乌骨藤皂苷 H 及其制备方法与应用 【技术领域】
本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的乌骨藤皂苷 H 的制备方法及其应用， 属于医药 领域范畴。背景技术
肿瘤是世界卫生组织 (WHO) 认定危害人类生命的第一大杀手， 成为常见且严重威 胁人类生命和生活质量的主要疾病之一， 过去 20 年中肿瘤发病率呈总体上升之势， 肿瘤已 越来越严重地威胁着人类健康和生命安全。
我国使用中草药治疗各种疾病有着悠久的历史， 从中草药中筛选抗癌新药具有自 己的优势， 在已上市的抗肿瘤药中有很多都是从天然中草药中提取的有效成分制成的， 在 临床治疗肿瘤方面起了非常重要的作用， 因此运用先进的分离纯化技术， 从天然产物中开 发出具有良好活性的抗肿瘤药物不但完全符合当前″回归自然″的世界潮流， 而且具有非 常重要的社会意义。
乌 骨 藤 是 萝 藦 科 (Asclepiadaceae) 植 物 通 关 藤 (Marsdenia tenacissima(Roxb.)Wight etArn.) 的藤茎。主要产于我国云南、 贵州等西南地区， 始载于 《滇南本草》 。乌骨藤中化学成分复杂， 主要含有皂苷、 生物碱、 有机酸、 多糖、 树脂及色素等 多种化学成分， 临床应用表明， 本品具有抗肿瘤、 免疫调节等作用。 目前， 在国内市场上由乌 骨藤单味中药开发出的中成药是消癌平， 包括注射液、 片剂、 胶囊、 口服液等多种剂型， 这些 制剂均具有一定的抗癌疗效， 对胃癌、 肝癌、 肺癌、 食道癌等多种肿瘤具有确切的疗效， 在临 床上已得到较广泛的应用， 说明乌骨藤具有确切的抗肿瘤活性。
由于消癌平开发于上世纪 90 年代， 时间较早， 当时的技术相对落后， 再加上乌骨 藤药材中化学成分很复杂， 所以诸多消癌平制剂中均未能明确其中真正的抗肿瘤活性成 分， 在质量控制上也是选择主要有抗菌、 消炎活性的绿原酸作为指标性成分， 显然存在不 妥。 另外由于制备工艺落后， 导致活性成分含量低， 服用剂量很高， 以消癌平片为例， 其口服 剂量为一次 8 ～ 10 片， 一日 3 次， 如此大的给药剂量给患者带来了很多麻烦。 随着分离纯化 技术的提高以及药理研究的深入， 研究表明 ： 乌骨藤中起抗癌作用的是一类 “C21- 甾体苷” 成分， 其机理为作用于肿瘤细胞防止分裂， 抑制肿瘤细胞增殖， 促进肿瘤细胞分化。
尽管明确了乌骨藤中的主要活性成分是一大类皂苷类成分， 但由于乌骨藤皂苷种 类很多， 而且很多结构相似， 分离纯化难度很大， 很难进一步明确这类皂苷中真正具有活性 的成分是哪一种， 也很难对本品进行有效的质量控制， 达不到国家对现代中药活性成分结 构明确、 质量可控的要求， 严重制约了本品的进一步开发提高。
本发明的目的是提供一种结构明确、 疗效确切的乌骨藤皂苷 H。乌骨藤皂苷 H 是 从中药乌骨藤中通过科学的分离纯化方法制备得到， 具有结构明确， 活性高， 毒副作用小的 特点。通过对乌骨藤皂苷 H 含量的控制可大大提高乌骨藤制剂的安全性、 稳定性和可控性。 同时由于其含量高， 能大大降低原制剂的使用剂量， 减少其他杂质药物对机体的刺激性。 本 发明提供的乌骨藤皂苷 H 可以作为乌骨藤制剂的质量控制指标性成分， 能更好的保障乌骨藤皂苷制剂的临床疗效， 更好的为广大癌症患者服务， 使抗肿瘤中药乌骨藤发挥更大社会 价值。
在专利申请号为 CN200610091096.2 的名为 《一种具有抗肿瘤活性的中药有效部 位的制备及其应用》 专利中， 公开了一种由乌骨藤多糖和总皂苷的组成的混合物有效部位， 没有明确其中的某一活性成分及其化学结构， 与本发明提供的化学成分及结构明确的乌骨 藤皂苷 H 具有明显的不同。在专利申请号为 CN200810059047.X 的名为 《具有抗肿瘤作用的 乌骨藤碳 -21 甾体皂苷混合物》 专利中， 公开了具有抗肿瘤作用的乌骨藤皂苷， 虽然提到了 其中的皂苷类成分乌骨藤苷 A、 B、 C、 D、 K， 并且将由这些皂苷组成的混合物定名为乌骨藤总 苷 H， 但与本发明中所提供的结构明确的单一成分乌骨藤皂苷 H 具有本质的区别。 在专利申 请号为 CN92102027.9 的名为 《消癌平有效成分的提取及剂型制备》 发明专利中， 公开的是 一种从中药乌骨藤中提取的抗癌有效成分乌骨藤多糖的生产工艺， 该发明采用水浸泡， 煎 沸， 醇沉， 去蛋白， 过柱， 透析， 醇沉， 洗涤干燥而获得乌骨藤多糖， 与本发明所说明的内容不 属于一类成分。 在专利申请号为 CN200510082960.8 名为 《一种含乌骨藤苷元的药物及其制 备方法和应用》 专利中， 公开的是一类由乌骨藤总皂苷水解制成的总皂苷元， 也是由多种成 分组成的混合物， 与本发明提供的乌骨藤皂苷 H 也具有本质的不同。 本发明的优势在于克服了以往工艺的不足， 提供了一种结构明确、 高含量的乌骨 藤皂苷 H ； 本发明还提供了高含量的乌骨藤皂苷 H 及其药物组合物的制备方法， 临床用于肿 瘤的治疗。本发明提供的乌骨藤皂苷及其药物组合物的制备方法重复性好， 可适用于生产 放大， 易于推广， 具有很强的实用性。
发明内容
本发明的目的在于克服传统工艺的不足， 提供一种具有良好抗肿瘤活性的高含量 的乌骨藤皂苷 H， 采用高效液相色谱法测定， 含量 60％～ 99.8％， 其结构式如下 ：
本发明的另一目的在于提供一种乌骨藤皂苷 H 及其药物组合物的制备方法， 临床 用于肿瘤的治疗。
根据本发明的比较优选的实施方案， 提取乌骨藤皂苷 H 的制备方法包括如下步 骤：
(1) 取乌骨藤药材， 加适量溶剂加热回流提取， 合并提取液 ；
(2) 提取液浓缩后， 过滤， 滤液上大孔树脂柱， 上柱完成后， 加水洗脱去除大极性杂
质后， 改用乙醇洗脱， 至洗脱液中无乌骨藤皂苷 H， 收集洗脱液 ；
(3) 洗脱液减压浓缩成稠膏， 减压干燥， 粉碎， 得乌骨藤总皂苷粗品 ；
(4) 取乌骨藤总皂苷粗品， 加入适量有机溶剂加热回流提取， 过滤， 残渣弃去， 提取 液合并浓缩至一定体积， 冷却， 加入微量纯度大于 98％的乌骨藤皂苷 H 结晶作为晶种， 静置 结晶， 过滤， 干燥， 得类白色乌骨藤皂苷 H 粗品。
(5) 取上述乌骨藤皂苷 H 粗品， 加适量溶剂加热回流溶解后， 过滤， 滤液冷却， 加入 微量纯度大于 99％的乌骨藤皂苷 H 结晶作为晶种， 静置， 重结晶， 重结晶步骤重复 2 ～ 4 次， 得含量大于 60 ～ 99.8％的乌骨藤皂苷 H。
上述步骤 (1) 中， 提取溶剂可以是水、 甲醇或乙醇， 为了更大程度的保证乌骨藤皂 苷 H 的提取率， 优选使用乙醇作为提取溶剂， 其浓度为 50％～ 95％， 优选 80％ ； 提取溶剂的 用量为药材量的 5 ～ 12 倍 (M/V)， 优选为 7 倍量 ； 提取次数为 2 ～ 4 次， 优选 3 次。
上述步骤 (2) 中， 提取液浓缩至药材量的 5 ～ 10 倍 (M/V)， 优选为 7 ～ 8 倍量 ； 所 用的大孔树脂型号可为 HPD-100、 HPD-400、 HPD-500、 HPD-600， 或 D101、 D1300。通过正交试 验优选， 综合上样量、 吸附率、 解吸速度等各方面因素， 优选树脂型号为 D101 的大孔树脂。 上柱完成后， 用水洗净杂质， 然后用乙醇洗脱， 通过对洗脱率、 样品得率、 样品含量的综合筛 选， 洗脱用乙醇的浓度为 50 ～ 95％， 最佳浓度为 65％。根据洗脱溶剂的不同， 洗脱溶剂用 量为药材量的 2 ～ 6 倍 (M/V)。根据本发明优选的技术方案， 将事先处理好的大孔树脂装 柱， 所用层析柱的规格和材质无特殊要求， 可根据实际生产的需要选定， 并按常规操作方法 填装， 装柱量不少于柱高的 2/3， 最好选用直径与柱高比在 1 ∶ 5 ～ 1 ∶ 6 的柱 ； 乙醇的洗 脱速度优选为 1000 ～ 1500 毫升 / 分钟。
上述步骤 (3) 中， 乙醇洗脱液在 55 ～ 75℃下减压回收， 优选 60℃ ； 减压干燥温度 为 65 ～ 75℃， 优选为 70℃ ； 粉碎后颗粒粒度为 40 ～ 100 目， 优选为 80 目。
上述步骤 (4) 中， 结晶所用的有机溶剂可以为丙酮、 乙酸乙酯、 异丙醇、 正丁醇或 异丙醚， 或是以上溶剂中两种或几种的组合， 优选为乙酸乙酯 ； 提取次数为 2 ～ 4 次， 优选为 3次； 所用晶种纯度越高越好， 一般不低于 98.5％， 否则影响结晶效果 ； 结晶时间为 6 ～ 24 小时， 优选为 12 小时。
上述步骤 (5) 中， 结晶所用的溶剂可以为水、 甲醇、 乙醇、 丙酮、 异丙醇、 乙酸乙酯、 异丙醚或冰醋酸， 或是以上溶剂中两种或几种溶剂的组合， 优选为甲醇 - 水组合， 更优选的 比例为甲醇∶水 (75 ∶ 25) ； 重结晶所用晶种纯度一般不低于 99.5％。
根据本发明的技术方案， 采用科学可行的方法从乌骨藤中经提取、 分离、 结晶、 重 结晶等一系列步骤， 制得乌骨藤皂苷 H 的含量大于 60％， 最高可达 99.8％， 并进一步将本品 制成各种适合于临床应用的制剂， 包括片剂、 胶囊、 滴丸、 软胶囊、 粉针或注射液。
以下通过本发明提供的乌骨藤皂苷 H 的抗肿瘤药理研究来进一步说明本品的实 用性 ：
1、 乌骨藤皂苷 H 对人体肝癌 QGY 裸鼠移植瘤的疗效
1.1 试验目的
测试样品乌骨藤皂苷 H 对移植于裸鼠的人体肝癌 QGY 生长的抑制作用。
1.2 受试药物
乌骨藤皂苷 H ： 江苏天晟药业有限公司提供， 性状 ： 白色粉末， 含量 98.1％ (HPLC) ；阳性对照药物 ： 消癌平片， 5 氟尿嘧啶注射液 (5FU)。
1.3 动物
品系 ： BALB/C 裸鼠 (SPF 级 )， 性别 ： 雄性， 体重 ： 18 ～ 20g， 每组动物数 ： 6 只。
1.4. 移植性肿瘤 ： 人体肝癌
1.5 试验方法
接种后 7 日开始给药， 连续经口灌胃 16 天， 定期用游标卡尺测瘤块的长径 (a)、 短 径 (b)， 肿 瘤 体 积 (tumor volume， TV) 计 算 公 式 为 ： TV ＝ 1/2×a×b2， 相对肿瘤体积 (relativetumor volume， RTV) 计算公式为 ： RTV ＝ Vt/Vo， Vo 为分笼时 ( 即 do) 测量所得 肿瘤体积， Vt 为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖抑制率 (％ ) ： (1-T/C)×100％， 并进行 T 检验。 接种后 24 天 (d17) 处死动物， 解剖取瘤块， 称瘤重， 计算瘤重抑瘤率， 合并用药的效应根据金氏公式计算 Q 值。
1.6 试验结果
根据瘤重计算， 15mg/kg 的 5FU 连续腹腔注射 15 天， 抑瘤率为 47.81％ ； 乌骨藤皂 苷 H 在剂量 80mg/kg、 40mg/kg、 20mg/kg， 连续经口灌胃 16 天， 对人体肝癌 QGY 的抑瘤率为 53.50％、 48.68％、 44.16％， 消癌平 4800mg/kg、 2400mg/kg、 1200mg/kg 剂量， 连续经口灌胃 16 天的抑瘤率为 42.8％、 38.16％、 35.22％。 1.7 试验结论
试验结果表明， 乌骨藤皂苷 H 对人体肝癌 QGY 的生长有一定的抑制作用， 高剂量组 优于 5FU 对照组， 中剂量组与 5FU 组作用相当， 在相当于消癌平片 1/6 给药剂量情况下， 抑 制率仍然明显优于消癌平片。
具体实施方式
以下实施例中所用乌骨藤药材购于贵州， 含量测定用对照品由江苏天晟药业有限 公司提供， 所用乙醇为药用级， 水为纯化水， 其他溶剂为分析纯， 所用辅料为药用级。
实施例 1
取乌骨藤药材 20kg， 分别加 80％乙醇 140L 加热回流提取 3 次， 每次 1.5 小时， 合并 提取液 ； 提取液减压浓缩至 100L， 过滤， 滤液上 HPD-100 大孔吸附树脂柱， 上柱完成后， 加水 洗脱去除大极性杂质后， 改用 80％乙醇 80L 洗脱至洗脱液中无乌骨藤皂苷 H， 收集洗脱液， 60℃减压浓缩至稠膏， 70℃减压干燥， 粉碎成 80 目粉末， 得乌骨藤总皂苷粗品 440g ；
将上述乌骨藤总皂苷粗品， 分别加入 2.2L 乙酸乙酯加热回流提取 3 次， 过滤， 残渣 弃去， 提取液合并浓缩至 2.0L， 冷却， 加入微量纯度为 99.1％的乌骨藤皂苷 H 结晶作为晶 种， 静置结晶 12 小时， 过滤， 干燥， 得类白色乌骨藤皂苷 H 粗品 106g。
将上述乌骨藤皂苷 H 粗品， 用 75％的甲醇溶液 500ml 加热回流溶解后， 过滤， 滤液 冷却， 加入微量纯度为 99.6％的乌骨藤皂苷 H 结晶作为晶种， 静置结晶 12 小时， 并按上述操 作步骤重结晶 4 次， 得白色针状结晶 46.4g， 即乌骨藤皂苷 H， 含量 99.8％。
实施例 2
取乌骨藤药材 50kg， 分别加 95％乙醇 250L 加热回流提取 4 次， 每次 1 小时， 合并 提取液 ； 提取液浓缩至 250L， 过滤， 滤液上 D-101 大孔吸附树脂柱， 上柱完成后， 加水洗脱去 除大极性杂质后， 改用 200L 95％乙醇洗脱， 至洗脱液中无乌骨藤皂苷 H， 收集洗脱液， 65℃减压浓缩至稠膏， 稠膏于 65℃减压干燥， 粉碎成 60 目粉末， 得乌骨藤总皂苷粗品 1.4kg ；
将上述乌骨藤总皂苷粗品， 分别加入 14L 异丙醚加热回流提取 2 次， 过滤， 残渣弃 去， 提取液合并浓缩至 7.0L， 冷却， 加入微量纯度为 99.0％的乌骨藤皂苷 H 结晶作为晶种， 静置结晶 24 小时， 过滤， 干燥， 得类白色乌骨藤皂苷 H 粗品 286g。
将上述乌骨藤皂苷 H 粗品， 用 50％的乙醇溶液 1400ml 加热回流溶解后， 过滤， 滤液 冷却， 加入微量纯度为 99.5％的乌骨藤皂苷 H 作为晶种， 静置结晶 24 小时， 并按上述操作步 骤重结晶 2 次， 得类白色方晶 188g， 即乌骨藤皂苷 H， 含量为 62.5％。
实施例 3 ：
取乌骨藤药材 50kg， 分别加水 500L 加热回流提取 3 次， 每次 2 小时， 合并提取液 ； 提取液浓缩至 500L， 过滤， 滤液上 D-1300 大孔吸附树脂柱， 上柱完成后， 加水洗脱去除大极 性杂质后， 改用 300L 50％乙醇洗脱， 至洗脱液中无乌骨藤皂苷 H， 收集洗脱液， 75℃减压浓 缩至稠膏， 稠膏于 75℃减压干燥， 粉碎成 100 目粉末， 得乌骨藤总皂苷粗品 1.6kg ；
将上述乌骨藤总皂苷粗品， 分别加入 13L 异丙醚 - 乙酸乙酯 (1 ∶ 1) 加热回流提 取 3 次， 过滤， 残渣弃去， 提取液合并浓缩至 6.5L， 冷却， 加入微量纯度为 99.3％的乌骨藤皂 苷 H 结晶作为晶种， 静置结晶 18 小时， 过滤， 干燥， 得类白色乌骨藤皂苷 H 粗品 252g。 将上述乌骨藤皂苷 H 粗品， 用 60％的异丙醇溶液 1400ml 加热回流溶解后， 过滤， 滤 液冷却， 加入微量纯度为 99.5％的乌骨藤皂苷 H 结晶作为晶种， 静置结晶 18 小时， 并按上述 操作步骤重结晶 3 次， 得白色针状结晶 143g， 即乌骨藤皂苷 H， 含量为 72.6％。
实施例 4
取乌骨藤药材 50kg， 分别加 50％乙醇 400L 加热回流提取 2 次， 每次 2 小时， 合并 提取液 ； 提取液浓缩至 250L， 过滤， 滤液上 HPD-400 大孔吸附树脂柱， 上柱完成后， 加水充 分洗脱去除大极性杂质后， 改用 250L 70％乙醇洗脱， 至洗脱液中无乌骨藤皂苷 H， 收集洗 脱液， 65℃减压浓缩至稠膏， 稠膏于 70℃减压干燥， 粉碎成 40 目粉末， 得乌骨藤总皂苷粗品 1.5kg ；
将上述乌骨藤总皂苷粗品， 分别加入 15L 乙酸乙酯 - 丙酮 (2 ∶ 1) 加热回流提取 2 次， 过滤， 残渣弃去， 提取液合并浓缩至 10L， 冷却， 加入微量纯度为 99.6％的乌骨藤皂苷 H 结晶作为晶种， 静置结晶 20 小时， 过滤， 干燥， 得类白色乌骨藤皂苷 H 粗品 248g。
将上述乌骨藤皂苷 H 粗品， 用丙酮溶液 1000ml 加热回流溶解后， 过滤， 滤液冷却， 加入微量纯度为 99.6％的乌骨藤皂苷 H 结晶作为晶种， 静置结晶 24 小时， 并按上述操作步 骤重结晶 4 次， 得白色针状结晶 102g， 即乌骨藤皂苷 H， 含量为 95.6％。
实施例 5
取乌骨藤药材 100kg， 分别加 60％乙醇 800L 加热回流提取 3 次， 每次 1.5 小时， 合 并提取液 ； 提取液浓缩至 500L， 过滤， 滤液上 HPD-600 大孔吸附树脂柱， 上柱完成后， 加水充 分洗脱去除大极性杂质后， 改用 400L 75％乙醇洗脱， 至洗脱液中无乌骨藤皂苷 H， 收集洗 脱液， 70℃减压浓缩至稠膏， 稠膏于 70℃减压干燥， 粉碎成 40 目粉末， 得乌骨藤总皂苷粗品 3.2kg ；
将上述乌骨藤总皂苷粗品， 分别加入 48L 乙酸乙酯 - 异丙醚 (1 ∶ 1) 加热回流提 取 3 次， 过滤， 残渣弃去， 提取液合并浓缩至 32L， 冷却， 加入微量纯度为 99.5％的乌骨藤皂 苷 H 结晶作为晶种， 静置结晶 12 小时， 过滤， 干燥， 得类白色乌骨藤皂苷 H 粗品 550g。
将上述乌骨藤皂苷 H 粗品， 用乙酸乙酯溶液 2200ml 加热回流溶解后， 过滤， 滤液冷 却， 加入微量纯度为 99.8％的乌骨藤皂苷 H 结晶作为晶种， 静置结晶 18 小时， 并按上述操作 步骤重结晶 4 次， 得白色针状结晶 240g， 即乌骨藤皂苷 H， 含量为 98.1％。
实施例 6( 乌骨藤皂苷 H 注射液的制备 )
取实施例 5 中的乌骨藤皂苷 H 针状结晶 0.5g， 羟丙基 β- 环糊精 0.5g， 加适量注 射用水溶解后， 再加入活性碳 0.02g， 加热煮沸 30 分钟， 滤过， 加水至 900ml， 用 1％的 NaOH 调 pH 至 6.5， 静置 2h， 滤过， 滤液加注射用水至 1000ml， 灌封 (10ml/ 支， 0.5mg/m1)， 灭菌， 即 得。用法用量为每日 1 次， 每次 10 ～ 20mg 静脉注射， 或加入生理盐水或 5 ～ 10％的葡萄糖 溶液中静脉滴注。
实施例 7( 乌骨藤皂苷 H 胶囊的制备 ) ：
取实施例 5 中的乌骨藤皂苷 H 针状结晶 100g， 淀粉 50g， β- 环糊精 100g 混匀， 制 粒， 过 60 目筛， 干燥后装成 1000 粒胶囊 (100mg/ 粒 )， 即得。用法用量为 ： 口服， 每次 1 粒， 每日 3 次。
实施例 8( 乌骨藤皂苷 H 片的制备 ) ：
取实施例 5 中的乌骨藤皂苷 H 针状结晶 50g， 淀粉 70g， 硬脂酸镁 4.0g， 微粉硅胶 1.0g， 糊精 125g 混匀， 制粒， 过 60 目筛， 干燥后压成 1000 片 (25mg/ 片 )， 即得。用法用量 为： 口服， 每次 1 ～ 2 片， 每日 3 次。8