供上文所定义的一种预防病原体所引起的感染或疾病的方法或应用， 所述病原体所含抗原 是免疫原性组合物中抗原的变种。 图形简述
图1： 临床试验 ： 抗 -HA 抗体在不同时间点的几何平均效价 (GMTs)( 免疫原性 ATP 同龄组 )。
图2： 临床试验 ： 在 0 和 21 天具有 95 ％置信区间的 HI 抗体效价的血清保护率 (SPR)( 免疫原性 ATP 同龄组 )。
图3： 临床试验 ： 在 21 天具有 95 ％置信区间的 HI 抗体效价的血清转变率 (SCR) ( 免疫原性 ATP 同龄组 )。
图4： 临床试验 ： 在 21 天具有 95％置信区间的 HI 抗体效价的血清转变因子 (SCF) ( 免疫原性 ATP 同龄组 )。
图5： 小鼠研究 ： 用 异 源 亚 型 株 ( 剂 量 范 围 AS03) 致 敏 的 BALB/c 小 鼠 的 血 凝 抑 制 试 验 (GMT+/-IC95)。 图 5A ： 抗 -A/New Caledonia/20/99HI 效 价 ； 图 5B ： 抗 -A/ Panama/2007/99HI 效价 ； 图 5C ： 抗 -B/Shandong/7/97HI 效价。
图6： 小鼠研究 ： 用异源亚型株 ( 剂量范围 AS03) 致敏的 C57B1/6 小鼠的血凝抑制 试验 (GMT+/-IC95)。
图7： 小鼠研究 ： 用异源亚型株 ( 剂量范围 AS03) 致敏的 C57B1/6 小鼠 PBMC 中的 细胞免疫反应 (CD4+T 细胞 )。
图8： 小鼠研究 ： 用异源亚型株致敏的 C57B1/6 小鼠和用剂量范围 AS03 为佐剂的 低剂量抗原 (0.5μg) 免疫的 C57B1/6 小鼠的 PBMC 中的细胞免疫反应 (CD4+T 细胞 )。
图9： 小鼠研究 ： 免疫后 14 天 (GMT+/-IC95) 两个不同抗原剂量 ： 1.5μg(A、 C 和 E) 或 0.38μg(B、 D 和 F) 的 H5N1- 特异性血清 Ig ELISA 效价 (A 和 B) 和抗 -H5N1IgG1(C 和 D) 和 IgG2b(E 和 F) 同种型反应。
图 10 ： 小鼠研究 ： 免疫后 21 天 (GMT+/-IC95) 两个不同抗原剂量 ： 1.5μg(A) 或 0.38μg(B) 的血凝抑制试验 (GMT+/-IC95)。
图 11 ： 小鼠研究 ： 在用不同剂量 H5N1 疫苗 (1.5 或 0.38μg) 免疫的未接触抗原 C57B1/6 小鼠中的细胞免疫应答 (CD4+T 细胞 )， 所述疫苗辅以剂量范围 AS03 ： (A)1.5μg HA Ag( 抗原 ) 或 (B)0.38μg HA Ag( 抗原 )。
图 12 ： 猪研究： 用 同 源 株 ( 剂 量 范 围 AS03) 致 敏 的 猪 的 血 凝 抑 制 试 验 (GMT+/-IC95)
发明详述
在每种情况下， 发明者意指本文术语 “包含” 和 “包括” 可分别任选取代术语 “含有” 和 “由 ...... 组成” 。
本文中涉及本发明 “疫苗组合物” 的实施方式同样适用于涉及本发明 “免疫原性组 合物” 的实施方式， 反之亦然。
在本发明一个实施方式中， 提供一种包含抗原或抗原组合物以及包含水包油乳剂 的佐剂组合物的疫苗或免疫原性组合物， 其中所述水包油乳剂包含每人剂 0.5-10mg 可代 谢的油、 0.5-11mg 母育酚和 0.4-4mg 乳化剂。
在本发明进一步的实施方式中， 提供了一种包含抗原或抗原组合物以及包含水包
油乳剂的佐剂组合物的疫苗或免疫原性组合物， 其中所述水包油乳剂包含每人剂 0.5-10mg 可代谢的油 ( 如角鲨烯 )、 0.5-11mg 母育酚 ( 如 α- 生育酚 ) 和 0.4-4mg 乳化剂 ( 如聚氧 乙烯山梨糖醇酐单油酸酯 )。
水包油乳剂组分
本发明的佐剂组合物包括水包油乳剂佐剂， 优选所述乳剂包含 0.5-10mg 的量的 可代谢的油、 0.5-11mg 的量的母育酚和 0.4-4mg 的量的乳化剂并且具有油滴， 至少 70 ％ ( 强度 ) 的所述油滴直径小于 1μm。
为了使任何水包油组合物适合于人类给药， 乳化剂体系的油相须包含可代谢的 油。术语可代谢的油的意思已为本领域所熟知。 “可代谢的” 可被定义为 “能够通过代谢作 用转变” (Dorland 的医学词典解释， W.B.Sanders 公司， 第 25 版本 (1974))。所述油可以 是任何对受体无毒并可通过代谢作用转化的植物油、 鱼油、 动物油或合成油。坚果、 种子和 谷物是常见的植物油来源。合成油也是本发明的一部分， 可包括市售的油如 NEOBEE0 和其 它。特别合适的可代谢的油是角鲨烯。角鲨烯 (2， 6， 10， 15， 19， 23- 六甲基 -2， 6， 10， 14， 18， 22- 二十四碳己烯 ) 是一种在鲨鱼肝油中大量发现的未饱和的油， 在橄榄油、 小麦胚芽油、 米糠油和酵母中含量较低， 是本发明所使用的特别优选的油。 角鲨烯是一种可代谢的油， 因 为它是胆固醇的生物合成的中间产物 (Merck 索引， 第 10 版本， 登记号 8619)。 在佐剂组合物中可代谢的油合适地以 0.5-10mg 的量存在， 优选 1-10、 2-10、 3-9、 4-8、 5-7 或 5-6mg( 例如 2-3、 5-6 或 9-10mg)， 特别是 5.35mg 或 2.14mg。在本发明进一步的 实施方式中， 可代谢的油在疫苗 ( 或免疫原性 ) 组合物中以 0.5-10mg 的量存在， 优选 1-10、 2-10、 3-9、 4-8、 5-7 或 5-6mg( 例如 2-3、 5-6 或 9-10mg)， 特别是 5.35mg 或 2.14mg。
可代谢的油在疫苗或免疫原性组合物中的量可以用总组合物的百分比来表示。 在 疫苗组合物中的可代谢的油适合地以组合物总体积的油的 0.5％ -2％存在， 优选 0.25-2 或 0.25-1.75 或 0.5-1.65 或 0.6-1.5 或 0.8-1.4 或 1-1.25％ (v/v)。
在另一个具体实施方式中， 可代谢的油的最终量大约占疫苗 ( 或免疫原性 ) 组合 物总体积的 1.25％。在另一个具体实施方式中， 可代谢的油的最终量为组合物总体积的 0.25％ (v/v)。
以澄清的方式， 应用以下转换因子可将 v/v 表示的浓度转换为 w/v 表示的浓度 ： 5％ (v/v) 角鲨烯浓度相当于 4.28％ (w/v) 角鲨烯浓度。
水包油乳剂包含母育酚。母育酚为本领域所熟知并在 EP0382271 中描述。合适的 母育酚是 α- 生育酚或其衍生物如 α- 生育酚琥珀酸酯 ( 也称作维生素 E 琥珀酸酯 )。 所述 母育酚合适地以 0.5-11mg 的量佐剂组合物中存在， 优选 1-11、 2-10、 3-9、 4-8、 5-7、 5-6( 例 如 10-11、 5-6、 2.5-3.5 或 1-3mg)。在一个具体实施方式中， 母育酚存在的量为 5.94mg 或 2.38mg。 在进一步的实施方式中， 所述母育酚合适地以 0.5-11mg 的量在疫苗 ( 或免疫原性 ) 组合物中存在， 优选 1-11、 2-10、 3-9、 4-8、 5-7、 5-6( 例如 10-11、 5-6、 2.5-3.5 或 1-3mg)。 在 一个具体实施方式中， 所述母育酚存在的量为 5.94mg 或 2.38mg。
母育酚的量可表示为疫苗或免疫原性组合物总体积的百分比。母育酚在疫苗 组合物中合适以免疫原性组合物总体积的 0.25 ％ -2 ％ (v/v) 存在， 优选为 0.25-2， 包括 0.25-2、 或 0.25-1.75、 或 0.5-1.65、 或 0.6-1.5、 或 0.8-1.4 或 1-1.25％ (v/v) 总体积的母 育酚。
优选母育酚的量在疫苗 ( 或免疫原性 ) 组合物总体积的 0.2％和 2％ (v/v) 之间， 更优选为占 0.5ml 剂量的 1.25％ (v/v) 的量。
在一个具体实施方式中， 所述母育酚最终量为疫苗或免疫原性组合物总体积的约 1.25％。在另一个具体实施方式中， 所述母育酚最终量为总体积的 0.25％ (v/v) 或 0.5ml 剂量的 1.25％ (v/v) 或 0.7ml 剂量的 0.9％ (v/v)， 或 0.5ml 剂量的 0.5％ (v/v) 或 0.7ml 疫苗或免疫剂量的 0.35-0.37％， 优选 0.36％。
以澄清的方式， 可利用以下转换因子将给定的 v/v 浓度转化为 w/v 浓度 ： 5％ (v/ v)α- 生育酚浓度相当于 4.8％ (w/v)α- 生育酚浓度。
水包油乳剂进一步包含乳化剂。乳化剂合适地是聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。 在一个具体实施方式中， 乳化剂可选自 ： 聚山梨酸
80 或80。所 述 乳 化 剂 合 适 地 以 0.1-5、 0.2-5、 0.3-4、 0.4-3 或 2-3mg( 例 如 0.4-1.2、 2-3 或 4-5mg) 乳化剂的量存在于佐剂组合物中。在一个具体实施方式中， 乳化剂存在的量为 0.97mg 或 2.425mg。
此外， 所述乳化剂合适地以 0.1-5、 0.2-5、 0.3-4、 0.4-3 或 2-3mg( 例如 0.4-1.2、 2-3 或 4-5mg) 乳化剂的量存在于疫苗或免疫原性组合物中。在一个具体实施方式中， 乳化 剂存在的量为 0.97mg 或 2.425mg。
乳化剂的量可表示为疫苗或免疫原性组合物总体积的百分比。乳化剂合适地 以组合物总体积的 0.125-0.8 ％ (v/v) 存在于疫苗 ( 或免疫 ) 组合物中， 优选总体积的 0.08-.05、 或 0.1-0.7、 或 0.2-0.6、 或 0.25-0.55、 或 0.3-0.52 或 0.4-0.5％ (v/v)。在一个 具体实施方式中， 乳化剂存在的量为疫苗或免疫原性组合物总体积的 1％、 0.5％或 0.2％ (v/v)。
以澄清的方式， 利用以下转换因子可将给定的 v/v 浓度转换成 w/v 浓度 ： 1.8 ％ (v/v) 聚山梨酸酯 80 浓度相当于 1.91％ (w/v)) 聚山梨酸酯 80 浓度。
在一个具体实施方式中， 0.5ml 的疫苗或免疫原性剂量含有 0.45％ (v/v) 的 Tween 80， 0.7ml 剂量含有 0.315 ％ (v/v)Tween 80。在另一个具体实施方式中， 0.5ml 剂量含有 0.18％ (v/v) 乳化剂， 0.7ml 疫苗或免疫原性组合物剂量含有 0.126％ (v/v) 乳化剂。
术语 “人剂” 是指适合于人使用的量的剂量。通常在 0.25 和 1.5ml 之间。在一个 实施方式中， 人剂量为 0.5ml。在进一步的实施方式中， 人剂量高于 0.5ml， 例如 0.6、 0.7、 0.8、 0.9 或 1ml。在进一步的实施方式中， 人剂量在 1ml 和 1.5ml 之间。在另一个实施方式 中， 特别是当免疫原性组合物是针对小儿群体时， 人剂量可小于 0.5ml 如在 0.25 和 0.5ml 之间。 本发明特征在于免疫原性组合物中佐剂的每一或所有个体成分的水平低于如上所述 的以前认为有用且为通常使用的水平。特别合适的组合物包含在人剂量最终量为 0.5ml 中 的以下量的下列佐剂组合物的 ：
表1
例如但不排除表 1 中所示的， 本发明进一步提供包含如本文上面所定义的个别组 分和上面所定义的含量的佐剂组合物。通常这样的佐剂组合物在人剂量中有合适的量。如 果佐剂是以液体形式与液体形式的抗原组合物结合， 那么所述佐剂组合物在人剂量中有合 适的量， 其为预期的人剂量最终量的一部分， 例如大约为预期的人剂量最终量的一半， 例如 预期的 0.7ml 人剂量中含有 350μl 的量， 或预期的 0.5ml 人剂量中含有 250μl 的量。 当佐 剂组合物与抗原组合物结合提供疫苗最终人剂量时， 佐剂组合物被稀释。这种剂量的最终 量当然根据佐剂组合物的初始量和加到佐剂组合物中的抗原组合物的量而变化。 在一个替 代实施方式中， 液体佐剂用于重建冻干的抗原组合物。 在该实施方式中， 佐剂组合物的人剂 量适合量大约等于人剂量最终量。将液体佐剂组合物加到含有冻干抗原组合物的小瓶内。 最终的人剂量可在 0.5 和 1.5ml 之间变化。
本领域技术人员已熟知生产水包油乳剂的方法。 通常该方法包括将含有母育酚的 TM 油相与表面活性剂如 PBS/TWEEN80 溶液混合， 接着用匀化器进行匀化， 本领域的熟练技术 人员很清楚用注射器针头传送混合物两次的方法适合于匀化小量的液体。同样， 本领域技 术人员可调节微射流纳米匀质机 (M110S 微射流机， 在最大压力输入为 6bar( 输出压力大约 850bar) 时， 2 分钟期间内的最大次数为 50 次 ) 的乳化方法以生产较大或较小量的乳化剂。 该调节可通过常规实验达到， 所述常规实验包括生成的乳化剂的测量到所需直径油滴的制 备完成。
在水包油乳剂中， 油和乳化剂应该处于水性载体中。水性载体可以是例如磷酸盐 缓冲盐水。
本发明优选的水包油乳剂体系含有亚微米范围大小的小油滴。 合适的油滴大小范 围在 120-750nm， 更优选大小其直径为 120-600nm。最优选水包油乳剂含有根据强度至少 70％的直径小于 500nm 的油滴、 更优选根据强度至少 80％的直径小于 300nm 的油滴、 更优选 根据强度至少 90％的直径在 120-200nm 范围内的油滴。
根据强度给出本发明油滴的大小即直径。 有几种根据强度测量油滴直径大小的方 法。强度利用大小测定仪来测量， 更适合地用动态光散射法如 MalvemZetasizer 4000 或优 选 Malvern Zetasizer 3000HS 来测量。在实施例 II.2 中给出详细的步骤。第一个可能性 是通过动态光散射法 (PCS- 光子相关光谱法 ) 测量 z 平均直径 ZAD ； 该方法另外给出多分
散性指数 (PDI)， ZAD 和 PDI 都用累积量算法来计算。这些值不需要粒子折射指数的知识。 第二个平均值是利用其它运算法如 Contin 或 NNLS 或自动 “Malvern” ( 为大小测定仪提供 的默认算法 ) 通过测量整个颗粒的大小分布计算油滴的直径。大多数时间， 由于复杂的组 合物的粒子折射指数未知， 仅考虑强度分布， 如果需要， 考虑源自该分布的强度平均值。
任选的免疫刺激剂
在本发明进一步的实施方式中， 提供了疫苗或免疫原性组合物， 所述疫苗或免疫 原性组合物包含抗原或抗原组合物和含有水包油乳剂的佐剂组合物以及任选一种或多种 另外的免疫刺激剂， 其中所述水包油乳剂包含 0.5-10mg 可代谢的油、 0.5-11mg 母育酚和 0.4-4mg 乳化剂。
在一个实施方式中， 所述佐剂组合物包含本文所述的水包油乳剂。在另一实施方 式中所述佐剂组合物可进一步包含一种或多种另外的佐剂或免疫刺激剂。 在进一步的实施 方式中， 所述佐剂组合物任选包含一种或多种不同于 QS21 和 / 或 MPL 的另外的佐剂或免疫 刺激剂。
任选的另外的佐剂选自 ： 皂苷， 脂质 A 或其衍生物， 免疫刺激寡核苷酸， 烷基氨基 葡糖苷磷酸盐， 金属盐， Toll- 样受体激动剂或它们的组合。优选的佐剂是 Toll- 样受体激 动剂， 特别是 Toll- 样受体 2， 3， 4， 7， 8 或 9 的激动剂， 或者皂苷。进一步优选佐剂体系包 含两个或更多个来自以上列出的佐剂。优选的组合包括皂苷 ( 特别是 QS21) 佐剂和 / 或 Toll- 样受体 4 激动剂如如 3D-MPL 或 Toll- 样受体 9 激动剂如含有免疫刺激寡核苷酸的 CpG。其它优选的组合包括皂苷 ( 特别是 QS21) 和 Toll- 样受体 4 激动剂如皂苷 ( 特别是 QS21) 和 Toll- 样受体 4 配体如 3D-MPL 或烷基氨基葡糖苷磷酸盐。
在一个实施方式中， 另一个佐剂是 Toll- 样受体 (TLR)4 配体， 优选的激动剂如脂 质 A 衍生物， 特别是单磷酰脂质 A 或更具体是 3 脱酰化单磷酰脂质 A(3D-MPL)。
可使用具有葛兰素史克生物制剂北美公司商标 的 3D-MPL， 其主要以 IFN-g(Th1) 表型促进 CD4+T 细胞反应。可用在 GB 2220211A 中公开的方法进行生产。其 化学成分是带有 3， 4， 5， 6 酰基化链的 3- 脱酰单磷酰脂 A 的混合物。在本发明的组合物中 优选使用小颗粒的 3D-MPL。小颗粒 3D-MPL 具有可经过 0.22μm 过滤器进行无菌过滤的粒 度。这样的制剂在国际专利申请 No.WO 94/21292 中有所描述。脂质 A 的合成衍生物是已 知的并被认为是 TLR 4 激动剂， 包括但不限于 ：
OM174(2- 脱 氧 -6- 氧 -[2- 脱 氧 -2-[(R)-3- 十 二 酰 氧 基 四 - 葵 酰 基 氨 基 ]-4- 氧 - 磷酰基 -β-D- 吡喃葡糖基 ]-2-[(R)-3- 羟基四葵酰基氨基 ]-α-D- 吡喃葡糖 二氢磷酸盐 )， (WO 95/14026)
OM 294DP(3S， 9R)-3-[(R)- 十 二 酰 氧 基 四 葵 酰 基 氨 基 ]-4- 氧 代 -5- 氮 杂 -9(R)-[(R)-3- 羟 基 四 葵 酰 基 氨 基 ] 葵 -1， 10- 二 醇， 1， 10- 双 ( 二 氢 磷 酸 盐 ) (WO99/64301 和 WO 00/0462)
OM 197MP-Ac DP(3S-， 9R)-3-[(R)-d 十二酰氧基四葵酰基氨基 ]-4- 氧代 -5- 氮 杂 9-[(R)-3- 羟基四葵酰基氨基 ] 葵 -1， 10- 二醇， 1- 二氢磷酸盐 10-(6- 氨基己酸酯 )(WO 01/46127)
其它可使用的 TLR4 配体是烷基氨基葡糖苷磷酸盐 ((AGP)， 如在 WO9850399 或 US6303347 中所公开的那些 ( 还公开了 AGPs 制备过程 )， 或如在 US6764840 所公开的 AGP的药学上可接受的盐。一些 AGP 是 TLR4 激动剂， 一些是 TLR4 拮抗剂。两者都可被用作佐 剂。
能 够 通 过 TLR-4 引 起 信 号 应 答 的 其 它 合 适 的 TLR-4 配 体 (Sabroe 等， JI2003p1630-5) 是， 例如， 来自革兰氏阴性菌的脂多糖和其衍生物， 或其片段， 特别是 LPS 的非毒性衍生物 ( 如 3D-MPL)。其它合适的 TLR 激动剂是 ： 热休克蛋白 (HSP)10、 60、 65、 70、 75 或 90 ； 表面活性剂蛋白 A， 透明质酸低聚糖， 类肝素硫酸盐片段， 纤连蛋白片段， 纤维蛋白 源肽和 b- 防御素 -2， 胞壁酰二肽 (MDP) 或呼吸道合胞病毒 F 蛋白。在一个实施方式中 TLR 激动剂是 HSP60、 70 或 90。
Toll- 样受体 (TLR) 是 I 型跨膜受体， 在昆虫与人之间进化上保守。 至今已建立了 10 个 TLR(TLR 1-10)(Sabroe 等， JI 2003p1630-5)。TLR 家族成员有相似的胞外和胞内结 构域 ； 它们的胞外结构域显示含有富亮氨酸重复序列， 它们的胞内结构域与白细胞介素 -1 受体 (IL-1R) 的胞内区域相似。 TLR 细胞在免疫细胞和其它细胞 ( 包括血管上皮细胞， 脂肪 细胞、 心肌细胞和肠上皮细胞 ) 中的表达不同。 TLR 的胞内结构域可与连接蛋白 Myd88 相互 作用， 其在细胞质区域还具有 IL-1R 结构域， 导致细胞因子的 NF-KB 活化 ； 该 Myd88 途径是 TLR 活化作用通过它影响细胞因子释放的一种方式。TLR 的主要表达是在如抗原呈递细胞 ( 如树状细胞， 巨噬细胞等 ) 的细胞类型中进行的。 由 TLR 刺激作用对树状细胞的活化导致树状细胞的成熟以及炎症细胞因子如 IL-12 的生成。 尽管一些激动剂对于几个 TLR 相同， 迄今为止进行的研究业已发现 TLR 识别 不同类型的激动剂。 TLR 激动剂主要源自细菌或病毒， 并包括分子如鞭毛蛋白或细菌脂多糖 (LPS)。
“TLR 激动剂” 意思是能够作为直接的配体或者间接地通过内源性或外源性配体的 生成 (Sabroe 等， JI 2003p1630-5) 经 TLR 信号途径引起信号应答的组分。
在另一个实施方式中， TLR 分子的其它天然或合成的激动剂用作任选的附加免疫 刺激剂。这些包括但不限于 TLR2、 TLR3、 TLR7、 TLR8 和 TLR9 的激动剂。
在本发明一个实施方式中， 所使用的 TLR 激动剂能够通过 TLR-1 引起信号应 答 (Sabroe 等， JI 2003p1630-5)。 合 适 地， 能 够 通 过 TLR-1 引 起 信 号 应 答 的 TLR 激 动 剂选自 ： 三酰化脂肽 (LPs) ； 酚溶调控蛋白 ； 结核分枝杆菌 LP ； S-(2， 3- 二 ( 十六酰基氧 基 )-(2-RS)- 丙基 )-N- 十六酰基 -(R)- 半胱氨酸 -(S)- 丝氨酸 -(S)- 赖氨酸 (4)-OH、 模拟 来自伯氏疏螺旋体的细菌脂蛋白和 OspA LP 的酰化氨基末端的三盐酸化物 (Pam3Cys)LP。
在一个替代的实施方式中， 所使用的 TLR 激动剂能够通过 TLR-2 引起信号应答 (Sabroe 等， JI 2003p1630-5)。 合适地， 能够通过 TLR-2 引起信号应答的 TLR 激动剂是一种 或多种脂蛋白， 肽聚糖， 来自结核分枝杆菌、 伯氏疏螺旋体菌、 苍白螺旋体的细菌脂肽 ； 来自 包括金黄色葡萄球菌种的肽聚糖 ； 脂磷壁酸， 甘露糖醛酸， 奈瑟菌属孔蛋白， 细菌菌毛蛋白， 耶尔森氏病毒性因子， CMV 病毒粒子， 麻疹血凝素， 以及来自酵母的酵母多糖。
在一个替代的实施方式中， 所使用的 TLR 激动剂能够通过 TLR-3 引起信号应答 (Sabroe 等， JI 2003p1630-5)。合适地， 能够通过 TLR-3 引起信号应答的 TLR 激动剂是双 链 RNA(dsRNA)， 或聚肌胞苷酸 (Poly IC)， 与病毒感染有关的分子核酸模式。
在一个替代的实施方式中， 所使用的 TLR 激动剂能够通过 TLR-5 引起信号应答 (Sabroe 等， JI 2003p1630-5)。合适地， 能够通过 TLR-5 引起信号应答的 TLR 激动剂是细
菌菌毛蛋白。
在一个替代的实施方式中， 所使用的 TLR 激动剂能够通过 TLR-6 引起信号应答 (Sabroe 等， JI 2003p1630-5)。 合适地， 能够通过 TLR-6 引起信号应答的 TLR 激动剂是分枝 杆菌脂蛋白、 二酰化 LP 和酚溶调控蛋白。另外的 TLR6 激动剂在 WO2003043572 中有描述。
在一个替代的实施方式中， 所使用的 TLR 激动剂能够通过 TLR-7 引起信号应答 (Sabroe 等， JI 2003p1630-5)。合适地， 能够通过 TLR-7 引起信号应答的 TLR 激动剂是单 链 RNA(ssRNA)、 洛索立宾、 位于 N7 和 C8 的鸟苷类似物或咪唑喹啉化合物或其衍生物。 在一 个实施方式中， TLR 激动剂是咪喹莫德。另外的 TLR7 激动剂在 WO02085905 中有描述。
在一个替代的实施方式中， 所使用的 TLR 激动剂能够通过 TLR-8 引起信号应答 (Sabroe 等， JI 2003p1630-5)。合适地， 能够通过 TLR-8 引起信号应答的 TLR 激动剂是单 链 RNA(ssRNA)、 有抗病毒活性的咪唑喹啉分子， 例如瑞喹莫德 (R848) ； 瑞喹莫德还能够被 TLR-7 识别。其它可使用的 TLR-8 激动剂包括在 WO2004071459 中所描述的那些。
还可使用免疫刺激寡核苷酸或任何其它 Toll 样受体 (TLR)9。用于本发明佐剂或 疫苗或免疫原性组合物的优选的寡核苷酸是含有寡核苷酸的 CpG， 优选含有两个或更多个 二核苷酸 CpG 基序， 其被至少三个、 更优选至少六个或更多个核苷酸所分离。CpG 基序是 连接着鸟嘌呤核苷酸的胞嘧啶核苷酸。本发明的 CpG 寡核苷酸是典型的脱氧核苷酸。在 一个优选的实施方式中， 尽管磷酸二酯和其它核苷酸间键合在本发明范围之内， 但寡核苷 酸之间的核苷酸键合是二硫代磷酸酯， 或更优选硫代磷酸酯键。在本发明范围之内还包 括带有混合核苷酸间键合的寡核苷酸。生产硫代磷酸寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法在 US5,666,153、 US5,278,302 和 WO95/26204 中有所描述。
优选的寡核苷酸实施例具有以下序列。 所述序列优选含有硫代磷酸酯修饰的核苷 酸间键合。
OLIGO 1(SEQ ID NO ： 1) ： TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)
OLIGO 2(SEQ ID NO ： 2) ： TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)
OLIGO 3(SEQ ID NO ： 3) ： ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
OLIGO 4(SEQ ID NO ： 4) ： TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)
OLIGO 5(SEQ ID NO ： 5) ： TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)
OLIGO 6(SEQ ID NO ： 6) ： TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G(CpG 5456)
替代的 CpG 寡核苷酸可包含以上优选的序列， 其中它们含有不重要的缺失或添 加。 本发明所使用的 CpG 寡核苷酸可用本领域所知的任何方法合成 ( 例如参见 EP 468520)。 方便的是， 这种寡核苷酸可利用自动合成仪进行合成。
因此， 在另一个实施方式中， 佐剂组合物进一步包含另外的免疫刺激剂， 其选自 ： TLR-1 激动剂、 TLR-2 激动剂、 TLR-3 激动剂、 TLR-4 激动剂、 TLR-5 激动剂、 TLR-6 激动剂、 TLR-7 激动剂、 TLR-8 激动剂、 TLR-9 激动剂或其组合。
本发明所使用的另一优选的免疫刺激剂是 Quil A 及其衍生物。Quil A 是一种从 南非树 Quilaja Saponaria Molina 中分离的皂苷制剂， 其在 1974 年首先被 Dalsgaard 等 描述为具有佐剂活性 (“皂苷佐剂” ， Archiv.für die gesamteVirusforschung， Vol.44， Springer Verlag， Berlin， p243-254)。已用 HPLC 分离到保持佐剂活性而无与 Quil A 相关 毒性的纯化的 Quil A 片段 (EP 0362278)， 例如 QS7 和 QS21( 也称为 QA7 和 QA21)。 QS-21 是来自莫里纳地区 Quillajasaponaria 树皮的天然皂苷， 其诱导 CD8+ 细胞毒性 T 细胞 (CTL)、 Th1 细胞和主要的 IgG2a 抗体反应， 是本发明上下文中优选的皂苷。
已经描述了特别优选的 QS21 具体制剂， 这些制剂进一步包含甾醇 (WO96/33739)。 其中包含了角鲨烯和皂苷 ( 任选 QS21)， 在制剂中还包含甾醇 ( 任选胆固醇 ) 是有益的， 因 为这可能降低乳化剂中油的总水平。 这将带来生产成本的降低， 免疫的总体舒适度的改善， 以及所获得的免疫应答的定性定量改进如改进的 IFN-γ 产生。因此， 本发明佐剂体系通常 包含可代谢的油 ： 皂苷 (w/w) 的比例范围为 200 ∶ 1-300 ∶ 1， 本发明还可以 “低油” 的形 式使用， 其任选范围是 1 ∶ 1-200 ∶ 1， 任选 20 ∶ 1-100 ∶ 1， 或基本上 48 ∶ 1， 该疫苗保留 所有组分的有益的佐剂性质， 以及大大降低的反应原性特征。 因此， 一些实施方式具有角鲨 烯： QS21(w/w) 的比例范围为 1 ∶ 1-250 ∶ 1， 或 20 ∶ 1-200 ∶ 1， 或 20 ∶ 1-100 ∶ 1， 或基 本上 48 ∶ 1。还任选包括甾醇 ( 例如胆固醇 )， 其以上述的皂苷 ： 甾醇的比例存在。
抗原和抗原组合物
疫苗或免疫原性制剂含有能够诱发针对人或动物病原体的免疫反应的葡萄球菌 糖和 / 或蛋白。
多糖 本发明免疫原性组合物任选包含 PNAG、 336 抗原和 / 或来自金黄色葡萄球菌 (S.aureus) 的 5 型和 / 或 8 型多糖。
PNAG
现在很明显各种形式的鉴定为 PS/A、 PIA 和 SAA 的葡萄球菌表面多糖是同样的化 学实体 -PNAG(Maira-Litran 等， 疫苗 22 ； 872-879(2004))。因此， 术语 PIA 或 PNAG 包括所 有这些从其衍生的多糖或寡糖。
PIA 是一种多糖胞间黏附素， 由被 N- 乙酰和 O- 琥珀酰组分取代的 β-(1 → 6)- 连 接的氨基葡萄糖组成。该多糖存在于金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌 (S.epidermidis)， 可从其中任一来源中分离得到 (Joyce 等 2003， 糖类研究 338 ； 903 ； Maira-Litran 等 2002， Infect.Imun.70 ； 4433)。 例 如， PNAG 可 从 金 黄 色 葡 萄 球 菌 菌 株 MN8m 中 分 离 得 到 (WO 04/43407)。
从表皮葡萄球菌中分离的 PIA 是生物膜不可缺少的组成部分。它负责介导细 胞 - 细胞黏着， 并还可能起着屏蔽来自宿主免疫应答的生长菌落的作用。
由 于 N- 琥 珀 酰 化 的 鉴 定 是 错 误 的， 最 近 得 知 先 前 命 名 为 多 聚 -N- 琥 珀 酰 -β-(1 → 6)- 氨基葡萄糖 (PNSG) 的多糖不具备预期的结构 (Maira-Litran 等 2002， Infect.Imun.70 ； 4433)。因此术语 PIA 同样包括形式上名为 PNSG 而现在发现是 PNAG 的多 糖。
PIA( 或 PNAG) 可有不同的大小， 其变化从 400kDa 以上到 75 和 400kDa 之间到 10 和 75kDa 之间到由多达 30 个重复单位 ( 被 N- 乙酰和 O- 琥珀酰组分取代的 β-(1 → 6)- 连 接的氨基葡萄糖 ) 组成的寡糖。任何大小的 PIA 多糖或寡糖可用于本发明的免疫原性组合 物， 然而优选超过 40kDa 的大小。可以用本领域任何已知的方法例如微流态化法、 超声辐射 或化学裂解确定大小 (WO03/53462、 EP497524、 EP497525)。
在一个实施方式中， PIA(PNAG) 的大小范围是 40-400kDa、 50-350kDa、 40-300kDa、 60-300kDa、 50-250kDa 和 60-200kDa。
由于乙酸根取代氨基， PIA(PNAG) 可有不同程度的乙酰化。体外生成的 PIA 的氨 基几乎全部被取代 (95-100％ )。或者， 可被使用的脱乙酰化 PIA(PNAG) 有少于 60％， 优选 少于 50％、 40％、 30％、 20％、 10％的乙酰化。优选使用脱乙酰化 PIA(PNAG)， 因为 PNAG 的非 乙酰化表位在介导革兰氏阳性细菌 ( 优选金黄色葡萄球菌和 / 或表皮葡萄球菌 ) 的调理性 杀伤方面是有效的。最优选的是， PIA(PNAG) 的大小在 40kDa 和 300kDa 之间并被脱乙酰化 以至于少于 60％、 50％、 40％、 30％或 20％的氨基被乙酰化。
术语脱乙酰化 PNAG(dPNAG) 是指 PNAG 多糖或寡糖， 其少于 60％、 50％、 40％、 30％、 20％或 10％的氨基被乙酰化。
在一个实施方式中， 通过化学处理天然多糖使 PNAG 脱去乙酰形成 dPNAG。例如， 用碱性溶液处理天然 PNAG 使 pH 升至 10 以上。例如， 用 0.1-5M、 0.2-4M、 0.3-3M、 0.5-2M、 0.75-1.5M 或 1M NaOH、 KOH 或 NH4OH 处理 PNAG。 在 20-100、 25-80、 30-60 或 30-50 或 35-45℃ 的温度下处理至少 10 或 30 分钟， 或 1、 2、 3、 4、 5、 10、 15 或 20 小时。可如在 WO 04/43405 中 所描述的那样制备 dPNAG。
本发明免疫原性组合物所包括的多糖可与如下所述的载体蛋白任选缀合或者选 择不缀合。
来自金黄色葡萄球菌的 5 型和 8 型多糖
大多数引起人感染的金黄色葡萄球菌菌株含有 5 型或者 8 型多糖。大约 60％感 染人的菌株是 8 型而大约 30％是 5 型。5 型和 8 型荚膜多糖抗原的结构在 Moreau 等人的 “糖类研究” 201 ； 285(1990) 和 Fournier 等人的 “感染免疫” 45 ； 87(1984) 中有所描述。在 它们的重复单位中都有可被用来引入巯基的 FucNAcp 和 ManNAcA。其结构报道为 ：
5型
→ 4)-β-D-ManNAcA(3OAc)-(1 → 4)-α-L-FucNAc(1 → 3)-β-D-FucNAc-(1 →
8型
→ 3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1 → 3)-α-L-FucNAc(1 → 3)-β-D-FucNAc-(1 →
最近 (Jones“糖类研究” 340， 1097-1106(2005)) 核磁共振波谱法修改结构为 ：
5型
→ 4)-β-D-ManNAcA-(1 → 4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1 → 3)-β-D-FucNAc-(1 →
8型
→ 3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1 → 3)-α-L-FucNAc(1 → 3)-α-D-FucNAc(1 →
如在 US6294177 中所描述的那样， 可用技术人员所熟悉的方法从合适的金黄色葡 萄球菌菌株中提取多糖。例如， ATCC 12902 是 5 型金黄色葡萄球菌菌株而 ATCC 12605 是 8 型金黄色葡萄球菌菌株。
多糖具有天然大小， 或者可替代地用例如微流态化法、 超声波照射或化学处理确 定其大小。本发明还包含了源自金黄色葡萄球菌的 5 型和 8 型多糖的寡糖。
本发明免疫原性组合物所包含的 5 型和 8 型多糖优选与以下所述的载体蛋白缀合 或者选择不缀合。
本发明的免疫原性组合物选择地包含 5 型或 8 型多糖。
金黄色葡萄球菌 336 抗原
在一个实施方式中， 本发明免疫原性组合物包含 US6294177 中所述的金黄色葡萄球菌 336 抗原。
336 抗原包含 β- 连接的己糖胺， 含有非 O- 乙酰基团， 与储存在 ATCC55804 下的抗 金黄色葡萄球菌 336 型抗体特异性结合。
在一个实施方式中， 所述 336 抗原是具有天然大小或者可选择地利用例如微流态 化法、 超声波照射或化学处理确定其大小的多糖。本发明还包括源自 336 抗原的寡糖。
本发明免疫原性组合物所包含的 336 抗原优选与以下所述的载体蛋白缀合或者 可选择地不缀合。
来自表皮葡萄球菌的 I、 II 和 III 型多糖
表皮葡萄球菌菌株 ATCC-31432、 SE-360 和 SE-10 的特征是分别具有三种不同的荚 膜类型 I、 II 和 III(Ichiman 和 Yoshida 1981， J.Appl.Bacteriol.51 ； 229)。从表皮葡萄 球菌的每种血清型提取的荚膜多糖组成了 I、 II 和 III 型多糖。可用几种方法提取多糖， 这些方法包括在 US4197290 中所述的方法或在 Ichiman 等人 1991， J.Appl.Bacteriol.71 ； 176 中所述的方法。
在本发明的一个实施方式中， 免疫原性组合物包含来自表皮葡萄球菌的 I 型和 / 或 II 型和 / 或 III 型多糖或寡糖。
多糖具有天然大小， 或者可选择地利用例如微流态化法、 超声波照射或化学裂解 确定其大小。本发明还包括从表皮葡萄球菌菌株提取的寡糖。
这些多糖是非缀合的或优选如下所述缀合的。
糖的缀合
与多糖在接种免疫中的应用的相关问题中， 事实上多糖本身是很差的免疫原。被 设计用来克服这种免疫原性缺乏的策略包括将多糖与提供旁侧效应 T- 细胞援助的大分子 蛋白载体的连接。优选本发明所使用的多糖与提供旁侧效应 T- 细胞援助的蛋白载体相连 接。 这些通常用来与多糖或寡糖免疫原相偶连的载体的实例包括白喉和破伤风类毒素 (DT， DT Crm197 和 TT)、 镇眼帽贝血蓝蛋白 (KLH)、 绿脓假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 胞 外蛋白 A(rEPA) 和纯化的结核菌素蛋白衍生物 (PPD)、 来自流感嗜血杆菌 (Haemophilus influenzae) 的蛋白 D、 肺炎链球菌溶血素或上述的任何一种的片段。适用的片段包括含有 T 辅助细胞表位的片段。具体而言， 蛋白 D 片段优选含有该蛋白 N- 末端的 3/1。蛋白 D 是 来自流感嗜血杆菌 (Haemophilus influenzae) 的 IgD- 结合蛋白 (EP 0594610B1)。
尽管经常使用这些载体以及它们在诱导抗多糖抗体应答方面取得成功， 但它们仍 涉及几个缺陷。例如， 已知抗原特异性免疫应答可被预先存在的针对载体 ( 在此情况下为 破伤风毒素 ) 的抗体所抑制 (Di John 等， “柳叶刀” ， 1989 年 12 月 16 日 )。对于大量人群来 说， 非常高百分比的人对 DT 和 TT 均具有预存免疫力， 因为人们用这些抗原进行常规接种。 例如在英国 95％的儿童接受同时含有 DT 和 TT 的 DTP 疫苗。其他作者已描述了在动物模型 中对多肽疫苗的表位抑制问题 (Sad 等， “免疫学” ， 1991 ； 74 ： 223-227 ； Schutze 等， “免疫学 杂志” 135 ： 4， 1985 ； 2319-2322)。
已知 KLH 为有效免疫原， 并在人类临床试验中用作 IgE 肽的载体。然而， 已经注意 到一些不利的反应 (DTH- 样反应或 IgE 致敏性 ) 以及针对抗体的抗体应答。
用于本发明免疫原性组合物中的另一载体蛋白是单一的葡萄球菌蛋白或其片段 或包含至少或确切地 1、 2、 3 或 4 或更多的下节所列的葡萄球菌蛋白的融合蛋白或其片段。特别有益于在葡萄球菌疫苗的情形下的应用的新的载体蛋白是葡萄球菌 α- 类 毒素。 可将天然的形式与多糖缀合， 因为缀合的过程可降低毒性。 优选将基因脱毒的 α- 毒 素如 His35Leu 或 His 35Arg 变异体用作载体， 因为其残余毒性较低。可选择的 α- 毒素是 通过用交联剂、 甲醛、 戊二醛进行处理化学脱毒的。基因脱毒 α- 毒素是任选的化学脱毒， 优选通过使用交联剂、 甲醛或戊二醛进行处理以进一步降低毒性。其它葡萄球菌蛋白或其 片段， 特别是以上所列的那些可被用作以上所列多糖的载体蛋白。所述载体蛋白可以是含 有以上所列的至少或确切地 1、 2、 3、 4 或 5 种葡萄球菌蛋白的融合蛋白。
可通过任何已知的方法 ( 例如， Likhite， 美国专利 4,372,945， Armor 等， 美国专利 4,474,757 和 Jennings 等， 美国专利 4,356,170) 将多糖连接到载体蛋白。优选实行 CDAP 缀合化学法 ( 参见 WO95/08348)。
在 CDAP 中， 氰化试剂 1- 氰基 - 二甲氨基吡啶四氟硼酸酯 (CDAP) 优选用于多 糖 - 蛋白质缀合物的合成。氰化反应可在相对温和的条件下进行， 可避免碱性敏感多糖的 水解。该合成反应允许直接偶合载体蛋白。
多糖可溶解于水或盐溶液中。可将 CDAP 溶解在乙腈中并立即加到多糖溶液中。 CDAP 与多糖的羟基反应生成氰酸酯。活化步骤之后， 加入载体蛋白。赖氨酸的氨基与活化 的多糖反应形成异脲共价键。 偶联反应之后， 加入过量的甘氨酸终止残余的活化官能团。 然 后将产物经过凝胶过滤柱除去未反应的载体蛋白和残余试剂。 蛋白
本发明免疫原性组合物任选包含葡萄球菌蛋白， 任选来自金黄色葡萄球菌或表皮 葡萄球菌的蛋白。本发明一些实施方式包含来自金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的蛋白。
本发明的进一步的方面涉及 HarA 或 MRPII 的结合并且进一步的葡萄球菌蛋白可 与上述的 PNAG 和 / 或荚膜多糖结合。本发明这些方面可包括下述的蛋白或蛋白的组合。
以下蛋白的描述适用于 HarA 和 MRPII 以及存在于本发明免疫原性组合物的其它 蛋白。
在一个实施方式中， 本发明的免疫原性组合物包含所含氨基酸序列与存在于 WO 06/32475 或 WO 07/113222 中的任何序列有至少 85％同一性、 至少 90％同一性、 至少 95％ 同一性、 至少 97-99％或准确同一性的分离蛋白。
本文具体提及的蛋白， 优选提及天然或重组体、 全长蛋白或任选已除去其中任何 信号序列的成熟蛋白。该蛋白可直接从葡萄球菌菌株中分离或者通过重组 DNA 技术合成。 可将该蛋白免疫原性片段整合到本发明的免疫原性组合物中。这些是含有至少 10 个氨基 酸、 优选 20 个氨基酸、 更优选 30 个氨基酸、 更优选 40 个氨基酸或 50 个氨基酸、 最优选 100 个氨基酸的连续取自该蛋白氨基酸序列的片段。另外， 这样的免疫原性片段与针对葡萄球 菌蛋白所生成的抗体或与由于哺乳动物宿主感染葡萄球菌所生成的抗体起免疫反应。免 疫原性片段还包括当给予有效剂量 ( 单独或者作为与载体结合的半抗原 ) 时诱发对葡萄 球菌感染、 更优选对金黄色葡萄球菌和 / 或表皮葡萄球菌感染的保护性免疫应答的片段。 这样的免疫原性片段可包括， 例如， 缺少 N- 末端前导序列、 和 / 或跨膜域和 / 或 C- 末端锚 定域的蛋白。在优选的方面， 本发明免疫原性片段基本上包括相对于 WO 06/32475 或 WO 07/113222 中存在的序列全长片段序列具有至少 85％同一性、 至少 90％同一性、 至少 95％ 同一性、 至少 97-99％同一性的蛋白的所有胞外域。
本发明免疫原性组合物还包括葡萄球菌蛋白的重组融合蛋白或其片段。 这些在同 一蛋白中可以结合不同的葡萄球菌蛋白或其片段。或者说， 本发明还包括葡萄球菌的个别 融合蛋白或其片段， 如带有异源序列的融合蛋白如 T- 细胞表位供应者或纯化标签， 例如 ： β- 半乳糖苷酶、 谷胱甘肽 -S- 转移酶、 绿色荧光蛋白 (GFP)、 表位标记如 FLAG、 myc 标记、 多聚组氨酸或病毒表面蛋白如流感病毒血凝素， 或细菌蛋白如破伤风类毒素、 白喉类毒素、 CRM197。
蛋白
本发明免疫原性组合物任选包括一种或多种下面提及的蛋白。 很多蛋白分类为胞 外组分结合蛋白、 转运蛋白、 毒素和毒力调节剂或结构蛋白。 本发明免疫原性组合物任选进 一步包括葡萄球菌胞外组分结合蛋白或葡萄球菌转运蛋白或葡萄球菌毒素或毒力调节剂 或结构蛋白。本发明免疫原性组合物任选包含 2、 3、 4、 5 或 6 种葡萄球菌蛋白。
表1
下表列出在 WO 06/32475 中发现的优选蛋白序列和 DNA 序列的 SEQ ID 号码。SA 表示来自金黄色葡萄球菌的序列， SE 表示来自表皮葡萄球菌的序列。
接种
通过系统或粘膜途径给予所述的疫苗， 包含本发明免疫原性组合物的疫苗制剂可 用于保护或治疗容易感染的哺乳动物。这些给药可包括经由肌肉、 腹腔、 皮内或皮下途径 注射 ； 或通过粘膜给药至口腔 / 消化道、 呼吸道、 泌尿生殖道。尽管本发明疫苗可以单一剂 量进行给药， 但其组分也可在同一时间或不同时间进行共同给药 ( 例如肺炎球菌糖缀合物 可在同一时间或在相对于彼此的免疫应答的优化协调疫苗的任何细菌蛋白组分给药后 1-2 周分别给药 )。另外， 可 IM 给予本发明疫苗致敏剂量和 IN 给予促升剂量。
疫 苗 中 蛋 白 抗 原 的 含 量 通 常 范 围 在 1-100μg， 优 选 5-50μg， 更典型在范围 5-25μg。随着初始接种， 接受试验者可接受足够间隔的一个或几个促升免疫。
疫苗制备通常在 “疫苗设计” 中有所描述 ( “亚基和佐剂方法” (PowellM.F.&Newman M.J.) 编辑 (1995)“Plenum Press New York” )。Fullerton 在美国专利 4,235,877 中描 述了在脂质体中的封装。
本发明疫苗可储存在溶液中或者冻干。 优选在糖如蔗糖或乳糖的存在下将溶液冻 干。进一步优选将其冻干并在使用前即时性重建。
本发明一方面提供疫苗试剂盒， 包括含有本发明免疫原性组合物的小瓶， 任选以 冻干形式， 进一步包括含有如本文所述佐剂的小瓶。 预想在本发明这方面， 所述佐剂将被用
于重建冻干的免疫原性组合物。
尽管可通过任何途径给予本发明疫苗， 但本发明的一个实施方式是将所述疫苗通 过皮肤 (ID) 进行给药。人的皮肤包括覆盖着表皮的称作角质层的外部 “简单的” 表皮。表 皮下面是称作真皮的一层， 其依次覆盖皮下组织。 研究者已经证明疫苗注入皮肤， 特别是真 皮， 刺激免疫应答， 还关乎很多附加优点。 本文所述的疫苗的皮内接种成为本发明优选的特 征。
皮内注射的常规技术 “芒图 (mantoux) 方法” ， 包括清洗皮肤， 然后用一只手拉伸， 用窄规针 (26-31 规 ) 面向针上方的斜面以 10-15°之间的角度插入的步骤。 一旦插入针的 斜面， 将针筒降低并进一步推进同时在皮肤下面给出轻微的压力使其抬高。然后将液体非 常缓慢地注入， 由此在皮肤表面上形成气泡或肿块， 然后缓慢退出针头。
最近， 已经描述了专门设计进行液体试剂给药进入或穿过皮肤的装置， 例如在 WO 99/34850 和 EP 1092444 中所描述的装置， 还例如在 WO01/13977、 US 5,480,381、 US 5,599,302、 US 5,334,144、 US 5,993,412、 US5,649,912、 US 5,569,189、 US 5,704,911、 US 5,383,851、 US 5,893,397、 US5,466,220、 US 5,339,163、 US 5,312,335、 US 5,503,627、 US 5,064,413、 US 5,520,63、 US 4,596,556、 US 4,790,824、 US 4,941,880、 US 4,940,460、 WO 97/37705 和 WO 97/13537 中所描述的喷射注射装置。疫苗制剂的皮内给药的替代方 法可包括常规注射器和针， 或设计用来弹道递送固体疫苗的装置 (WO99/27961)， 或经皮 贴片 (WO97/48440 ； WO98/28037) ； 或应用至皮肤表面 ( 经真皮或经皮递送 WO98/20734 ； WO98/28037)。
当将本发明的疫苗给予皮肤或更具体地给予真皮时， 所述疫苗使用低液量， 具体 为约 0.05ml 和 0.2ml 之间的容量。
本发明皮肤或皮内疫苗所含抗原的含量与在肌内疫苗中所发现的常规剂量相似 ( 参见上文 )。然而， 皮肤或皮内疫苗有一个特征即制剂可以是 “低剂量” 的。因此在 “低剂 量” 疫苗中的蛋白抗原优选以少至每剂 0.1-10μg， 优选 0.1-5μg 存在 ； 以及糖 ( 优选缀合 的 ) 抗原可以每剂糖 0.01-1μg 的范围， 优选在 0.01-0.5μg 之间存在。
如本文所使用的， 术语 “皮内给药” 意思是将疫苗输送到皮肤的真皮区域。然而， 疫苗无需唯一地位于真皮内。真皮是位于距离人皮肤表面约 1.0 和约 2.0mm 之间的皮层， 但在个体之间以及身体不同部位有某些量的变化。一般而言， 期望通过从表皮向下 1.5mm 达到真皮。真皮层位于表面的角质层和表皮与其下的皮下层之间。根据给药的模式， 疫苗 最终仅仅或主要位于真皮层内， 或最终分布到表皮或真皮层内。
选择每种疫苗剂量中所含每种抗原的量作为诱导通常受接种者中没有重大不利 副作用的免疫保护反应的量。这种量的变化取决于使用的特异的免疫原以及其如何存在。
在进一步的实施方式中， 通过给予如本文基本所述的组合物， 提供对易感或罹患 疾病的个体的治疗方法。
还提供防止个体感染疾病的方法， 所选疾病包括 ： 传染性细菌和病毒疾病、 寄生虫 病， 特别是胞内致病性疾病、 增生性疾病如前列腺、 乳房、 结肠直肠、 肺、 胰腺、 肾脏、 卵巢或 黑色素肿瘤 ； 非癌慢性疾病， 包括如本文基本所述对所述个体进行组合物给药的过敏症。
在进一步的实施方式中， 提供疫苗组合物用于预防性治疗或病状或疾病的治疗， 其中疫苗组合物包含抗原或抗原组合物和由水包油乳剂组成的佐剂组合物， 所述乳剂包含每人剂 0.5-10mg 可代谢的油、 0.5-11mg 母育酚和 0.1-4mg 乳化剂。
在进一步的实施方式中， 提供疫苗组合物在制备用于预防性治疗或病状或疾病治 疗的药剂的应用， 其中疫苗组合物包含抗原或抗原组合物和由水包油乳剂组成的佐剂组合 物， 所述乳剂包含每人剂 0.5-10mg 可代谢的油、 0.5-11mg 母育酚和 0.1-4mg 乳化剂。
参照下列非限制性实施例进一步对本发明进行描述。
实施例 I 描述了用于小鼠、 雪貂、 猪和人研究的免疫学读出方法。
实施例 II 描述了用于示例性研究的水包油乳剂和佐剂制剂的制备。
实施例 III 显示了在年龄 18-59 岁成年人群中使用含有流感片段抗原制剂和各种 剂量的 AS03 佐剂的疫苗的临床试验。
实施例 IV 显示了在已致敏的 BALB/c 小鼠中有佐剂和无佐剂片段流感疫苗 ( 含有 各种剂量的 AS03 佐剂 ) 的临床前评估。
实施例 V 显示了在已致敏的 C57B1/6 小鼠中有佐剂和无佐剂片段流感疫苗 ( 含有 各种剂量的 AS03 佐剂 ) 的临床前评估。
实施例 VI 显示了在已致敏的 C57B1/6 小鼠中有佐剂和无佐剂流感片段疫苗 ( 含 有各种剂量的 AS03 佐剂和低剂量抗原 ) 的临床前评估。
实施例 VII 显示了在未接触抗原的 C57B1/6 小鼠中有佐剂和无佐剂片段 H5N1 疫 苗 ( 含有各种剂量的 AS03 佐剂和抗原 ) 的临床前评估。
实施例 VIII 显示了在已致敏的大白猪中有佐剂和无佐剂流感疫苗的临床前评 估。
实施例 I □免疫学读出方法
I.1. 小鼠方法
I.1.1. 血凝抑制试验
试验原理 ( 经典步骤 )
利用血凝抑制试验 (HI) 测定了对三种 ( 季节性的 ) 流感病毒株的抗血凝素抗体 效价。 HI 试验的原理是基于特异性抗流感抗体通过流感病毒血凝素 (HA) 抑制红细胞 (RBC) 凝集的能力。用高岭土和 RBC 处理热失活血清除去非特异性抑制剂。预处理后， 将稀释两 倍的血清与 4 个血凝单位的各流感株进行孵育。然后加入红细胞并对凝集抑制作用评分。 效价表示为完全抑制凝集的血清最高稀释度的倒数。当血清的第一个稀释度为 1 ∶ 20 时， 将不易觉察的水平记为相当于 10 的效价。
使之适于 H5N1( 用马红细胞进行 HI 的具体描述 )
由于证明了测定抗 -HA 抗体的经典 HI 分析方法对 H5N1 株不能很好地起作用， 于 是应用使用马 RBC 的调整方法。
将马的红细胞用于 H5N1 流行株。 0.5％ ( 终浓度 ) 马红细胞悬浮于含 0.5％ BSA( 牛 血清白蛋白， 终浓度 ) 的磷酸盐缓冲液中。每天通过用同样的磷酸盐缓冲液洗涤红细胞和 随后的离心步骤 (10min， 2000rpm) 制备该悬浮液。该洗涤步骤须重复一次。将马红细胞添 加到血清和病毒悬浮液的反应混合物中后， 由于马红细胞的沉降速度低， 须将平板于室温 (RT， 20℃ +/-2℃ ) 下温育 2 小时。
统计分析
利用 UNISTAT 对接种后 HI 效价进行统计学分析。用于方差分析的试验方案可简述如下。 ◆数据的对数转换
◆为验证组的正态分布而设的对每一种群 ( 组 ) 的 Shapiro-Wilk 试验
◆为验证不同种群 ( 组 ) 之间方差均一性的 Cochran 试验
◆对所选数据的方差分析
◆双向 ANOVA 的交互试验
◆多重比较的 Tukey-HSD 试验
I.1.2. 胞内细胞因子染色
该技术允许基于细胞因子产生的抗原特异性 T 淋巴细胞的量化 ： 效应 T 细胞和 / 或效应子 - 记忆 T 细胞产生 IFN-γ 和 / 或中心记忆 T 细胞产生 IL-2。免疫后 7 天收获 PBMC。
在分泌抑制剂 (Brefeldine) 存在下淋巴样细胞在体外受到重新刺激。
然后用荧光抗体 (CD4、 CD8、 IFN-γ 和 IL-2) 通过传统的荧光免疫检测方法处理这 些细胞。结果表示为 CD4/CD8T 细胞内细胞因子阳性细胞的发生率。在第二次免疫之后 7 天对 PBMC 进行 T 细胞的细胞因子的胞内染色。从小鼠收集血液并集中于肝素化的培养基 RPMI+Add。 对于血液， 按照推荐的试验方案 ( 室温下以 2500rpm 离心 20min) 将 RPMI+Add- 稀 释的 PBL 悬浮液置于哺乳动物淋巴细胞分离液梯度离心进行分层。移出在界面的单核细 胞， 在 RPMI+Add 中清洗两次， 将 PBMC 悬浮液在 5％胎牛血清的 RPMI 中调整到 2x106 细胞 / ml。
以终浓度为 1x107 细胞 /ml( 试管 FACS) 用 Whole FI(1μgHA/ 株 ) 进行 PBMC 的 体外抗原刺激， 然后加入抗 -CD28 和抗 -CD49d( 均为 1μg/ml) 在 37℃下温育 2 小时。
抗原再刺激步骤后， 将 PBMC 于 37℃下在布雷菲德菌素 (1μg/ml) 的存在下温育 过夜， 以抑制细胞因子的分泌。IFN-γ/IL-2/CD4/CD8 染色如下进行 ： 洗涤细胞悬浮液， 重 新悬浮于 50μl 含有 2％ Fc 阻断剂 (1/50 ； 2.4G2) 的 PBS1％ FCS 中。4℃下温育 10min 之 后， 加入 50μl 抗 -CD4-PE(2/50) 和抗 -CD8perCp(3/50) 的混合物， 并于 4℃下温育 30min。 在 PBS 1％ FCS 中洗涤之后， 通过重新悬浮于 200μl Cytofix-Cytoperm(Kit BD) 并于 4℃ 下温育 20min 将细胞进行透化。然后用 Perm Wash(Kit BD) 洗涤细胞并用 Perm Wash 稀释 的抗 -IFN-γAPC(1/50) 和抗 -IL-2FITC(1/50) 的混合液 50μl 重新悬浮细胞。于 4 ℃下 最少 2 小时最长过夜的温育之后， 用 Perm Wash 液洗涤细胞并将细胞重新悬浮于 PBS 1％ FCS+1％多聚甲醛中。通过 FACS 进行样品分析。收集活细胞 (FSC/SSC) 并对 CD4+T 细胞进 行～ 20,000 个 ( 淋巴细胞 ) 或 35,000 个数据采集。 用 CD4+ 和 CD8+ 门控群计算出 IFN-γ+ 或 IL2+ 的百分比。
I.1.3. 抗 -H5N1 酶联免疫吸附测定法
用片段 H5N1 作为包衣通过 ELISA 对抗 -H5N1Ig、 IgG1 和 IgG2b 抗体效价进行定量。 每孔使用 100μl 病毒和抗体溶液。稀释片段病毒 H5N1 使其在 PBS 中的终浓度为 1μg/ml 并吸至 96 孔微量滴定板 (Maxisorb ImmunoplateNunc 439454) 的孔内于 4℃下过夜。然 后将板置于 37℃下温育 1 小时， 每孔内有 200μl 含 1％ BSA 和 0.1％ Tween 20( 饱和缓冲 液 ) 的 PBS。将 12 个在饱和缓冲液中稀释两倍的血清加入到 H5N1 包被的板中并于 37℃ 下温育 1 小时 30 分钟。用 0.1％ Tween 20 的 PBS 液将该板洗涤 4 次。将在含有 1％ BSA
和 0.1 ％ Tween 20 的 PBS 中的稀释 1/500 的生物素化的缀合抗小鼠 Ig(Prozan-E0413) 或生物素化的缀合抗小鼠 IgG1(Imtech 1070-08)， 或稀释至 1/4000 的生物素化的抗小鼠 IgG2b(Imtech 1090-08) 加到每个孔内并于 37℃下温育 1.30 小时 ； 洗涤步骤之后， 用在含 有 1％ BSA Tween 20 的 PBS 中稀释 1/10000 的链霉亲和素 - 生物素 - 过氧化物酶缀合物 (ProzanP0397) 将板温育 30 分钟。
为了比色显示， 用 0.1M、 pH 4.2 的柠檬酸缓冲液配制的含有 0.04 ％ o- 苯二胺 (Sigma P4664)0.03％ H2O2 的溶液将板于 22℃下温育 20min。用 2NH2SO4 终止反应， 微量板 于 490-630nm 下进行读数。
I.2. 雪貂方法
I.2.1. 血凝抑制试验 (HI)
试验步骤
用血凝抑制试验 (HI) 测定对三种流感病毒株的抗血凝素抗体效价。HI 试验的原 理是基于特异性抗流感抗体通过流感病毒血凝素 (HA) 抑制鸡红细胞 (RBC) 凝集的能力。 首先用 25％神经氨酸酶溶液 (RDE) 处理血清并加热失活除去非特异性抑制剂。预处理后， 稀释两倍的血清与每个流感株的 4 个血凝单位温育。然后加入鸡红细胞并记录凝集反应的 抑制。效价表示为完全抑制血凝集的血清最高稀释度的倒数。如果血清的第一稀释度为 1 ∶ 10， 不可检测的水平记为相当于 5 的效价。 统计分析
利用 UNISTAT 对 HI 效价 ( 攻击前 41 天 ) 进行统计分析。用于方差分析的试验方 案可简述如下 ：
◆数据的对数转换
◆为验证组的正态分布而设的对每一种群 ( 组 ) 的 Shapiro-Wilk 试验
◆为验证不同种群 ( 组 ) 之间方差均一性的 Cochran 试验
◆单向 ANOVA 的交互试验
◆多重比较的 Tukey-HSD 试验
I.2.2. 体温监测
在攻击期间用传感器通过遥测记录监测个体的温度。检查和刷新所有植入物， 并 在放置于腹腔之前通过 DSI( 国际科技数据委员会， Centaurusweg 123， 5015TC Tilburg， The Netherlands) 进行新的校正。在这些测量期间， 所有动物各自放入单个笼中
从攻击前 4 天一直到攻击后 7 天每 15 分钟记录一次温度。
I.2.3. 鼻腔清洗
通过给予清醒的动物两个鼻孔 5ml PBS 进行鼻的清洗。用培养皿收集接种物并放 置于干的冰上的样品容器内。
鼻腔清洗液中的病毒滴定
所有鼻腔样本首先经过 Spin X 过滤器 (Costar) 进行无菌过滤以除去任何细菌的 污染。将 50μl 连续 10 倍稀释的鼻腔清洗液移至含有 50μl 培养基 (10 孔 / 每稀释度 ) 的微量滴定板上。然后将 100μl MDCK 细胞 (2.4x 105 细胞 /ml) 加到每个孔内并于 35℃ 下温育 5-7 天。
温育 5-7 天之后， 将培养基轻轻地除去， 加入 100μl 含 1/20WST-1 的培养基并温
育另外的 18 小时。
活细胞还原 WST-1 所产成的黄色 formazan 染料的强度与在病毒滴定分析试验最 后孔内存在的活细胞数量成正比， 并通过在适当的波长 (450 纳米 ) 下测量每孔的吸光率进 行定量。界值点被定义为未感染对照细胞的 OD 平均值 -0.3OD(0.3OD 相当于未感染对照细 胞 OD 的 +/-3StDev)。当 OD ＜界值点时定为正分数， 相反当 OD ＞界值点时定为负分数。通 过 “Reed 和 Muench” 测定病毒屏蔽效价并表示为 Log TCID50/ml。
I.3. 猪的方法
I.3.1. 血凝抑制试验 (HI)
试验步骤
用血凝抑制试验 (HI) 测定三种流感病毒株的抗血凝素抗体效价。HI 试验的原理 是基于特异性抗流感抗体通过流感病毒血凝素 (HA) 抑制鸡红细胞 (RBC) 凝集的能力。首 先用 25％神经氨酸酶溶液 (RDE) 处理血清并加热失活除去非特异性抑制剂。预处理后， 用 每个流感株的 4 个血凝单位温育稀释两倍的血清。然后加入鸡红细胞并记录凝集反应的 抑制。效价表示为完全抑制血凝集的血清最高稀释度的倒数。如果血清的第一稀释度为 1 ∶ 10， 不可检测的水平记为相当于 5 的效价。
统计分析
利用 UNISTAT 对 HI 效价 ( 攻击前 41 天 ) 进行统计分析。用于方差分析的试验方 案可简述如下 ：
数据的对数转换
为验证组群正态分布的对每一种群 ( 组 ) 的 Shapiro-wilk 试验
为验证不同种群 ( 组 ) 之间方差均一性的 Cochran 试验
单向 ANOVA 交互试验
多重比较的 Tuckey-HSD 试验
I.4. 人免疫应答的评估分析
I.4.1. 血凝集抑制测定
利用 WHO 流感合作中心、 疾病控制中心 ( 亚特兰大， 美国 (1991)) 所描述的方法通 过测量 HI 抗体测定免疫应答。
通过标准的和全面验证的微量测定法用合适抗原的 4 个血凝抑制单位 (4HIU) 和 0.5％鸡红细胞悬浮液对冻融血清样品抗体效价进行测量。通过加热处理和受体破坏酶除 去非特异性血清抑制剂。
对所得到的血清进行 HI 抗体水平的评估。从最初的稀释度 1 ∶ 10 开始， 制备系 列稀释度 ( 稀释倍数为 2) 直到最终稀释度为 1 ∶ 20480。显示血凝完全抑制 (100％ ) 的 最高稀释度作为滴定终点。所有测定均一式两份。
I.4.2. 神经氨酸酶抑制测定
所述测定在胎球蛋白包被的微量滴定板上进行。 制备两倍稀释系列的抗血清并与 标准化量的流感 A H3N2、 H1N1 或流感 B 病毒进行混合。该试验是基于神经氨酸酶从胎球蛋 白酶促释放神经氨酸的生物学活性。末端神经氨酸裂解之后， β-D- 半乳糖 -N- 乙酰 - 半 乳糖胺暴露。将来自花生的辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的花生凝集素加到加样孔内， 所述 花生凝集素与半乳糖结构特异性结合。在与四甲基联苯胺 (TMB) 的底物反应中可检测和定量结合凝集素的量。显示仍然抑制病毒神经氨酸酶活性至少 50％的最高抗体稀释度为 NI 效价。
I.4.3. 中和抗体测定
用冻融血清样品进行中和抗体测定。 在微量中和试验中通过血清中所含抗体对病 毒的中和作用进行测定。在测定中所用血清没有作进一步的处理。每种血清一式三份进行 检测。将标准化量的病毒与系列稀释的血清混合并温育使抗体与病毒结合。然后将含有定 量 MDCK 细胞的细胞悬浮液加到病毒与抗血清的混合物中并于 33℃下温育。 温育期之后， 通 过鸡红细胞凝集显现病毒复制。通过 Reed 和 Muench 的方法计算血清 50％的中和效价。
I.4.4. 通过流式细胞计数法 (CFC) 评估细胞介导的免疫
如果和与其相应的抗原进行温育， 在体外可重新刺激外周血液抗原特异性的 CD4 和 CD8T 细胞生成 IL-2、 CD40L、 TNF-α 和 IFN。所以， 可通过流式细胞术在细胞表型和胞内 细胞因子产生的常规免疫荧光标记术后对抗原特异性的 CD4 和 CD8T 细胞进行列举。在最 近的研究中， 来自特异性流感蛋白的流感疫苗抗原及肽用作抗原以重新刺激流感特异性的 T 细胞。结果表示为 CD4 或 CD8T 细胞亚群内部的细胞因子阳性 CD4 或 CD8T 细胞。
I.4.5 统计方法
I.4.5.1. 主要终点
·在接种后 7 天后续期内 ( 即接种日和其后 6 天 ) 要求的局部和总体征象和症状 的百分比、 强度和与接种的关系以及概况
·在接种后 21 天后续期内 ( 即接种日和其后 20 天 ) 未要求的局部和总体征象和 症状的百分比、 强度和与接种的关系以及概况
·在整个研究过程中严重不利事件的发生
I.4.5.2. 次要终点
对于体液免疫应答 ：
观察变量 ：
· 在 第 0 和 第 21 天 ： 血 清 凝 集 抑 制 (HI) 和 NI 抗 体 效 价， 分别针对在疫苗 ( 抗 -H1N1、 抗 -H3N2 和抗 -B- 抗体 ) 中所代表的三种流感病毒株的每一株进行试验。
·在第 0 和第 21 天 ： 中和抗体效价， 分别针对在疫苗中所代表的三种流感病毒株 的每一株进行试验。
衍生变量 (95％置信区间 ) ：
·接种前后 95％置信区间 (95％ CI) 的血清 HI 抗体的几何平均效价 (GMTs) *
·在第 21 天具有 95％ CI 的血清转变率
在第 21 天具有 95％ CI 的转变因子 ** ***
·在第 21 天具有 95％ CI 的血清保护率
·所有时间点的血清 NI 抗体 GMTs’ (95％置信区间 ) *
对于每个疫苗株， 血清转变率定义为接受接种者百分比， 其在第 21 天比第 0 天有 至少 4 倍的血清 HI 效价增加。 **
对于每个疫苗株， 转变因子定义为与第 0 天相比在第 21 天的血清 HIGMTs 的增 加倍数。 ***
保护率定义为接种后 ( 对于每个疫苗株 ) 血清 HI 效价＝ 40 的接受接种者百分比， 其通常当作是指示保护。
应该理解的是， 对于某些临床试验， 反应原性 / 安全性可能是次要终点， 免疫原性 可能是主要终点。
对于细胞介导的免疫 (CMI) 应答
观测变量
在第 0 和第 21 天 ： 在不同试验中每 106 中细胞因子 - 阳性 CD4/CD8 细胞的频率
每个试验将 CD4/CD8T 细胞的应答定量至 ：
·多肽流感 (pf) 抗原 ( 需给出 / 解释这些抗原的精确性质和来源 )。
·流感 (sf) 抗原。
·完整流感 (wf) 抗原。
衍生变量 ：
·产生至少两种不同细胞因子 (CD40L、 IL-2、 IFNγ、 TNFα) 的细胞
·产生至少 CD40L 和另一种细胞因子 (IL-2、 TNFα、 IFNγ) 的细胞
·产生至少 IL-2 和另一种细胞因子 (CD40L、 TNFα、 IFNγ) 的细胞
·产生至少 IFNγ 和另一种细胞因子 (IL-2、 TNFα、 CD40L) 的细胞
·产生至少 TNFα 和另一种细胞因子 (IL-2、 CD40L、 IFNγ) 的细胞
I.3.5.3. 免疫原性分析
免疫原性分析是基于全部接种疫苗的组群。对于每个处理组， 计算出下列参数 (95％置信区间 ) ：
□第 0 和第 21 天的 HI 几何平均效价 (GMTs) 和 NI 抗体效价。
□第 0 和第 21 天的中和抗体效价的几何平均效价 (GMTs)。
□第 21 天的转变因子。
·定义为接受接种者百分比的第 21 天的血清转变率 (SC)， 所述接受接种者第 21 天与第 0 天相比其血清 HI 效价有至少 4 倍的增加。
□第 21 天的保护率定义为血清 HI 效价＝ 1 ∶ 40 的接受接种者的百分比。
□总结 ( 描述性统计 ) 每个接种组在每个时间点 ( 第 0 天、 第 21 天 ) 以及每个抗 原 ( 肽流感 (pf)、 流感片段疫苗 (sf) 和完整流感 (wf)) 在应答中分泌 CD4/CD8T- 淋巴细胞 的频率。
·在时间点 ( 后 - 前 ) 之间每个接种组和每 5 个不同试验的每个抗原 (pf、 sf 和 wf) 之间应答的个体差异的描述性统计
· 非参数试验 (Kruskall-Wallis 试验 ) 用于比较 3 组之间的地方差异并对每 5 个不同试验的每个抗原计算统计学 p- 值。所有显著性检验都是双尾的。P- 值小于或等于 0.05 被认为是统计学上有意义的。
实施例 II □水包油乳剂和佐剂制剂的制备
除非另有说明， 在随后的实施例中所使用的油 / 水乳化剂含有由 2 种油 (α- 生育 酚和角鲨稀 ) 制成的有机相和含有作为乳化剂的 Tween 80 的 PBS 水相。除非另有说明， 在 随后的实施例中所使用的水包油乳剂佐剂制剂经制备以含有下列水包油乳剂组分 ( 给定 最终浓度 ) ： 2.5％角鲨稀 (v/v)、 2.5％ α- 生育酚 (v/v)、 0.9％聚氧乙烯山梨糖醇酐单油 酸酯 (v/v)(Tween80)， 参见 WO 95/17210。在随后的实施例中称作 AS03 的这种乳化剂以两倍的浓缩液如下制备。
II.1. 乳剂 SB62 的制备
在临床和临床前期的实施例章节中所报道研究中使用了该方法。SB62 乳剂的制 备是通过在强烈的搅拌下将由疏水组分 ((DL-α- 生育酚和角鲨稀 ) 组成的油相和含有水 溶性组分 ( 阴离子洗涤剂 Tween 80 和改良的 PBS， (pH6.8)) 的水相混合而完成的。搅拌 的时候， 将油相 ( 总体积的 1/10) 转移至水相 ( 总体积的 9/10)， 于室温下将混合物搅拌 15 分钟。将生成的混合物在微射流均质机 ( 在实施例 III 报道的临床试验中所使用的佐剂的 15000PSI-8 个循环， 或 3 个循环 ) 的相互作用室内进行剪切、 碰撞和空化胁迫生成亚微米 液滴 ( 分布在 100 和 200nm 之间 )。得到的 pH 在 6.8±0.1 之间。然后将 SB62 乳剂经过 0.22μm 的膜进行过滤除菌， 并将无菌的原液乳剂冷藏在 2-8℃ Cupac 容器内。将无菌惰性 气体 ( 氮或氩 ) 充入到 SB62 乳剂最终原液容器的死区容积至少 15 秒钟。
SB62 乳剂的最终组成如下 ：
Tween 80 ： 1.8％ (v/v)19.4mg/ml ； 角鲨稀 ： 5％ (v/v)42.8mg/ml ； α- 生育酚 ： 5％ (v/v)47.5mg/ml ； PBS-mod ： NaCl 121mM， KCl 2.38mM， Na2HPO47.14mM， KH2PO41.3mM， pH 6.8±0.1。
实施例 III □含有片段病毒抗原制剂和各种剂量 AS03 佐剂 (Flu-LD-004) 的疫苗 在年龄为 18-59 岁的成年人群中的临床试验
III.1. 引言
为了评估含有两剂 AS03 佐剂的 GlaxoSmithKline 生物制剂公司的低剂量流感候 选疫苗 ( 即每株含 5μg HA) 的免疫原性、 安全性和反应原性， 在 2006 年对年龄 18-59 岁的 成年人群进行了 II 期、 可控、 随机、 单盲的研究。
肌肉给药一剂含 AS03 佐剂的疫苗后 21 天测定体液免疫应答 ( 即抗血凝素 )。 TM Fluarix 用作参考。
III.2. 研究设计
三组对象平行接受下列疫苗肌内注射 ：
■含 100 名对象的一组， 接受一次含 5μg HA 佐剂为 AS03(FluLD1/1) 的低剂量片 段流感病毒疫苗的注射
■ 含 100 名 对 象 的 一 组， 接 受 一 次 含 5μg HA 佐 剂 为 半 剂 量 AS03(AD031/2) (FluLD1/2) 的低剂量片段流感病毒疫苗的注射
■含 100 名对象的一组， 接受一剂 FluarixTM(Fluarix)
计划 ： 第 0 天进行一次流感疫苗的 IM 注射， 在研究部位第 0 天和第 21 天收集血液 样品进行观察 (HI 抗体测定 ) 并在第 30 天进行额外的电话联系 ( 研究结论 )。
本研究所使用的标准的三价片段流感疫苗 -FluarixTM 是来源于 2006 年开发的由 GlaxoSmithKline 生物制剂公司制造的商业疫苗。
III.3. 研究目标
III.3.1. 主要目标
- 就抗血凝素抗体效价方面评估所研究疫苗所诱导的体液免疫应答 ：
第 0 和第 21 天的观察变量 ： 血清血凝抑制抗体效价。
衍生变量 (95％置信区间 ) ：- 第 0 天和第 21 天的血清抗体几何平均效价 (GMTs)
- 第 21 天的血清转变率 *
- 第 21 天的转变因子 **
- 第 0 天和第 21 天的保护率 *** *
血凝抗体应答的血清转变率定义为接受接种者百分比， 该接受接种者具有接种 前效价＜ 1 ∶ 10， 接种后效价≥ 1 ∶ 40， 或者接种前效价≥ 1 ∶ 10， 接种后效价增加至少 4 倍。 **
转变因子定义为与第 0 天相比接种后血清 HI GMTs 的成倍增加 ； ***
保护率定义为通常当作是指示保护的接种后血清 HI 效价≥ 40 的接受接种者百 分比。
III.3.2. 次要目标
- 就要求的局部和总体不利事件、 未要求的不利事件和严重的不利事件评估所研 究疫苗的安全性和反应原性 ：
1. 在每组每次接种后 7 天后续期内 ( 即接种日和其后 6 天 ) 要求的局部和总体征 象和症状的发生、 强度和与接种的关系。 2. 在每组接种后 30 天后续期内 ( 即接种日和其后 29 天 ) 未要求的局部和总体征 象和症状的发生、 强度和与接种的关系。
3. 在整个研究期间各组严重不利事件的发生和关系。
III.4. 疫苗组合物和给药
III.4.1. 疫苗制备
无佐剂流感疫苗是三价的片段病毒颗粒， 失活的流感疫苗由三个单价病毒抗原原 液组成 ( 分别从流感株 A/H1N1、 A/H3N2 和 B 制得 )。该疫苗中所存在的抗原与得到许可的 TM TM Fluarix 疫苗相同， Fluarix 疫苗为自 1992 年以来由市场提供的 Fluarix TM(α) 且每剂含 15μg HA/ 株。FluLD 临床批次所包含的流感株是选作 2006/2007 北半球的病 毒株。
● A/New Caledonia/20/99(H1N 1)- 类 株 ： A/New Caledonia/20/99(H1N1) IVR-116
● A/Wisconsin/67/2005(H3N2)- 类株 ： A/Wisconsin/67/2005(H3N2)NYMCX-161
● B/Malaysia/2506/2004。
所述抗原来自蛋生病毒。 在经过脱氧胆酸钠和甲醛相继作用的失活步骤之前用脱 氧胆酸钠进行裂解。
佐剂为 AS03 的低剂量流感 (FluLD) 疫苗 ( 临床批次 ) 是基于市售的 FluarixTM 疫苗 ( 分别从流感株 A/H1N1、 A/H3N2 和 B 制得 )， 但抗原含量较低且佐剂为 GSK 佐剂体 系 AS03。AS03 由水包油乳剂 (SB62) 组成， 含有两种可生物降解的油、 角鲨烯和 α- 生育 酚 ( 维生素 E) 及表面活性剂聚山梨酸酯 80(Tween 80)。通过与乳剂简单混合将流感抗 原与佐剂体系的水相合并到一起。已试验了两种制剂， 区别在于在疫苗批次中流感抗原引 入的佐剂的量。含有佐剂的疫苗每剂中包含每种流感病毒株的 5μg 血凝素 (HA)， 与全量 (AS03) 或半量 (AS031/2) 佐剂体系 AS03 相结合。赋形剂如下 ： 聚山梨酸酯 80(Tween 80)、 辛基酚聚醚 -10(Triton X-100)、 α- 生育酚琥珀酸氢酯 (alpha-tocopheryl hydrogen
succinate)、 氯化钠、 磷酸氢二钠、 磷酸二氢钾、 氯化钾、 注射用水。佐剂为 AS03 的低剂量流 感疫苗 (FluLD， 全剂量或半剂量 AS03) 是无防腐剂的疫苗。然而， 它们含有来自制造过程 早期的痕量的乙基汞硫代水杨酸钠 ( 每剂＜ 1.25μg Hg)。它们在预先充满的玻璃 (I 型 ) 注射器内均以 0.5ml/ 剂的量以单剂疫苗存在。
III.4.1.1.AS03 佐剂流感疫苗的组成
一剂 FluLD( 全或半剂量 AS03) 相当于 0.5ml。表 3 提供了其组成。两种制剂中每 一剂的 HA 含量为 5μg， 唯一的差别是存在于最终容器中的 AS03 的量。
表 3 含 AS03 佐剂的低剂量流感疫苗 ( 全或半剂量 AS03) 的组成
缩写 ： HA ＝血凝素
当使用全剂量 AS03 时， 在聚山梨酸酯 80 中的总含量相当于每剂 4.972mg， 当使用 半剂量 AS03 时， 相当于每剂 2.547mg。
III.4.1.2. 片段失活流感抗原制剂的生产
流感抗原与 FluarixTM( 流感病毒疫苗 ) 中所包含的那些完全相同。单价原液由纯 化的灭活片段病毒组成， 其由三株单独生长在受精鸡蛋里的 A 型 (H1N1 和 H3N2) 和 B 型流 感病毒的工作种子制得。这些工作种子来自于从 WHO 合作中心 ( 随年度 WHO 推荐报告 ) 接 收的病毒株。对于制备抗原的过程， 以说明的方式， 在 WO 02/097072 中给出参考。三个单 价原液的体积基于制备前在每个单价原液中所测定的 HA 含量和目标生产体积。
将 10 倍浓缩的磷酸盐缓冲液 (1 倍浓缩时 pH 7.4) 及 Tween 80 和 α- 生育酚琥 珀酸氢酯的预混料用注射用水稀释， 随后在室温下搅拌 5-30 分钟。
然后将三个浓缩的单价原液在得到的磷酸盐缓冲液 /Tween 80-α- 生育酚琥珀 酸氢酯溶液中连续稀释至以下浓度 ：
每个 A 单价原液 (H1N1、 H3N2)20μgHA
B 单价原液 23.32μgHA
每 mL 中间产物三价原液 ( 每个 A 单价原液 5μg HA 和 B 的 5.83μg HA/500μl 三价最终原液 )。
在添加每个单价原液之间， 将混合物于室温下搅拌 10-30 分钟， 且在最后的单价 原液添加之后将混合物搅拌 15-30 分钟。也被称作 “预混合” 的中间产物三价原液可放置 于 +2-+8℃或在同一天进一步加工成最终制剂。预混合的终体积是每剂 250μl。
III.4.1.3. 佐剂为 AS03 的疫苗组合物的制备
佐剂疫苗 ： LD AS031/1( 表 4)
将 10 倍 浓 缩 的 改 良 PBS(1 倍 浓 度 时 pH 7.4 ； 137mM NaCl， 2.7mM KCl， 8.1mM Na2HPO4， 1.47mM KH2PO4， pH 7.4) 以及含有 Tween80、 Triton X-100 和 VES 的混合物 ( 考虑 了存在于病毒株中的清洁剂的量 ) 加到注射用水中。5-30 分钟搅拌后， 加入 H1N1 和 H3N2 每株每 ml 20μg HA 和 B 株每 ml23.32μgHA， 每次添加之间搅拌 10-30 分钟。15-30 分钟 搅拌后， 弃去少量所谓的 “中间产物原液” 用于分析并在 +2-+8℃之间的温度下储藏。中间 产物原液存在于 1 倍浓缩的改良 PBS 中。目标清洁剂浓度为每 ml 488μg Tween80， 每 ml 73.6μg Triton X-100 和每 ml 66.6μg VES。
然后制备最终制剂 ： 加入等体积 SB62( 参见实施例 II 中的制备 ) 至每 250μl 预 混合中间产物原液并于室温下混合 30-60 分钟。检查 pH 范围在 6.8 和 7.5 之间。用氮气 冲洗制剂然后在充满之前在 +2 和 8℃之间的温度下储存。
表 4 佐剂为 AS03 的低剂量疫苗
(1) ： 缓冲液最终原液组成为： 137mM NaCl， 2.7mM KCl， 8.1mMNa2HPO4， 1.47mM KH2PO4， pH 7.4
佐剂疫苗 ： LD AS031/2( 表 5)
将 10 倍浓缩的改良 PBS(1 倍浓度时 pH 7.4- 参见上面的组成 ) 以及含有 Tween 80、 Triton X-100 和 VES( 考虑存在于病毒株的清洁剂的量 ) 的混合物加到注射用水中。 搅 拌 5-30 分钟后， 加入 H1N1 和 H3N2 每株每 ml20μgHA 和 B 株每 ml 23.32μgHA， 每次添加 之间搅拌 10-30 分钟。15-30 分钟搅拌后， 弃去少量所谓的 “中间产物原液” 用于分析并在 +2 和 +8℃之间的温度下储藏。改良 PBS 在中间产物原液中为 1 倍浓度。目标清洁剂浓度 为每 ml 488μg Tween 80， 每 ml 73.6μg Triton X-100 和每 ml 66.6μg VES。
然后制备最终制剂 ： 首先用改良的 PBS 缓冲液稀释 SB62 并于室温下搅拌 15-30 分 钟。然后将等体积的该稀释 SB62 加至每 250μl 预混合中间产物原液。室温下混合搅拌 30-60 分钟之后， 检查 pH 范围在 6.8 和 7.5 之间。用氮气冲洗制剂然后在充满之前在 +2 和 8℃之间的温度下储存。
两种制剂的最终体积均为每剂 500μl 并且最终 HA 浓度是每 ml 三价最终原液的 每种 A 单价原液 10μg 而 B 单价原液 11.66μg。最终的 Tween 80、 Triton X-100( 来自 H3N2 单原液制造的残余物 ) 和 α- 生育酚琥珀酸氢酯 (α- 生育酚琥珀酸氢酯是 RRR(D 异 构体 )-α- 生育酚的酯形式 ) 目标浓度分别是 244μg/ml、 58.6μg/ml 和 33.3μg/ml。
表 5 佐剂为 AS03 的低剂量疫苗 ( 半剂量佐剂 )
(1) ： 缓冲液最终原液组成是： 137mM NaCl， 2.7mM KCl， 8.1mMNa2HPO4， 1.47mM KH2PO4， pH 7.4
III.4.2. 疫苗给药
将疫苗装进 1.25-ml 无菌 I 型 (Ph.Eur) 玻璃注射器。 每个注射器注入的目标值为 0.57ml( 范围 ： 0.54-0.60ml)。在非优势臂的三角肌区域将疫苗进行肌内注射给药。所有 疫苗都以预先加满注射器 (0.5ml) 的形式呈现。为确保疫苗合适的 IM 注射， 使用至少 25G 和至少 2.5cm 长的针。
III.5 群体研究结果
在此项研究中共有 300 名对象登记 ： 分为 3 组， 每组 100 名对象。接种时总的接种 的同龄组的平均年龄为 36.7 岁， 标准偏差为 13.67 岁。3 个疫苗组的对象平均年龄和性别 分布是相似的。
III.6 免疫原性研究结果 针对 ATP 同龄组免疫原性进行免疫原性分析 (297 个对象 )体液免疫应答
为了评估由低剂量流感候选疫苗 ( 佐剂为 AS03) 诱导的体液免疫应答， 对每个处 理组计算下列参数 ( 具有 95％置信区间 ) ：
□第 0 和第 21 天 HI 抗体效价的几何平均效价 (GMTs) ；
□第 21 天的血清转变率 (SC) ；
□第 21 天的转变因子 ；
□第 0 和第 21 天的保护率。
III.6.1.HI 几何平均效价 (GMT)
表 10 和图 1 显示了有 95％ CI 的 HI 抗体的 GMT。表 11 显示了组间调整的 GMT 比 率。
所有 3 个疫苗株的 HI 抗体的预接种 GMT 在 3 个处理组中都在同一范围内。佐剂 组在第 21 天所观察的 GMT 有高于所有 3 株的 Fluarix 组的倾向， 对于 /Wisconsin 疫苗株， FluLD1/1 和 Fluarix 之间具有统计学差异 ( 没有 95％ Cis 的重叠并且调整的 GMT 比率不 含有值 1)。在 B/Malaysia 疫苗株的 FluLD1/2 和 Fluarix 之间也观察到统计学差异 ( 调整 的 GMT 比率不含有值 1)。 表 10- 抗 -HA 抗体在第 0 和第 21 天 ( 免疫原性的 ATP 同龄组 ) 的血清阳性率和 几何平均效价 (GMT)
FluLD1/1 ＝具有全剂量 AS03 佐剂的低剂量流感疫苗 (5ug HA/ 株 ) FluLD1/2 ＝具有半剂量 AS03 佐剂的低剂量流感疫苗 (5ug HA/ 株 ) Fluarix ＝ Fluarix 疫苗 GMT ＝几何平均抗体效价 N ＝有可用结果的对象数 n/％＝数量 / 血清反应阳性对象的百分比 (HI 效价＞＝ 1 ∶ 10) 95％ CI ＝ 95％置信区间， LL ＝下限， UL ＝上限MIN/MAX ＝最小值 / 最大值 PRE ＝在第 0 天的预接种 PI(D21) ＝接种后第 21 天 表 11- 在第 21 天每个疫苗株的组间调整的 GMT 比率 ( 免疫原性的 ATP 同龄组 )FluLD1/1 ＝具有全剂量 AS03 佐剂的低剂量流感疫苗 (5ug HA/ 株 )
FluLD1/2 ＝具有半剂量 AS03 佐剂的低剂量流感疫苗 (5ug HA/ 株 )
Fluarix ＝ Fluarix 疫苗
调整的 GMT ＝调整基线效价的几何平均抗体效价
N ＝具有接种前、 后可用结果的对象数
95％ CI ＝对于调整的 GMT 比率的 95％置信区间 ( 协方差分析模型 ： 基线效价调 整 - 超过 2 组的合并方差 ) ；
LL ＝下限， UL ＝上限
III.6.2 抗 -HI 抗体效价的转变因子， 血清保护率和血清转变率 ( 与为人流感疫苗 而建立的保护相关 )
结果见表 6- 图 2 为血清保护率， 表 7- 图 3 为血清转变率， 表 8- 图 4 为转变因子。
所有的组 ( 至少 94.9％ ) 都达到了欧洲官方所要求的血清保护率阈值 (70％ )。 对于每个疫苗株， 3 个组在第 21 天的血清保护率在相同范围内。
所有的组 ( 至少 65％ ) 都达到了欧洲官方所要求的血清转变率阈值 (40％ )。
对于 A/New Caledonia 疫苗株， 3 个组在第 21 天的 SCR 在相同范围内。
对于 A/Wisconsin 疫苗株， 与 Fluarix 组相比， FluLD1/1 组在第 21 天的 SCR 有稍 高的倾向。与 Fluarix 组相比 FluLD1/2 组在第 21 天的 SCR 在相同范围内。
对于 B/Malaysia 疫苗株， 与 Fluarix 组相比 FluLD1/2 组在第 21 天的 SCR 有稍高 的倾向。与 Fluarix 组相比 FluLD1/1 组在第 21 天的 SCR 在相同范围内。
所有的组 ( 至少 6.2) 都达到了欧洲官方所要求的血清转变率阈值 (2.5)。
对于 A/New Caledonia 疫苗株， 3 个组在第 21 天的 SCF 似乎在相同范围内。对
FluLD1/2 组所观察到的值低于对 Fluarix 组所观察到的值， 但可由 FluLD1/2 组中较高的接 种前血清保护率来解释。
对于 A/Wisconsin 疫苗株， 与 Fluarix 组相比 FluLD1/1 组在第 21 天的 SCF 有稍 高的倾向。与 Fluarix 组相比 FluLD1/2 组在第 21 天的 SCF 在相同范围内。
对于 B/Malaysia 疫苗株， 与 Fluarix 组相比两个佐剂组在第 21 天的 SCF 有稍高 的倾向。
表 6- 在第 0 和第 21 天的 HI 抗体效价的血清保护率 (SPR)( 免疫原性的 ATP 同龄 组)
FluLD1/1 ＝具有全剂量 AS03 佐剂的低剂量流感疫苗 (5μg HA/ 株 ) FluLD1/2 ＝具有半剂量 AS03 佐剂的低剂量流感疫苗 (5μg HA/ 株 ) Fluarix ＝ Fluarix 疫苗 N ＝具有可用结果的对象数 n/％＝数量 / 血清保护对象的百分比 (HI 效价＞＝ 401/DIL) 95％ CI ＝ 95％置信区间， LL ＝下限， UL ＝上限 PRE ＝在第 0 天的预接种 PI(D1) ＝接种后第 21 天 数据来源＝附录表 IIIA 表 7- 在第 21 天的 HI 抗体效价的血清转变率 (SCR)( 免疫原性的 ATP 同龄组 )
FluLD1/1 ＝具有全剂量 AS03 佐剂的低剂量流感疫苗 (5μg HA/ 株 ) FluLD1/2 ＝具有半剂量 AS03 佐剂的低剂量流感疫苗 (5μg HA/ 株 ) Fluarix ＝ Fluarix 疫苗 血清转变率定义为 ： 对于最初血清反应阴性的对象， 接种后抗体效价＞＝ 401/DIL 对于最初血清反应阳性的对象， 接种后抗体效价＞＝ 4 倍接种前抗体效价 N ＝具有接种前和接种后可用结果的对象数 n/％＝数量 / 血清转变对象的百分比 95％ CI ＝ 95％置信区间， LL ＝下限， UL ＝上限 表 8- 在第 21 天的 HI 抗体效价的血清转变因子 (SCF)( 免疫原性的 ATP 同龄组 )
FluLD1/1 ＝具有全剂量 AS03 佐剂的低剂量流感疫苗 (5μg HA/ 株 ) FluLD1/2 ＝具有半剂量 AS03 佐剂的低剂量流感疫苗 (5μg HA/ 株 ) Fluarix ＝ Fluarix 疫苗 N ＝具有接种前和接种后可用结果的对象数 SCF ＝血清转变因子或几何平均比率 ( 平均值 [log10(PI(D21)/PRE)]) 95％ CI ＝ 95％置信区间， LL ＝下限， UL ＝上限 III.7 安全性总结 与 Fluarix 组相比， 就佐剂疫苗组中要求的 ( 局部的 / 总体的 ) 和未要求的症状而言， 较高的反应原性是在本研究中观察到的整体趋势。
在佐剂疫苗中 AS03 含量的减少对所有总体和局部的 3 级症状有重要影响。
未要求症状的发生率在佐剂疫苗组 (55％和 47％的对象 ) 比在 Fluarix 组 (35％ ) 中有更高的倾向。
从这些结果可以得出结论 ： 候选疫苗的反应原性和安全性特征是令人满意的并且 临床上是可以接受的。
III.8. 总体结论
III.8.1. 免疫原性结果
本研究的主要目的是评估由具有两种不同浓度 AS03 佐剂的低剂量流感疫苗和 Fluarix 引起的体液免疫应答 ( 抗 -HI 抗体效价 )。
在第 21 天， 这三种疫苗超过了欧洲官方年度注册流感病毒粒子片段疫苗的要求 (“Note for Guidance on Harmonisation of Requirements for influenzaVaccines” 年度病毒株变化的免疫学评估 -CPMP/BWP/214/96)。佐剂组与 Fluarix 组相比其 GMT 常常 较高， 有着对 A/Wisconsin(FluLD1/1 对比 Fluarix) 和 B/Malaysia 疫苗株 (FluLD1/2 对比 Fluarix) 观察到的统计学上的显著差异。在所有 3 个疫苗组中观察到从 94.9％到 99％范 围的相似的血清保护率。在佐剂组观察到的血清转变率和血清转变因子比 Fluarix 组的 高。从该试验得到的数据还显示， 由半剂量 AS03 佐剂疫苗诱导的免疫原性与用全剂量佐剂 疫苗诱导的免疫原性相当。
III.8.2. 反应原性和安全性结果
佐剂为 AS03 的低剂量流感候选疫苗的给药在研究群体即年龄在 18 和 59 岁之间 的成年人中是安全的并很好地被临床上所接纳。与全剂量佐剂疫苗相比， 半剂量佐剂疫苗 在要求的局部和总体症状的发生率方面显示了明显的下降。
实施例 IV □在致敏的 BALB/c 小鼠中有佐剂和无佐剂流感片段疫苗 ( 包含各种剂 量的 AS03 佐剂 ) 的临床前评估
IV.1. 实验设计和目的
为了评估用 AS03 这种水包油佐剂配制的流感疫苗所诱导的体液应答的增加， 对 已致敏的小鼠进行了实验。为了模仿人的情况， 用异源亚型株致敏的小鼠进行实验。
IV.1.1. 处理 / 组 ( 表 9)
在第 0 天用三价的完整的甲醛灭活的流感病毒 ( 每株 5μg HA) 鼻内 (20μl 体 积 ) 致敏数组 27 只雌性 BALB/c 成年小鼠。致敏株由包含于疫苗中的那些病毒的早期遗传 漂移变异体 ((5μg HA 完整失活的 H1N1A/Johannesburg/82/96、 H3N2A/Sydney/5/97、 B/ Harbin/7/94) 组成。28 天之后， 用单剂量候选疫苗以 50μl 的总量对小鼠进行肌内注射接 种。用仅含有片段抗原 ( 三价片段疫苗纯剂 ) 的制剂或用含有佐剂为 2 种剂量的 AS03( 全 剂量或 1/5) 的片段抗原的制剂对小鼠进行免疫。用于免疫的病毒株包括 H1N1 A/New Caledonia/20/99、 H3N2A/Panama/2007/99、 B/Shangdong/7/97 病毒抗原 (1.5μg/ 株， 每人 th 剂的 1/10 )。
表9
36102065889 A CN 102065899说组 1 2 3 抗原 / 制剂明书其它处理 异源致敏 D0 异源致敏 D0 异源致敏 D034/43 页三价片段疫苗 / 纯剂 ( 无佐剂 ) 三价片段疫苗 /AS03 三价片段疫苗 /AS031/5
IV.1.2. 疫苗制剂的制备
准备 Tween 80、 Triton X100 和维生素 E 琥珀酸酯 (VES) 的预混料以便在疫苗中 最终浓度达到 750μg/ml Tween 80、 110μg/ml Triton X100 以及 100μg/mlVES。考虑清 洁剂及已存在于病毒株中的 VES 的量， 计算预混料中所使用的数量。
1L 10 倍浓缩的盐水缓冲液 (PBS pH 7.4) 的制备 ： 向 0.800L 注射用水中加入 NaCl 80g、 KCl 2g、 Na2HPO411.44g、 KH2PO42g。溶解后， 用注射用水调节至 1.0L。10 倍稀释 后 pH 将为 7.4。
三价片段疫苗 / 纯剂
按照下列顺序即时制备一 50μl 剂量的制剂 ： 注射用水 + 盐水缓冲液 (10 倍浓缩 的 PBS pH 7.4)+ 预混料， 室温下磁力搅拌 5 分钟， +1.5μg HA H1N1 株， 室温下磁力搅拌 10 分钟， +1.5μg HA H3N2 株， 室温下磁力搅拌 10 分钟， +1.5μgHA B 株， 室温下磁力搅拌 15 分钟。制剂在其制备结束后一小时内注射。
三价片段疫苗 /AS03
准备 Tween 80、 Triton X100 和维生素 E 琥珀酸酯 (VES) 的预混料以便在疫苗中 最终浓度达到 750μg/ml Tween 80、 110μg/ml Triton X100 以及 100μg/mlVES。考虑清 洁剂及已存在于菌株中的 VES 的量， 计算预混料中所使用的数量。
按照下列顺序即时制备一 50μl 剂量的制剂 ： 注射用水 + 盐水缓冲液 (10 倍浓缩 的 PBS pH 7.4)+ 预混料， 室温下磁力搅拌 5 分钟， +1.5μg HA H1N1 株， 室温下磁力搅拌 10 分钟， +1.5μg HA H3N2 株， 室温下磁力搅拌 10 分钟， +1.5μgHA B 株， 室温下磁力搅拌 15 分钟， 对于全剂量 AS03 的 SB62， +25μl 乳剂， 或对于 1/5 量 AS03 的 SB62， +5μl 乳剂， 室温 下磁力搅拌 15 分钟。制剂在其制备结束后一小时内注射。
IV.1.3. 读数 ( 表 10)
在免疫前 ( 第 28 天 ) 和免疫后 14 天对接种的体液免疫应答进行测定 (27 小鼠 / 组 )。通过血凝抑制 (HI) 试验检测血清样品。
表 10
读数 体液应答
时间点 D28， D42样品类型 血清分析方法 IHAIV.2. 结果 IV.2.1. 体液免疫结果如图 5 所示。在这种异源亚型致敏然后单一接种的小鼠模型中， 显示出 AS03 及其稀释液比纯剂疫苗诱导更高的 HI 效价。对于所有的流感 A 株， 观察到 HI 效价统计学 上显著增加 (p ＜ 0.05)。对于 H1N1 株， 在 AS03 和 AS031/5 之间也观察到 HI 效价的显著性 差异 (p ＜ 0.05)。与纯剂疫苗相比， 减少剂量的 AS03 不能增加三个病毒株的 HI 效价。观 察到对 B 株 (B/Shangdong) 非常低的应答 ； 这可能是由于用于致敏的 B 株和疫苗之间的明 显抗原漂移。
IV.3. 结果和结论概要
总之， 与纯剂疫苗相比， 当使用 AS03 佐剂疫苗时可在用异源亚型株致敏的动物中 观察到 HI 效价的增加。全剂量 AS03 对于获得针对所有三个流感疫苗株的强 HI 效价是最 理想的。
实施例 V □在致敏的 C57B1/6 小鼠中的有佐剂和无佐剂流感片段疫苗 ( 包含各种 剂量 AS03 佐剂 ) 的临床前评估
V.1. 实验设计和目的
为了评估由 AS03 这种水包油佐剂制备的流感疫苗所诱导的体液和细胞应答的增 加， 在流感病毒致敏的小鼠中进行实验。 为了模仿人的情况， 用异源亚型株致敏的小鼠进行实验。
V.1.1. 处理 / 组 ( 表 11)
在第 0 天用三价完整的、 经甲醛灭活的流感病毒 ( 每株 5μgHA) 对数组 25 个成 年雌性 C57B1/6 小鼠进行鼻内致敏 (20μl 量 )。致敏株由包括于疫苗中的那些病毒株的 早期漂移变异体 ((5μg HA 完整灭活的 H1N1A/Beijing/262/95、 H3N2A/Panama/2007/99、 B/Shangdong/7/97) 组成。28 天以后， 用单剂量的候选疫苗以 100μl 的总量对小鼠进行 肌肉内接种。用仅含有片段抗原 ( 三价片段抗原纯剂 ) 的制剂或含有佐剂为三种剂量的 AS03( 全剂量、 1/2 或 1/5) 的片段抗原的制剂免疫小鼠。 用于免疫的病毒株包括 H1N1 A/New Caledonia/20/99、 H3N2A/New York/55/2004、 B/Jiangsu/10/2003 病毒抗原 (1.5μg/ 株， 相当于每人剂 1/10th)。
表 11
组 1 2 3 4 5
抗原 / 制剂 三价片段疫苗 / 纯剂 ( 无佐剂 ) 三价片段疫苗 /AS03 三价片段疫苗 /AS031/2 三价片段疫苗 /AS031/5 PBS其它处理 异源致敏 D0 异源致敏 D0 异源致敏 D0 异源致敏 D0 异源致敏 D0V.1.2. 疫苗制剂的制备 三价片段疫苗 / 纯剂按照下列顺序即时制备 100μl 剂量的制剂 ： 注射用水 + 盐水缓冲液 ( 按实施例 IV 所授方法配制 10 倍浓缩的 PBS pH 7.4)+Fluarix 临床批次 DFLUA014( 每株最终剂量 1.5μg)。
三价片段疫苗 /AS03
按照下列顺序即时制备 100μl 剂量的制剂 ： 注射用水 + 盐水缓冲液 ( 按实施例 IV 所授方法配制 10 倍浓缩的 PBS pH 7.4)+Fluarix 临床批次 DFLUA014( 每株最终剂量 1.5μg)+25μl SB62 乳剂 ( 全剂量 ) 或 12.5μl SB62 乳剂 (1/2 剂量 ) 或 5μl SB62 乳剂 (1/5 剂量 )。制剂在制备结束后一小时内注射。
V.1.3. 读数 ( 表 12)
免疫后第 21 天 (10 鼠 / 组 ) 测量对接种的体液免疫应答并通过血凝抑制 (HI) 试 验检测血清样品。免疫后 7 天通过胞内细胞因子染色 (ICS) 检测细胞免疫应答。
表 12
读数 体液应答 细胞应答
时间点 D49 D35样品类型 血清 PBMC分析方法 IHA ICSV.2. 结果
V.2.1. 体液免疫 (10 鼠 / 组 )
结果如图 6 所示。在异源亚型致敏随后单一接种的该小鼠模型中， 与纯剂疫苗相 比， AS03 和其稀释液 (1/2 和 1/5) 显示诱导较高的 HI 效价。对于所有三个病毒株， 在接受 佐剂为全剂量 AS03 或减剂量 AS03 的疫苗的小鼠之间没有观察到 HI 效价的差异。
V.2.2.. 细胞免疫 (15 鼠 / 组 )
结果如图 7 所示。无论 AS03 的稀释度如何， 与用三价片段抗原纯剂免疫的小鼠相 比， 在用佐剂为 AS03 的三价片段疫苗的小鼠中观察到较高的 CD4+T 细胞应答。与用佐剂 为全剂量 AS03 的三价片段疫苗免疫的小鼠中诱导的应答相比， 当小鼠用佐剂为较低剂量 AS03 的三价片段疫苗免疫时， 观察到较少的细胞应答趋势。
V.3. 结果和结论概要
总之， 与纯剂疫苗相比， 当使用佐剂为 AS03 的疫苗时在异源亚型株致敏的动物中 观察到体液和细胞应答的增加。在用全剂量或部分剂量 AS03 佐剂免疫的小鼠之间观察到 相似程度的体液应答。然而， 佐剂剂量的减少与 CD4+T 细胞应答所减少的程度的趋势相关。
实施例 VI □致敏的 C57B1/6 小鼠中有佐剂和无佐剂流感片段疫苗 ( 包含各种剂 量 AS03 佐剂和低剂量抗原 ) 所诱导的细胞免疫应答的临床前评估
VI.1. 实验设计和目的
为了评估由用 AS03 这种水包油佐剂制备的含低剂量抗原 (0.5μg/ 株， 每人剂的 th 1/30 ) 的流感疫苗所诱导的细胞免疫应答的增加， 用流感病毒致敏的小鼠进行实验。为了 模仿人的情况， 用异源亚型株致敏的小鼠进行实验。
VI.1.1. 处理 / 组 ( 表 13)在第 0 天用三价完整的、 经甲醛灭活的流感病毒 ( 每株 5μgHA) 对数组 15 个成年 雌性 C57B1/6 小鼠进行鼻内致敏 (20μl 量 )。致敏株由包括于疫苗中的那些病毒株的早 期漂移变异体 ((5μgHA 完整灭活的 H1N1A/Beijing/262/95、 H3N2A/Panama/2007/99、 B/ Shangdong/7/97) 组成。 28 天以后， 用单剂量的候选疫苗以 50μl 的总量对小鼠进行肌肉内 接种。用仅含有片段抗原 ( 三价片段抗原纯剂 ) 的制剂或含有佐剂为三种剂量的 AS03( 全 剂量、 1/2 或 1/5) 的片段抗原的制剂对小鼠进行免疫。用于免疫的病毒株包括 H1N1A/New Caledonia/20/99、 H3N2A/New York/55/2004、 B/Jiangsu/10/2003 病毒抗原 (0.5μg/ 株， 相当于每人剂的 1/30th)。
表 13
组 1 2 3 4 5
抗原 / 制剂 三价片段疫苗 / 纯剂 ( 无佐剂 ) 三价片段疫苗 /AS03 三价片段疫苗 /AS031/2 三价片段疫苗 /AS031/5 PBS其它处理 异源致敏 D0 异源致敏 D0 异源致敏 D0 异源致敏 D0 异源致敏 D0VI.1.2. 疫苗制剂的制备
三价片段疫苗 / 纯剂
按照以下顺序即时制备 50μl 剂量的制剂 ： 注射用水 + 盐水缓冲液 ( 按实施例 IV 所授方法配制 10 倍浓缩的 PBS pH 7.4)+Fluarix 临床批次 DFLUA014( 每株最终剂量 0.5μg)
三价片段疫苗 /AS03
按照以下顺序即时制备 50μl 剂量的制剂 ： 注射用水 + 盐水缓冲液 ( 按实施例 IV 所授方法配制 10 倍浓缩的 PBS pH 7.4)+Fluarix 临床批次 DFLUA014( 每株最终剂量 0.5μg)+25μl SB62 乳剂 ( 全剂量 ) 或 12.5μl SB62 乳剂 (1/2 剂量 ) 或 5μl SB62 乳剂 (1/5 剂量 )。制剂在制备结束后一小时内注射。
VI.1.3. 读数 ( 表 14) 免疫后 7 天通过胞内细胞因子染色检测细胞免疫应答 表 14读数 细胞应答 时间点 D35 样品类型 PBMC 分析方法 ICS
VI.2. 结果 VI.2.1. 细胞免疫结果如图 8 所示。与用三价片段疫苗纯剂免疫的小鼠相比， 在用佐剂为 AS03( 全 剂量或 1/2 剂量 ) 的三价片段疫苗免疫的小鼠中观察到略高的 CD4+T 细胞应答。与用三价 片段疫苗纯剂或佐剂为全剂量或半剂量 AS03 的三价片段疫苗所免疫的小鼠中诱导的应答 相比， 当小鼠用佐剂为 1/5AS03 剂量的三价片段疫苗免疫时， 观察到较高的细胞应答。
VI.3. 结果和结论概要
总之， 与疫苗纯剂相比， 当使用佐剂为 AS03 的疫苗时在异源亚型抗原致敏的动物 中观察到 CD4+T 细胞应答的最小增加。在该实验中没有观察到佐剂剂量应答， 实际上看到 1/5 剂量 AS03 比较高剂量佐剂诱导更高的抗原特异性 CD4+T 细胞的频率。 总体上这些数据 与其它临床前实验不一致， 可能暗示该具体实验有技术问题。
实施例 VII □未接触抗原 C57B1/6 小鼠中有佐剂和无佐剂 H5N1 片段疫苗 ( 包含 各种剂量 AS03 佐剂和抗原 ) 的临床前评估
VII.1.VII.1. 实验设计和目的
为了评估由用 AS03 这种水包油佐剂制备的 H5N1 片段疫苗所诱导的体液和细胞免 疫应答的增加， 对 H5N1- 未接触抗原小鼠进行实验。在流行病的情况下， 预期全世界的人口 对最近流行的流感病毒菌株免疫上未接触抗原。由于这种未接触抗原的免疫状态， 流行病 疫苗可能需要两个疫苗剂量以保护个体免受由新病毒菌株引起的感染和严重疾病。 为了表 现以前暴露给抗原的缺乏， 开发了未接触抗原小鼠模型以评估疫苗免疫原性。
VII.1.1. 处理 / 组 ( 表 15)
在第 0 和第 28 天用流行的 H5N1 候选疫苗以 50μl 的总量对数组 15 个成年雌性 未接触抗原 C57B1/6 小鼠肌内注射进行免疫。用仅含有 H5N1 片段抗原 (H5N1 片段抗原纯 剂 ) 的制剂或佐剂为不同剂量 AS03( 两倍、 全剂量、 1/2 或 1/5) 的片段抗原的制剂对小鼠进 行免疫。用于免疫的病毒株包括 H5N1A/Vietnam/1194/04 病毒抗原 (1.5 或 0.38μg/ 株， 相当于每人剂的 1/10th)。没有制备双倍剂量 AS03 的制剂而是伴随注射一 50μl H5N1 片 段疫苗 / 全剂量 AS03+ 一 50μl 剂量 AS03。
表 15
组 1 2 3 4 5 6 7抗原 / 制剂 H5N1 片段疫苗 / 纯剂 ( 无佐剂 ) H5N1 片段疫苗 / 双倍剂量 AS03 H5N1 片段疫苗 /AS03 H5N1 片段疫苗 /AS031/2 H5N1 片段疫苗 /AS031/5 H5N1 片段疫苗 / 纯剂 ( 无佐剂 ) H5N1 片段疫苗 / 双倍剂量 AS0341抗原剂量 1.5μg 1.5μg 1.5μg 1.5μg 1.5μg 0.38μg 0.38μg102065889 A CN 102065899说8 9 10 11明书0.38μg 0.38μg 0.38μg39/43 页H5N1 片段疫苗 /AS03 H5N1 片段疫苗 /AS031/2 H5N1 片段疫苗 /AS031/5 PBS
VII.1.2. 疫苗制剂的制备
1L 最终原液缓冲液 (PBS pH 7.2±0.2) 的制备 ： 向 0.800l 注射用水中加入 NaCl 7.699g、 KCl 0.200g、 MgCl2x 6H2O 0.100g、 Na2HPO4x 12H2O2.600g、 KH2PO40.373g。 溶解之后， 用注射用水调至 1.0L。
H5N1 片段疫苗 / 纯剂
50μl 剂量的制备 ：
将乙基汞硫代水杨酸钠 ( 考虑其在病毒株中的浓度的量 ) 和 Triton X100 加到最 终的原液缓冲液中。 因为病毒株中的 Tween 浓度达到了制剂中的目标含量， 所以不加 Tween 368μg/ml Tween 80。在 1.5μg 剂量的制剂中终浓度是 10μg/ml 乙基汞硫代水杨酸钠、 80 和 35μg/ml Triton X100。其在 0.38μg 剂量的制剂中为 10μg/ml 乙基汞硫代水杨酸 钠、 93μg/ml Tween 80 和 8.9μg/ml TritonX100。经 5-30 分钟磁力搅拌之后， 加入 1.5 或 0.38μgHA(H5N1 株 )。将制剂搅拌 30-60 分钟。检查 pH。在配制结束后一小时之内进 行注射。
H5N1 片段疫苗 /AS03
50μl 剂量的制备 ：
将乙基汞硫代水杨酸钠 ( 考虑其在病毒株中的浓度的量 ) 和 Triton X100 加到最 终的原液缓冲液中。因为菌株中的 Tween 浓度达到了制剂中的目标含量， 所以不加 Tween 80。在 1.5μg 剂量的制剂中最终浓度 10μg/ml 乙基汞硫代水杨酸钠、 368μg/ml Tween 80 和 35μg/ml Triton X100。其在 0.38μg 剂量的制剂中为 10μg/ml 乙基汞硫代水杨酸 钠、 93μg/ml Tween 80 和 8.9μg/ml Triton X100。经 5-30 分钟磁力搅拌之后， 加入 1.5 或 0.38μgHA(H5N1 株 )。经 30-60 分钟磁力搅拌之后， 加入 25 或 12.5 或 5μl SB62 乳剂。 将制剂搅拌 30-60 分钟。检查 pH。在配制结束后一小时之内进行注射。
VII.1.3. 读数 ( 表 16)
免疫 (10 鼠 / 组 ) 后 14 天通过抗 -Ig、 IgG1 和 IgG2b 抗体效价 ( 图 9， A-F) 测定 体液免疫应答。体液免疫应答也可在免疫 (10 鼠 / 组 ) 后 21 天通过抗 -H5N1 血凝抑制试 验进行测定 ( 图 10， A-B)。
免疫后 6 天 ( 每组 3 只小鼠， 5 个汇集 ) 通过抗原特异性的 CD4+T 细胞的胞内细胞 因子染色 (ICS) 并通过流式细胞术计数检测细胞免疫应答 ( 图 11， A-B)。
表 16VII.2. 结果
VII.2.1. 体液免疫应答 ： ELISA 和同种型
结果如图 9 所示。
对于每剂 H5N1 片段疫苗， 与无佐剂 H5N1 片段疫苗相比， 所有佐剂组诱导较高的 抗 -H5N1Ig、 IgG1 和 IgG2b 抗体效价 ( 图 9-A-F)。
对于每剂 H5N1 片段疫苗， 抗 -H5N1IgG1 抗体应答比抗 -H5N1IgG2b 抗体应答高 4-5 倍 ( 图 9-C-F)。 用一剂 1.5μgHA 的 H5N1 片段疫苗并结合每剂佐剂， 没有观察到抗 -H5N1Ig、 IgG1 和 IgG2b 抗体应答的差别 ( 图 9-A、 C 和 E)。
对 于 剂 量 为 0.38μgHA 的 H5N1 片 段 疫 苗， 与 佐 剂 为 AS03/2(p ＝ 0.7315) 和 AS031/5(p ＝ 0.9744) 的 H5N1 片段疫苗诱导的应答相比， 在用 2x 全剂量佐剂的 H5N1 片段 疫苗产生免疫之后观察到较高抗 -H5N1Ig 效价的倾向 ( 图 9-B)。对于抗 -H5N1IgG1 抗体应 答也观察到这一倾向 ( 图 9-D)。然而， 其功率不足以观察到统计学上显著差异 ( 对于 1.7 倍的差异为 25％的功率， 或者对于 2 倍的差异为 47％的功率 )。
VII.2.2. 体液免疫应答 ： HI 效价
对于 1.5μg HA/ 鼠的剂量
对于每个佐剂剂量， 与用无佐剂 H5N1 片段疫苗免疫的小鼠中所获得的应答相比， 所有用佐剂为 AS03 的 H5N1 片段疫苗免疫的小鼠诱导较高的 HI 效价 ( 图 10-A)。当 H5N1 片段疫苗用一剂量范围 AS03 作为佐剂时， 没有观察到 HI 效价的差别 ( 图 10-A)。
对于 0.38μgHA/ 剂的剂量
对于每个佐剂剂量， 与用无佐剂 H5N1 片段疫苗免疫的小鼠中所获得的应答相比， 所有用佐剂为 AS03 的 H5N1 片段疫苗免疫的小鼠诱导较高的 HI 效价 ( 图 10B)。
与用佐剂为 AS03/2 的 H5N1 片段疫苗所获得的应答相比， 用佐剂为 2x 全剂量 AS03 的 H5N1 片段疫苗观察到明显高的 HI 效价 ( 相差 4 倍时 p ＝ 0.032)( 图 10B)。
在用佐剂为 2x 全剂量 AS03 或全剂量 AS03 的 H5N1 片段疫苗免疫的小鼠中或在用 佐剂为 AS03/2 或 AS03/5 的 H5N1 片段疫苗免疫的小鼠之间没有观察到 HI 效价的差别 ( 图 10B)。
抗原剂量之间的对比 (1.5μg 或 0.38μg)
除了在用佐剂为 AS03/5 的 1.5μg HA 片段 H5N1 免疫的小鼠和用佐剂为 2x 全剂 量 AS03 的 0.38μg HA 片段 H5N1 免疫的小鼠之间以外， 在用佐剂为 AS03、 AS03/2 或 AS03/5 的每个 HA 剂量的 H5N1 片段疫苗所免疫的小鼠之间没有观察到 HI 效价的差异 ( 图 10)。与 结合较低剂量佐剂 ( 佐剂为 AS03/5 的 1.5μg HA， 相差 4 倍时 p ＝ 0.0193) 的较高抗原剂 量相比， 用佐剂为 2x 全剂量 AS03 的 0.38μg HA 片段 H5N1 免疫后， HI 效价显著较高 ( 图 10)。
VII.2.3. 细胞免疫应答
结果如图 11 所示。
与用无佐剂 H5N1 片段疫苗免疫的小鼠相比， 用佐剂为各种剂量 AS03 的 H5N1 片段 疫苗免疫的小鼠在每个剂量 (1.5 或 0.38μg) 的 H5N1 片段疫苗中观察到更高的 CD4+T 细 胞应答 ( 图 11)。
对于剂量为 1.5μg 的 H5N1 片段疫苗， AS03 剂量的减少对应于 CD4+T 细胞频率的 下降 ( 图 11A)。然而， 对于剂量为 0.38μg 的 H5N1 片段疫苗， 在用佐剂为 AS03 的 H5N1 片 段疫苗免疫的小鼠中不同佐剂剂量之间没有观察到 CD4+T 细胞应答的差别 ( 图 11B)。
VII.3. 结果和结论概要
小鼠免疫原性研究显示含有佐剂的 H5N1 片段疫苗比无佐剂 H5N1 片段疫苗诱导明 显较高的体液 ( 抗 -H5N1ELISA 和 HI 效价 ) 和细胞 (CD4+T 细胞 ) 应答。
在用 1.5μg 和 0.38μg 佐剂 H5N1 片段疫苗免疫的小鼠之间没有观察到体液免疫 应答的抗原剂量应答效应， 表明当佐剂存在时， 可需要甚至更低剂量的 HA 以观察在此模型 中的剂量应答效应。
与 H5N1 疫苗纯剂相比， 当使用 AS03 佐剂 H5N1 流感疫苗时在未接触抗原小鼠中可 观察到 CD4+T 细胞应答的强烈增加。当用 0.38μg H5N1 片段疫苗作为候选疫苗时观察到 AS03 稀释液没有影响， 而当 1.5μg H5N1 片段疫苗用减量的 AS03 作为佐剂时则观察到 CD4T 细胞应答的减弱。
如以前所观察到的， 在用佐剂为全剂量或半剂量 AS03 的 H5N1 片段疫苗 ( 以两者 之任一抗原剂量 ) 免疫的小鼠之间没有观察到体液和细胞免疫应答的差别。当疫苗制剂中 使用 2x 全剂量 AS03 时检测到一些免疫应答的增强， 而当疫苗制剂中使用 AS03/5 时则相应 地检测到免疫应答的减弱。
总之， 此处报道的数据支持该疫苗制剂的新颖佐剂体系的效能。
实施例 VIII □在致敏的大白猪中有佐剂和无佐剂流感疫苗的临床前评估
VIII.1. 实验设计和目的
为了评估由用 AS03 这种水包油佐剂制备的流感疫苗所诱导的体液应答的增加， 对流感病毒致敏的猪进行实验。
为了评估 AS03 在与人接近的动物模型的剂量范围， 使用猪进行实验。猪显示了 一系列生物学类似性， 以至于建立这种动物作为生理学上与人类极少有例外最接近的动物 (Douglas R.， 1972)。此外， 猪感染流感的表现易于观察。
VIII.1.1 处理 / 组 ( 表 17)
在第 0 天用总量为 200μl 的三价完整的甲醛灭活流感病毒 ( 每株 25μgHA) 对 数组 10 头雌性大白猪进行鼻内致敏。致敏病毒株由与疫苗株同源的病毒株组成 (25μgHA 完整的灭活 H1N1A/New Caledonia/20/99、 H3N2A/Panama/2007/99 和 B/Shangdong/7/97)。 28 天之后， 用单剂量的候选疫苗以 500μl 的总量对猪进行肌内注射接种。用仅含有片 段抗原 ( 三价片段疫苗纯剂 ) 的制剂或含有剂量范围 ( 全剂量、 1/2 或 1/5) 的佐剂 AS03 的 片 段 抗 原 的 制 剂 对 猪 免 疫。 用 于 免 疫 的 病 毒 株 包 括 H1N1A/New Caledonia/20/99、 H3N2A/Panama/2007/99 和 B/Shangdong/7/97 病 毒 抗 原 ( 每 人 剂 15μgHAH1N1 A/New Caledonia/20/99、 H3N2 A/Panama/2007/99 株和 17.5μgB/Shangdong/7/97 株 )。
组 (10 头猪 / 组 ) ：表 17组 1 2 3 4 抗原 / 制剂 三价片段疫苗 / 纯剂 ( 无佐剂 ) 三价片段疫苗 /AS03 三价片段疫苗 /AS031/2 三价片段疫苗 /AS031/5 其它处理 异源致敏 D0 异源致敏 D0 异源致敏 D0 异源致敏 D0VIII.1.2. 疫苗制剂的制备
三价片段 / 纯剂
制备 Tween 80、 Triton X100 和维生素 E 琥珀酸酯 (VES) 预混料以使其在疫苗中 的最终浓度达到 750μg/ml Tween 80、 110μg/ml Triton X100 以及 100μg/ml VES。 预混 料中所使用的量考虑其在病毒株中的含量。
按照下列次序即时制备 500μl 剂量的制剂 ： 注射用水 + 盐水缓冲液 ( 按实施例 IV 所授方法制备的 10 倍浓缩的 PBS pH 7.4)+ 预混料， 室温下磁力搅拌 5 分钟， +15μg HA H1N1 株， 室温下磁力搅拌 10 分钟， +15μgHA H3N2 株， 室温下磁力搅拌 10 分钟， +17.5μgHA
B 株， 室温下磁力搅拌 15 分钟。制备结束后一小时内将制剂进行注射。
三价片段疫苗 /AS03
制备 Tween 80、 Triton X100 和维生素 E 琥珀酸酯 (VES) 预混料以使其在疫苗中 的最终浓度达到 750μg/ml Tween 80、 110μg/ml Triton X100 以及 100μg/ml VES。 预混 料中所使用的量考虑其在病毒株中的含量。
按照下列次序即时制备 500μl 剂量的制剂 ： 注射用水 + 盐水缓冲液 ( 按实施例 IV 所授方法制备的 10 倍浓缩的 PBS pH 7.4)+ 预混料， 室温下磁力搅拌 5 分钟， +15μgHA H1N1 株， 室温下磁力搅拌 10 分钟， +17.5μg HA B 株， 室温下磁力搅拌 15 分钟， +250μl AS03 的 乳剂 SB62( 全剂量 ) 或 125μl 的乳剂 SB62(1/2 剂量 AS03) 或 50μl 的乳剂 SB62(1/5 剂 量 AS03)， 室温下磁力搅拌 15 分钟。制备结束后一小时内将制剂进行注射。
VIII.1.3. 读数 ( 表 18) 在鼻内致敏抗原之前 ( 第 0 天 )、 免疫之前 ( 第 28 天 ) 和免疫之后 14 天 (10 头猪 / 组 ) 对接种的体液免疫应答进行了测定。通过血凝抑制试验 (HI) 检测血清样品。
表 18
读数 体液应答
时间点 D0， D28， D42样品类型 血清分析方法 IHAVIII.2. 结果和结论 VIII.2.1. 体液免疫结果如图 12 所示。不管佐剂的稀释度如何， 在该同源致敏的模型中， 佐剂为 AS03 的三价片段制剂比三价制剂纯剂诱导对所有菌株诱导更强的 HI 应答， 尽管对于所有三种 病毒株， 不一定达到统计学显著性。观察到佐剂剂量效应具有病毒株之间的轻微差异。对 于免疫原性较弱的株如 B/Shangdong， 仅有佐剂为全剂量 AS03 的三价片段疫苗显著不同于 疫苗纯剂。对照佐剂为全剂量 AS03 的三价片段疫苗， 减少剂量的 AS03 不能增加以上那些 用疫苗纯剂所见到的所有三种病毒株的 HI 效价。