本发明属中药制剂领域，具体涉及中药地黄提取物及其制备方法 和应用。
肥胖是由于能量物质摄入超过消耗，体内脂肪积聚过多造成的疾 病。统计学显示，美国的肥胖总人数达9700万，在20岁以上人口 中，30％为肥胖，我国人民随着生活水平的提高，肥胖发生率也逐年 升高，肥胖人数达到7000万，青少年肥胖正在影响民族素质，已成 流行病。肥胖不仅降低患者的生活质量，而且与高血压、糖尿病、 冠心病、高血脂、性功能障碍乃至肿瘤等多种疾病密切相关，所以， 抗肥胖保健食品或药物的研制，不仅可以减少肥胖人数，提高人民 的生活、工作质量，延长寿命，还可防治与治疗肥胖相关的病症。 目前，国外减肥药作用于局部环节，有较多的副反应，停药后反弹 严重。
本发明的目的是以中药地黄为原料，提取有效组分，制成防治肥 胖的保健食品，另一目的是将有效成份配以辅料制成有明确的作用 机制的中药制剂及其在防治肥胖及肥胖病药中的应用。
地黄Rehmannia glutinosa Libosch为常用中药，始载于神农本 草经，列位上品，主要含环烯醚萜类，功能清热凉血，养阴生津， 用于热病舌绛，烦渴，阴虚内热，骨蒸劳热，吐血，发斑发疹等。
本发明通过以下方法提取有效组分：取生地黄用水浸泡过夜后， 置80℃处理4小时，滤液浓缩为每毫升液体中含有1克地黄即得提 取物地黄原液，高效液相测试，以2％乙晴为流动相，210nm扫描波 长，测得在保留时间为t=9.1min左右有地黄主要成分梓醇的吸收 峰；地黄原液色泽棕褐，闻之有浓香，味微苦，pH偏酸。本发明地 黄提取物作为活性组分，配以各种辅料可制成胶囊、片剂、颗粒剂、 丸剂、散剂、汤剂以及复方制剂。
本发明经体外细胞及动物试验证实地黄原液可抑制脂肪细胞分 化，抑制动物体内脂肪组织的形成，降低血浆胆固醇、甘油三酯和 血糖的浓度，并增加血浆高密度脂蛋白的浓度，作为活性组分，配 以各种辅料，可制成防治肥胖的保健食品和防治肥胖的中药制剂。
以下举实施例说明。
实施例1：地黄原液抑制脂肪细胞的分化
本发明试验用3T3-L1小鼠前脂肪细胞系引自美国John HopKins University医学院，建立诱导分化为成熟脂肪细胞的模型：在含10 ％小牛血清的DMEM培液中培养3T3-L1细胞成单层，然后加入MIX(甲 基异丁基黄嘌呤)0.52mM、胰岛素1.7uM、地塞米松1uM刺激培养2 天，换以只含胰岛素1.7uM的分化液，继续培养，以后每隔2天换 分化液。使梭形前脂肪细胞转变为圆而大，充满了脂滴的脂肪细胞。
试验中，在刺激细胞的同时(0h)加入地黄原液可强烈抑制脂肪 细胞的分化，在刺激后12h,24h加入药物仍有明显的抑制作用，在 0h加入不同浓度(0.01％-4％)的地黄原液，抑制分化的效应随浓度 的升高而加强，
为了确定是否由于药物的毒性而抑制脂肪细胞的分化，本发明进 行了药物毒性测试： 从形态学上可见在有效浓度(0.01％-4％)范围内，3T3-L1前脂肪细 胞，不加分化刺激剂，只加地黄原液，细胞生长分裂旺盛，与不加地 黄原液的3T3-L1前脂肪细胞没有差别； 用MTT法检测细胞的活力：配制5mg/ml的MTT溶液，闭光保存；3T3 -L1细胞传至96孔板中，细胞培养贴壁后，加入含0.25％,1％,4％三 种浓度的地黄原液培液中作用2天，然后加MTT溶液，作用4小时， 去除培液，加入200ulDMSO和25ulSorensen’sGlysine buffer，于 570nm波长段分析其吸光率。结果显示在有效浓度(0.01％-4％)范 围内，药物不影响细胞的活力，相反有益于细胞的生长。
在诱导分化3天后，取对照的正常分化细胞和经地黄原液处理 的细胞，以异硫氰酸胍法抽提RNA，用DIG标记C/EBPα和422/aP2 基因探针(试剂盒购自宝灵曼公司)，与细胞总RNA作核酸斑点杂交， (C/EBPα为脂肪细胞分化过程中重要的转录调控因子，可激活成熟 脂肪细胞所具有的系列特异性蛋白的表达，如422/aP2为脂肪细胞 特异的脂肪酸结合蛋白，这些特征蛋白的表达使前脂肪细胞获得合 成甘油三酯的能力，并形成脂滴聚集的圆形大脂肪细胞。)结果显示， 地黄原液处理后的细胞，C/EBPα基因的转录水平较对照细胞降低 86.1％,422/aP2基因的转录水平较对照细胞降低37％。实验重复3 次以上，结果不变。
在诱导分化3天后，取对照的正常分化细胞和经地黄原液处理 的分化细胞，以异硫氰酸胍法抽提RNA，采用RT-PCR法，以β-actin 为内对照，分析药物对leptin mRNA表达水平的影响。(leptin为 肥胖基因的表达产物，在脂肪细胞中表达量最高，具有调节能量平 衡、食欲、免疫和生殖等广泛的生理学效应，血浆leptin浓度增加， 通过下丘脑，使食欲下降，因此与肥胖有很大的相关性。设计leptin 引物为P15’-ACGCAGTCGGTATCCGCAA-3’P2 5’- GCTCTATGCCAACACAGTGC-3’；设计β-actin引物为P1 5’- CTCTATGCCAACACAGTGC-3’P2 5’-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3’。由总RNA 为模板反转录得到cDNA后，按以下方案PCR扩增：94℃变性后加入 Taq酶，经94℃30”,60℃1’,68℃1’30次循环，68℃延伸7’，结束后 1.2％琼脂糖凝胶电泳，用Pharmacia核酸蛋白自动成像系统对电泳 区带灰度扫描，结果显示地黄原液可促进脂肪细胞中肥胖基因leptin 表达。
脂肪细胞分化过程中，经地黄原液处理后，采用Western Blot 技术检测脂肪细胞分化相关的蛋白表达量的变化。以60mM Tris-HCl， 1％SDS溶液提取全细胞组分；刺激0h加入1％地黄原液后，按照标 准分化方案培养1天后，提取全细胞蛋白，检测C/EBPβ蛋白的表 达；培养3天、5天，检测C/EBPα的表达；培养5天检测422/aP2， Glut4蛋白的表达水平。(C/EBPβ为脂肪细胞分化的早期蛋白，可 能具有促进C/EBPα表达，进而促进分化的作用；Glut4也为脂肪细 胞后期表达的特征蛋白，与葡萄糖转运有关。)结果显示这些蛋白的 表达均受到不同程度的抑制。 实施例2，地黄原液防止大鼠饮食性肥胖。 采用重量为200克左右的SD雄性大鼠12只/批，(从上海医科大学 实验动物部购得)，其饮食方案如下配制，光照，昼夜节律等环境因 素两组一致。 甜全脂奶粉 44％ 标准啮齿类饲料 47％ 玉米油 8％ 玉米淀粉 1％ 地黄活性组分 1％ 培养10周后，对照组大鼠重约500克，明显高于正常饮食的大鼠， 说明饮食诱导的肥胖动物模型制造成功。 将SD雄性大鼠随机分为2组，每组12只：对照组大鼠高脂饮食中 不加地黄原液，给药组大鼠高脂饮食合地黄原液。观察并计算大鼠 每天摄食量，给药组和对照组的食量类似，无统计学差别。 每周称重动物并记录，得到动物的周生长曲线，结果显示，给药组 雄性大鼠的体重比对照组大鼠降低17.6％,P＜0.05。
对照组(g) 给药组(g) 第一周 261.67±27.14 283.33±24.22 第二周 221.67±28.05 235.00±27.02 第三周 239.33±33.93 229.67±21.81 第四周 262.33±28.99 245.67±16.80 第五周 297.00±29.44 269.67 ± 21.96 第六周 315.67±38.81 292.33 ± 27.29 第七周 356.67±32.04 309.00 ± 27.76 第八周 370.00±38.34 315.67±30.16 第九周 411.00±37.67 338.33 ± 37.28 第十周 430.83±42.00 355.00±40.77 动物处死后，观察腹腔脂肪组织，发现给药组大鼠大网膜及附睾脂 肪组织均明显少于对照组大鼠。 大鼠的体重和大鼠腹腔内脂肪组织重量，给药组大鼠显著低于对照 组大鼠，具有统计学意义(p＜0.05)。 地黄原液对大鼠的体重、体重指数、腹腔脂肪重量的影响(x±s) 组别 鼠 数 体重(g) 体重指数 腹腔脂肪组织重量(g) 给药组 12 349.6±43.11 0.60±0.03 14.55±5.43 对照组 12 443.0±33.09 0.70±0.08 18.85±3.18 取同一部位紧贴附睾上的脂肪组织，经HE染色后直接观察大鼠体内 脂肪细胞的形态，结果显示给药组大鼠的脂肪细胞属小脂肪细胞(对 胰岛素敏感)，而对照组大鼠的为含大量脂滴的大脂肪细胞(对胰岛 素不敏感)。 两组血脂浓度有明显区别：给药组血浆甘油三酯，胆固醇，血糖浓度 低于对照组，前两者有统计学差别，而高密度脂蛋白则比对照组高。
对照组(n=12) 给药组(n=12) TC 54.3±12..5 44.0±12.0 TG 70.6±41.2 62.4±35.8 G 143.0±142.8 115.0±60.7 HDL 32.7±5.8 45.2±9.7 TC：总胆固醇，TG：总甘油三酯，G：血糖，HDL：高密度脂蛋白 用原位免疫组化技术检测组织中leptin蛋白表达的变化，给药组大 鼠脂肪组织中leptin阳性信号强于对照组。用RT-PCR检测动物 体内脂肪组织leptin的mRNA表达水平，显示给药组大鼠的表达水 平比对照组大鼠的升高。用Western Blot技术检测动物脂肪组织中 C/EBPα、422/aP2、leptin的蛋白表达水平，结果显示，给药组大 鼠C/EBPα、422/aP2的表达低于对照组，而leptin的表达高于对 照组大鼠。
以上实施例说明地黄原液具有明显的抑制脂肪细胞分化，促进 leptin表达和降低血浆甘油三酯，胆固醇和血糖，并升高血浆高密度 脂蛋白，具有防止肥胖的效用和防治动脉粥样硬化的效用。 实施例3：本发明通过下述不同方法从地黄提取有效成份。 方法1，取地黄剪碎后，用水煎煮后取汤剂提取有效成分，温度从 常温到100℃ 方法2，取地黄剪碎后，直接用稀乙醇(甲醇)溶液提取 方法3，按上述方法提取地黄原液后，加入乙醇(或异丙醇/甲醇)至 80％以上，取其沉淀部分。
附图说明：
图1为3T3-L1小鼠前脂肪细胞分化为脂肪细胞的过程，显示 原来呈梭形、瘦长的前脂肪细胞转变为圆而大，充满了脂滴的成熟 大脂肪细胞。其中1为分化1天；2为分化2天；3为分化5天；4 为分化11天的细胞形态。
图2为加入不同浓度的地黄原液抑制脂肪细胞分化的情况，均 为分化刺激5天后，1为对照组，有多量成熟的大脂肪细胞；2为用 低浓度(0.25％)地黄原液处理的细胞；3为用高浓度(1％)地黄原液处 理的细胞，随底荒原液浓度升高，对脂肪细胞分化的抑制效果加强。
图3为地黄原液对前脂肪细胞生长的影响，1为在前脂肪细胞 培养液中加入1％的地黄原液；2为前脂肪细胞对照，加入地黄原液 后没有影响前脂肪细胞的生长和分裂，即地黄原液对前脂肪细胞的省 长无直接损害，只作用于分化。
图4为用点杂交的方法检测分化3天和5天时脂肪细胞中C/EBP αmRNA的表达水平和地黄原液对其表达的影响。A:1,4为对照细胞 mRNA,2,3为1％地黄原液处理的细胞mRNA。B：以杂交点的灰度扫 描值为纵坐标比较对照组和药物处理组细胞mRNA，该图显示经地黄 原液处理后，脂肪细胞分化过程中C/EBPαmRNA的表达量显著降低。
图5用RT-PCR的方法，检测脂肪细胞中leptin mRNA表达的 状况，各组均为分化5天，A为电泳的结果，1为标准分子量对照，2 为分化5天的对照组细胞，3为经0.125％地黄原液处理，4为经0.25％ 地黄原液处理，5为经1％浓度地黄原液处理，6为β-actin内对照， 7为leptin DNA阳性对照。B以leptin/β-actin mRNA的灰度扫 描比值为纵坐标直接比较地黄原液对脂肪细胞分化的影响，显示随 着药物浓度的升高，具有增强脂肪细胞中leptin mRNA表达的作用。
图6用Western的方法检测地黄原液对分化1天的脂肪细胞中 C/EBPβ蛋白表达的影响，38KD和18KD分别为C/EBPβ蛋白的两种 异构体蛋白，该图显示在分化1天时，地黄原液对细胞C/EBPβ蛋 白的表达有明显的抑制作用。
图7用Western的方法检测地黄原液对分化5天的脂肪细胞中 422/aP2蛋白表达的影响，A:1,6用4％地黄原液处理，2,5用1％地 黄原液处理，3,4为对照组细胞，B：以蛋白条带的灰度扫描值为纵 坐标比较不同浓度地黄原液处理对细胞表达422/aP2蛋白的影s相c v，显示随着药物浓度的升高，其抑制422/aP2蛋白表达的效应增 强。
图8大鼠的周体重变化曲线，横坐标代表周数，纵坐标为大鼠 的体重，菱形图标代表对照组的大鼠，方形图标代表给药组的大鼠， 显示给药组大鼠的体重明显低于对照组大鼠的体重。
图9大鼠喂养10周后，大鼠腹腔大网膜和副睾脂肪组织分布的 情况，左为对照组的大鼠，右为给药组大鼠，显示给药组的大鼠大 网膜和副睾上脂肪组织量均明显少于对照组。
图10地黄原液对大鼠血脂的影响，显示给药组大鼠的血浆胆固 醇、甘油三酯、血糖水平明显降低，而高密度脂蛋白水平则升高。
图11用RT-PCR方法，检测大鼠脂肪中leptin mRNA表达水平， A：1为标准分子量对照，2,3为对照组大鼠脂肪组织，4,5,6,7 为经给药组大鼠的脂肪组织，8为β-actin内对照，9为leptin 阳性对照。B：以leptin/β-actin的灰度比值为纵坐标直接比较 地黄原液对脂肪细胞分化过程中leptin mRNA水平的影响，给药后 大鼠脂肪组织中leptin mRNA表达增加。