一种快速高通量抗病毒药物筛选模型 技术领域 本发明涉及药物筛选模型领域， 具体涉及一种抗病毒药物的快速高通量筛选模型 的建立方法， 可应用于药物的筛选。
背景技术 药物筛选模型 (drug screening model， drugscreening assay method) 是用于证 明某种物质具有药理活性 ( 生物活性、 治疗作用 ) 的实验方法， 这些实验方法是寻找和发现 药物的重要条件之一。人们在长期寻找药物的实践过程中， 建立了大量用于新药筛选的各 类模型， 大致分为经典的动物实验法、 分子生物学筛选法、 高通量药物筛选法和高内涵药物 筛选技术。
所谓动物筛选法就是以动物作药物筛选的观察对象， 以动物对药物的反应， 证明 某些物质的药理作用， 评价其药用价值。 单纯从新药筛选的角度看， 动物筛选模型的最大优 点是可以从动物身上直观地反应出药物的治疗效果、 不良反应以及毒副作用。由动物模型 获得的筛选结果， 对预测被筛选样品的临床效果、 毒副作用和应用前景具有十分重要的价 值。但动物筛选法也存在缺点 ： 采用动物模型进行药物筛选时， 由于动物的特殊性， 决定了 药物筛选过程主要依赖于手工操作， 而且只能对有限的样品进行筛选， 使整体动物模型筛 选新药具有明显的局限性， 效率低、 成本高、 动物实验需要时间长、 劳动强度大、 操作技术要 求高、 受试样品需要量大 ( 约 5g)。
分子生物学筛选方法 ： 近 20 年来， 许多药物作用的受体已被分离、 纯化， 一些基因 的功能及相关调控物质被相继阐明， 为药物筛选提供了许多新的靶点， 这就使得药物筛选 模型从传统的整体动物、 器官和组织水平发展到细胞和分子水平。分子生物学为药物筛选 提供了新型靶蛋白， 对人工合成的组合化学库和小分子肽库进行目的性药物筛选。通过比 较健康人群与患者间在机体组织细胞分子上的差异以及阐明模型组织中相应蛋白质的功 能， 从而正确地选择、 描述并确认某些靶蛋白， 这有助于更加理性和有目的性地进行药物筛 选。生化水平的药物筛选拟用开发药物作用的靶点设计实验， 一般而言这种作用靶点是具 有某种特定生理功能的蛋白质， 如酶和受体等， 此外一些编码功能明确的 DNA 也越来越多 地成为药物作用的新靶点。候选化合物与靶点混合后， 可以通过酶联免疫、 荧光显色、 核磁 共振等方法定量测定化合物与靶点的相互作用， 从而成为筛选化合物的依据。生化水平的 药物筛选操作相对简单， 成本较低， 但是由于药物在体内的作用并不仅仅取决于其与靶酶 的作用程度， 吸收、 分布、 代谢、 排泄均会对药物的作用产生极大的影响， 仅仅一道薄薄的细 胞膜就能够阻挡住许多候选化合物， 因而生化水平的药物筛选不确定因素更多， 误筛率较 高。此外， 该筛选方法手段单一、 费时耗财也成为其无法深入发展的缺陷。
高通量药物筛选 (high throughput screening， HTS) 是 20 世纪 80 年代后期形 成的寻找新药的高新技术。 采用的筛选方法一般是以药物作用靶点为主要对象的细胞和分 子水平的筛选模型， 根据样品与靶点结合的表现， 判断化合物的生物活性。 由于这些筛选方 法在微量条件下进行， 同时采用自动化操作系统， 可以进行大规模的筛选， 因而称为高通量
药物筛选。 高通量筛选依赖数量庞大的样品库， 实现了药物筛选的规模化， 较大限度地利用 了药用物质资源， 提高了药物发现的概率， 同时提高了发现新药的质量， 充分利用了药用资 源。高通量筛选采用的是细胞、 分子水平的筛选模型， 筛选实验是在微量筛选系统中完成 的， 样品用量一般在微克级 (g)， 节省了样品资源， 奠定了 “一药多筛” 的物质基础， 同时节省 了实验材料， 降低了单药筛选成本。 而且高通量药物筛选为高度自动化操作， 不但减少了操 作误差的发生， 降低了劳动强度， 而且提高了药物筛选的效率和结果的准确性。但是， 高通 量筛选所采用的主要是分子、 细胞水平的体外实验模型， 任何模型都不可能充分反映药物 的全面药理作用 ； 用于高通量筛选的模型总是有限的， 要建立反映机体全部生理机能或药 物对整个机体作用的理想模型， 也是不现实的。
高内涵筛选是指在保持细胞结构和功能完整性的前提下， 同时检测被筛样品对细 胞形态、 生长、 分化、 迁移、 凋亡、 代谢途径及信号转导各个环节的影响， 在单一实验中获取 大量相关信息， 确定其生物活性和潜在毒性的一种药物筛选方法。 从技术层面而言， 高内涵 筛选是一种应用高分辨率的荧光数码影像系统， 在细胞水平上检测多个指标的多元化、 功 能性筛选技术， 旨在获得被筛样品对细胞产生的多维立体和实时快速的生物效应信息 ； 从 筛选载体上看， 高内涵药物筛选与高通量药物筛选并没有显著的区别， 也是在微孔板上进 行的， 目前使用较多的是 96 孔微板。高内涵药物筛选的检测体积并未因检测指标增加而增 高， 操作步骤同样简单可行、 自动化。虽然高通量药物筛选的结果较为准确， 易于评价， 但 其检测模型均建立在单个药物作用靶分子的基础上， 无法全面反映被筛样品的生物活性特 征。 以现代分子和细胞生物学为基础建立的快速、 微量、 定向的体外筛选模型和测试 方法， 以及结合自动化技术发展起来的高通量筛选技术是目前创新药物的研究重要手段。 药物的药理作用是通过肌体细胞或病原体的药物靶点而发挥， 内用药物无论是经过口服、 注射等任何一种给药途径， 都需经过吸收、 代谢、 分布和排泄的过程， 这些过程都影响药物 的效果， 如代谢通过氧化、 分解、 结合等影响药物的分子结构和作用效果， 过程相当复杂， 有 的使药效降低或消失， 如氯丙嗪、 磺胺药等 ； 有的使药效增强， 如无活性的抗癌药物硫唑嘌 呤经过代谢变成具有药理活性的 6- 硫基嘌呤。常规体外细胞或病原体培养药物筛选模型， 因药物未经过体内吸收、 分布、 代谢等过程， 而是直接作用于细胞或病原体 ； 因此不能真正 的反映药物的作用， 存在不确定性和不对应性， 有些在体外实验有效的药物或药物成分， 在 临床实验上却无效。通常体外药物筛选的结果与临床效果存在很大的偏差 ； 同时常规体外 细胞培养药物筛选模型需先对每种药物进行培养细胞的安全用量测定， 工作量大， 操作复 杂， 成本高等缺陷。
发明内容
针对普通体外高通量筛选的不确定性和不对应性等缺陷， 本发明提供了一种新型 的高通量筛选模型的建立方法， 最大限度的模拟动物体内生理生化环境与过程， 提高了药 物筛选的准确性。
本发明的技术方案包括如下步骤 ：
(1) 给每只试验动物灌服最大安全剂量药物， 分离制备含药血清或血浆备用 ；
(2) 按常规方法制备正常试验动物血清或血浆， 测试其血清或血浆对细胞的影响，得出动物血清或血浆对细胞系培养的最大安全浓度 ；
(3) 以动物血清的最大安全浓度量为标， 将含药血清或血浆加入细胞培养液或细 胞维持液中培养， 作 CPE 测定和 MTT 法测定， 评价药物效果， 筛选出有效药物。
本发明中所说的最大安全剂量是指给某一种动物一次灌服药物最多， 但不致动物 死亡的剂量。最大耐受剂量 ： (maximal tolerance dose， MTD 或 LD0 或 LC0) ： 指某实验总 体的一组受试动物中不引起动物死亡的最大剂量。
毒理学中， 最大耐受剂量 ： (maximal tolerance dose， MTD 或 LD0 或 LC0) ： 指某实 验总体的一组受试动物中不引起动物死亡的最大剂量。
本方法的原理是 ： 测定某一试验动物 ( 小鼠、 大鼠、 豚鼠、 犬、 猫、 猪、 兔、 禽等 ) 血 清 ( 血浆 ) 对培养细胞系的安全使用浓度， 并建立细胞系微量培养方法 ； 将药物经试验动物 服用， 进行吸收、 分布与代谢， 提取动物含药血清 ( 血浆 )， 以安全浓度替代正常试验动物血 清 ( 血浆 )， 按微量细胞培养法， 作细胞培养， 测定细胞病变 (CPE) 程度和 MTT 法计算细胞活 性， 判断药效。
根据生物药剂学原理， 通过试验动物对药物的消化、 吸收、 分布和代谢， 药物有效 成分进入动物血液中 ( 药动学中央区 )， 从而分离获得含药血清或血浆， 极大地摒弃药物的 非活性成分 ； 利用其含药血清或血浆， 进行细胞培养， 结合细胞病变 (CPE) 程度测定和细胞 成活率测定法 (MTT)， 判断药物的有效性 ； 最大程度地排除药物中非特异性成分的干扰， 提 高药物筛选的可靠性。
根据本发明的实施例， 步骤 (1) 中对未知药动力学参数的药物给每只试验动物连 续 1-5 次灌服最大安全剂量药物， 间隔时间为 0.5-2h， 最后一次灌服后 10-60min 采血 ； 对 已知药动力学参数的药物在血液的药峰时间采血。
本发明与现有技术相比， 具有如下优势 ：
a) 提高了药物的有效筛选率。本发明模型使药物经过动物体内的吸收、 分布、 代 谢过程后， 取含药血清 ( 血浆 ) 用体外细胞培养法进行药效测定 ； 其模型结合了体内生理生 化过程和体外细胞与病原体的直观效果测定的两大特点， 其药效结果能真实反映药物的作 用， 使体外筛选的结果与临床药效的吻合度大大增加 ； 因此该高通量药物筛选模型提高了 药物筛选的可靠性， 有效的提高了药物的筛选率 ；
b) 简化了筛选程序。常规的体外细胞培养法高通量筛选模型， 要检测每一种待筛 药物对细胞的安全浓度， 这对于成千上万药物的初筛是一项巨大的工作。该发明将含药动 物血清或血浆添加到细胞培养液中， 虽然各种动物血清对细胞的毒害作用存在差异， 但试 验动物血清和药物相比， 与细胞培养的犊牛血清较接近， 能适于细胞培养， 加入之前只需测 试动物血清对细胞的安全浓度， 无须检测每一种待筛药物对细胞的安全浓度， 简化了筛选 程序， 可大批量的快速测定， 节约了大量的人力物力 ；
c) 大大降低或消除药物理化因素对常规模型的不良作用。 常规的体外细胞培养法 筛选模型大都将药物直接加到细胞培养液中去， 一方面药物可能对病原体产生非药理性抑 灭作用， 造成筛选的假阳性结果 ； 另一方面药物对细胞产生诸多不利的理化作用， 造成假阴 性结果。如细胞培养的最适 PH 值为 7.2 ～ 7.4 之间， 大于 8 或者小于 5 细胞状态不良或死 亡， 而很多药物的 PH 值不在体外细胞培养的最适范围内 ； 又如药物， 尤其是中草药含有大 量的非药效成分， 对细胞有毒害作用， 因此造成有效药物漏筛的情况非常普遍。 本发明是通过动物服用对药物进行筛选式的吸收， 滤过大量非药理成分 ； 再经肝脏代谢进入血液 ( 药 代动力学的中央区 )， 其血液所含药物大多为功能性成分 ； 因此， 大大消除常规模型的非特 异性结果， 提高药物筛选的有效性。
d) 操作方便， 节约成本。 所有药物的筛选最终都需要做动物和人体给药试验， 但动 物尤其是大型动物如猿、 猴等试验费用昂贵， 且试验规模和效率也受到影响。 本发明的血药 细胞培养法采取试验小动物的血清进行试验， 即使是大动物亦可反复试验， 来源广泛， 成本 低廉， 操作方便， 效果真实， 大大降低了药物筛选的成本， 提高了工作效率， 可用于大规模药 物初步筛选， 尤其适合中草药有效成分和前体药物的筛选， 因为中草药成分复杂， 有效成分 不易确定， 本发明是体内与体外相结合的高通量筛选， 易于寻找和发现中草药的有效部位， 进而借助药物分离方法， 分离确定药物或动物血清中的有效药物成分。 具体实施方式
比较试验发现将粗提的中草药药液直接加入到长满细胞的 96 孔培养板中， 大部 分细胞死亡， 可能与中草药液对细胞的非生理性作用有关。综合以上因素， 试验通过本发 明模型进行抗猪繁殖与呼吸道综合征病毒 (PRRSV) 中草药的筛选， 筛选出有效抗猪繁殖与 呼吸综合征病毒的中草药 1 种， 水煎制剂， 进行猪的攻毒防治试验 ； 在此基础上组方进行临 床防治试验和扩大临时治疗试验 ( 在四川成都市、 河南商丘、 北京大兴和湖南岳阳县、 宁乡 县、 望城县的发病猪群进行临床实验 )， 攻毒防治试验和临床试验的效果与通过该发明筛选 的药效非常吻合。 实施例 1 ：
中草药提取物对培养细胞的毒性作用测定
为了了解和比较常规方法药物直接添加对细胞的毒性作用， 测定了试验用的 21 种中草药的水提取液对 Marc-145 细胞的毒性作用及安全浓度。方法是将 21 种中草药分别 用水进行粗提， 每种中草药的水提液灭菌后用细胞维持液稀释， 分别加入到长满细胞的 96 孔培养板中， 每浓度 8 孔， 每孔 100ul， 37℃ 5％ CO2 培养箱中培养 72h， 每天观察 CPE。结果 显示各种提取液对细胞产生不同程度的毒性作用， 其作用随浓度的增加而增加， 且不同的 中草药的副作用大小不同， 分别在细胞培养液中添加 0.625-1.25％ (V/V) 以上的中草药水 提液 ( 含生药 0.5g/ml)， 即每毫升培养液中含生药 1.95-3.90mg， 细胞开始出现细胞病变 (CPE)。 可见中草药成分直接对细胞其毒性作用比较大， 这可能一方面由于中草药作为非细 胞营养物对细胞产生的毒副作用 ； 另一方面由于中草药液中的生物碱等成分影响细胞培养 PH 值 ( 细胞的最适 PH 值为 7.2 ～ 7.4 之间， 大于 8 或者小于 5 细胞状态不良或死亡 ) 所 致。因此， 每种中草药添加的安全浓度应在此浓度以下 (0.625-1.25％ )。
实施例 2 ：
小鼠血清对 Marc145 细胞的安全浓度测定
小鼠血清 56℃灭活 30min， 用维持液稀释成 80％， 0.22μm 微孔滤膜过滤除菌， 用 维持液倍比稀释稀释成不同的浓度， 小鼠血清的稀释浓度分别为 80 ％、 40 ％、 20 ％、 10 ％、 5％、 2.5％、 1.25％、 0.625％、 0.312％， 从高浓度到低浓度分别加入到长成良好的单层细胞 中， 每孔 100μl， 每个浓度重复 8 孔， 设细胞对照组， 置 37℃培养箱中培养 72h， 每天用倒置 显微镜观察 CPE 并记录结果， 以最后的记录结果为最终结果。同时用 MTT 法测得的 OD 值计
算细胞存活率。具体操作如下 ： 经过 72h 处理后， 吸出细胞孔中残余的小鼠血清， 用预热至 37℃的 PBS 溶液漂洗 2 次， 每孔加入 10μl 的 MTT(5mg/ml 溶于 PBS)， 37℃继续培养 4h， 4h 后加入 100μ1DMSO， 在微量振荡器上振荡 10min， 以溶解细胞中的紫色结晶物， 然后在酶标 仪上 570nm 处测定其光吸收值。 据细胞病变 (CPE) 程度和 MTT 法测得的细胞成活率为依据， 以能长成或维持良好单层细胞的药物的最高浓度作为药物的安全浓度。 抗病毒实验采用最 高安全浓度的含药血清进行。
小鼠血清对 Marc-145 细胞比较小牛血清 ( 常用量 5-10％ )， 有一定的毒副作用， 5％以上开始出现细胞病变， 高浓度的小鼠血清导致细胞全部病变， 细胞圆缩、 堆积、 脱落 ； 随着血清浓度的降低， 这种病变程度下降， 测得细胞的 OD 值增大， 血清对细胞增殖的抑制 率越来越小， 即小鼠血清毒性与其浓度呈正相关 ； 血清浓度降低到 5％， 细胞基本不发生病 变， 其最大的无毒浓度为 2.5％。其最大安全浓度大于中草药提取液 2-4 倍。
实施例 3 ：
含中草药小鼠血清对 Marc-145 细胞感染 PRRSV 病毒的保护与抗病毒药物的筛选
1 试验材料
Marc-145 细胞 ( 非洲恒河猴肾细胞 ) ： 由湖南农业大学动物医学院惠赠 ； 美洲型猪繁殖 - 呼吸道综合征病毒 (PRRSV) ： 由湖南农业大学动物医学院惠赠 ；
中草药 ： 21 种中草药 ( 贯众、 重楼、 槟榔、 八角莲、 杜仲、 板蓝根、 黄柏、 天南星、 半 夏、 大青叶、 紫花地丁、 玄胡、 半枝莲、 山茱萸、 连翘、 香薷、 牛至、 马鞭草、 喜树果、 蛇床子、 马 钱子等进行编号 ) 购自湖南养天和大药房， 用传统的煎煮法提取三次， 合并浓缩， 过滤 4℃ 保存 ；
2 试验方法
通过细胞培养， 对猪繁殖 - 呼吸道综合征病毒 (PRRSV)TCID50 进行测定， 根据小鼠 血清对 Marc145 细胞的安全浓度， 制备中草药药液， 采集含药小鼠血清 ： 20g 左右的小鼠用 中药药液进行最大安全剂量的灌胃， 每种中药灌两只， 每只小鼠连续灌服 4 次， 每次灌 5ml， 灌药时间间隔为 1 小时， 灌第三次半个小时后， 即刻摘眼球取血 ( 旨在使小鼠血中药物浓度 最高 )， 离心取血清， 56℃灭活 30min。在细胞已基本长成单层的 96 孔中， 吸出各孔旧的培 养液， 加入稀释到安全浓度的含药血清。试验根据抗病毒药物的三种作用方式设计药血清 的添加方式 ： 抗病毒吸附 ( 先加药后加病毒 )、 抗病毒复制 ( 先接毒后加药 )、 直接灭活病 毒作用 ( 药物与病毒体外作用一段时间后加入 ) ； 同时设正常细胞对照组、 小鼠血清对照组 和病毒对照组 ； 置 37℃ 5％ CO2 培养箱中培养 4h 后加入 100 个 TCID50 的病毒液 100μl， 置 37℃ 5％ CO2 培养箱中培养 72h， 每天用倒置显微镜观察细胞病变 (CPE) 情况并记录， 以最 后的记录结果为最终的结果， 筛选抗病毒中草药。
3 结果
试验的三种作用方式投药表明 ： 不同药物 ( 含药血清 ) 对抗病毒的效果和作用方 式不同， 所筛选的药物中， 3、 7、 8、 9 具有抗病毒吸附的作用 ( 表 1) ； 2 和 8 有抗病毒复制的作 用 ( 表 2) ； 2、 8、 5 能够直接灭活病毒 ( 表 3)。综合三种作用方式考虑， 2、 8 能够抑制病毒， 对细胞的保护率较高， 将筛选为具抗病毒作用的中草药进行后面的临床试验。
表 1 先加药后加病毒 72h 测得细胞 CPE 情况与 MTT 法的 OD 值及药物对细胞的保 护率
注： 细胞 72h 时的 CPE 情况中， 数字 04 代表细胞病变程度 表 2 先加病毒后加药 72h 测得细胞 CPE 情况与 MTT 法的 OD 值及药物对细胞的保护率
注： 细胞 72h 时的 CPE 情况中， 数字 04 代表细胞病变程度
表 3 药物和病毒同时加入 72h 测得细胞 CPE 情况与 MTT 法的 OD 值及药物对细胞 的保护率
注： 细胞 72h 时的 CPE 情况中， 数字 04 代表细胞病变程度 实施例 4 ：抗病毒中草药的人工感染治疗试验
1 材料与方法
1.1 试验动物与分组 ： 从非疫区购买未免疫注射的 16-19 公斤杂交仔猪 42 头， 置 一深山闲置 2 年的猪舍内饲养， 随机分为 7 组， 试验组与对照组并排穿插分栏， 处理如下 ：
第1组： 感染蓝耳病毒
第2组： 感染蓝耳病毒并给 8 号药，
第3组： 感染蓝耳病毒并给 10 号药
第4组： 感染圆环病毒 + 蓝耳病毒
第5组： 感染圆环病毒 + 蓝耳病毒并 8 号药，
第6组： 感染圆环病毒 + 蓝耳病毒并 10 号药，
第7组： 不感染不给药的空白对照组
试验期间保持圈舍干燥、 清洁、 通风， 饲喂、 饮水和饲养管理按常规方法进行， 做到 优良饲养管理。
1.2 药物与给药方法 ： 将筛选出的 8 号中草药， 按常规方法用水煎成含生药 0.5g/ ml 的药液， 分装， 15 磅消毒 15 分钟， 备用 ； 感染发病猪用药液灌服或加入饮水中喂服治疗， 每次每头猪 2ml/kg， 每天 2 次， 给药时间至体温体征正常为止， 最长 14d。同时， 用血 药细胞模型筛选效果不太好的 10 号药作对照。
1.3 观察方法 ： 自投药之日起连续观察 30d， 每天上午、 下午各观察 1 次及时做好观 察记录。
2 试验结果
感染后第 2 天， 除空白对照组外， 全部体温升高达 42℃； 第 4 天达 43-44℃， 并伴有 呼吸困难等症状出现， 皮发红色。
第1组： 感染蓝耳病毒， 猪的体温持续在 40 度以上， 从第六天开始， 至第 12 天， 全 部死亡。
第2组 ： 感染蓝耳病毒并给 8 号药， 第五天开始下降， 第九天恢复正常， 仅 1 头猪因 体弱于第 12 天死亡。
第3组： 感染蓝耳病毒并给 10 号药， 体温持续在 40 度以上， 全部死亡。
第4组： 感染圆环病毒 + 蓝耳病毒， 持续高体温， 到 12 天全部死亡。
第5组： 感染圆环病毒 + 蓝耳病毒并 8 号药， 第六天体温下降， 第十天基本恢复正 常体温， 死亡 2 头。
第6组： 感染圆环病毒 + 蓝耳病毒并 10 号药， 体温 40 度以上， 猪全部死亡。
第7组： 不感染不给药的空白对照组， 第七天开始体温持续上升， 死亡 5 头。
本试验结果显示 ： 给 8 号药后病猪死亡率均有大幅下降， 对高致病性蓝耳病治愈 率较高， 达 83.3％， 对高致病性猪蓝耳病及圆环病毒病混合感染治愈率 66.6％， 表明筛选 出的中草药对猪蓝耳病有确切疗效。
实验情况记录
实施例 5 ： 自然感染猪蓝耳病猪的临床治疗试验 1 材料与方法 1.1 试验动物与分组及管理 在湖南境内某地发生猪蓝耳病， 经湖南省动物疫病检测中心取病料样送中国农科院哈尔滨兽医研究所诊断为高致病性猪蓝耳病 ； 试验选择两个相近的猪场， 一个为未发病 猪场供作药物预防试验， 一个为高致病性猪蓝耳病疫情场供作药物治疗试验。两猪场各有 大小猪 200 头左右， 分别取一部分作试验， 另一部分作不给药空白对照和清瘟败毒散药物 对照。试验期间保持圈舍干燥、 清洁、 通风， 饲喂、 饮水和饲养管理按常规方法进行， 尽可能 保持优良。
1.2 药物及给药方法
依以上试验筛选出的抗蓝耳病病毒药物与非抗病毒性的调理药物 ( 如石膏等 ) 组 方， 配制成散剂或汤剂， 用于猪蓝耳病的预防和治疗。 预防效果试验给药方法为 2kg/1000kg 饲料， 拌料喂服 ； 治疗效果试验给药方法为按每头每次 1ml/kg 体重， 煎水 ( 三次煎水， 合并， 浓缩至含生药 0.5g/ml 水 ) 灌服， 每天 2 次， 待病情稳定后， 药液兑饮水或拌料喂服， 直至康 复。自投药之日起连续观察 20d， 每天上午、 下午各观察 1 次及时做好观察记录。
2. 试验结果
2.1 预防试验 ：
药物预防组 80 头猪无一头猪死亡， 仅有 4 头 30kg 左右的小猪表现出较轻的蓝耳 病症状， 体温升高， 呼吸加快， 食欲下降等， 约 1 周后康复 ； 清瘟败毒散组 60 头猪有 39 头猪 发病， 18 头死亡， 发病率 65％， 死亡率达 30％ ； 不给药对照组 65 头猪有 54 头发病， 死亡 30 头， 发病率达 83％， 死亡率达 46％。
2.2 治疗试验
将确诊为高致病性猪蓝耳病病毒感染的病猪群集中到隔离舍， 随机选取大小和病 况基本一致的病猪 80 头， 分成 4 个组， 每组 20 头， 1--2 组为本药物治疗组， 3 组为清瘟败毒 散治疗对照组， 4 组为不给药空白对照组。两本药物治疗组 35 头完全治愈， 3 头呈慢性经 过， 缓慢康复， 仅 2 头猪死亡 ； 清瘟败毒散治疗组 6 头治愈， 7 头呈慢性经过， 7 头死亡 ； 而不 给药组 16 头死亡， 4 头呈慢性经过， 死亡率达 80％。本试验结果表明， 本筛选药物对防治高 致病性猪蓝耳病具有确切的疗效。
对高致病性猪蓝耳病的临床治疗试验效果 ( 头，％ )
药物名称 药物试验 1 组 药物试验 2 组 清瘟败毒散组 不给药组
试验猪 20 20 20 20有效 19 19 7 0康复 18 17 6 0死亡 1 1 7 16有效率 95 95 45 0治愈率 90 85 30 0死亡率 5 5 35 80在此基础上， 在四川成都市， 河南商丘， 北京大兴， 湖南岳阳县、 宁乡县和望城县进 行扩大治疗试验， 其效果基本与上一致。13