HIV融合抑制剂缓释微球.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101810583 B (45)授权公告日 2013.09.11 CN 101810583 B *CN101810583B* (21)申请号 201010142574.4 (22)申请日 2010.04.09 A61K 9/16(2006.01) A61K 45/00(2006.01) A61K 38/16(2006.01) A61K 47/34(2006.01) A61P 31/18(2006.01) (73)专利权人 佟丽 地址 100875 北京市海淀区新街口外大街 19 号北京师范大学生命科学学院 专利权人 咸洪军 (72)发明人 佟丽 咸洪军 WO 2007。

2、021970 A2,2007.02.22, WO 0137896 A2,2001.05.31, CN 101400363 A,2009.04.01, 贾伟等 . 复乳液中干燥法 . 药物控释新剂 型 . 化学工业出版社 ,2005, 第 186 187 页 . (54) 发明名称 HIV 融合抑制剂缓释微球 (57) 摘要 本发明公开了一种 HIV 融合抑制剂缓释微 球。HIV 融合抑制剂选自恩夫韦肽、 西夫韦肽、 艾 博卫泰。HIV 融合抑制剂缓释微球采用生物可降 解聚合物作为微球基质， 粒径为11000微米， 可 用于注射， 在体内可缓释 0.5 3 个月或更长时 间。本发明还公开了 HI。

3、V 融合抑制剂缓释微球的 制备方法。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 冯超 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 (10)授权公告号 CN 101810583 B CN 101810583 B *CN101810583B* 1/1 页 2 1. 一种西夫韦肽缓释微球， 采用下面步骤制备 ： 将 100mg 西夫韦肽溶于 1.5mL30mg/mL 尿素水溶液中， 1.0g 聚乳酸 - 羟基乙酸， MW 10000， 乳酸羟基乙酸摩尔比 75 25， 溶于2mL二氯甲烷中， 。

4、将二者合并， 在室温下用超声探头， 输出功率100W， 间歇式超声1min， 形成 W/O 乳液， 将 W/O 乳液倒入 1000mL 含 0.2聚乙烯醇的外水相中， 形成 W/O/W 复乳， 在 500rpm 的搅拌下搅拌 4h， 挥发有机溶剂， 离心分离， 用蒸馏水洗涤 3 次， 冷冻干燥 20h， 得到 流动性良好的白色粉末， 平均粒径 48.9 微米， 外观为圆整的球形。 2. 一种西夫韦肽缓释微球， 采用下面步骤制备 ： 将 100mg 西夫韦肽和 30mg 乳糖溶于水 中作为水相， 1g 聚乳酸 - 羟基乙酸， MW 10000， 乳酸羟基乙酸摩尔比 50 50， 溶于 1.5mL。

5、二氯甲烷中作为油相 ； 在冰浴条件下用超声探头， 输出功率100W， 间歇式超声1min制 成 W/O 乳液 ； 将硅油匀速滴入搅拌着的 W/O 乳液中， 由于二氯甲烷与硅油的互溶性， PLGA 很 快沉淀出来形成载药微球 ； 加入 1 1 正己烷 / 乙醇 ； 固化， 4条件下搅拌 2h， 真空干燥得 到微球粉末。 3. 一种西夫韦肽缓释微球， 采用下面步骤制备 ： 取 1g 聚乳酸 - 羟基乙酸， MW 10000， 乳酸羟基乙酸摩尔比7525， 溶于30mL乙腈， 加入100mg西夫韦肽， 经100W超声分散 均匀后缓缓加入到含的 2 w/w Span40 的矿物油中制成 O/O 乳液，。

6、 55水浴下以 3000rpm 速度搅拌30min， 再以440rpm继续搅拌60min以蒸发残余的有机溶剂 ； 将乳液冷至35， 使 微球硬化， 分离微球并于真空条件下干燥。 4. 一种艾博卫泰缓释微球， 采用下面步骤制备 ： 将 50mg 艾博卫泰溶于 1.5mL25mg/mL 尿素水溶液中， 1.0g 聚乳酸 - 羟基乙酸， MW 10000， 乳酸羟基乙酸摩尔比 75 25， 溶于2mL二氯甲烷中， 将二者合并， 在室温下用超声探头， 输出功率100W， 间歇式超声1min， 形成 W/O 乳液， 将 W/O 乳液倒入 1000mL 含 0.2聚乙烯醇的外水相中， 形成 W/O/W 复。

7、乳， 在 500rpm 的低速搅拌下搅拌 4h， 挥发有机溶剂， 离心分离， 用蒸馏水洗涤 3 次， 冷冻干燥 15h， 得到流动性良好的白色粉末。 权 利 要 求 书 CN 101810583 B 2 1/7 页 3 HIV 融合抑制剂缓释微球 技术领域 0001 本发明涉及医药领域， 具体涉及用于治疗 HIV 感染药物的缓释微球及其制备方 法。 背景技术 0002 艾滋病 (AIDS) 是现代社会的瘟疫。2004 年全世界艾滋病毒 (HIV) 感染者为 4 千万， 死亡 300 万， 2005 年新增感染者 500 万。官方统计结果显示我国现有 HIV 感染者约 65 万， 其中艾滋病病人。

8、约 7.5 万， 2005 年新发感染者约 6 8 万。现在我国正处于一个 HIV 感染快速增长阶段， 疫情正在从高危人群向普通人群扩散。HIV 感染的预防、 控制和治疗已 经刻不容缓。 0003 HIV-1 在感染机体时， 首先其包膜与宿主靶细胞膜发生融合， 而后进入靶细胞。 HIV-1 融合抑制剂正是针对这一最初感染过程而设计的药物。HIV-1 融合进入靶细胞的主 要步骤为 ： (1)HIV-1 表面糖蛋白 gp120 同宿主 CD4+T 细胞膜上 CD4 受体结合 ； (2)gp120 结 合于细胞膜表面辅助受体CCR5和CXCR4， 发生构象改变 ； (3)HIV-1跨膜亚基gp41构。

9、象改变 形成六螺旋体结构， 暴露融合肽(FP)， 使病毒包膜与宿主细胞膜发生融合。 抑制该过程的任 何一个环节都可抑制 HIV-1 进入靶细胞， 从而阻止感染。根据对病毒融合的作用机制， 可将 HIV-1 融合抑制剂分为干扰 gp120 结合的 HIV-1 附着抑制剂、 HIV-1 辅助受体抑制剂和阻止 gp41 核心结构形成的 HIV-1 融合抑制剂。 0004 gp41 是 HIV-1 包膜糖蛋白的跨膜部分， gp120 结合辅助受体后其蛋白质结构构象 发生转化， 并同gp41上的保守性小环相互作用， 拉长小环两侧， 暴露出gp41上融合肽， 融合 肽插入宿主细胞膜内， 这时gp41被活化。

10、， 与此同时gp120从病毒包膜和CD4上松动脱落。 在 融合肽与gp41的跨膜部分之间有2段疏水的七氨基酸残基重复序列， 靠近N端的为NHR， 靠 近跨膜部分的为CHR， NHR与CHR都可以形成2螺旋结构。 gp41活化后， NHR螺旋与CHR螺 旋开始互相向对面弯曲， 带动宿主细胞和病毒表面形成平行面互相靠近， 呈发卡结构， gp41 的三聚体形式则可同时形成 3 个发卡结构而紧密排列组成六聚体螺旋束， 其中 3 条 NHR 螺 旋形成中心的卷曲螺旋， 3 条 CHR 螺旋以反平行结合在卷曲螺旋表面的疏水槽中， 形成外层 三聚体螺旋， 疏水槽中有深穴。这六聚体螺旋束使病毒与细胞膜并列连接。

11、， 最终导致膜融 合， 病毒内容物融入宿主细胞内。gp120 的变异性很大， 作为 HIV 疫苗和药物的作用靶点有 很大的局限性， 而作用于 CD4、 CXCR4、 CCR5 等受体的化合物有可能干扰机体正常的免疫防 御功能。 gp41的组成序列比gp120保守， 而且是病毒自身形成的蛋白， 与人体自身蛋白没有 同源性， 因此gp41被公认为更适合作为HIV进入抑制剂研究的靶点。 gp41核心结构上的疏 水槽和疏水残基构成的深穴结构对于 gp41 的构象活化和膜融合起关键作用， 因此可以将 它们作为抗融合药物设计的理想靶位。 0005 20 世纪 90 年代早期的研究发现， 衍生于 gp41C。

12、HR 区域的 C2 多肽 SJ22176 能非常 有效地抑制 HIV-1 感染， 其 IC50 达每升纳摩尔水平。此后， 罗氏制药公司开发出人工合成 肽 T20( 恩夫韦肽， enfuvirtide， 商品名 Fuzeon)。该产品于 2003 年 3 月被批准上市， 成为 说 明 书 CN 101810583 B 3 2/7 页 4 第一个作用于 HIV 与靶细胞融合过程的第 3 类抗 HIV 药物， 即 HIV 融合抑制剂。T20 可与 gp41NHR 三聚体形成的卷曲螺旋表面疏水沟结合， 阻挡 3 个 gp41CHR 在卷曲螺旋外周附着， 抑制六聚体螺旋束的形成。它的作用位点是 gp41。

13、 活化时暴露出的存活时间很短的中间体， 并可以结合 gp120， 干扰 gp120 与 CXCR4 的相互作用， 拮抗 X4 型病毒株感染。但恩夫韦肽注 射剂目前需要每天注射两次， 非常不方便。 0006 基于专利 ( 中国发明专利， 01130985.7， 02146006.X) 而制备的西夫韦肽是 36 个 氨基酸组成的多肽， 微溶于水， 不溶于有机溶剂， 是一种新型的HIV融合抑制剂， 其抗HIV的 效价比 T20 高 20 倍。但西夫韦肽的体内半衰期短， 目前研制的普通冻干粉针剂需每天注射 1 2 次， 而一个疗程长达 52 周， 患者顺应性差， 治疗成本高。基于专利 ( 中国发明专利。

14、， 03816434.5)制备的艾博卫泰和西夫韦肽类似， 也是一个多肽， 其抗HIV的效价比T20高， 但 同意存在西夫韦肽的问题。 0007 上述多肽类 HIV 融合抑制剂都存在注射次数多， 用药剂量大的问题。如果制备成 长效缓释剂型， 将有利于给药和患者接受。 0008 微球是基质型微小球状实体的固体骨架物， 药物溶解和 / 或分散在高分子材料基 质中。微球制剂作为一种高度分散的药物制剂， 拥有超越普通制剂的优点， 如剂量均一、 靶 向性、 控释性等。注射后微球通过在体内不断降解， 释放出包裹的药物而具有缓释作用。但 上述多肽类 HIV 融合抑制剂水溶性差， 难以获得高浓度水溶液， 因此难。

15、以制备成缓释微球 制剂。 0009 生物可降解材料是近 30 年迅速发展的新兴材料。生物降解通常是指聚合物在生 物环境中 ( 水、 酶、 微生物等作用下 ) 大分子的完整性受到破坏， 产生碎片或其它降解产物 的现象。降解的特征是分子量下降。生物降解的过程包括水解、 氧化、 酶解等反应。当被植 入体内后， 生物可降解高分子材料在完成使命后会自动分解成无毒无害的物质， 从体内排 出， 因此不需要再次动手术取出。 发明内容 0010 本发明创造性地制备得到 HIV 融合抑制剂缓释微球， 因此本发明公开了一种 HIV 融合抑制剂缓释微球及其制备方法。 0011 本发明中的 HIV 融合抑制剂缓释微球，。

16、 可用于注射、 鼻腔给药、 肺吸入给药、 植入， 优选的是注射给药。注射给药的方式选自皮下注射、 肌肉注射、 静脉注射， 优选的是皮下注 射。 HIV融合抑制剂缓释微球与传统注射剂(包括注射用粉针或普通注射液)相比， 具有突 出的优势。 HIV融合抑制剂缓释微球注射后能在人体内保持长时间释放药物， 从而大大减少 注射次数， 患者顺应性好， 治疗成本大大下降。 0012 本发明中的HIV融合抑制剂缓释微球， 可在体内缓释时间延长至0.5个月、 1个月、 2 个月、 3 个月、 6 个月或 9 个月， 优选的是缓释时间延长至 0.5 个月、 1 个月、 2 个月或 3 个 月， 更优选的是缓释时间。

17、延长至 0.5 个月或 1 个月。 0013 本发明中的HIV融合抑制剂缓释微球， 其粒径为11000微米， 优选的是5200 微米， 更优选的是 10 50 微米。 0014 本发明中的HIV融合抑制剂缓释微球， 对其中HIV融合抑制剂的量、 辅料的量没有 限制， 只要能产生相应缓释作用就可以， 优选的缓释微球中含有0.540重量比的HIV融 说 明 书 CN 101810583 B 4 3/7 页 5 合抑制剂、 6099.5重量比的聚合物、 010重量比的其它在药学上可接受的辅料。 其 它在药学上可接受的辅料选自吸附剂、 增溶剂、 助溶剂、 防腐剂、 稳定剂、 冻干保护剂、 表面 活性剂。

18、中的一种或多种。 0015 本发明中的HIV融合抑制剂缓释微球， 其中HIV融合抑制剂没有限制， 优选自多肽 类 HIV 融合抑制剂， 更优选自恩夫韦肽、 西夫韦肽、 艾博卫泰， 最优选的是西夫韦肽。 0016 本发明中的 HIV 融合抑制剂缓释微球， 其中微球基质选自各种能起到缓释作用的 材料， 具体选自聚合物、 水难溶无机材料， 优选自聚合物。聚合物选自生物可降解聚合物和 生物难或不降解聚合物， 优选自生物可降解聚合物。水难溶性无机材料选自碳酸钙、 磷酸 钙、 硫酸钙、 乳酸钙、 硅酸盐、 二氧化硅。生物可降解聚合物选自天然聚合物、 合成聚合物， 优选的是合成聚合物。天然聚合物选自多糖、 。

19、多肽、 蛋白质。多糖选自葡聚糖、 壳聚糖、 海 藻酸盐、 淀粉、 微晶纤维素。蛋白质选自明胶、 牛血清白蛋白。合成聚合物选自聚酯、 聚酐、 聚磷腈、 聚酰胺， 优选自聚酯、 聚酐， 更优选的是聚酯。聚酯选自聚乳酸羟基乙酸 (PLGA)、 聚丙交酯乙交酯、 聚乳酸、 聚乙醇酸、 聚 -3- 羟基丁酸酯、 聚乳酸乙醇酸、 聚邻酯、 聚内酯、 聚 酐、 聚羟基丁酸酯羟基戊酸酯共聚物、 聚丙烯葡聚糖、 羟基乙酸、 聚乳酸羟基乙酸聚乙二醇 (PLGA-PEG)、 聚乳酸聚乙二醇 (PLA-PEG)、 聚羟乙酸聚乙二醇 ； 优选自聚乳酸羟基乙酸、 聚 丙交酯乙交酯、 聚乳酸、 聚乳酸乙醇酸、 聚羟基丁酸酯。

20、羟基戊酸酯共聚物、 聚乳酸羟基乙酸 聚乙二醇 ； 更优选自聚乳酸羟基乙酸、 聚乳酸羟基乙酸聚乙二醇 ； 最优选的是聚乳酸羟基 乙酸。聚乳酸羟基乙酸优选的是分子量在 3,000 50,000 道尔顿之间， 乳酸和羟基乙酸聚 合比例在 10 90 90 10 之间的聚合物。 0017 本发明中的HIV融合抑制剂缓释微球， 含有添加剂， 选自能吸附HIV融合抑制剂的 吸附剂、 能增加 HIV 融合抑制剂溶解的助溶剂。能吸附 HIV 融合抑制剂的吸附剂选自明胶、 牛血清白蛋白。能增加 HIV 融合抑制剂溶解的助溶剂选自尿素、 环糊精、 聚乙二醇、 海藻糖、 乳糖、 蔗糖、 甘露醇、 乙酸， 优选自尿素。

21、、 乙酸。 0018 本发明中的 HIV 融合抑制剂缓释微球， 其制备方法选自单乳 - 液中干燥法、 复 乳 - 液中干燥法、 喷雾干燥法、 低温喷雾提取法、 相分离法、 超临界流体技术， 优选自单 乳 - 液中干燥法、 复乳 - 液中干燥法、 喷雾干燥法、 相分离法， 更优选的是复乳 - 液中干燥 法。这些制备方法可以参考相关专业书籍和文献， 由专业技术人员设计和操作完成。制备 得到的微球混悬液， 可进一步干燥可形成粉末。 0019 本发明中的HIV融合抑制剂缓释微球， 采用复乳-液中干燥法时， 其制备工艺可包 括下面步骤 ： 0020 (1) 用有机溶剂溶解生物可降解聚合物， 作为油相 ；。

22、 0021 (2) 用添加剂的水溶液溶解 HIV 融合抑制剂， 作为内水相 ； 0022 (3) 将油相和内水相混合， 通过机械力或压力形成油包水 (W/O) 型乳液 ； 0023 (4) 将 W/O 乳液加入外水相中形成水包油包水 (W/O/W) 型复乳 ； 0024 (5) 将复乳挥干有机溶剂， 使微球固化， 然后离心、 洗涤、 干燥， 得到微球固体粉末。 0025 上述制备工艺是用复乳-液中干燥法制备HIV融合抑制剂缓释微球的一个一般过 程。在实际制备中， 根据需要， 还可以进一步限制制备工艺条件， 具体包括如下方面。 0026 上述制备工艺中的油相中生物可降解聚合物在有机溶剂中的浓度为。

23、 10 1000mg/mL， HIV 融合抑制剂在内水相中的浓度为 10 500mg/mL。有机溶剂选自二氯甲烷、 说 明 书 CN 101810583 B 5 4/7 页 6 三氯甲烷、 二甲基甲酰胺、 二甲基亚砜、 乙酸乙酯、 二氧六环、 乙醚、 丙酮、 四氢呋喃、 乙醇、 乙 腈、 三乙胺中的一种或其中的两种或两种以上的混合物。添加剂选自能吸附 HIV 融合抑制 剂的吸附剂、 能增加 HIV 融合抑制剂溶解的助溶剂。能吸附 HIV 融合抑制剂的吸附剂选自 明胶、 牛血清白蛋白。能增加 HIV 融合抑制剂溶解的助溶剂选自尿素、 环糊精、 聚乙二醇、 海 藻糖、 乳糖、 蔗糖、 甘露醇、 乙。

24、酸， 优选自尿素、 乙酸。外水相中溶解有下面一种或多种材料， 选自聚乙烯醇、 聚乙烯吡咯烷酮、 聚甲基丙烯酸钠、 聚丙烯酸钠、 聚甲基纤维素钠、 氯化钠、 甘露醇、 海藻糖， 浓度为0.515重量比。 实施机械力或压力的方法可以利用各种机械设 备， 如果采用高速匀浆器， 可以每分钟 5000 50000 转高速搅拌 0.5 5 分钟 ； 如果采用超 声分散方法， 可用 100W 1000W 超声探头超声 1 5 分钟。挥干有机溶剂的方法， 可通过 减压挥发、 加热、 室温挥发等方法， 如果是室温挥发方法， 可以在每分钟 100 1000 转搅拌 下挥发有机溶剂。 0027 如果采用喷雾干燥法制。

25、备 HIV 融合抑制剂缓释微球， 用有机溶剂将生物可降解聚 合物溶解得到油相， 其中所述的有机溶剂选自于二氯甲烷、 三氯甲烷、 二甲基甲酰胺、 二甲 基亚砜、 乙酸乙酯、 二氧六环、 乙醚、 丙酮、 四氢呋喃、 乙醇、 乙腈、 三乙胺其中的一种或其中 的两种或两种以上的混合物， 用含添加剂的水溶液将 HIV 融合抑制剂溶解形成水相。其中 生物可降解聚合物在有机溶剂中的浓度为 10 1000mg/mL， HIV 融合抑制剂在水相中的浓 度为 10 500mg/mL。制备时， 采用高速匀浆器或超声探头， 在室温以每分钟 5000 25000 转高速搅拌0.55分钟或间歇式超声13分钟， 形成W/O。

26、乳液， 采用喷雾干燥制得微球。 添加剂选自能吸附 HIV 融合抑制剂的吸附剂、 能增加 HIV 融合抑制剂溶解的助溶剂。 0028 本发明中的 HIV 融合抑制剂缓释微球的形态可以是混悬液或注射用粉末。混悬液 状态是 HIV 融合抑制剂微球直接在分散介质中分散的状态， 一般放置后会有沉降现象， 振 摇后能混悬均匀。分散介质选自水、 水溶液、 丙二醇， 水一般采用注射用水。水溶液中溶解 电解质、 渗透压调节剂、 pH 调节剂、 混悬剂等一种或多种成分， 选自氯化钠、 葡萄糖、 甘露醇、 磷酸盐缓冲剂、 醋酸盐缓冲剂、 羧甲基纤维素钠。混悬液状态的 HIV 融合抑制剂缓释微球用 于注射时称为缓释微。

27、球注射液。注射用粉末是 HIV 融合抑制剂缓释微球的干燥状态， 一般 经过适当处理， 经过喷雾干燥或冷冻干燥得到。粉末状态的 HIV 融合抑制剂缓释微球用于 注射时称为注射用缓释微球。 附图说明 0029 图 1. 复乳法制备西夫韦肽缓释微球显微镜照片 0030 图 2. 相分离法制备西夫韦肽缓释微球显微镜照片 0031 图 3. 西夫韦肽微球加速体外释放率和时间的关系 0032 图 4. 西夫韦肽微球体外释放率和时间的关系 具体实施方式 0033 实施例 1. 复乳法制备西夫韦肽微球 0034 将100mg西夫韦肽溶于1.5mL 30mg/mL尿素水溶液中， 1.0g聚乳酸-羟基乙酸(MW 。

28、10000， 乳酸羟基乙酸摩尔比 75 25) 溶于 2mL 二氯甲烷中， 将二者合并， 在室温下 用超声探头 ( 输出功率 100W) 间歇式超声 1min， 形成 W/O 乳液， 将 W/O 乳液倒入 1000mL 含 说 明 书 CN 101810583 B 6 5/7 页 7 0.2聚乙烯醇的外水相中， 形成W/O/W复乳， 在500rpm的搅拌下搅拌4h， 挥发有机溶剂， 离 心分离， 用蒸馏水洗涤3次， 冷冻干燥20h， 得到流动性良好的白色粉末， 平均粒径48.9m， 外观为圆整的球形。 0035 实施例 2. 喷雾干燥法制备西夫韦肽缓释微球 0036 将1.0g西夫韦肽溶于15。

29、mL人血清白蛋白(HSA)水溶液中， 10g聚乳酸-羟基乙酸 (MW 20000， 乳酸羟基乙酸摩尔比 50 50) 溶于 20mL 二氯甲烷中， 将二者合并， 冰浴 条件下高速匀浆器高速搅拌 5 分钟 (10000rpm)， 形成 W/O 乳液。冷至室温后采用喷雾干燥 设备制备微球。喷雾过程参数为 ： 空气进出口温度分别为 41 46和 34 35， 料液速 度 7.5mL/min， 气流压力 73Psi， 气流速度 400NL/h。 0037 实施例 3. 相分离法制备西夫韦肽缓释微球 0038 将 100mg 西夫韦肽和 30mg 乳糖溶于水中作为水相， 1g 聚乳酸 - 羟基乙酸 (M。

30、W 10000， 乳酸羟基乙酸摩尔比 50 50) 溶于 1.5mL 二氯甲烷中作为油相。在冰浴条件 下用超声探头 ( 输出功率 100W) 间歇式超声 1min 制成 W/O 乳液 ； 将硅油匀速滴入搅拌着的 W/O 乳液中， 由于二氯甲烷与硅油的互溶性， PLGA 很快沉淀出来形成载药微球。加入正己烷 / 乙醇 (1 1) 固化， 4条件下搅拌 2h， 真空干燥得到微球粉末。 0039 实施例 4. 溶媒移除法制备西夫韦肽缓释微球 0040 1g 聚乳酸 - 羟基乙酸 (MW 10000， 乳酸羟基乙酸摩尔比 75 25) 溶于 30mL 乙腈， 加入100mg西夫韦肽， 经超声(100W。

31、)分散均匀后缓缓加入到含2(W/W)Span40的矿 物油中制成 O/O 乳液， 55水浴下以 3000rpm 速度搅拌 30min， 再以 440rpm 继续搅拌 60min 以蒸发残余的有机溶剂。将乳液冷至 35 ( 防止 Span40 析出 )， 使微球硬化， 分离微球并 于真空条件下干燥。 0041 实施例 5. 复乳法制备艾博卫泰缓释微球 0042 将 50mg 艾博卫泰溶于 1.5mL 25mg/mL 尿素水溶液中， 1.0g 聚乳酸 - 羟基乙酸 (MW 10000， 乳酸羟基乙酸摩尔比 75 25) 溶于 2mL 二氯甲烷中， 将二者合并， 在室温下 用超声探头 ( 输出功率 。

32、100W) 间歇式超声 1min， 形成 W/O 乳液， 将 W/O 乳液倒入 1000mL 含 0.2聚乙烯醇的外水相中， 形成 W/O/W 复乳， 在 500rpm 的低速搅拌下搅拌 4h， 挥发有机溶 剂， 离心分离， 用蒸馏水洗涤 3 次， 冷冻干燥 15h， 得到流动性良好的白色粉末。 0043 实施例 6. 喷雾干燥法制备恩夫韦肽缓释微球 0044 将1.0g恩夫韦肽溶于15mL人血清白蛋白(HSA)水溶液中， 10g聚乳酸-羟基乙酸 (MW 20000， 乳酸羟基乙酸摩尔比 50 50) 溶于 20mL 二氯甲烷中， 将二者合并， 冰浴 条件下高速匀浆器高速搅拌 5 分钟 (10。

33、000rpm)， 形成 W/O 乳液。冷至室温后采用喷雾干燥 设备制备微球。喷雾过程参数为 ： 空气进出口温度分别为 41 46和 34 35， 料液速 度 7.5mL/min， 气流压力 75Psi， 气流速度 400NL/h。 0045 以下是关于 HIV 融合抑制剂缓释微球缓释效果证明的实验例。 0046 实验例 1. 西夫韦肽缓释微球的加速体外释放试验 0047 微球制剂在体内缓释时间很长， 我们采用体外加速释放的方法评价其释放效果， 并预测其体内缓释情况。 0048 试验样品 ： 用实施例 1 所述的方法制备的西夫韦肽微球。 0049 试验试剂 ： 0.02的吐温 80 水溶液。 说。

34、 明 书 CN 101810583 B 7 6/7 页 8 0050 试验仪器 ： 水浴恒温振荡器、 离心机。 0051 试验条件 ： 温度， 50 ； 转速， 160rpm。 0052 试验方法 ： 精密称取实验样品约 10mg 微球置于容积为 100ml 的具盖血清瓶中， 加 90ml 释放介质 (0.02的 Tween80 水溶液 )， 置于水浴恒温振荡器中， 保持一定的温度和转 速按时取样。 0053 取样方法 ： 吸取 5ml 溶液， 3000rpm 离心 10min， 再补加 5ml 释放介质 (0.02 Tween-80 水溶液 )， 上清液 HPLC 检测。 0054 取样时间。

35、点 ( 小时 ) ： 1、 4、 7、 20、 30。 0055 试验结果 ： 本发明所制备的微球加速释放试验1小时的累积释放率为9， 30小时 的累积释放率为79。 普通片剂在此条件下在15分钟内全部释放完全， 而我们制备的微球 的释放长达 30 小时以上。因此证明其有强烈的缓释效果， 在体内能达到长效缓释目的。微 球加速释放试验效果图见图 3。 0056 实验例 2. 西夫韦肽缓释微球的体外释放试验 0057 试验样品 ： 采用实施例 2 所述的方法制备的微球。 0058 试验试剂 ： 0.02的吐温 80 水溶液。 0059 试验仪器 ： 水浴恒温振荡器、 离心机。 0060 试验条件 。

36、： 温度 ： 37， 转速 ： 100rpm。 0061 试验方法 ： 精密称取实验样品约 10mg 置于容积为 100ml 的具盖血清瓶中， 加 90ml 释放介质(0.02的Tween-80水溶液)， 置于水浴恒温振荡器中， 保持一定的温度和转速按 时取样。 0062 取样方法 ： 精密量取 5ml 溶液， 3000 转条件下离心 10min， 再补加 5ml 的释放介质 (0.02的 Tween-80 水溶液 )， 上清液用 HPLC 检测。 0063 取样时间点 ( 天 ) ： 1、 4、 7、 20、 30。 0064 试验结果 ： 本发明所制备的微球加速释放试验第 1 天的累积释放。

37、率为 12， 第 30 天的累积释放率为86。 普通片剂在此条件下在30分钟内全部释放完全， 而我们制备的微 球的释放长达 30 天以上。因此证明其有强烈的缓释效果， 在体内能达到长效缓释目的。微 球释放试验效果图见图 4。 0065 实验例 3. 艾博卫泰缓释微球的体外释放试验 0066 试验样品 ： 用实施例 5 所述的方法制备的微球。 0067 试验方法同实验例 2。 0068 试验结果 ： 本发明所制备的微球加速释放试验第 1 天的累积释放率为 10， 第 30 天的累积释放率为 89。证明其有缓释效果， 在体内能达到长效缓释目的。 0069 实验例 4. 恩夫韦肽缓释微球的体外释放试。

38、验 0070 试验样品 ： 用实施例 6 所述的方法制备的微球。 0071 试验方法同实验例 2。 0072 试验结果 ： 本发明所制备的微球加速释放试验第 1 天的累积释放率为 12， 第 30 天的累积释放率为 95。证明其有缓释效果， 在体内能达到长效缓释目的。 0073 实验例 5. 西夫韦肽微球体内药效学实验 0074 试验药品 ： 实施例 1 制备的西夫韦肽微球 说 明 书 CN 101810583 B 8 7/7 页 9 0075 病毒 ： HIV-1 0076 动物 ： 免疫缺陷小鼠 (SCID) 小鼠 ) 经放射抑制免疫， 静脉注射人 T 淋巴细胞。 0077 感染途径 ： 。

39、尾静脉注射 HIV-1 病毒感染移植人淋巴细胞免疫缺陷小鼠。 0078 阳性药 ： 西夫韦肽普通注射剂。 0079 观察指标 ： 血浆中 P24 抗原滴度， HIV-1 病毒负荷 (HIV-1RNA) 和人淋巴细胞。 0080 操作 ： 将移植人淋巴细胞的免疫缺陷小鼠分组， 设正常对照组、 病毒对照组、 阳性 药物对照组和西夫韦肽微球组。用 1-10TCID50HIV-1 病毒尾静脉注射感染小鼠， 感染后 2h 按西夫韦肽注射液皮下注射 1mg/kg， 每天 1 次， 连续给药 30 天 ； 西夫韦肽微球 30mg/kg， 单次皮下注射。取抗凝血分离血浆、 测定 P24 滴度， 用 PCR 方法测定病毒核酸病毒负荷 (HIV-1RNA)。计算病毒对照组和药物治疗组血人淋巴细胞， 判断治疗效果。 0081 结果 ： 西夫韦肽微球显示与西夫韦肽注射剂组相同治疗效果， 病毒滴度和 RNA 在 第 20 天已非常低。 说 明 书 CN 101810583 B 9 1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101810583 B 10 2/2 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101810583 B 11 。