一种表面介导基因治疗型人工晶状体及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510205350.6 (22)申请日 2015.04.28 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104825249 A (43)申请公布日 2015.08.12 (73)专利权人 温州医科大学 地址 325000 浙江省温州市瓯海经济开发 区东方南路38号006信箱 (72)发明人 林全愧 陈浩 (74)专利代理机构 温州金瓯专利事务所(普通 合伙) 33237 代理人 林岩龙 (51)Int.Cl. A61F 2/16(2006.01) (56)对比文件 W。

2、O 2012/115182 A1,2012.08.30, CN 102988965 A,2013.03.27, CN 103773764 A,2014.05.07, 审查员 万励之 (54)发明名称 一种表面介导基因治疗型人工晶状体及其 制备方法 (57)摘要 一种表面介导基因治疗型人工晶状体及其 制备方法。 本发明中， 在所述人工晶状体表面固 定有含功能基因的质粒DNA或负载含功能基因质 粒DNA的非病毒基因载体。 本发明的优点是通过 表面基因修饰方法获得表面介导的基因治疗载 体， 从而通过表面介导的基因治疗方法抑制晶状 体上皮细胞增殖、 转分化， 得到可有效抑制后发 性白内障的人工晶状体。。

3、 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 104825249 B 2017.11.07 CN 104825249 B 1.一种表面介导基因治疗型人工晶状体， 其特征在于： 所述的人工晶状体的表面化学 接枝有含功能基因的质粒DNA或负载含功能基因质粒DNA的非病毒基因载体， 所述的含功能 基因的质粒DNA为表达绿荧光蛋白GFP的模型质粒DNA、 表达诱导细胞凋亡的p53蛋白的质粒 DNA或表达MicroRNA前体的质粒DNA中的一种， 所述的人工晶状体通过以下步骤制备: （1） 取干净的人工晶状体， 并通过表面预处理获得化学活性表面， 所述的化学活性表面为： 硅烷 偶联剂或聚乙烯亚胺吸附处理。

4、获得的胺基化表面， NaOH或KOH碱溶液浸泡处理的羧基化表 面中的一种； （2） 将步骤 （1） 处理后的人工晶状体采用化学接枝含功能基因的质粒DNA或负载含功 能基因质粒DNA的基因载体， 获得表面基因或非病毒基因载体修饰的人工晶状体， 所述的化 学接枝方法为羧基与胺基或胺基与胺基的偶联反应。 2.根据权利要求1所述的一种表面介导基因治疗型人工晶状体， 其特征在于： 所述的负 载含功能基因的质粒DNA的非病毒基因载体为脂质体、 壳聚糖、 聚赖氨酸、 聚精氨酸、 聚乙烯 亚胺或聚酰胺类树状聚合物中的一种。 3.一种如权利要求1所述的表面介导基因治疗型人工晶状体的制备方法， 其特征在于： 包括。

5、以下工艺步骤： （1） 取干净的人工晶状体， 并通过表面预处理获得化学活性表面， 所述的化学活性表 面为： 硅烷偶联剂或聚乙烯亚胺吸附处理获得的胺基化表面， NaOH或KOH碱溶液浸泡处理 的羧基化表面中的一种； （2） 将步骤 （1） 处理后的人工晶状体采用化学接枝含功能基因的质粒DNA或负载含功 能基因质粒DNA的基因载体， 获得表面基因或非病毒基因载体修饰的人工晶状体， 所述的化 学接枝方法为羧基与胺基或胺基与胺基的偶联反应。 4.根据权利要求3所述的一种表面介导基因治疗型人工晶状体的制备方法， 其特征在 于： 所述的人工晶状体为硬性人工晶状体或软性可折叠人工晶状体。 5.根据权利要求4。

6、所述的一种表面介导基因治疗型人工晶状体的制备方法， 其特征在 于： 所述的硬性人工晶状体的制备材料为聚甲基丙烯酸甲酯， 所述的软性可折叠人工晶状 体的制备材料为硅橡胶或聚甲基丙烯酸羟乙酯水凝胶。 6.根据权利要求3所述的一种表面介导基因治疗型人工晶状体的制备方法， 其特征在 于： 所述含功能基因的质粒DNA为表达绿荧光蛋白GFP的模型质粒DNA、 表达诱导细胞凋亡的 p53蛋白的质粒DNA或表达MicroRNA前体的质粒DNA中的一种。 7.根据权利要求3所述的一种表面介导基因治疗型人工晶状体的制备方法， 其特征在 于： 所述负载含功能基因的质粒DNA的非病毒基因载体为脂质体、 壳聚糖、 聚赖。

7、氨酸、 聚精氨 酸、 聚乙烯亚胺或聚酰胺类树状聚合物中的一种。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104825249 B 2 一种表面介导基因治疗型人工晶状体及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及医用植入材料及器械表面修饰领域， 具体涉及一种表面介导基因治疗 型人工晶状体及其制备方法。 本发明的人工晶状体的表面上固定有能功能基因， 能表达细 胞凋亡蛋白和/或干扰细胞增殖的MicroRNA， 能抑制晶状体上皮细胞增殖或诱导晶状体上 皮细胞凋亡， 防止后发性白内障发生。 背景技术 0002 白内障是我国首位致盲眼病。 目前临床治疗主要采用超声乳化晶状体囊外摘除联 合人工晶状体植入术。。

8、 然而目前广泛使用的各类人工晶状体在植入后人眼后常面临后发性 白内障高发生的问题。 后发性白内障， 即， 人工晶状体植入后晶状体囊膜再次混浊， 是人工 晶状体植入术后严重影响患者视力恢复的主要并发症。 后发性白内障不仅严重影响术后的 视力恢复， 而且需要二次手术， 增加病人的经济负担。 因此， 能有效防治后发性白内障的人 工晶状体具有重要的临床应用前景。 0003 现有研究认为： 超声乳化手术过程中对晶状体表层晶状体上皮细胞的破坏刺激及 不完全去除， 使其在术后人工晶状体材料表面粘附、 增殖和转分化是导致晶状体囊膜再次 发生浑浊的主要原因。 为降低人工晶状体植入后后发性白内障的发生， 通常通过。

9、人工晶状 体材料表面改性降低晶状体上皮细胞粘附， 或通过药物方法阻断晶状体上皮细胞增殖或转 分化， 并已有相关专利。 如中国专利CN103405807 A “一种表面梳状聚合物亲水改性的人工 晶状体及其制备方法” ， 通过人工晶状体材料表面的修饰， 获得亲水性表面， 抑制晶状体上 皮细胞粘附， 从而降低后发性白内障的发生； 中国专利CN101036804A “纳米氟尿嘧啶涂层人 工晶体及其制备方法” ， 中国专利CN101053680A “防止后发障形成的具抗增殖药涂层的人工 晶体” ， 中国专利CN2531755Y “缓释剂携带型人工晶体” ， 中国专利CN200973766Y “防止后发 。

10、性白内障的人工晶状体” 及中国专利CN200810061511 “表面抗转化生长因子 2抗体膜的人 工晶状体” 等， 均是在人工晶状体表面或赤道部外侧或袢等部位负载抗增殖类化学药物或 抗体药物来达到抑制晶状体上皮细胞增殖的目的。 0004 通过这些抗增殖药物注射或药物涂层方法， 能较好的抑制晶状体上皮细胞增殖或 转分化， 但是难以避免抗增类药物渗透至房水或眼部其他组织， 从而造成眼部其他组织的 损伤。 发明内容 0005 为解决上述技术问题， 本发明的目的是通过人工晶状体材料表面修饰功能基因或 基因载体， 在人工晶状体表面原位负载非病毒型基因载体， 通过基因转染的方法， 人工晶状 体植入后原位。

11、诱导晶状体上皮细胞凋亡， 从而降低后发性白内障的发生率。 0006 本发明采用如下技术方案： 一种表面介导基因治疗型人工晶状体， 所述的人工晶 状体的表面修饰有含功能基因的质粒DNA或负载含功能基因质粒DNA的非病毒基因载体。 0007 所述的一种表面介导基因治疗型人工晶状体， 所述的含功能基因的质粒DNA为表 说 明 书 1/4 页 3 CN 104825249 B 3 达绿荧光蛋白GFP的模型质粒DNA、 表达诱导细胞凋亡的p53蛋白的质粒DNA或表达MicroRNA 前体的质粒DNA中的一种。 0008 所述的一种表面介导基因治疗型人工晶状体， 所述的负载含功能基因的质粒DNA 的非病毒。

12、基因载体为脂质体、 壳聚糖、 聚赖氨酸、 聚精氨酸、 聚乙烯亚胺或聚酰胺类树状聚 合物中的一种。 0009 一种所述的表面介导基因治疗型人工晶状体的制备方法， 包括以下工艺步骤： 0010 （1） 取干净的人工晶状体， 并通过表面预处理获得化学活性表面； 0011 （2） 将步骤 （1） 处理后的人工晶状体采用物理静电吸附或化学接枝含功能基因的 质粒DNA或负载含功能基因质粒DNA的基因载体， 获得表面基因或非病毒基因载体修饰的人 工晶状体。 0012 所述的一种表面介导基因治疗型人工晶状体的制备方法， 所述的人工晶状体为硬 性人工晶状体或软性可折叠人工晶状体。 0013 所述的一种表面介导基。

13、因治疗型人工晶状体的制备方法， 所述的硬性人工晶状体 的制备材料为聚甲基丙烯酸甲酯， 所述的软性可折叠人工晶状体的制备材料为硅橡胶或聚 甲基丙烯酸羟乙酯水凝胶。 0014 所述的一种表面介导基因治疗型人工晶状体的制备方法， 所述的化学活性表面 为： 硅烷偶联剂或聚乙烯亚胺吸附处理获得的胺基化表面， NaOH或KOH碱溶液浸泡处理的 羧基化表面。 0015 所述的一种表面介导基因治疗型人工晶状体的制备方法， 所述的化学接枝方法为 羧基与胺基或胺基与胺基的偶联反应。 0016 所述的一种表面介导基因治疗型人工晶状体的制备方法， 所述含功能基因的质粒 DNA为表达绿荧光蛋白GFP的模型质粒DNA、 。

14、表达诱导细胞凋亡的p53蛋白的质粒DNA或表达 MicroRNA前体的质粒DNA中的一种。 0017 所述的一种表面介导基因治疗型人工晶状体的制备方法， 所述负载含功能基因的 质粒DNA的非病毒基因载体为脂质体、 壳聚糖、 聚赖氨酸、 聚精氨酸、 聚乙烯亚胺或聚酰胺类 树状聚合物中的一种。 0018 本发明的原理是： 人工晶状体植入后面临的后发性白内障高发生的临床问题， 其 主要的原因是手术过程中在晶状体囊袋内残留的晶状体上皮细胞在人工晶状体材料表面 及囊膜上的粘附、 增殖和转分化。 因此， 目前常用的减少后发性白内障的发生方法是通过人 工晶状体材料表面改性降低晶状体上皮细胞粘附， 或通过抗增。

15、殖药物或生长因子受体抑制 剂等的应用来实现抑制晶状体上皮细胞增殖或转分化的目的。 然而抗增殖药物的应用不可 避免造成眼部其他组织的损伤。 表面介导的基因治疗提供了一种更为便捷的抑制后发性白 内障的手段。 基因治疗的广义概念是把某些遗传物质转移到患者体内， 使其在体内表达， 最 终达到治疗某种疾病的方法。 其要目的是将基因材料成功地传递到靶组织， 并通过基因的 转录和翻译， 表达功能性蛋白质， 最终达到治疗疾病的目的。 通过在材料表面负载凋亡基因 或细胞增殖抑制基因等功能基因， 可以达到诱导晶状体上皮细胞凋亡、 抑制晶状体上皮细 胞增殖或转分化的目的。 本发明通过表面修饰方法将功能基因或含有功能。

16、基因的非病毒载 体修饰于人工晶状体材料表面， 利用表面介导的基因治疗方法。 通过表面功能基因对晶状 体上皮细胞的转染， 而非注射抗增殖药物， 获得对晶状体上皮细胞的增殖抑制或诱导凋亡， 说 明 书 2/4 页 4 CN 104825249 B 4 实现对后发性白内障进行原位治疗。 0019 本发明的有益效果是： 本发明提供了一种表面介导基因治疗型人工晶状体及其制 备方法， 通过在人工晶状体表面通过表面修饰方法构建了一层功能基因或含功能基因的非 病毒载体修饰层， 达到抑制晶状体上皮细胞增殖或诱导晶状体上皮细胞凋亡的效果， 从而 可降低后发性白内障的发生率， 避免了药物注射或药物涂层人工晶状体应用。

17、中存在的对非 靶向细胞的毒副作用， 采用表面修饰方法构建可抑制后发性白内障的修饰层， 制造工艺简 单， 成本低廉， 可使用于各种复杂体型结构的三维植入器械表面。 附图说明 0020 图1为人工晶状体材料表面构建功能基因涂层或含功能基因的非病毒载体涂层的 过程示意图。 0021 图2为阳离子性聚电解质与功能基因DNA分子间静电缔合制备纳米微球型非病毒 基因载体的原理图。 0022 图3为阳离子性聚电解质与功能基因DNA分子间静电缔合制备纳米微球型非病毒 基因载体的过程示意图。 0023 图4为人工晶状体材料表面晶状体上皮细胞培养3天后的明场照片。 0024 图5为人工晶状体材料表面晶状体上皮细胞。

18、培养3天后的荧光照片。 具体实施方式 0025 下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。 0026 实施例1 0027 首先， 取干净的人工晶状体， 并通过含胺基官能团的的表面活化剂表面处理使其 表面带上胺基基团： 选择聚甲基丙烯酸甲酯硬性人工晶状体， 浸没到3mg/mL 的聚乙烯亚胺 溶液中， 作用6小时， 人工晶状体材料表面吸附一层聚乙烯亚胺层， 水清洗， 氮气吹干备用。 随后将表面胺基活化的人工晶状体浸没到100 g/mL含编码p53蛋白基因的质粒DNA溶液， 通 过静电吸附使人工晶状体材料表面吸附一层质粒DNA层， 如示意图1所示。 0028 实施例2 0029 阳离子性。

19、聚电解质溶液和含功能基因片段的质粒DNA溶液相互混合， 制备静电缔 合型纳米基因载体， 制备原理如图2所示。 本实施例选用阳离子性聚电解质壳聚糖和含编码 p53蛋白的功能基因片段的质粒DNA为例。 取50mg壳聚糖 （以下缩写为CHI） 溶解于50mL醋酸 缓冲溶液 （pH=5.5） 中， 充分溶解后， 利用220 m的微孔滤膜过滤不溶物； 另取10mL浓度为100 g/mL含编码绿荧光蛋白基因的质粒DNA （以下缩写为pDNA） 溶液， 与10mL上述CHI溶液互相 混合， 涡旋振荡器涡旋振荡30秒， 室温下静置30分钟， 制备得到含功能基因的非病毒载体 CHI-pDNA纳米缔合物溶液， 制。

20、备过程如图3所示。 0030 实施例3 0031 首先， 取干净的人工晶状体， 并通过含胺基官能团的表面活化剂表面处理使其表 面带上胺基基团： 选择聚甲基丙烯酸甲酯硬性人工晶状体， 浸没到3mg/mL 的聚乙烯亚胺溶 液中， 作用6小时， 人工晶状体材料表面吸附一层聚乙烯亚胺层， 水清洗， 氮气吹干备用。 随 后将表面胺基活化的人工晶状体浸没到1mg/mL的阴离子性的聚电解质肝素 （以下缩写为 说 明 书 3/4 页 5 CN 104825249 B 5 HEP） 溶液中， 静电吸附30分钟， 人工晶状体材料表面吸附一层带负电荷的肝素； 随后将人工 晶状体浸没到实施例1所制备得到的含功能基因的。

21、非病毒载体CHI-pDNA纳米缔合物溶液30 分钟， 人工晶状体表面吸附一层带正电荷的CHI-pDNA纳米缔合物； 随后人工晶状体交替浸 没到肝素溶液和CHI-pDNA纳米缔合物溶液， 得到多层结构的 （HEP/CHI-pDNA） 表面基因载体 涂层。 本实施例制备的表面基因载体涂层 （HEP/CHI-pDNA） 为5个双层， 即得到(HEP/CHI- pDNA)5基因载体多层膜修饰的人工晶状体。 0032 本实施例制备的(HEP/CHI-pDNA)5基因载体多层膜修饰的人工晶状体进行细胞转 染试验。 利用常规的细胞培养方法将晶状体上皮细胞种植到(HEP/CHI-pDNA)5基因载体多 层膜修。

22、饰的人工晶状体材料表面。 细胞初始种植密度为5000个细胞每/孔， 在常规条件下培 养3天， 用荧光显微镜观察细胞内部绿荧光蛋白表达水平。 0033 实施例4 0034 首先， 取干净的聚甲基丙烯酸羟乙酯软性人工晶状体人工晶状体， 浸没到1 mol/L 的KOH溶液， 水解3小时， 人工晶状体材料表面的酯键水解使表面带上羧基， 随后将表面羧基 化的人工晶状体浸没到含有2mg/mL水溶性碳二亚胺(EDC)、 4mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺 （NHS)及按实施例2方法制备得到的聚赖氨酸-含功能基因的质粒DNA纳米缔合物 （PLL- pDNA） 混合溶液中， 室温持续搅拌3小时。 PLL-pDNA。

23、纳米缔合物表面的胺基和和材料表面的 羧基利用EDC/NHS偶联作用接枝到材料表面， 获得表面负载功能基因的非病毒载体的人工 晶状体。 0035 通过表面预处理及随后功能基因或含功能基因非病毒载体表面修饰方法在人工 晶状体材料表面上构建含功能基因的表面修饰层， 过程如图1所示。 其中， 含功能基因的非 病毒载体制备原理及过程如图2和图3所示。 图4和图5分别为人工晶状体材料表面晶状体上 皮细胞培养3天后的明场照片和荧光照片， 显示了表面含绿荧光蛋白基因的非病毒载体涂 层修饰的人工晶状体材料表面能够对晶状体上皮细胞进行转让并表达绿荧光蛋白。 通过表 面预处理及功能基因或含功能基因的非病毒载体进行对。

24、人工晶状体表面修饰， 将各种含功 能基因或含功能基因的非病毒载体负载到人工晶状体表面， 可实现对其表面的晶状体上皮 细胞的基因转染并表达功能蛋白， 对后发性白内障具有潜在良好的基因治疗作用。 0036 具体实施方式只用于对本发明进行进一步说明， 不能作为对本发明保护范围的限 定， 同时该领域的技术人员根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整， 都位于本发明的保护范围内， 本发明的保护范围以权利要求书为准。 说 明 书 4/4 页 6 CN 104825249 B 6 图1 图2 图3 说 明 书 附 图 1/2 页 7 CN 104825249 B 7 图4 图5 说 明 书 附 图 2/2 页 8 CN 104825249 B 8 。