技术领域
本发明涉及纳米药物领域，涉及一种抗肿瘤多肽纳米药物及其制备方法和 应用。
背景技术
近年来抗肿瘤多肽类药物的研发备受关注。与抗体和小分子药物相比，多 肽药物免疫原性低、受体结合率高、制备成本低且易于改造和联合应用，但它 最大的缺点是体内半衰期短，易被蛋白酶降解和肝肾等脏器代谢。因此，改善 多肽的药代动力学而不降低其疗效是多肽药物研发的重要方向。
纳米药物是新兴的药物剂型，通过设计和调控有机或无机材料的纳米特性， 制备结构稳定、功能多样和生物相容性好的纳米载体，可显著延长药物半衰期、 提高靶向性、降低用药剂量并实现联合用药。通过合理调控多肽的分子结构和 改变外界环境，某些多肽分子间或多肽分子中某一片段和另一片段之间可利用 非共价的弱相互作用力，如氢键、范德华力、静电力、疏水作用和π-π堆积作用 等，自发或触发地自组装成具有特定排列顺序的分子聚集体。多肽自身具有良 好的生物相容性和可控的降解性能，但是其在体内的稳定性不够，分子结构易 于被破坏。如果将抗肿瘤多肽通过改造使其能直接组装成纳米结构，可开发出 分散性好、纯度高、毒副作用低和稳定性高的抗肿瘤纳米药物。
此外，研究表明，恶性肿瘤组织的pH环境为微酸性，肿瘤细胞部位pH值 在6.7-7.2之间。因此，为了减少药物对于正常组织细胞的毒副作用，期望能够 得到一种在体内运输过程中可以稳定存在，而当到达肿瘤部位时可以释放药物 以达到治疗肿瘤目的的pH响应性纳米药物。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗肿瘤多肽纳米药物及 其制备方法和应用。本发明所述的抗肿瘤多肽纳米药物克服了抗肿瘤多肽药物 半衰期短的瓶颈，提供一种具有肿瘤部位弱酸环境响应性、生物相容性好、稳 定性强、安全性高和生物利用度高的抗肿瘤多肽纳米药物。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种抗肿瘤多肽纳米药物，所述抗肿瘤多肽纳米药物 包含两亲性抗肿瘤多肽以及与两亲性抗肿瘤多肽偶联的酸响应性功能分子。
目前存在的具有抗肿瘤性的多肽分子大多数是亲水性的，但是其体内半衰 期短，易被蛋白酶降解和肝肾等脏器代谢，并且一些少数的两亲性多肽分子由 于疏水与亲水片段之间的比例不协调造成很难形成纳米颗粒，因此，本发明对 亲水性抗肿瘤多肽进行改造，将亲水性抗肿瘤多肽片段和疏水性多肽片段相结 合，改造成两亲性抗肿瘤多肽，而后与酸响应性功能分子偶联得到的抗肿瘤多 肽纳米药物，相容性好，稳定，使得其在体内的半衰期延长，也提高了对肿瘤 部位的靶向性以及抗肿瘤多肽分子的生物利用度，另外，由于该药物中含有酸 响应性功能分子使得所述纳米药物具有酸响应性，以在肿瘤细胞外基质pH值 为酸性的环境下，达到较好的治疗效果。
本发明将所述抗肿瘤多肽药物制备成纳米颗粒，是因为纳米颗粒体系稳 定，肿瘤富集作用强，具有靶向性，此外，将其制备纳米颗粒还可以使得亲水 性抗肿瘤多肽上的受体结合位点不暴露在外，提高了亲水性抗肿瘤多肽分子在 体内的稳定性。
由于多肽分子侧链可带不同电荷，通过设计和修饰使多肽分子具有微酸性 pH响应性，其中最简易的方法就是通过两亲性多肽自组装方式构建。两亲性多 肽在水溶液中倾向于将其亲水部分暴露在外层与水分子形成交界面，疏水部分 则聚集于内。在中性环境中，多肽分子主要通过疏水作用和氢键的物理相互作 用力，自组装形成纳米颗粒；在微酸性环境中，多肽分子疏水端被质子化，疏 水端之间的正电荷排斥力使自组装体解聚，释放出多肽分子。该方法可使抗肿 瘤多肽药物在生理环境中形成纳米结构，延长其在生物体内的半衰期，纳米结 构在微酸性肿瘤微环境中特异响应性解聚，释放出多肽分子，发挥抗肿瘤作 用。
本发明所述抗肿瘤多肽纳米药物中，所述两亲性抗肿瘤多肽包含通过酰胺 键偶联在一起的亲水性抗肿瘤多肽和疏水性多肽。
优选地，所述酸响应性功能分子带有与氨基反应的官能团；
优选地，所述酸响应性功能分子为异氰酸酯类有机分子，进一步优选为 3-(二乙基氨基)丙基硫代异氰酸酯；
优选地，所述述酸响应性功能分子进行酸响应的pH值为6.7-7.2，例如 6.7、6.8、6.9、7.0、7.1或7.2。
本发明所述的酸响应的弱酸性pH值是相对于人体内正常组织内的pH值而 言的，人体正常组织的pH值为7.4，而肿瘤部位的pH值为6.7-7.2，因此相对 于人体正常组织来说，肿瘤组织部位的pH环境为弱酸性。
酸响应性功能分子在pH值为6.7-7.2时，可以被质子化，导致多肽疏水端 之间产生正电荷排斥力，使自组装纳米颗粒形态被破坏。
由于肿瘤部位的pH值为弱酸性环境即(6.7-7.2)，该药物在pH值为 6.7-7.2，会使得药物纳米颗粒被破坏，抗肿瘤多肽上的结合位点裸露出来，达 到治疗的目的。
优选地，所述酸响应性功能分子通过疏水性多肽末端氨基偶联至疏水性多 肽上。
优选地，所述抗肿瘤多肽纳米药物还包含与疏水性多肽连接的赖氨酸。
优选地，所述酸响应性功能分子通过赖氨酸连接至疏水性多肽上。
本发明中所述酸响应性功能分子是指在一定酸性环境下的刺激下具有发生 某种反应的能力的分子，例如，3-(二乙基氨基)丙基硫代异氰酸酯分子在酸性环 境下可以被质子化。
本发明所述抗肿瘤多肽纳米药物中，所述与疏水性多肽连接的赖氨酸为1 个赖氨酸或2-5个赖氨酸形成的肽链，例如疏水性多肽可以连接1个赖氨酸，或 者疏水性多肽可以连接有2、3、4或5个赖氨酸形成的肽链。在疏水性多肽上 引入赖氨酸，而后再通过赖氨酸引入酸响应性功能分子，这样可以在抗肿瘤多 肽上引入多个酸响应性功能分子，例如，当疏水性多肽不连接赖氨酸时，通过 疏水性氨基酸末端氨基连接一个酸响应性功能分子，而当疏水性多肽连接一个 赖氨酸时，可以通过赖氨酸的末端氨基和侧链氨基共连接2个酸响应性功能分 子，如果疏水性多肽连接的是4个赖氨酸形成的肽链，则可以通过赖氨酸肽链 的末端氨基和侧链氨基共连接5个酸响应性功能分子。连接多个酸响应性功能 分子能够保证两亲性多肽疏水端的疏水性，并使得药物在肿瘤部位发生酸响应 的动力更强。
优选地，所述赖氨酸的末端氨基和侧链氨基均与所述酸响应性功能分子连 接。
本发明所述抗肿瘤多肽纳米药物中，所述亲水性抗肿瘤多肽为具有抑制肿 瘤细胞、肿瘤血管、肿瘤淋巴管或肿瘤间质细胞功能的多肽分子中的任意一种 或至少两种的组合。
优选地，所述亲水性抗肿瘤多肽为含有5-30个氨基酸的可溶性多肽，例如 可以是含有5、6、7、8、9、10、13、15、18、20、24、26、28或30个氨基酸 的可溶性多肽。
本发明所述抗肿瘤多肽纳米药物中，所述疏水性多肽为含有5-40个疏水性 氨基酸的多肽，例如在具体的实施方案中，疏水性多肽可以含有5、6、7、8、 9、10、13、15、18、20、24、26、28、30、32、34、36、38或40个疏水性氨 基酸。
优选地，所述疏水性氨基酸为亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨 酸、蛋氨酸、缬氨酸或酪氨酸中的任意一种或至少两种的组合。
本发明所述抗肿瘤多肽纳米药物的粒径为10-200nm。该范围内的纳米颗 粒稳定，具有肿瘤富集作用，可以提高药物的靶向性以及药物的生物利用度。
另一方面，本发明提供了如本发明第一方面所述的抗肿瘤多肽纳米药物的 制备方法，所述方法为：以氨基酸为原料，合成两亲性抗肿瘤多肽分子，而后 在两亲性抗肿瘤多肽分子上引入酸响应性功能分子，然后进行自组装形成所述 抗肿瘤多肽纳米药物。
优选地，所述两亲性抗肿瘤多肽包含通过酰胺键偶联在一起的亲水性抗肿 瘤多肽和疏水性多肽。
优选地，亲水性抗肿瘤多肽为具有抑制肿瘤细胞、肿瘤血管、肿瘤淋巴管 或肿瘤间质细胞功能的多肽分子中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述亲水性抗肿瘤多肽为含有5-30个氨基酸的可溶性多肽。
优选地，所述疏水性多肽为含有5-40个疏水性氨基酸的多肽。
优选地，所述疏水性氨基酸为亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、蛋氨 酸、缬氨酸或酪氨酸中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述两亲性抗肿瘤多肽分子的疏水性多肽末端连接有赖氨酸。
优选地，所述两亲性抗肿瘤多肽分子的合成通过固相合成法实现。
优选地，所述酸响应性功能分子带有与氨基反应的官能团。
优选地，所述酸响应性功能分子为异氰酸酯类有机分子，进一步优选为 3-(二乙基氨基)丙基硫代异氰酸酯。
优选地，所述酸响应性功能分子与两亲性抗肿瘤多肽分子的疏水性多肽末 端的赖氨酸偶联。
作为本发明的优选技术方案，本发明的抗肿瘤多肽纳米药物的制备方法包 括以下步骤：
(1)以氨基酸为原料，利用固相合成法合成疏水性多肽末端连接有赖氨酸 的两亲性抗肿瘤多肽分子；
(2)使步骤(1)合成的两亲性抗肿瘤多肽分子的疏水性多肽末端的赖氨 酸与酸响应性功能分子偶联；
(3)将步骤(2)的产物在中性水环境中自组装得到所述抗肿瘤多肽纳米 药物。
本发明所述的抗肿瘤多肽纳米药物的制备方法中，步骤(1)以利用氨基酸 之间发生缩合反应得到两亲性抗肿瘤多肽分子，可以在两亲性抗肿瘤多肽分子 的疏水性多肽上偶联有赖氨酸。在步骤(2)中两亲性抗肿瘤多肽分子末端连接 的赖氨酸上的氨基与酸响应性功能分子中可与氨基反应的官能团进行反应，从 而在两亲性抗肿瘤多肽分子上偶联上酸响应性功能分子。
优选地，步骤(3)所述中性水环境为pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液。
作为进一步的优选技术方案，本发明的抗肿瘤多肽纳米药物的制备方法具 体包括以下步骤：
(1)以氨基酸为原料，利用固相合成法合成疏水性多肽末端连接有赖氨酸 的两亲性抗肿瘤多肽分子；
(2)使步骤(1)合成的两亲性抗肿瘤多肽分子的疏水性多肽末端的赖氨 酸与酸响应性功能分子3-(二乙基氨基)丙基硫代异氰酸酯偶联；
(3)将步骤(2)的产物在pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中自组装得到所 述抗肿瘤多肽纳米药物。
其中，在上述步骤(2)中3-(二乙基氨基)丙基硫代异氰酸酯分子中的异氰 酸酯基可以与赖氨酸的氨基发生反应而偶联在一起。
本发明所述将亲水性抗肿瘤多肽和和疏水性氨基酸以及任选的赖氨酸偶联 获得两亲性抗肿瘤多肽分子的过程，可采用现有技术中已知的固相合成方法 (例如，Lihong Liu等，Nature Nanotechnology,2009,4:457-463；以及Ying Zhao等，J Control Release,2014,177:11-19中提供的方法)来实现，为了实现 亲水性抗肿瘤多肽与疏水性氨基酸以及任选的赖氨酸之间以特定方式连接，在 合成两亲性多肽分子之前将原料中的不同种氨基利用化学修饰方法进行保护 (采用现有技术中氨基的保护方法进行)。由于氨基保护的氨基酸产品可以商 业购买到，因此，本发明利用从自吉尔生化(上海)有限公司购买的氨基酸完成本 发明。本发明所述抗肿瘤多肽纳米药物的制备过程可以采用如下详细步骤完 成：
(1)本发明用于多肽合成的氨基酸均购自吉尔生化(上海)有限公司，所购 氨基酸的末端氨基均由Fmoc(笏甲氧羰基)保护，用于合成亲水性抗肿瘤多肽 的赖氨酸侧链氨基由Boc(叔丁氧羰基)保护，用于偶联功能分子的赖氨酸侧链 的氨基由CBZ(苄氧羰基)保护。
(2)将所要合成的两亲性多肽分子的第一个氨基酸(末端氨基由Fmoc保 护)的末端羧基与CLEAR-酰胺树脂(引入CLEAR-酰胺树脂的目的是将氨基酸 的羧基末端固定，以便使其氨基端发生反应)的氨基末端连接，通过20％哌啶 /N,N-二甲基甲酰胺脱去Fmoc保护基，然后以此结合在树脂上的氨基酸作为氨 基组分，同过量的含活化羧基的下一个氨基酸反应接长肽链，重复上述操作直 至所有的氨基酸缩合完毕，形成肽链上氨基被保护的两亲性抗肿瘤多肽。
(3)将两亲性抗肿瘤多肽用20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺脱去Fmoc保护 基，用催化氢解法脱去CBZ保护基，使酸响应性功能分子与脱去保护的氨基反 应，从而将酸响应性功能分子连接至两亲性抗肿瘤多肽上。
(4)用高浓度三氟乙酸的二氯甲烷溶液将肽链从树脂上裂解下来，C16Y 片段中的Boc保护基团也将同时除去，经过纯化等处理，即得到连接有酸响应 性功能分子的两亲性抗肿瘤多肽。
(5)将所得到的连接有酸响应性功能分子的两亲性抗肿瘤多肽在中性水环 境中进行自组装性能纳米颗粒体系，即得到所述抗肿瘤多肽纳米药物。
本发明所述两亲性抗肿瘤多肽的自组装采用本领域技术人员熟知的现有技 术进行。
本发明制备的抗肿瘤多肽纳米药物的粒径在10-200nm，粒径较均一，有 利于在肿瘤部位的富集，提高了药物的靶向性，减少了对正常细胞的毒副作 用。
另一方面，本发明提供了如本发明第一方面所述的抗肿瘤多肽纳米药物在 制备抗肿瘤药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明的抗肿瘤多肽纳米药物生物相容性好，毒副作用低，具有酸性pH 响应性，纳米材料本身即为药物，生物利用度高。本发明的抗肿瘤多肽纳米药 物以多肽和氨基酸为原料制备而成，具有高度的生物安全性。与裸肽比较，在 中性环境下，抗肿瘤多肽纳米药物形成高度有序的纳米结构，隐藏了多肽上的 受体结合而位点，从而延长了在体内循环的半衰期，稳定性高，并可富集于肿 瘤部位，在肿瘤部位的弱酸性环境中，纳米药物的纳米粒子形态解聚，暴露出 抗肿瘤多肽上的受体结合位点，以达到抗肿瘤治疗的作用，提高了抗肿瘤多肽 药物的生物利用度。本发明的制备方法简单，自组装过程中不生成共价健，没 有逆反应，制备得到的抗肿瘤多肽纳米药物具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中偶联有DEAP的两亲性抗肿瘤多肽的高效液相色谱图；
图2为实施例1中偶联有DEAP的两亲性抗肿瘤多肽的质谱图；
图3A为实施例1中抗肿瘤多肽纳米药物在中性磷酸盐缓冲液中的电镜形貌 图；
图3B为实施例1中抗肿瘤多肽纳米药物在中性磷酸盐缓冲液中的粒径分布 图；
图4A为实施例1中制备的抗肿瘤多肽纳米药物在pH值为6.8的弱酸性磷 酸盐缓冲液中的电镜形貌图；
图4B为实施例1中制备的抗肿瘤多肽纳米药物在pH值为6.8的弱酸性磷 酸盐缓冲液中的粒径分布图；
图5为实施例8中对实施例1制备的抗肿瘤多肽纳米药物进行肿瘤部位响 应性测定的结果图；
图6为实施例9中测定的实施例1制备的抗肿瘤多肽纳米药物在小鼠体内 血液循环中的稳定性结果图；
图7为实施例10中对实施例1制备的的抗肿瘤多肽纳米药物测定的抑制肿 瘤生长的效果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员 应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限 制。
实施例1
在本实施例中，通过以下方法制备抗肿瘤多肽纳米药物，所述方法为：
选用M.Lourdes Ponce等，Cancer Research,2003,63:5060-5064提供的抑制 肿瘤新生血管生成和肿瘤生长的C16Y多肽(从氨基端开始的序列为：天冬氨酸 -苯丙氨酸-赖氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-缬氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-酪 氨酸-精氨酸)作为亲水性抗肿瘤多肽，按照文献(Lihong Liu等，Nature Nanotechnology,2009,4:457-463和Ying Zhao等，J Control Release,2014,177: 11-19)提供的固相合成法以及多肽纯化方法，将8个亮氨酸和2个甘氨酸组成 的疏水性多肽连接至抗肿瘤多肽C16Y上，并在疏水性多肽的氨基末端连接由3 个赖氨酸形成的三肽，而后通过赖氨酸上的氨基(包括末端氨基和侧链氨基) 连接4个3-(二乙基氨基)丙基硫代异氰酸酯功能分子(DEAP)，获得偶联有酸响 应性功能分子的两亲性抗肿瘤多肽。所述合成过程如下：
(1)用于合成C16Y的氨基酸以及亮氨酸、甘氨酸和赖氨酸的末端氨基均 由Fmoc(笏甲氧羰基)保护，用于合成C16Y的赖氨酸侧链氨基由Boc(叔丁 氧羰基)保护，用于偶联功能分子的赖氨酸侧链的氨基由CBZ(苄氧羰基)保 护，以上氨基酸均购自吉尔生化(上海)有限公司。
(2)使C16Y羧基末端氨基酸的羧基与CLEAR-酰胺树脂(引入CLEAR- 酰胺树脂的目的是将氨基酸的羧基末端固定，以便使其氨基端发生反应)的氨 基末端连接，通过20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺脱去该氨基酸上的Fmoc保护基 以暴露出氨基，然后以此结合在树脂上的氨基酸作为氨基组分，同过量的含活 化羧基的下一个氨基酸反应接长肽链，重复上述操作直至所有的氨基酸缩合完 毕，形成肽链上氨基被保护的两亲性抗肿瘤多肽。
(3)将两亲性抗肿瘤多肽用20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺脱去Fmoc保护 基，用催化氢解法脱去CBZ保护基，使酸响应性功能分子DEAP与脱去保护的 氨基反应，从而将酸响应性功能分子DEAP连接至两亲性抗肿瘤多肽上。
(4)用高浓度三氟乙酸的二氯甲烷溶液将肽链从树脂上裂解下来，C16Y 片段中的Boc保护基团也将同时除去，经过纯化等处理，即得到偶联有DEAP 的两亲性抗肿瘤多肽。
(5)取0.5mg偶联有DEAP的两亲性抗肿瘤多肽溶解于10μL二甲基亚砜 中，接着加入到1mL的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中，将混合液于功率为600 W的超声波清洗仪中超声处理2min。超声完毕后，样品于室温静置2h后即得 到抗肿瘤多肽纳米药物体系。体系中的二甲基亚砜通过在pH 7.4的磷酸盐缓冲 液中透析除去。
通过高效液相色谱和电喷雾离子化质谱等手段证实了本实施例得到的偶联 有DEAP的两亲性抗肿瘤多肽的结构为：C16Y-(甘氨酸形成的二肽)-(亮氨酸形 成的八肽)-(赖氨酸形成的三肽)-(DEAP)4，图1为抗肿瘤多肽的高效液相色谱图， 图2为合成的抗肿瘤多肽的质谱图，表1中总结了图1的高效液相色谱图中各 峰的出峰时间、峰面积、高度以及含量数据。
表1
由图1和图2的结果分析得出主峰3为合成的抗肿瘤多肽的峰，由表1的结 果可以看出，合成的抗肿瘤多肽纯度在90％以上。
利用透射电镜(美国FEI，Tecnai G2 20 S-TWIN，200kV)和激光粒度仪(英 国Malvern,Zetasizer Nano ZS90)对得到的抗肿瘤多肽纳米药物体系进行形态以 及粒径表征，如图3所示，其中图3A为抗肿瘤多肽纳米药物体系的透射电镜图， 从图中可以看出，制备得到的抗肿瘤多肽纳米药物呈球形，颗粒大小较均一； 图3B为粒径分布图，所得抗肿瘤多肽纳米药物的粒径分布为15-60nm，平均粒 径约为30nm，分散指数(PDI)为0.373，与电镜图所测得的结果相符合。
实施例2
在本实施例中，通过与实施例1相同的合成方法以及步骤，实现了在抗肿 瘤多肽C16Y上偶联3个异亮氨酸和2个蛋氨酸以及1个赖氨酸，并在赖氨酸的 末端氨基和侧链氨基上连接了DEAP分子，得到了偶联有DEAP的两亲性抗肿 瘤多肽。经与实施例1相同的自组装过程得到抗肿瘤多肽纳米药物体系。
经过高效液相色谱和质谱等手段证实了本实施例得到的偶联有DEAP的两 亲性抗肿瘤多肽的结构为：C16Y-(异亮氨酸形成的三肽)-(蛋氨酸形成的二肽)- 赖氨酸-(DEAP)2。
利用透射电镜和激光粒度仪对得到的抗肿瘤多肽纳米药物体系进行形态以 及粒径表征，结果表明制备得到的抗肿瘤多肽纳米药物呈球形，颗粒大小较均 一，抗肿瘤多肽纳米药物的粒径分布为40-200nm，平均粒径约为150nm，分散 指数(PDI)为0.368。
实施例3
在本实施例中，通过与实施例1相同的合成方法以及步骤，实现了在抗肿 瘤多肽C16Y上偶联20个丙氨酸以及5个赖氨酸，并在赖氨酸的末端氨基和侧 链氨基上连接了DEAP分子，得到了偶联有DEAP的两亲性抗肿瘤多肽。经与 实施例1相同的自组装过程得到抗肿瘤多肽纳米药物体系。
经过高效液相色谱和质谱等手段证实了本实施例得到的偶联有DEAP的两 亲性抗肿瘤多肽的结构为：C16Y-(20个丙氨酸形成的多肽)-(5个赖氨酸形成的 多肽)-(DEAP)6。
利用透射电镜和激光粒度仪对得到的抗肿瘤多肽纳米药物体系进行形态以 及粒径表征，结果表明制备得到的抗肿瘤多肽纳米药物呈球形，颗粒大小较均 一，抗肿瘤多肽纳米药物的粒径分布为30-160nm，平均粒径约为100.5nm，分 散指数(PDI)为0.324。
实施例4
在本实施例中，通过与实施例1相同的合成方法以及步骤，实现了在抗肿 瘤多肽C16Y上偶联20个缬氨酸、10个酪氨酸以及5个赖氨酸，并在赖氨酸的 末端氨基和侧链氨基上连接了DEAP分子，得到了偶联有DEAP的两亲性抗肿 瘤多肽。经与实施例1相同的自组装过程得到抗肿瘤多肽纳米药物体系。
经过质谱以及核磁等手段证实了本实施例得到的偶联有DEAP的两亲性抗 肿瘤多肽的结构为：C16Y-(20个缬氨酸形成的多肽)-(10个酪氨酸形成的多肽)-(5 个赖氨酸形成的多肽)-(DEAP)6。
利用透射电镜和激光粒度仪对得到的抗肿瘤多肽纳米药物体系进行形态以 及粒径表征，结果表明制备得到的抗肿瘤多肽纳米药物呈球形，颗粒大小较均 一，抗肿瘤多肽纳米药物的粒径分布为10-180nm，平均粒径约为123.6nm，分 散指数(PDI)为0.348。
实施例5
在本实施例中，通过与实施例1相同的合成方法以及步骤，实现了在抗肿 瘤多肽C16Y上偶联40个亮氨酸以及4个赖氨酸，并在赖氨酸的末端氨基和侧 链氨基上连接了DEAP分子，得到了偶联有DEAP的两亲性抗肿瘤多肽。经与 实施例1相同的自组装过程得到抗肿瘤多肽纳米药物体系。
经过质谱以及核磁等手段证实了本实施例得到的偶联有DEAP的两亲性抗 肿瘤多肽的结构为：C16Y-(40个亮氨酸形成的多肽)-(4个赖氨酸形成多 肽)-(DEAP)5。
利用透射电镜和激光粒度仪对得到的抗肿瘤多肽纳米药物体系进行形态以 及粒径表征，结果表明制备得到的抗肿瘤多肽纳米药物呈球形，颗粒大小较均 一，抗肿瘤多肽纳米药物的粒径分布为10-120nm，平均粒径约为78.6nm，分 散指数(PDI)为0.311。
实施例6
在本实施例中，通过与实施例1相同的合成方法以及步骤，实现了在文献 (Stephanie Filleur等，Cancer Research,2005,65:5144-5152)提供的含有11个 氨基酸的来源于色素上皮细胞衍生因子的多肽TGA(该多肽能抑制肿瘤血管生 成和肿瘤生长)上偶联10个亮氨酸和3个甘氨酸以及2个赖氨酸，并在赖氨酸 的末端氨基和侧链氨基上连接了DEAP分子，得到了偶联有DEAP的两亲性抗 肿瘤多肽。经与实施例1相同的自组装过程得到抗肿瘤多肽纳米药物体系。
利用透射电镜和激光粒度仪对得到的抗肿瘤多肽纳米药物体系进行形态以 及粒径表征，结果表明制备得到的抗肿瘤多肽纳米药物呈球形，颗粒大小较均 一，抗肿瘤多肽纳米药物的粒径分布为10-60nm，平均粒径约为21.04，分散指 数(PDI)为0.292。
实施例7
本实施例目的在于测定抗肿瘤多肽纳米药物自组装纳米颗粒在微酸性溶液 中的形貌和粒径。
将实施例1中得到的抗肿瘤多肽纳米药物体系样品的pH值调整至6.8，室 温静置2h后，通过透射电镜观察形貌并用激光粒度仪测定粒径分布。如图4A 所示，在酸性溶液中，多肽已无明显的纳米球形结构，如图4B所示，粒径分布 为4-18nm，平均粒径为7nm。另外将抗肿瘤多肽纳米药物体系样品的pH值分 别调整至6.7、7.0、7.1和7.2时均得到了与将pH值调整至6.8相似的结果，这 说明在酸性溶液中，抗肿瘤多肽纳米药物不再是纳米球状，而是由于酸响应性 分子带有正电荷之后，使得纳米球结构产生排斥力，使得药物不再聚集为纳米 球。
实施例8
本实施例目的在于测定抗肿瘤多肽纳米药物自组装纳米颗粒在体内对肿瘤 酸性环境的响应性。
取0.5mg实施例1步骤(4)得到的偶联有DEAP的两亲性抗肿瘤多肽 (DEAP-两亲性抗肿瘤多肽)，与0.1mg四甲基罗丹明-5-异硫氰酸酯荧光分子和 0.1mg淬灭分子共同溶解于10μL二甲基亚砜中，接着加入到1mL的pH值为 7.4的磷酸盐缓冲液中，将混合液于功率为600W的超声波清洗仪中超声处理2 min。超声完毕后，样品于室温静置2h后，于10000g离心5min，取上清即得 到同时包载有荧光分子和淬灭分子的DEAP-两亲性抗肿瘤多肽自组装纳米颗粒， 经测定该纳米颗粒为大小较均一、稳定的球形结构。
取100μL制备的纳米颗粒，从尾静脉处注射至荷瘤小鼠体内，于1h、3h 和5h用小动物活体成像仪(美国的Cambridge Research&Instrumentation， MaestroTM)检测体内荧光分布，如图5所示，荧光信号主要分布于肿瘤部位， 这说明本发明制备的抗肿瘤多肽纳米药物能响应弱酸性的肿瘤环境而解聚释放 出荧光分子。
实施例9
本实施例目的在于测定抗肿瘤多肽纳米药物自组装纳米颗粒在血液循环中 的稳定性。
利用实施例1中制备的抗肿瘤多肽纳米药物(简记为DEAP-C16Y)进行测 定，以C16Y多肽为对照样品，各取1μmol的C16Y和DEAP-C16Y，将3μmol 的荧光分子Cy5.5分别偶联至C16Y和DEAP-C16Y多肽分子的氨基上，获得偶 联荧光分子的多肽。将偶联Cy5.5的C16Y多肽直接溶解在1mL的pH值为7.4 的磷酸盐缓冲液中；将偶联Cy5.5的DEAP-C16Y溶解于10μL二甲基亚砜中， 接着加入到1mL的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中，将混合液于功率为600W 的超声波清洗仪中超声处理2min，室温静置2h后获得偶联荧光分子的 DEAP-C16Y多肽自组装纳米颗粒。体系中的二甲基亚砜以及多余的荧光分子通 过在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中透析除去。
将偶联荧光分子的C16Y和DEAP-C16Y自组装纳米颗粒，于尾静脉处注射 入BALB/c小鼠体内，于1h、3h、5h、8h、12h和24h等时间点分别从尾静 脉处取小鼠血液30μL，于4000g离心10min后，取上清获得血浆。利用小动 物活体成像仪检测血浆中的荧光信号，与注射荧光标记的C16Y组比较，如图6 所示，注射荧光标记的DEAP-C16Y自组装纳米颗粒组的血浆中的荧光信号存在 的时间显著延长，这说明本发明制备的抗肿瘤多肽纳米药物(DEAP-C16Y)比 C16Y在体内血液循环中更稳定。
实施例10
本实施例的目的在于测试多肽自组装纳米颗粒抑制肿瘤生长的效果。
利用实施例1中制备的抗肿瘤多肽纳米药物(简记为DEAP-C16Y)进行测 定，以C16Y多肽为对照样品。将BALB/c裸鼠于乳腺脂肪垫处接种 MDA-MB-231乳腺癌细胞，待肿瘤生长至体积为100mm3时，尾静脉注射中性 磷酸盐(PBS)缓冲液、C16Y或DEAP-C16Y，其中C16Y为每天注射一次， DEAP-C16Y每两天注射一次和每三天注射一次各设一组，其中C16Y多肽剂量 均为6.5μmol/kg，PBS为每三天注射一次，每组5只小鼠。处理14天并继续观 察一周后，将小鼠处死，取出肿瘤组织，称取瘤重。如图7所示，DEAP-C16Y 每两天注射一次时抑制肿瘤生长的效果最显著，明显优于DEAP-C16Y每三天注 射一次以及C16Y每天注射一次的抑瘤率，而DEAP-C16Y每三天注射一次与 C16Y每天注射一次的抑瘤率相当，这说明应用DEAP-C16Y和C16Y对肿瘤进 行治疗时，要达到相同的治疗效果，在每次注射中所含C16Y剂量相同的情况下， 要多次注射单独的C16Y，而DEAP-C16Y每三天注射一次即可，减少了用药次 数，这也侧面反映了注射单独的C16Y时，由于C16Y在体内循环时不稳定而造 成药物利用率低，本发明的抗肿瘤纳米药物很好地克服了此缺陷，具有很好的 应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的抗肿瘤多肽纳米药物 及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必 须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的 任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选 择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。