养液， 加入温热的无菌滤过的 0.4胶原酶溶液 ( 含 0.4 胶原酶 )， 37孵育 1 小时。上述溶液加入 ZO-MEM， 。

16、10 FBS， 0.05mg/ml 庆大霉素使胶原酶 失活。离心 (1000rpm， 5 分钟 )， 弃去上清， 细胞重新悬浮于含 10 FBS 培养液中， 调节细胞 浓度至 0.1x105/ml， 接种 96 孔板， 每孔 100l( 第一列为无细胞空白对照 )， 剩余细胞接种 至 25cm2培养瓶， 上述样本均置于 5 CO2， 37孵育。24h 后， 取出 96 孔板， 自第三列起， 按 照 0.003、 0.01、 0.03、 0.1、 0.3、 1、 3g/ml 的终浓度， 分别向各列孔中添加化合物蟾毒它灵 溶液 ( 事先已溶解于 1640 培养液中 )， 重复 4 行， 96 孔板。

17、再次放入 5 CO2， 37全湿孵育 44h 后取出。采用 XXT 法 ( 该方法文献吴楠等， XTT 比色法测定细胞生长曲线 .华北 国防医药(04) ： 7-8. ； 吴楠XTT比色法在细胞活性检测中的应用.国外医学(临床生物 化学与检验学分册 )(05) ： 204-206. 等有报道 ) 进行细胞测试， 每孔加入 50lXTT-PMS 溶 液 ( 内含 XTT50g， PMS0.38g)， 37全湿孵育 4h 后取出， 放入酶标仪进行双波长 OD 测 定 ( 波长分别为 450nm 和 630nm)， 结果如下 ： 0047 表 2 蟾毒它灵作用于原代人脑胶质瘤细胞的体外活性测定结果 。

18、0048 0049 实施例 6 0050 蟾毒它灵及其组合物在颅内药物浓度测定 0051 采用 HPLC 分析方法， 采用 C18 5m 2504.6mm 色谱柱， 以 0.5 KH2PO4- 乙腈 ( 用磷酸调 pH 值至 3.0)(60 40) 作为流动相， 流速 1.0ml/min， 检测波长 ： UV296nm， 柱温 ： 40。 0052 将蟾毒它灵配制成 1mg/ml 的注射液， 取小鼠， 准确称重后， 以每 28 分钟输入 4mg/ kg 的剂量进行小鼠尾静脉恒速注射。于注射结束后迅速脱臼处死小鼠， 取出颅内组织， 纯 水洗后吸干， 用剪刀剪碎后放入 10ml 具塞玻璃离心管中并。

19、精密称定重量， 加入乙酸乙脂 3.0ml， 涡旋振荡 2min， 超声 20min， 3000R/min 离心 10min， 顷出上层 ( 其中血浆放入 -20 冰箱， 待下部结冰固化后再顷出上层 ) 吹干后， 各加入 100l 甲醇溶解， 静置， 取上清液 说 明 书 CN 102204919 B 6 5/5 页 7 20l 进行 HPLC 分析。分析结果见表 3。 0053 表 3 恒速输注小鼠 (4mg/kg28min) 脑组织中蟾毒它灵分布结果 ( 单位 ： g/g) 0054 0055 经分析研究发现小鼠脑内组织药物浓度可以达到 0.75730.1073g/g， 远远高 于药物起效的有效浓度， 显示了很强的穿透血脑屏障的能力。 0056 蟾毒它灵及含有蟾毒它灵的组合物可以很好穿过血脑屏障， 并能在稳态状况下达 到有效药物浓度之上， 而且具有很高的对颅内肿瘤组织的生长抑制活性， 因此具有很大的 开发成治疗颅内肿瘤药物的前景。 说 明 书 CN 102204919 B 7 。