相关申请
本申请根据35U.S.C.119(e)要求1999年9月2日申请的美国 申请系列No：60/152494，和1999年7月13日申请的美国申请系 列No：60/143581的优先权，所述申请并入参考。 政府支持
本发明是在国立健康研究院合同号R29CA74132的政府支持下 进行的。
发明领域
本发明涉及医学领域，尤其涉及用具有在MMP-9和/或β1整联 蛋白内发现的特异序列的拮抗剂抑制组织血管发生或检测血管发生 的方法和组合物。
发明背景
每年肿瘤生长和转移影响了众多人的健康。事实上，只在美国 在未来的一年里估计有600000个以上的新癌症患者被诊断(Varner， J.A.，Brooks，P.C.，和Cheresh，D.A.(1995)Cell Adh.Commun3， 367-374)。许多研究提示所有实体肿瘤的生长需要新血管形成以使 肿瘤由最小持续扩张(Varner等，1995；血液，C.H.和Zetter，B.R. (1990)Biochim.Biophys.Acta.1032：89-118；Weidner，N等(1992)， J.Natl.Cancer Inst.84：1875-1887；Weidner，N.等(1991)，N.Engl. J.Med.324：1-7；Brooks，P.C.等(1995)，J.Clin.Invest.96：1815-1822； Brooks，P.C.等(1994)，细胞79：1157-1164；Brooks，P.C.等(1996)， 细胞85：683-693；Brooks，P.C.等(1998)，细胞92：391-400)。许多 其它人体疾病也是特征在于不受调节的血管发生，包括眼部疾病如 黄斑变性和糖尿病视网膜病变。另外，许多炎症疾病也与失控的新 血管形成相关，如关节炎和银屑病(Varner等，1995)。
从现有的血管中通过生理过程发生新血管已知称为血管发生 (Varner等，1995；血液和Zetter 1990；Weidner等，1992)。此复 杂过程要求各种分子的协作，包括生长因子，细胞粘着受体，基质 降解酶和胞外基质成分(Varner等，1995；血液和Zetter 1990；Weidner 等，1992)。因此，阻断血管发生的治疗方法可影响实体肿瘤的生长。 事实上，已经提供了清晰的证据证明在各种动物模型中阻断肿瘤的 新血管形成可抑制肿瘤生长，而且人体临床数据支持此论点(Varner， J.A.，Brooks，P.C.，和Cheresh，D.A.(1995) Cell Adh.Commun3， 367-374)。
也已经提出抑制血管发生可通过以下方式进行：(1)抑制“血 管发生分子”如βFGF(成纤维细胞生长因子)的释放，(2)中和血 管发生分子，如通过使用抗βFGF抗体，和(3)抑制内皮细胞对血 管发生刺激物的应答。后一方案已经引起注意，Folkman等，癌症 生物学，3：89-96(1992)已经阐述了一些内皮细胞应答抑制剂，包 括胶原酶抑制剂，基底膜周转抑制剂，抑制血管(angiostatic)的类 固醇，真菌产生的血管发生抑制剂，血小板因子4，血小板反应蛋 白，关节炎药物如D-青霉胺和硫代苹果酸金，维生素D3类似物，α —干扰素及可用于抑制血管发生的其它物质。另外提出的血管发生 抑制剂见Blood和Zetter1990；Moses等(1990)科学248：1408-1410； Ingber等(1988)Lab.Invest.，59：44-51；和美国专利No：5092885， 5112946，5192744和5202352所述。
为阻断血管发生，许多研究人员也着重于起动血管发生的生长 因子和细胞因子(Vamer等，1995；Blood和Zetter1990；Weidner 等，1992；Weidner等，1991；Brooks等，1995；Brooks等，1994； Brooks等，1997)。然而，有大量的独特的生长因子和细胞因子具有 刺激血管发生的能力。因为此丰余所致，阻断单一细胞因子的治疗 方面的益处是有限的。因此，需要抑制血管发生和蛋白酶解的其它 抗血管发生的靶。
发明概述
侵袭细胞利用蛋白质一蛋白质之间的相互作用，包括酶和整联 蛋白受体，以将蛋白酶解活性定位于细胞表面，并促进侵袭细胞行 为。本发明提供了抑制血管发生和肿瘤生长的方法和组合物，使用 靶向细胞粘着和胞外基质(ECM)的蛋白酶解的拮抗剂。特别地， 基于发现侵袭细胞有助于将蛋白酶解活性定位于细胞表面这一独特 机制，本发明提供了新的组合物和方法以抑制血管发生。
本发明的一方面提供了抑制蛋白质—蛋白质之间相互作用的血 管发生拮抗剂的组合物，包含细胞粘着和胞外基质(ECM)的蛋白 酶解的拮抗剂。
本发明的另一方面提供了抑制血管发生的组合物，包括修饰涉 及在蛋白酶MMP-9和/或β1整联蛋白受体内发现的一些序列的蛋白 质—蛋白质之间相互作用的拮抗剂。这种拮抗剂可包括但非限于与 MMP-9和β1整联蛋白受体免疫反应的抗体或其功能片段，或特异 于MMP-9和β1整联蛋白受体复合物的多肽或肽。
本发明的再一方面包含抑制血管发生的方法，包括将组织与细 胞粘着和胞外基质(ECM)的蛋白酶解的拮抗剂接触，所述拮抗剂 包括但非限于与MMP-9和β1整联蛋白受体免疫反应的抗体或其功 能片段，或特异于MMP-9和β1整联蛋白受体复合物的多肽或肽。
本发明的另一方面还阐述了抑制组织中疾病状态或血管发生的 方法。这些方法例如包括对该组织施用一种组合物，该组合物包含 抑制血管发生量的蛋白酶MMP-9在细胞表面的定位的拮抗剂。本发 明所应用的疾病状态可以是肿瘤生长或转移，黄斑变性，银屑病， 组织再狭窄等。
进行治疗的组织可以是任何需要抑制血管发生的组织，如发生 新血管形成的病变组织。这些组织例如包括炎症组织，实体肿瘤， 癌症转移，组织再狭窄等。
本发明还提供了检测血管发生，肿瘤组织，转移，和肿瘤侵袭 组织的方法，通过将本发明的拮抗剂与所述组织相接触而进行。
本发明还提供了筛选本发明拮抗剂的方法。
附图简述
图1：示出利用纤连蛋白的110kD细胞结合结构域，从胎盘裂 解物中纯化β1整联蛋白α5β1的结果。
图2：示出当纯化的α5β1和ανβ3在与明胶共聚的10％SDS PAGE 凝胶上分离时，β1整联蛋白α5β1的信号识别蛋白体的受体 (zymographic)分析结果。
图3：当纯化的整联蛋白α5β1和ανβ3(1ug)被分离时，对β1 整联蛋白α5β1的Western印迹分析的结果。
图4：重组的MMP-9与β1整联蛋白α5β1，或对照蛋白β酪蛋 白的结合分析结果。
图5：用α5β1阳性和阴性细胞温育重组MMP-9的实验结果。
图6：确定MMP-9和β1整联蛋白α5β1在人体黑素瘤血管中的 共定位的实验结果。
图7：鉴别结合MMP-9的合成肽的实验结果。FRIP-1是SEQ ID NO：1，AAA是AAA肽，其是SEQ ID NO：2。
图8A/8B：将FRIP-1肽注射入鸡胚中的实验结果，所用鸡胚中 已经诱导血管发生。
图9：产生抗合成肽FRIP-1(SEQ ID NO：1)的Mab的实验 结果。
图10：在有或无Mab FM155或LM609的情况下，结合重组人 MMP-9(2ug/ml)的实验结果。
图11：确定系统施用FM155对黑素瘤生长的作用。
发明详述
根据本发明，揭示了涉及蛋白酶MMP-9和/或β1整联蛋白受体 内的一些序列的蛋白质—蛋白质之间相互作用通过将蛋白酶解活性 定位于细胞表面而有助于血管发生和/或肿瘤生长。因此，修饰这种 涉及在MMP-9和/或β1整联蛋白受体内发现的一些序列的蛋白质— 蛋白质之间的相互作用，可抑制血管发生和/或肿瘤生长。 MMP-9和β1整联蛋白之间的相互作用 MMP-9
在生理状态下，结缔组织的合成与胞外基质的降解处于动态平 衡。降解有一部分是由于基质金属蛋白酶(MMPs)所致，这种酶 是参与结缔组织降解和再造型的一个蛋白酶家族。此家族成员内肽 酶是从位于或与结缔组织相关的各种类型细胞中以酶原形式分泌 的，所述细胞如成纤维细胞，单核细胞，巨噬细胞，内皮细胞和侵 袭或转移的肿瘤细胞。MMP表达是在局部组织环境中通过生长因子 和细胞因子的刺激进行的，在此环境中这些酶特异地降解胞外基质 的蛋白质成分，如胶原蛋白，蛋白聚糖(蛋白质核心)，纤连蛋白和 层粘连蛋白。这些普遍存在的胞外基质成分存在于关节囊内层，小 肠结缔组织，基底膜和软骨中。MMPs共享许多性质，包括锌和钙 依赖性，作为酶原分泌，和40-50％氨基酸序列同源性。
MMP对胞外基质的过分降解包含于许多慢性和急性疾病的发 病机理中。例如，许多研究如Exp.Opin.Invest.Drugs，5，323-335 (1996)已经确定MMPs的表达和激活在肿瘤生长，侵袭和转移中 是关键的。另外，已经发现MMP活性是血管发生所需的，血管发 生是肿瘤生长以及其它病理状况如黄斑变性所必需的。
这种酶家族成员包括但非限于胶原酶(MMP-1)，明胶酶或IV 型胶原酶(MMP-2，MMP-9)，matrilysin(MMP-7，PUMP-1)，和 溶基质素(MMP-3)。
特别感兴趣的是，明胶酶MMP-9是一种由单核巨噬细胞，中 性粒细胞，角膜上皮细胞，肿瘤细胞，细胞滋养层和角质细胞释放 的92kD的酶。
许多生理过程要求细胞与其它细胞和/或胞外基质密切接触。这 种粘着事件可以是细胞激活，迁移，增殖和分化所需的。细胞—细 胞和细胞—基质间相互作用是通过一些细胞粘着分子家族(Cams) 介导的，这些分子包括选择蛋白，整联蛋白，钙粘着蛋白和免疫球 蛋白。Cams在正常和病理过程中均起关键作用。因此，不干扰正常 细胞功能地将特异的和相关的Cams导向一些疾病情形是抑制细胞 —细胞和细胞—基质之间的相互作用的有效和安全治疗剂所必需 的。
在上述的各种Cams中，整联蛋白超家族是在近乎每种哺乳动 物细胞类型的各种组合中发现的(参见E.C.Butcher，细胞67，1033 (1991)；T.A.Springer，细胞76，301(1994)；D.Cox等，“整联蛋 白的药理学”，医学研究综述14，195(1994)和V.W.Engleman等，“作 为药物靶的细胞粘着整联蛋白”，Ann.Repts.医学化学第31卷， J.A.Bristol，Ed.，科学出版社，NY，1996，p191)。
整联蛋白代表粘着受体的鉴定最为清楚的超家族之一。整联蛋 白是糖蛋白异源二聚体，含有非共价结合的α和β亚单位。整联蛋白 亚单位是跨膜蛋白，含有一个与胞外基质或细胞成分相互作用的胞 外结构域，一个跨越细胞膜的跨膜结构域和一个与一或多个细胞骨 架成分相互作用的胞质结构域。
已知14种α亚单位和8种β亚单位，它们可配对形成至少20种 不同的整联蛋白分子。一些独特的整联蛋白α链能与一类β链配对形 成β链亚家族。
特别感兴趣的是β亚1(β1)亚家族，其包括7个成员(也已知 为VLA蛋白：α1β1-α7β1)。如以下实施例所示，可使用如下拮抗 剂抑制血管发生和疾病状态，所述拮抗剂修饰涉及β1整联蛋白例如 α5β1整联蛋白的一些氨基酸序列的蛋白质—蛋白质间相互作用。本 文中所用术语β1整联蛋白和含有β1的整联蛋白是可交替使用的。 本发明的拮抗剂
本发明的实施例确定MMP-9直接结合β1整联蛋白α5β1整联蛋 白。因此，缺失产生β1整联蛋白基因的细胞结合MMP-9的能力显 著降低。实施例还提示MMP-9和α5β1整联蛋白可共定位于细胞和 血管的表面，因为实施例表明MMP-9和α5β1整联蛋白在人体血管 区室以及在其自身肿瘤细胞上密切结合。
另外，对MMP-9和α5β1整联蛋白的氨基酸序列分析鉴别了一 种多肽FRIP-1(SEQ ID NO：1)，其介导这两个蛋白质之间的相互 作用。FRIP-1结合MMP-9，但一种对照肽AAAA(SEQ ID NO：3) 与MMP-9的结合亲和性明显较低。发现FRIP-1抑制血管发生。
另外，如以下实施例所示，FRIP-1可用于鉴别修饰涉及MMP- 9和/或α5β1整联蛋白内一些氨基酸序列的蛋白质—蛋白质间的相互 作用的拮抗剂。因此，通过用缀合载体蛋白的FRIP-1注射小鼠鉴别 了Mab FM155。发现Mab FM155与FRIP具有高度特异性，但与对 照肽AAAA(SEQ ID NO：3)不反应。
实施例例证了Mab FM155可强力抑制肿瘤在体内生长。因此 Mab FM155修饰涉及MMP-9和/或α5β1整联蛋白内一些氨基酸序列 的蛋白质—蛋白质间的相互作用。
本发明的拮抗剂可以是任何类型的分子，包括但非限于肽，多 肽，非肽分子，例如有机分子和寡核苷酸，蛋白质，酶，抗体，单 克隆和多克隆抗体等。
本发明的拮抗剂结合FRIP-1，但结合对照肽AAAA的亲和性 明显较低。表观亲和性可通过如酶联免疫吸附测定(ELISA)或任 何本领域技术人员已知的其它方法确定。真实的亲和性可通过本领 域技术人员已知方法确定。
另外，本领域技术人员已知特异地针对由Mab FM155限定的 表位的其它拮抗剂可具有相似的抗血管发生和抗肿瘤活性。这种拮 抗剂包括其它阻断功能的Mabs，人源化的Mabs，嵌合的Mabs，毒 素缀合的Mabs，多克隆抗体，针对此表位的小肽拮抗剂以及由FM155 限定的表位的有机和非肽模拟物。另外，由单克隆抗体FM155限定 的表位可自身作为强力抗血管发生和/或抗肿瘤化合物。另外，可使 用含有由拮抗剂识别的表位的肽本身。因此本发明具有若干实施方 案。
例如，本发明的一个实施方案是一种拮抗剂，其特异地修饰蛋 白质—蛋白质之间的相互作用，其中蛋白质—蛋白质之间相互作用 包括第一个蛋白质内的至少一个氨基酸序列与第二个蛋白质内的至 少一个氨基酸序列之间的相互作用。这种拮抗剂的第一个蛋白质可 以是MMP-9或可以是含有β1的整联蛋白。或者第一个蛋白质可以 是MMP-9，第二个蛋白质可以是含有β1的整联蛋白。另外，在这 种情况中，蛋白质—蛋白质之间的相互作用可以是如使MMP-9结合 含有β1的整联蛋白的相互作用。
或者，当第一个蛋白质是含有β1的整联蛋白时，其可以是α5β1 整联蛋白，或当第二个蛋白质是含有β1的整联蛋白时，其可以是α5β1 整联蛋白。
在一个实施方案中，拮抗剂是这样的，即蛋白质—蛋白质之间 的相互作用使第一个蛋白质和第二个蛋白质共定位于细胞表面或血 管上。
本发明的拮抗剂是一种抑制血管发生，肿瘤生长或癌转移的拮 抗剂。在一般情况下，其可以是抑制疾病的一种拮抗剂。这种疾病 例如是银屑病，黄斑变性，神经病，和组织再狭窄。
在另一实施方案中，本发明的拮抗剂是一种单克隆抗体。例如， 其可以是Mab FMM155，可以是特异性结合单克隆抗体FM155的至 少一个靶的单克隆抗体，一种人源化的或化学修饰的单克隆抗体， 或单克隆抗体的片段。或者其可以是多克隆抗体。
在另一实施方案中，本发明的拮抗剂是一种多肽，一种线性肽 或环肽。或者其可以是非肽化合物。例如，本发明的拮抗剂可以是 小有机化合物或寡核苷酸。
在一实施方案中，本发明的拮抗剂缀合于胞毒性或细胞抑制因 子。
在另一实施方案中，本发明是一种抑制血管发生或肿瘤生长的 多肽，其中此多肽特异结合MMP-9的结合能力明显高于SEQ ID NO：3与MMMP-9的结合能力。例如，这种多肽是一种蛋白质。
在一个优选实施方案中，本发明多肽是SEQ ID NO：1。或者， 本发明的多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO：1。
在另一实施方案中，本发明的多肽是一种单克隆抗体。例如， 此多肽可以是单克隆抗体FM155。
在另一实施方案中，本发明是一种抑制血管发生或肿瘤生长的 多肽，其中此多肽特异结合含有β1的整联蛋白的结合能力明显高于 SEQ ID NO：3与含有β1的整联蛋白的结合能力。在此实施方案中， 此多肽是一种蛋白质SEQ ID NO：1，一种其氨基酸序列含有SEQ ID NO：1的多肽，或一种单克隆抗体，例如FM155。
在另一实施方案中，本发明是一种特异结合SEQ ID NO：1， 但与SEQ ID NO：3的结合亲和性明显较低的拮抗剂。这种拮抗剂 抑制血管发生和肿瘤生长。在此实施方案中，拮抗剂是一种多肽， 例如一种蛋白质，或其是一种其氨基酸序列含有SEQ ID NO：1的 多肽。此多肽可以是单克隆抗体，例如FM155。
在另一实施方案中，本发明是一种拮抗剂，其破坏MMP-9单 位于细胞表面或血管上。在此实施方案中，拮抗剂抑制血管发生或 肿瘤生长。另外，这种拮抗剂是一种多肽，例如一种蛋白质，包含 SEQ ID NO：1氨基酸序列的多肽，或单克隆抗体，例如FM155。
在另一实施方案中，本发明是一种肽，其包含编码由特异修饰 蛋白质—蛋白质之间相互作用的拮抗剂识别的表位的序列，其中蛋 白质—蛋白质之间相互作用包括第一个蛋白质内的至少一个氨基酸 序列与第二个蛋白质内的至少一个氨基酸序列之间的相互作用。在 此实施方案的一种形式中，拮抗剂是一种单克隆抗体，例如Mab FM155。在另一形式中，此肽由SEQ ID NO：1氨基酸序列组成。 抗体拮抗剂
在一个实施方案中，本发明阐述了抗体形式的拮抗剂，其在一 般情况下修饰涉及MMP-9和/或β1整联蛋白内的一些氨基酸序列的 蛋白质—蛋白质之间的相互作用。这种抗体可包括结合具有SEQ ID NO：1多肽序列的肽，但不结合具有SEQ ID NO：3序列的对照肽 的抗体。这种抗体拮抗剂也可抑制血管发生。本发明还阐述了产生 此抗体的细胞系，产生这种细胞系的方法，和产生单克隆抗体的方 法。
本发明的抗体可以是单克隆或多克隆抗体。在一实施方案中， 使用的抗体是单克隆抗体。本发明的单克隆抗体包括与MMP-9和 α5β1整联蛋白免疫反应的抗体分子。
与FRIP-1优先结合的优选的单克隆抗体包括称为FM155的单 克隆抗体。
本发明的抗体拮抗剂可根据本领域技术人员已知的方法产生。 例如，将动物用FRIP-1或其片段免疫接种。可选择具有结合FRIP-1 (SEQ ID NO：1)的能力，但不结合对照的SEQ ID NO：3的这样 产生的抗体。
文中所用术语“抗体或抗体分子”，指免疫球蛋白分子和/或免 疫球蛋白分子的免疫活性部分的群体，即含有抗体结合部位或互补 位的分子。
“抗体结合部位”是由重链和轻链可变区和高变区组成的抗体 分子的特异结合抗原的结构部分。
用于本发明的抗体例如是完整的免疫球蛋白分子，基本完整的 免疫球蛋白分子，和含有互补位的免疫球蛋白分子的一部分，包括 本领域已知的那些部分如Fab，Fab’，F(ab’)2和F(v)，也称为抗 体片段。
在另一优选的实施方案中，本发明涵盖了一种截短的免疫球蛋 白分子，其包含衍生自本发明单克隆抗体的一个Fab片段。缺失Fc 受体的Fab片段是可溶的，并提供血清半衰期方面的治疗益处，及 在使用可溶的Fab片段的模式中的诊断益处。可溶的Fab片段的制 备是免疫学领域已知的，并可通过各种方法进行。
例如，抗体的Fab和F(ab’)2部分，是通过熟知的方法分别用 木瓜蛋白酶和胃蛋白酶对基本完整的抗体进行蛋白酶解反应而制备 的。见例如Theofilopolous和Dixon的美国专利No：4342566所述。 Fab’抗体部分也是熟知的，是从F(ab’).亚.2部分中生产的，随后 用巯基乙醇还原连接两个重链部分的二硫键，接着用如碘乙酰胺烷 化所得蛋白质硫醇。含有完整免疫球蛋白分子的抗体是优选的，并 在本文举例应用。
文中所用短语“单克隆抗体”是指只含有一种能与特定表位免 疫反应的抗体结合部位的抗体分子群体。单克隆抗体因此含有一种 抗体分子，该分子具有多个抗体结合部位，每个部位免疫特异于不 同的表位，例如双特异性单克隆抗体。
单克隆抗体典型是由称为杂交瘤的一个单细胞克隆产生的抗体 组成的，此杂交瘤只分泌(产生)一种抗体分子。杂交瘤细胞是通 过将产生抗体的细胞与骨髓瘤或其它自持细胞系融合而形成的。这 种抗体的制备是由Kohler和Milstein，自然256：495-497(1975) 首先阐述的，在此并入参考。其它方法见Zola，单克隆抗体技术手 册，CRC出版社(1987)。可以筛选这样制备的杂交瘤上清中与MMP-9 和/或α5β1整联蛋白免疫反应的抗体分子的存在。
简而言之，为形成从中可生产单克隆抗体组合物的杂交瘤，将 骨髓瘤或其它自持细胞系与得自用FRIP-1超免疫的哺乳动物脾组织 的淋巴细胞融合。
优选用于制备杂交瘤的骨髓瘤细胞系是取自与淋巴细胞相同物 种的。典型地，129 GIX.sup.+品系小鼠是优选的哺乳动物。用于本 发明的适当小鼠骨髓瘤包括次黄嘌呤—氨基蝶呤—胸苷敏感的 (HAT)细胞系P3X63-Ag8.653，和Sp2/0-Ag14，它们得自美国典 型培养物保藏中心，Rockville，Md.，名称分别为CRL1580和 CRL1581。
将脾细胞用聚乙二醇(PEG)1500与骨髓瘤细胞融合。融合的 杂种通过其对选择性生长培养基的敏感性而加以选择，如HAT(次 黄嘌呤—氨基蝶呤—胸苷)培养基。产生本发明单克隆抗体的杂交 瘤是通过用在实施例中阐述的酶联免疫吸附测定(ELISA)鉴别的。
本发明的单克隆抗体也可通过起始单克隆杂交瘤培养物而产 生，单克隆杂交瘤培养物包括一种含有分泌适当特异性的抗体分子 的杂交瘤的营养培养基。将此培养物保持在杂交瘤足以将抗体分子 分泌入培养基中的一定条件和时间下，然后收集含有抗体的培养基， 抗体分子然后可通过熟知方法进一步分离。
本领域熟知用于制备这些组合物的培养基，并可商购，包括合 成培养基，近交小鼠等。合成培养基例如是补加4.5g/L葡萄糖，20nM 谷氨酰胺，和20％胎牛血清的Dulbecco’s极限必需培养基(DMEM； Dulbecco等，病毒，8：396，1959)。近交小鼠例如是Balb/c品系。
本领域熟知生产单克隆抗体，杂交瘤细胞，或杂交瘤细胞培养 物的其它方法。见例如Sastry等(1989)美国科学院院报，86：5728 -5732和Huse等(1989)科学，246：1275-1281所述的从所有免 疫组分中分离单克隆抗体的方法。
本发明还涵盖了产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞，和含有 杂交瘤细胞的培养物。特别优选的是分泌单克隆抗体FM155的杂交 瘤细胞系。
本发明在一个实施方案中涵盖了一种具有FM155的免疫反应 特性的单克隆抗体。
本领域技术人员了解怎样确定一种单克隆抗体是否与本发明的 单克隆抗体具有相同特异性(免疫反应特性)，这是通过确定前者是 否阻止后者结合预先选择的靶分子进行。如果测试的单克隆抗体与 本发明的单克隆抗体竞争，这是通过在标准竞争分析中本发明的单 克隆抗体与固相靶分子的结合降低所示出的，则有可能这两个单克 隆抗体均结合相同的或密切相关的表位。
另一种确定一种单克隆抗体是否具有本发明单克隆抗体的特异 性的方式，是确定所测试抗体的CDR区的氨基酸残基序列。在其CDR 区具有相同或功能等价的氨基酸残基序列的抗体分子具有相同的结 合特异性。本领域熟知对多肽进行测序的方法。这不是提示具有不 同CDR区的抗体不能结合相同表位。
抗体的免疫特异性，其靶分子结合能力，和抗体对表位所呈现 的伴随亲和性，是通过抗体与之免疫反应的表位限定的。表位的特 异性至少部分由免疫球蛋白抗体的重链可变区的氨基酸残基序列限 定，部分由轻链可变区氨基酸残基序列限定。
文中所用术语“具有结合特异性”是指等价的单克隆抗体竞争 结合预先选择的靶表位。
人源化的单克隆抗体比鼠单克隆抗体具有特别的益处，尤其它 们可治疗性用于人体。特别地，人抗体不是与“外源”抗原一样迅 速从循环中清除，且不是以与外源抗原和外源抗体相同方式激活免 疫系统。本领域已知制备“人源化”抗体的方法，并可易于为本发 明所利用。
因此，本发明在一个实施方案中涵盖了本发明的一种单克隆抗 体，其是通过移植导入人免疫系统的成分且基本不干扰抗体与抗原 的结合能力而人源化。
本发明的抗体也可以是完全人抗体，如例如通过从展示人单链 或双链抗体的抗体噬菌体文库中选择而产生的那些抗体，如Haard， H.J.等(1999)，生物化学杂志274：18218-30，和Winter，G.等(1994) Annu.Rev.Immunol.12：433-55所述。 肽/多肽拮抗剂
本发明的拮抗剂也可以是多肽或肽。术语多肽是指通过邻近的 氨基酸残基的α-氨基基团和羧基基团之间的肽键彼此相连的3个或 更多个氨基酸的序列，并包括在已知称为蛋白质的一类化合物。文 中所用术语肽是指与多肽一样两个或多个彼此相连的线性序列。
在一个实施方案中，本发明涵盖多肽形式的拮抗剂。MMP-9定 位于细胞表面的多肽拮抗剂，可以是能破坏MMP-9定位于细胞表 面，或更一般地修饰涉及MMP-9和/或β1整联蛋白内的一些氨基酸 序列的蛋白质—蛋白质之间的相互作用的任何肽或多肽。
鉴别具有针对MMP-9或β1整联蛋白的选择性的优选的拮抗剂 肽，可在典型的结合抑制分析中鉴别，如实施例中所述的ELISA分 析。
肽和多肽拮抗剂可通过许多本领域已知的方法产生。例如，一 种双杂种系统(例如Fields，S.(1989)自然340：245-6)可使用 MMP-9的片段作“诱饵”，从文库中选择结合FRIP-1的蛋白质拮 抗剂。此潜在的拮抗剂文库例如可衍生自cDNA文库。在另一实施 方案中，潜在的拮抗剂可以是已知MMP-9结合蛋白的变体。这种蛋 白质可随机诱变或进行基因改组，或通过其它产生序列多样性的适 当方法。
本发明的肽和多肽拮抗剂也可以是通过分子演变方法产生的。 蛋白质文库可以通过诱变，基因改组或其它产生序列多样性的方法 产生。代表多种变体的蛋白质集合可以通过其结合FRIP-1的能力加 以选择，例如通过使这种蛋白质集合经过已经吸附FRIP-1的固体基 质加以选择。例如用盐梯度洗脱可纯化与FRIP-1具有亲和性的变 体。也可包括阴性选择步骤，这是将这种集合经过已经吸附对照肽 AAAA(SEQ ID NO：3)的固体基质加以选择。滤液中含有集合中 与AAAA亲和性较低的变体。
本发明的肽和多肽拮抗剂也可以是通过噬菌体展示产生的。随 机的肽或蛋白质可作为与噬菌体外壳蛋白的融合蛋白而在噬菌粒颗 粒表面表达。有许多适用的单价噬菌体展示方法(见例如Lowman H.B. 等(1991)生物化学30：10832-8)。表达随机肽或蛋白质文库的 噬菌体可以用已经吸附AAAA分子的固体基质淘选。剩余的噬菌体 不结合AAAA，或与AAAA的结合亲和性低。然后将噬菌体用已经 吸附FRIP-1的固体基质淘选。从固体基质中分离结合的噬菌体，是 通过改变溶液条件，或针对适当设计的结构是通过蛋白酶解连接噬 菌体外壳蛋白与随机的肽或蛋白质文库的接头区而分离。可对分离 的噬菌体进行测序以确定选择的拮抗剂的一致性。
在另一实施方案中，多肽包括本文已经示出其氨基酸残基序列 的多肽的任何类似物，片段或化学衍生物，只要此多肽是FRIP-1而 不是对照肽SEQ ID NO：3的拮抗剂。因此，可对现有的多肽进行 各种改变，取代，插入和缺失，使这种改变在使用中有一些优点。 在这点上，本发明的FRIP-1拮抗剂多肽相当于而不是等同于所述肽 序列，其进行了一或多种改变，并保留了在一或多种所述分析中作 为本发明拮抗剂的能力。
因此，此多肽可以是任何形式的肽衍生物，包括酰胺，与蛋白 质的缀合物，环肽，聚合的肽，类似物，片段，化学修饰的肽等。 其它拮抗剂
本发明的拮抗剂也可以是小有机分子，如那些天然产物，或那 些通过常规有机合成或组合有机合成而合成的化合物。对化合物可 进行测试其修饰涉及MMP-9和/或β1整联蛋白内的一些氨基酸序列 的蛋白质—蛋白质之间的相互作用的能力。也选择与对照肽AAAA， SEQ ID NO：3的亲和性降低的化合物。
本发明的拮抗剂也可以是非肽化合物。适当的非肽化合物例如 包括寡核苷酸。本文所用的寡核苷酸是指含有嘌呤，嘧啶和其它芳 香族碱基的任何杂聚物。DNA和RNA寡核苷酸适用于本发明，具 有糖(例如2’烷化的核糖)和骨架修饰(例如硫代磷酸酯寡核苷 酸)的寡核苷酸也适用。寡核苷酸可存在通常发现的嘌呤和嘧啶碱 基如腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶，以及在杂环部 分(例如7-脱氮鸟嘌呤)或环外位置修饰的碱基。寡核苷酸还涵盖 具有也存在芳香族碱基的独特结构的杂聚物，包括聚酰胺核酸等。
本发明的寡核苷酸拮抗剂可通过本领域已知的许多方法产生。 在一个实施方案中，产生一个含有大量序列的寡核苷酸集合。此集 合例如可用单体混合物在一个延伸步骤通过固相合成而产生。寡核 苷酸集合通过将含有此集合的溶液经过已经粘附FRIP-1或其片段的 固体基质而分选。集合中结合MMP-9的序列保留在固体基质上。用 不同盐浓度或pH的溶液洗脱这些序列。将选择的序列进行第二个 选择步骤。将选择的集合经过已经粘附SEQ ID NO：3的第二个固体 基质。层析柱中保留那些集合SEQ ID NO：3的序列，这样富集特异 于FRIP-1的序列集合。可将此集合扩增，及如果需要，进行诱变， 并重复此过程直至集合示出本发明拮抗剂的特性。通过对寡核苷酸 集合成员进行测序可鉴别各个拮抗剂，通常在将所述序列克隆入宿 主生物体如大肠杆菌中之后进行。 鉴别拮抗剂的结合分析
本发明还提供了鉴别本发明方法使用的候选拮抗剂的分析方 法。在这些分析方法中，候选拮抗剂是通过其结合FRIP-1和AAAA 对照肽的能力而加以评价的，并可通过其在组织中抑制血管发生的 潜力而加以进一步评价。 ELISA
首先通过ELISA分析测定拮抗剂与固相中FRIP-1和AAAA对 照肽的结合。此分析也可用于鉴别特异于FRIP-1而非AAAA对照 肽的化合物。此特异性分析是通过平行ELISA进行的，其中潜在拮 抗剂在分离的分析室中同时筛选其结合FRIP-1和AAAA对照肽的 能力。
破坏MMP-9和α5β1整联蛋白之间相互作用的拮抗剂，也可通 过其与本发明拮抗剂竞争结合的能力而加以鉴别。例如，推定的拮 抗剂可通过在结合分析如ELISA中监测其对已知拮抗剂如FM155 的亲和性的作用而加以筛选。这种拮抗剂可能具有与FM155相同特 异性，并识别相同隐蔽表位。通过这种选择方法选择的推定的拮抗 剂可结合MMP-9或α5β1整联蛋白，或结合拮抗剂。通过常规结合 分析可从推定的拮抗剂中选择拮抗剂，以确定结合MMP-9或α5β1 整联蛋白表位但不结合已知拮抗剂的那些拮抗剂。
以下是可用于鉴别候选拮抗剂的本发明的一些实施方案。
在一个实施方案中，本发明提供了一种筛选MMP-9拮抗剂的 方法，包括a)提供一种推定的拮抗剂；b)测定所述推定的拮抗剂结 合MMP-9的第一种亲和性；c)测定SEQ ID NO：3与MMP-9结合 的第二种亲和性；及d)如果所述第二种亲和性大大低于所述第一种 亲和性，则选择所述推定拮抗剂作为MMP-9的拮抗剂。在此实施方 案的一种形式中，推定的拮抗剂是非肽化合物，例如小有机化合物 或寡核苷酸。在另一形式中，推定的拮抗剂是多肽，线性肽或环肽。 或者，推定的拮抗剂是抗体，其可以是单克隆或多克隆抗体。
在此方法的一个优选的实施方案中，所述第一种和第二种亲和 性是通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析测定的。
在一个特定的实施方案中，第二种亲和性比第一种亲和性低大 约3倍。或者，第二种亲和性比第一种亲和性大约低5倍。在本发 明的另一实施方案中，第二种亲和性比第一种亲和性低大约10倍。
在一个实施方案中，本发明提供了一种筛选β1整联蛋白拮抗剂 的方法，包括a)提供一种推定的拮抗剂；b)测定所述推定的拮抗剂 结合β1整联蛋白的第一种亲和性；c)测定SEQ ID NO：3结合所述β1 整联蛋白的第二种亲和性；及d)如果所述第二种亲和性大大低于所 述第一种亲和性，则选择所述推定的拮抗剂作为β1整联蛋白的拮抗 剂。在此实施方案的一种形式中，推定的拮抗剂是非肽化合物，例 如小有机化合物或寡核苷酸。在另一形式中，推定的拮抗剂是多肽， 线性肽或环肽。或者，推定的拮抗剂是抗体，其可以是单克隆或多 克隆抗体。
在此方法的一个优选的实施方案中，所述第一种和第二种亲和 性是通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析测定的。
在一个特定的实施方案中，第二种亲和性比第一种亲和性低大 约3倍。或者，第二种亲和性比第一种亲和性大约低5倍。在本发 明的另一实施方案中，第二种亲和性比第一种亲和性低大约10倍。 血管发生分析
本发明的拮抗剂也可通过其在组织中调节血管发生的能力加以 分析。可使用本领域已知的任何适当方法监测这种作用。在此阐述 了一些方法。
例如，一种在鸡尿囊绒膜(CAM)中测定血管发生的分析，将 此分析称为CAM分析。CAM分析已经由其它研究人员详细阐述， 并已经用于测定肿瘤组织的血管发生和新血管形成。见Ausprunk 等，Am.J.Pathol.，79：597-618(1975)，和Ossonski等，癌症研 究40：2300-2309(1980)。
CAM分析是一种体内血管发生的公认分析模式，因为发生整 个组织的新血管形成，且真正的鸡胚血管生长入CAM中或在CAM 上生长的组织中。
如本文所述，CAM分析基于新血管生长的量和程度示出对新 血管形成的抑制。另外，这种分析易于监测移植在CAM上的任何 组织如肿瘤组织的生长情况。总而言之，这种分析是特别有益的， 因为在分析系统中有针对毒性的内部对照。将鸡胚暴露于任何试剂， 由此鸡胚的健康情况是毒性的标示。
另一种测定血管发生的分析是体内兔眼模型，称为兔眼分析。 兔眼分析已经由其它研究人员详细阐述，并已经用于在存在血管发 生抑制剂如镇静剂的情况下，测定血管发生和新血管形成。见 D’Amato等，(1994)美国科学院院报91：4028-4085。
兔眼分析是体内血管发生的公认分析模型，因为新血管形成的 过程，例如兔血管从角膜边缘生长至角膜，这一过程易于通过自然 透明的眼角膜观测。另外，可易于随时监测刺激或抑制新血管形成 或新血管形成消退的程度和量。
最后，将兔暴露于任何试剂，并由此兔的健康情况是试剂毒性 的标示。
再一种测定血管发生的分析是嵌合的小鼠：人小鼠模型，被称 为嵌合小鼠分析。此分析已经由其它研究人员阐述，并在此进一步 阐述以测定血管发生，新血管形成，及肿瘤组织的消退。见Yan等 (1993)，临床研究杂志91：986-996。
嵌合小鼠分析是一种体内血管发生的有用分析模型，因为移植 的皮肤移植物组织学十分类似正常人体皮肤，且整个组织发生新血 管形成，其中真正的人体血管从移植的人体皮肤生长至移植的人体 皮肤表面的人体肿瘤组织中。人体移植物中新血管形成的起源可以 通过对新血管结构用人特异性内皮细胞标记进行免疫组织化学染色 表明。
嵌合小鼠分析基于新血管生长消退的量和程度表明新血管形成 的消退。另外，这种分析易于监测对移植在移植的皮肤上的任何组 织生长的作用。最后，这种分析是实用的，因为分析系统中有针对 毒性的内部对照。将嵌合小鼠暴露于任何试剂，由此小鼠的健康情 况是毒性的标示。 抑制血管发生的方法
本发明提供了一种抑制组织中血管发生，从而抑制依赖于血管 发生的组织中的事件的方法。一般地，此方法包括给予组织一种组 合物，该组合物包含抑制血管发生量的拮抗剂，该拮抗剂修饰涉及 MMP-9和/或β1整联蛋白内的一些氨基酸序列的蛋白质—蛋白质之 间的相互作用。
如前所述，血管发生包括许多过程，涉及组织新血管形成包括 “萌发”，脉管形成，或血管膨大，所有血管发生过程均涉及血管中 胞外基质胶原的破坏。除了外伤伤口愈合，黄体形成和胚胎发生， 据信大多数血管发生过程与疾病过程相关，并因此可使用本发明的 治疗方法选择性治疗疾病。
有许多疾病其中血管发生据信是重要的，这种疾病称为血管发 生性疾病，包括但非限于炎症如免疫和非免疫性炎症，慢性类风湿 性关节炎，和银屑病，与非适当的或非适宜的血管侵袭相关的疾病 如糖尿病视网膜病变，新生血管青光眼，再狭窄，动脉硬化斑和骨 质疏松中毛细管增殖，及癌症相关的疾病如实体肿瘤，实体肿瘤转 移，血管纤维瘤，晶状体后纤维组织形成，血管瘤，Kaposi肉瘤， 及需要新血管形成以支持肿瘤生长的癌症等。其它适当的肿瘤包括 黑素瘤，癌，肉瘤，纤维肉瘤，胶质瘤和星形细胞瘤。
因此，抑制疾病组织中血管发生的方法可改善疾病的症状，及 根据疾病情况可有助于治疗疾病。在一个实施方案中，本发明涵盖 了抑制组织中血管发生。
如本文所述，任何组织或由器官化组织构成的器官，在疾病情 况下可支持血管发生，如皮肤，肌肉，内脏，结缔组织，关节，骨 及在血管发生刺激下血管可侵袭的组织。本文所用的组织也涵盖了 体液，分泌物等如血清，血液，脑脊液，血浆，尿液，滑液，玻璃 体液。
因此在一个相关的实施方案中，治疗的组织是炎症组织，被抑 制的血管发生是炎症组织血管发生，其中炎症组织有新血管形成。 本发明的方法涵盖了抑制如具有慢性类风湿性关节炎的患者的关节 炎组织，免疫或非免疫炎症组织，银屑病组织等组织中的血管发生。
在本发明许多实施方案中治疗的患者是人类患者，尽管知道本 发明的原理表明本发明对所有哺乳动物均是有效的，这些动物可概 括称为“患者”。本发明中哺乳动物包括任何患有需要治疗的与血管 发生相关的疾病的哺乳动物，尤其农用和家庭饲养的哺乳动物。这 种患者例如可包括猪，牛，马，山羊，绵羊，骡，驴，狗，猫，兔， 小鼠和大鼠。
在另一相关的实施方案中，治疗的组织是具有糖尿病视网膜病 变，黄斑变性或新生血管青光眼的视网膜组织，进行抑制的血管发 生是其中视网膜组织新血管形成的视网膜组织血管发生。
在另一相关的实施方案中，进行治疗的组织是患有实体肿瘤， 转移，皮肤癌，乳腺癌，血管瘤或血管纤维瘤，及癌症的患者的肿 瘤组织，进行抑制的血管发生是肿瘤组织血管发生，其中肿瘤组织 发生新血管形成。可用本发明方法治疗的实体肿瘤组织包括肺，胰 腺，乳腺，结肠，喉，卵巢，Kaposi肉瘤等组织。实施例中阐述了 肿瘤组织的血管发生及其抑制。
抑制肿瘤组织血管发生是尤为优选的实施方案，因为新血管形 成在肿瘤生长中起重要作用。在没有新血管形成的肿瘤组织中，肿 瘤组织不能获得所需的营养，生长缓慢，停止生长，消退及最后坏 死而得以杀死肿瘤。
换而言之，本发明提供了一种通过抑制肿瘤血管发生而抑制肿 瘤新血管形成的方法。相似地，本发明提供了一种通过血管发生抑 制方法抑制肿瘤生长的方法。
通过其抑制新血管形成的能力，本发明的方法也有效地抗转移 癌形成，因为(1)其形成需要原始肿瘤的血管化，以便转移的癌细 胞可脱离原始肿瘤，和(2)其在另一位置建立需要新血管形成以支 持转移癌的生长。
在一个相关的实施方案中，本发明涵盖了所述方法与其它疗法 如常规的直接抗实体肿瘤和控制转移的化疗方法组合使用。在化疗 期间或之后施用血管发生抑制剂，但优选在进行几次化疗后抑制血 管发生，因为此时肿瘤组织通过诱导血管发生重新获得供应肿瘤组 织的血液供给和营养以应答毒性攻击。另外，优选在除去实体肿瘤 的外科手术后施用血管发生抑制方法，预防转移。
此方法用于抑制肿瘤新血管形成，也可用于消退存在的肿瘤。
再狭窄是一种平滑肌细胞(SMC)在经皮穿刺冠脉血管成形术 的部位迁移和增殖，妨碍血管成形术成功。与在再狭窄期间血管相 关的SMCs的迁移和增殖与血管发生相关，血管发生可用本发明的 方法抑制。因此，本发明还涵盖了在接受血管成形术后的患者中， 根据本发明的方法通过抑制血管发生而抑制再狭窄。为抑制再狭窄， 本发明的拮抗剂在血管成形术后大约2-28天施用，优选在术后前 14天施用。
本发明的抑制组织中血管发生，及用此治疗血管发生相关的疾 病的方法，包括将发生血管发生或有发生危险的组织与一种包含治 疗有效量的拮抗剂的治疗组合物接触，所述拮抗剂修饰涉及MMP-9 和/或β1整联蛋白内一些氨基酸序列的蛋白质—蛋白质之间的相互作 用。因此，此方法包括对患者施用治疗有效量的生理可耐受的含有 本发明拮抗剂的组合物，所述拮抗剂修饰涉及MMP-9和/或β1整联 蛋白内一些氨基酸序列的蛋白质—蛋白质之间的相互作用。治疗组 合物和治疗有效量的本发明拮抗剂在“治疗组合物”章节中阐述。
根据拮抗剂的形式，其潜力而施用的拮抗剂的剂量范围在此进 一步阐述，其数量应足以产生所需效应，其中血管发生和由血管发 生所介导的疾病症状得以改善。剂量应以不导致不利的副作用为最 大限量，副作用如粘滞性过高综合征，肺水肿，充血性心衰等。通 常地，剂量应随患者的年龄，状态，性别，和疾病程度而变化，并 可由本领域技术人员确定。剂量还可通过临床医生在任何并发症的 情况下加以调节。
本发明的单克隆抗体或多肽可以随时非肠道地通过注射或通过 逐步输注而施用。尽管可通过系统施用而进入机体中需要治疗的组 织中，及更通常通过静脉内施用治疗组合物而进行治疗，但也包括 其它组织和输送方式，其中有可能靶向的组织含有靶分子。因此， 包括单克隆抗体，多肽及其衍生物的拮抗剂可静脉内，腹膜内，肌 内，皮下，腔内，经皮，局部，眼内，口服，鼻内施用，及可通过 蠕动方式输送。
含有本发明单克隆抗体或多肽的治疗组合物是常规静脉内施用 的，例如通过注射单位剂量施用。当阐述本发明治疗组合物时所用 的术语“单位剂量”是指适于作为单元剂量给予个体的物理分立的 单位，每单位含有计算产生所需治疗作用的预定量的活性物质，及 所需的稀释剂，即载体或运载体。
在一个如实施例所示优选的实施方案中，拮抗剂是以单剂量静 脉内施用的。
组合物以与剂量配方相容的方式，及治疗有效量施用。施用的 数量和时间根据需要治疗的患者的情况，患者的系统利用有效成分 的能力，及所需治疗作用的程度而定。需要施用的有效成分的实际 数量根据医生的判断和个体差异而定。然而，本发明在此揭示了适 当的系统施用的剂量范围，其根据施用途径而定。适当的施用方法 是可以变化的，但可通过初始施用后，随后间隔1或多个小时通过 随后的注射或其它施用方式重复施用。或者，也包括持续静脉内输 注以足以保持特异于体内治疗的血药浓度。
抑制血管发生或疾病状态的方法的特异实施例，在本发明的以 下实施方案中呈现。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抑制组织中血管发生的 方法，包括施用一种特异修饰蛋白质—蛋白质之间相互作用的拮抗 剂，其中蛋白质—蛋白质之间的相互作用包括第一个蛋白质中的至 少一个氨基酸序列与第二个蛋白质中的至少一个氨基酸序列之间的 相互作用。在此方法中，所述拮抗剂是静脉内，经皮，滑膜内，肌 内，肿瘤内，眼内，鼻内，鞘内，局部或口服施用的。另外，拮抗 剂可结合化疗或放疗施用。当组织发生炎症及发生血管发生时，当 组织是存在于哺乳动物时，或组织是关节炎组织，眼组织，视网膜 组织或血管瘤组织时，使用此方法。
在本发明的另一种治疗方法中，组织中的肿瘤生长或转移在如 下一种方法中被抑制，该方法包括使用一种特异修饰蛋白质—蛋白 质之间相互作用的拮抗剂，其中蛋白质—蛋白质之间的相互作用包 括第一个蛋白质的至少一个氨基酸序列与第二个蛋白质中至少一个 氨基酸序列之间的相互作用。在这种方法中，所述拮抗剂是通过静 脉内，经皮，滑膜内，肌内，肿瘤内，眼内，鼻内，局部或口服施 用的。另外，拮抗剂可与化疗或放疗结合施用。当肿瘤或转移癌是 黑素瘤，癌，肉瘤，纤维肉瘤，胶质瘤或星形细胞瘤时，可使用此 方法。在另一实施方案中，本发明提供了一种抑制银屑病，黄斑变 性或组织再狭窄的方法，通过施用一种特异修饰蛋白质—蛋白质之 间相互作用的拮抗剂而进行，其中蛋白质—蛋白质之间的相互作用 包括第一个蛋白质的至少一个氨基酸序列与第二个蛋白质中至少一 个氨基酸序列之间的相互作用。在这种方法中，所述拮抗剂是通过 静脉内，经皮，滑膜内，肌内，肿瘤内，眼内，鼻内，鞘内，局部 或口服施用的。另外，拮抗剂可与化疗或放疗结合施用。 疾病治疗
本发明一般地涉及这一发现，即修饰涉及MMP-9和/或β1整联 蛋白中一些氨基酸序列的蛋白质—蛋白质之间相互作用能抑制疾病 状态和血管发生。此发现是重要的，因为血管发生在许多疾病过程 中起作用。
在新血管的生长导致或有助于疾病发生之处，抑制血管发生可 降低疾病的有害作用。例子包括银屑病，类风湿性关节炎，糖尿病 视网膜病变，炎症疾病，再狭窄，黄斑变性等疾病。在需要新血管 生长以支持有害组织生长时，抑制血管发生可降低对该组织的血液 供给，从而基于血液供给需求有助于降低组织质量。例子包括肿瘤 生长，其中持续需要新血管形成，以使肿瘤生长厚度超过几毫米， 及建立实体肿瘤转移。
本发明的方法是有效的，部分因为这种治疗高度选择性针对血 管发生而非其它生物学过程。如实施例所示，只有新血管生长受破 坏MMP-9定位的拮抗剂的抑制，因此此治疗方法对成熟血管不起作 用。另外，由于本发明的一些拮抗剂只影响MMP-9的定位，不直接 阻断MMP-9的蛋白酶解活性或β1整联蛋白的附着功能，因此这些 化合物的副作用较少，因为MMP-9的蛋白酶解活性或β1整联蛋白 的附着功能可具有正常的生理功能。
另外，本发明的拮抗剂是特别强效的，提示在低浓度即可具有 治疗益处。
在本发明的揭示之前，还未知血管发生和依赖于血管发生的任 何过程可在体内通过使用拮抗MMP-9和β1整联蛋白之间的相互作 用的试剂而加以抑制。 治疗组合物
本发明涵盖了所述治疗方法中使用的治疗组合物。本发明的治 疗组合物含有一种可生理耐受的载体，和一种治疗有效量的溶解于 或分散于载体中的作为有效成分的所述拮抗剂。在一个优选的实施 方案中，当将治疗性拮抗剂组合物施用于哺乳动物或病人以进行治 疗时，其不是免疫原性的，或免疫原性较低。
治疗有效量是在治疗的组织中足以产生可测定的血管发生抑制 作用的本发明拮抗剂的量，即抑制血管发生的量。血管发生的抑制 可在原位通过所述免疫组织化学方法或通过其它本领域已知方法测 定。
本发明拮抗剂的效力可通过许多方式测定，包括在CAM分析 中，在体内兔眼分析中，在体内嵌合的小鼠：人分析中通过血管发 生的抑制而测定。
单克隆抗体形式的本发明拮抗剂的治疗有效量典型地是这样的 量，当在生理可耐受的组合物中施用时，足以获得血浆浓度为大约 0.01ug/ml-100ug/ml，优选大约1ug/ml-5ug/ml，通常为大约5ug/ml。 换而言之，此剂量可以是大约0.1mg/kg-300mg/kg，优选大约 0.2mg/kg-200mg/kg，更优选大约0.5mg/kg-20mg/kg，一日一或多 次，持续一或多天。
在拮抗剂是单克隆抗体片段形式时，基于片段的质量相对于整 个抗体的质量，可易于调节治疗有效量。优选的抗体拮抗剂的血浆 摩尔浓度为大约2uM-5mM，优选大约100uM-1mM。
多肽或小分子形式的本发明拮抗剂的治疗有效量典型地是这样 的多肽量，当在生理可耐受的组合物中施用时，足以获得血浆浓度 为大约0.1ug/ml-200ug/ml，优选大约1ug/ml-150ug/ml。基于多肽 的质量为大约500g/mol的多肽，优选的多肽拮抗剂的血浆摩尔浓度 为大约2uM-5mM，更优选为大约100uM-1mM。换而言之，体重 剂量为大约0.1mg/kg-300mg/kg，优选大约0.2mg/kg-200mg/kg， 一日一或多次，持续一或多天。
文中所用术语“药物学可接受的”“生理可耐受的”等当指组 合物，载体，稀释剂和试剂时是可交替使用的，及表示此物质能施 用于哺乳动物。
本领域熟知含有溶解的或分散的有效成分的药物组合物的制 备，不需基于配方限制。典型地将这种组合物制备为可注射的液体 溶液或悬浮液，然而，也可制备为在使用前在液体中形成溶液或悬 浮液的固体形式。适当的赋形剂例如是水，盐水，葡萄糖，甘油， 乙醇等，或它们的组合物。另外，如果需要，组合物可含有少量辅 助物质如湿润或乳化剂，pH缓冲剂等，以增强有效成分的效力。
本发明的治疗组合物的成分中可包括药物学可接受的盐。药物 学可接受的盐包括酸加合盐(与多肽的游离氨基基团形成的)，其是 与无机酸例如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸，酒石酸，苯基乙醇酸 等形成的。与游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱，如氢氧化钠， 氢氧化钾，氢氧化铵，氢氧化钙或氢氧化铁，及有机碱如异丙基胺， 三甲基胺，2-乙胺乙醇，组胺，普鲁卡因等。特别优选的是TFA和 HCl盐。
本领域熟知生理可耐受的载体。液体载体例如是无菌水溶液， 其除了有效成分和水之外不含有其它物质，或含有一种缓冲液如生 理pH的磷酸钠缓冲液，生理盐水或这二者，如磷酸盐缓冲盐水。 另外，水性载体可含有一种以上的缓冲盐，以及盐如氯化钠和氯化 钾，葡萄糖，聚乙二醇和其它溶质。
液体组合物除了水之外也可含有液相。这种另外的液相是甘 油，植物油如棉籽油，和水—油乳液。
治疗组合物含有抑制血管发生量的本发明拮抗剂，典型地配制 为总治疗组合物中含有至少0.01％重的拮抗剂。重量百分比是抑制 剂与总组合物的重量比。例如0.01％是指每100g总组合物中有0.01g 抑制剂。
抗体可缀合于胞毒素，胞毒剂，以输送至经历血管发生的肿瘤 或其它组织中。这种缀合物可用溶细胞素或外毒素产生，例如蓖麻 毒蛋白A，白喉毒素A，或假单胞杆菌外毒素及其片段。胞毒剂也 可以是用同位素放射标记的，以将具有放射性的毒性剂量输送至血 管发生组织。
本发明的拮抗剂也可以用于将一种酶输送至目标，其中此酶能 将前体药物转变为活性药物，以例如用于抗体指导的酶激活的前体 药物治疗(ADEPT)(见例如Syrigos，K.N.(1999)抗癌研究19： 605-1 3)。简而言之，本发明的拮抗剂与一种能将非毒性或无活性 前体药物转变为毒性的或活性药物的酶缀合，如内酰胺酶，蛋白酶 或酯酶。因为本发明的拮抗剂定位于血管发生部位，尤其肿瘤或转 移癌部位，因此可将毒性药物施用于这个部位。 检测方法
本发明的拮抗剂也适于检测组织中的血管发生。例如，拮抗剂 是抗体时，可将拮抗剂用于免疫组织化学方法中，以在体内染色组 织。免疫学方法如免疫染色和ELISA例如见下述：受体结合技术， 分子生物学方法，106，M.Keen.Humana出版社，1999；Brooks等 (1998)，细胞92：391-400；Brooks等(1996)，细胞85：683-693； 和Brooks等(1993)，细胞生物学杂志122：1351-1359。
本发明的拮抗剂一旦与靶组织结合，可直接或间接检测。直接 检测可对拮抗剂进行，拮抗剂包括检测标记如荧光染料，放射性标 记，顺磁性重金属或诊断染料。
或者，检测可通过二级相互作用进行。例如，一种识别拮抗剂 的检测标记的抗体可用于观测拮抗剂的定位。例如，如果拮抗剂是 源自小鼠的单克隆抗体，可施用适当标记的山羊抗小鼠抗体。本领 域技术人员可确定用于各种拮抗剂的适当二级抗体。
针对体内检测，优选使用检测标记的拮抗剂。将标记的拮抗剂 经静脉内，肌内等途径施用于患者。适于在患者体内检测的标记是 尤为优选的。例如，顺磁性标记的拮抗剂可通过磁共振显影检测。 也可检测放射性标记的拮抗剂。
适于检测的本发明特异的实施方案例如下述。
在一个实施方案中，本发明提供了一种检测组织中血管发生的 方法，通过将特异修饰蛋白质—蛋白质之间相互作用的拮抗剂与所 述组织接触而进行检测，其中蛋白质—蛋白质之间相互作用包括第 一个蛋白质中的至少一个氨基酸序列与第二个蛋白质中的至少一个 氨基酸序列之间的相互作用。在此方法中，例如所述组织是来自体 内的或所述组织是在体内的，及所述拮抗剂是经静脉内，经皮，滑 膜内，肌内，肿瘤内，眼内，鼻内，鞘内，局部或口服施用的。或 者，在此方法中，所述拮抗剂是缀合于荧光染料，放射性标记，顺 磁性重金属，诊断染料或酶。
所有引用的参考文献在此以其全文并入参考。
实施例 实施例1：纯化α5β1
α5β1是用纤连蛋白的110kD细胞结合结构域从胎盘裂解物中纯 化的。将洗脱的组分浓缩并通过10％SDS-PAGE分离，接着进行 银染色。一个90kD的蛋白质与α5β1整联蛋白共同纯化，其分子量 与MMP-9相同，如图1所示。在图中，泳道1相当于商购制备的人 α5β1(1ug)，泳道2相当于纯化自人胎盘组织的α5β1(50ul)。注意 较小的90kD的污染物(箭头)。
基于我们预先发现MMP-2和ανβ3之间的直接相互作用，我们 测试了此90kD蛋白质是否可以是结合整联蛋白的MMP的另一实 例。 实施例2：α5β1的zymographic分析
将纯化的α5β1和ανβ3在10％SDS-PAGE凝胶上分离，所述凝 胶是与明胶共聚的。将SDS通过用Triton X-100冲洗而从凝胶中除 去，并将凝胶在胶原酶缓冲液中温育。通过用考马斯蓝染色观测液 化明胶带。纯化的α5β1制备物含有液化明胶活性(90kD)，其与 MMP-9相同分子量迁移，如图2所示。在图中，泳道1相当于MMP-9 原(1ug)；泳道2相当于APMA激活的MMP-9(1ug)；泳道3相 当于来自胎盘组织的prep-1纯化的α5β1(1ug)；泳道4相当于从胎 盘组织中纯化的ανβ3(1ug)；泳道5相当于来自胎盘组织的prep-2 纯化的α5β1(1ug)。
这些数据提示与α5β1共纯化的污染的90kD的蛋白质也许是 MMP-9。另外，这些研究提示MMP-9可直接结合α5β1整联蛋白。 实施例3：纯化的α5β1整联蛋白的Western印迹分析
将纯化的α5β1和ανβ3整联蛋白(1ug)通过10％SDS-PAGE分 离，并移至硝化纤维上，用抗MMP-9 Mab印迹。用抗MMP-9的单 克隆抗体进行的纯化的α5β1的Western印迹分析，如图3所示，证 实α5β1制备物中存在MMP-9。在图3中，泳道1相当于重组MMP-9 (1ug)，泳道2相当于从胎盘组织中纯化的α5β1(1ug)，泳道3相 当于从胎盘组织中纯化的ανβ3(1ug)。 实施例4：重组MMP-9结合α5β1
将α5β1或对照蛋白β-酪蛋白固定在微量滴定孔中(10ug/ml)。 使重组人MMP-9(2ug/ml)结合对照蛋白包被的孔1小时。用抗MMP-9 Mab检测MMP-9结合。如图4所示，纯化的MMP-9直接结合α5β1 整联蛋白。数据杆代表从三份孔中所得的平均光密度±标准偏差。 实施例5：MMP-9与α5β1阴性细胞表面的结合降低
为评价α5β1是否参与促进MMP-9与细胞表面的结合，进行结 合分析。将几乎不表达任何内源性MMP-9的人HT29细胞与重组 MMP-9(0-100ng/ml)温育。除去未结合的酶，并制备总细胞裂解 物。细胞裂解物(100ug/泳道)在用明胶共聚的10％SDS-PAGE凝 胶上分离，并通过用考马斯蓝染色观测液化明胶带。示于图5的结 果提示缺失α5β1的肿瘤细胞结合MMP-9的能力明显降低，进一步 表明α5β1在将蛋白酶解活性定位于细胞表面中起重要作用。在图 中，上部相当于表达α5β1的HT29-30，底部相当于不表达α5β1的 HT29-1，NT相当于未处理的，50相当于与50ng/ml的MMP-9温育 的细胞，100相当于与100ng/ml的MMP-9温育的细胞。 实施例6：MMP-9和α5β1于人黑素瘤血管中的共定位
将取自黑素瘤患者的人体活检组织速冻，并用抗MMP-9的多 克隆抗体和抗β1的单克隆抗体共同染色组织切片，随后与罗丹明缀 合的山羊抗小鼠抗体和FITC缀合的山羊抗兔IgGs温育。在200X 进行显微照相。在显微照相相片中，红色表示β1整联蛋白表达，绿 色表示MMP-9表达，黄色表示MMP-9和β1的共定位。在图6中， 其是黑白显微摄影片，白色区代表黄色，黑色区代表红色，绿色或 肿瘤细胞。图6示出MMP-9和β1整联蛋白共定位于肿瘤细胞表面 和人黑素瘤肿瘤活检组织内的血管上。
这些发现提示MMP-9和β1整联蛋白在人体血管区室以及自身 的肿瘤细胞上均是密切结合的。 实施例7：产生结合MMP-9的合成肽
MMP-9和α5β1的氨基酸序列分析提示了可介导这两个蛋白质 之间的相互作用的序列。例如，产生合成肽并分析其结合MMP-9的 活性。这些肽的结合能力通过固相结合分析测定。
在分析的序列中，发现示出特异结合MMP-9或β1整联蛋白的 肽。因此，如图7所示，在固相结合分析中，称为FRIP的肽示出特 异结合MMP-9。除了3个关键的氨基酸改变之外与FRIP-1相同的 AAA肽示出结合能力很低。这些发现提示合成肽FRIP-1可能存在 介导MMP-9/α5β1相互作用的关键氨基酸。
FRIP-1合成肽具有以下序列：SEQ ID NO：1
CysArgLeuArgSerGlyGluProGlnCys。
FRIP-1(SEQ ID NO：1)氨基酸序列衍生自人MMP-9酶的C- 末端血红素结合蛋白类结构域内的一个区域。
AAA对照肽具有以下序列：SEQ ID NO：2
CysArgAlaAlaAlaGlyGluProGlnCys。
另外还用具有以下序列的AAAA对照肽进行了结合对照：
SEQ ID NO：3 CysArgAlaAlaAlaAlaGluProGlnCys。 实施例8：FRIP-1肽在鸡胚中抑制血管发生
在10天龄的鸡胚CAM中用bFGF诱导血管发生。24小时后， 将鸡胚单次静脉内注射100ug的FRIP-1或AAA对照肽。3天后， 通过计数在滤膜片区域内的血管分支点数目而定量血管发生。图8A 示出从典型实验中所取的CAM组织的代表性实例。图8B是血管发 生实验的定量。图8B的结果示出结合MMP-9的FRIP-1合成肽阻 断鸡胚CAM模型中血管发生。在图8B中，NT相当于未用bFGF 处理的，FRIP-1相当于bFGF+FRIP-1肽，AAA相当于bFGF+对 照AAA肽。数据杆代表每种条件下5-10个鸡胚的平均值±标准误 差。
此数据提示MMP-9/α5β1的相互作用在血管发生中起重要作 用。 实施例9：产生抗合成肽的Mab
将FRIP肽缀合于载体蛋白KLH，并注射入小鼠中。将5个代 表性杂交瘤克隆的条件培养基通过ELISA分析与FRIP-1肽或对照 AAA肽的结合情况。图9示出的数据代表得自三份孔的平均相对结 合性(光密度)±标准偏差。
如图9所示，针对FRIP-1肽产生了一些Mab，这些抗体中有 一些例如Mab FM155示出对FRIP-1肽具有高度特异性，但与对照 肽AAA不反应。因此，选择Mab FM155进行进一步评价。 实施例10：Mab FM155对MMP-9/α5β1相互作用的影响
将α5β1固定于微量滴定孔中(10ug/ml)。使重组人MMP-9 (2ug/ml)在有或无Mabs FM155或LM609的情况下结合。用抗 MMP-9多克隆抗体检测MMP-9的结合情况。结果示于图10。数据 杆代表得自三份孔的平均光密度±标准偏差。在图中，NT相当于未 处理，FM155相当于抗FRIP-1的Mab，LM609相当于抗ανβ3 Mab。
图10示出Mab FM155特异阻断MMP-9结合纯化的α5β1的能 力，这提示FM155可用于在体内破坏这种相互作用。 实施例11：系统施用FM155对黑素瘤生长的作用
将CS-1黑素瘤细胞(5×106)接种在10天龄的鸡胚CAM上。 24小时后，鸡胚经静脉内注射纯化的Mab FM155(2.0ug，10.0ug， 50.0ug)。7天后，切除肿瘤并确定湿重。图11表示确定的肿瘤重量。 数据杆代表在每种条件下得自5-10个鸡胚的平均值±标准误差。NT 代表未处理的数据。
图11示出Mab FM155强力抑制CS-1黑素瘤在体内生长。这 些发现表明阻断MMP-9与α5β1之间的相互作用可在体内调节血管 发生和肿瘤生长中起明显作用。
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还应意识到前面的关于本发明的阐述只是例证和解释了本发 明，而无任何限制本发明的实际应用之意。另外，本领域技术人员 在不偏离本发明精神的情况下可对本发明加以改变，本发明范围应 由权利要求书解释。
序列表 <110>南加利福尼亚大学
彼得·C·布鲁克斯
卢布纳·哈桑尼
多萝西·罗德里格斯 <120>用基于MMP-9和β1整联蛋白的拮抗剂抑制血管发生的新方法和组合物 <130>13761-734PCT <140>未给出 <141> <150>US 60/143,581 <151>1999-07-13 <150>US 60/152,495 <151>1999-09-02 <160>3 <170>FastSEQ for Windows Version4.0 <210>1 <211>10 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>合成序列，FRIP-1 <223>与MMP-9和β1整联蛋白结合 <400>1 Cys Arg Leu Arg Ser Gly Glu Pro Gln Cys 1 5 10 <210>2 <211>10 <212>PRT <213> <220>人工序列 <223>合成序列，AAA <223>以相比于FRIP-1与MMP-9和β1整联蛋白的结合能力大大降低的结合能力与
MMP-9和β1整联蛋白结合 <400>2 Cys Arg Ala Ala Ala Gly Glu Pro Gln Cys 1 5 10 <210>3 <211>10 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>合成序列，AAAA <223>以相比于FRIP-1与MMP-9和β1整联蛋白的结合能力大大降低的结合能力与
MMP-9和β1整联蛋白结合 <400>3 Cys Arg Ala Ala Ala Ala Glu Pro Gln Cys 1 5 10