51,1二甲烯丙基4,4’二羟基2甲氧基查尔酮的新用途.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103405402 A (43)申请公布日 2013.11.27 CN 103405402 A *CN103405402A* (21)申请号 201310039520.9 (22)申请日 2013.02.01 A61K 31/12(2006.01) A61P 31/14(2006.01) A61P 31/16(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军军事医学科学院放 射与辐射医学研究所 地址 100850 北京市海淀区太平路 27 号 (72)发明人 王升启 杨静 伯晓晨 韩明明 齐向云 李康 (54) 发明名称 5-(1,1- 二甲烯丙基 )-4,4 - 二。

2、羟基 -2- 甲 氧基查尔酮的新用途 (57) 摘要 本发明涉及一种小分子化合物的新用途。 具 体 说 是 5-(1,1- 二 甲 烯 丙 基 )-4,4 - 二 羟 基 -2- 甲氧基查尔酮或其可用药盐在制备用于治 疗 EV71 等引起手足口病病毒感染相关疾病的药 物中的用途以及在制备用于流感病毒感染相关疾 病的药物中的用途。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103405402 A CN 103405402 A *CN10340。

3、5402A* 1/1 页 2 1.5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮或其可用药盐在制备用于 治疗 EV71 病毒和流感病毒感染相关疾病的药物中的用途。 2. 根据权利要求 1， 其中所述 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔 酮， 也被命名为甘草查尔酮 A。 3. 根据权利要求 1， 其中所述药物含有一种或多种制药可接受的载体。 4. 根据权利要求 1 所述的用途， 其中所述药物可以制成注射剂、 冻干粉针、 微球、 粉末、 粉雾剂、 气雾剂、 肠溶衣、 毫微球、 微乳或复乳。 权 利 要 求 书 CN 103405。

4、402 A 2 1/7 页 3 5-(1,1- 二甲烯丙基 )-4,4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮的 新用途 技术领域 ： 0001 本发明涉及化学药物 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮的 新用途， 具体地说是 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮在制备治疗和 预防 EV71( 肠道病毒 71 型 ) 病毒 (Human enterovirus71) 感染和流感病毒 (Influenza Virus) 感染的药物中的新用途。 背景技术 0002 肠 道 病 毒 71 型 (EV71) 属 于 小 RNA 。

5、病 毒 科 (Picornaradae) 肠 道 病 毒 属 (Enterovirus) 的成员， 归属于人类肠道病毒 A。EV71 可导致大范围的暴发流行， 可伴有严 重的 CNS 并发症或致死性肺水肿， 其感染危害非常严重。目前抗 EV71 病毒的治疗药物仅利 巴韦林等广谱抗病毒药物， 但抗病毒疗效一般。因此， 研究开发有效的预防和控制 EV71 病 毒的方法已成当务之急。 0003 流感病毒感染可引起急性呼吸道传染病。该病潜伏期短， 传染性强， 传播迅速。几 次世界范围内的大流行， 都严重威胁了人们的健康和正常生活。 由于流感病毒变异， 常规疫 苗不能有效预防流感的发生和流行。 过去用于。

6、治疗流感的两种较低廉的抗病毒药物三环癸 胺(amantadine)和金刚乙胺(remantadine)对人体内流感病毒几乎不起作用， 且耐药较为 普遍。新近上市的神经氨酸酶抑制剂 ( 例如 ： 达菲和帕纳米韦 ) 虽效果较好， 但随着临床广 泛应用， 耐药毒株分离的报道也相继出现。目前仍缺乏可靠的方法对流感的发生和流行进 行有效的控制， 有效的预防和控制流感病毒的方法已成当务之急。 0004 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮属于查尔酮类化合物。由 于其分子结构具有较大的柔性， 能与不同的受体结合， 因此具有广泛的生物活性， 包括有抗 炎、 抗菌、 抗。

7、氧化、 抗癌、 降脂活性及解痉作用等。Kolbe 等发现 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 -二羟基-2-甲氧基查尔酮的抗炎作用与抑制多种致炎因子的生成相关， 5-(1， 1-二甲烯 丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮可抑制人皮肤成纤维细胞中白介素 1 诱导的前列 腺素 E 的生成， 具有抗炎活性。甘草查耳酮的抗癌活性是由于其诱导细胞周期停滞在 G2 和 G1 后期的作用。基于其抗炎、 抗氧化活性， 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基 查尔酮可用于敏感性皮肤病的治疗， 如酒渣鼻等。另外， 还发现 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-。

8、4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮体外具有抗幽门杆菌的活性， 还有抗 HIV 的活性。但是关于 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮是否具有抗 EV71 病毒和流感病毒 活性， 目前尚无相关文献报道。本实验室通过应用生物信息学预测并结合实验研究的策略 首次发现 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮能够抑制 EV71 病毒和流 感病毒的复制。 发明内容 0005 本发明的目的在于研究 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮 说 明 书 CN 103405402 A 3 2。

9、/7 页 4 抗 EV71 病毒和流感病毒感染致病的活性， 为 EV71 病毒和流感病毒感染相关疾病的预防和 治疗提供新型药物。 0006 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮又名甘草查尔酮 A， 分子式 C21H22O4， 分子量 338.40， 结构式如下 ： 0007 0008 本研究在 RD 细胞 ( 人横纹肌肉瘤细胞 ) 和 Vero 细胞 ( 非洲绿猴肾细胞 ) 中评价 了 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮抑制 EV71 病毒复制和致细胞病 变的特性， 结果显示在 RD 细胞和 Vero 细胞， 5。

10、-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧 基查尔酮均能剂量依赖性地抑制 EV71 病毒的复制和致细胞病变作用。进一步应用 EV71 感 染乳鼠模型评价结果显示 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮以 20mg/ kg/d 的剂量连续给药 5 天， 可提高病毒感染小鼠的存活率， 缓解病毒感染引起的小鼠体重 增长缓慢。以上结果提示 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮可发展成 为预防和治疗 EV71 病毒感染相关疾病的药物。 0009 另外， 本研究还应用流感病毒感染小鼠模型评价了 5-(1，。

11、 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮的体内抗流感病毒活性， 结果显示， 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮以 20mg/Kg/d 剂量灌胃给药或腹腔注射均能有效降低流感病 毒感染引起的小鼠死亡， 提示 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮还可 能被发展成为预防和治疗流感病毒感染相关疾病的新型药物。 0010 根据本发明， 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮能有效抑制 EV71 病毒的感染复制， 提高 EV71 病毒感染小鼠的存活率， 并有效降。

12、低流感病毒感染引起的 小鼠死亡， 有可能成为治疗及预防 EV71 病毒和流感病毒感染相关疾病的药物。 0011 根据本发明， 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮药物可接受 盐包括它们合适的碱加成盐。 盐为与以下碱形成的盐 ： 无机碱， 包括钠、 钾、 钡、 钙、 镁、 锌、 锂 的碱性化合物 ； 有机碱， 包括乙胺、 二乙胺、 乙醇胺、 吡咯烷， L- 精氨酸、 葡甲胺、 氨基葡萄糖 等。本发明化合物的药学上可接受的盐可以通过本领域中的常规方法制得。 0012 根据本发明， 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮可。

13、按本领域 已知方法配成药物制剂。 0013 根据本发明， 本发明的治疗组成， 依不同情况包括特定药物的药物动力学、 药代动 力学、 给药模式、 给药途径、 受者的年龄、 体重、 肝肾功能状态、 疾病的性质、 程度及治疗时限 等， 以适宜的剂量给药。 0014 本发明的实施对严重危害人类健康的 EV71 病毒感染的治疗具有重要的社会效益 和经济效益。 附图说明 ： 0015 图 1 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮及其钠盐在 RD 细胞 说 明 书 CN 103405402 A 4 3/7 页 5 剂量依赖性地抑制 EV71 病毒致细胞病变作用。 00。

14、16 图 2 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮及其钠盐在 Vero 细 胞剂量依赖性地抑制 EV71 病毒致细胞病变作用。 0017 图 3 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮在 RD 细胞对 EV71 病毒 RNA 的抑制作用。 0018 图4 5-(1， 1-二甲烯丙基)-4， 4 -二羟基-2-甲氧基查尔酮在Vero细胞对EV71 病毒 RNA 的抑制作用。 0019 图 5 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮在 RD 细胞对 EV71 病毒 VP1 蛋白表达的。

15、抑制作用。 0020 图6 5-(1， 1-二甲烯丙基)-4， 4 -二羟基-2-甲氧基查尔酮在Vero细胞对EV71 病毒 VP1 蛋白表达的抑制作用。 0021 图 7 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮对 EV71 病毒感染小 鼠存活率的影响 0022 图 8 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮对 EV71 病毒感染小 鼠体重的影响 0023 图 9 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮降低了流感病毒感 染小鼠的死亡率。 具体实施方式 0024 实施例一 ： 002。

16、5 本实施例主要说明 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮及其钠 盐在 RD 细胞和 Vero 细胞抗 EV71 病毒感染致细胞病毒的活性。 0026 材料与方法 0027 1. 细胞、 病毒和药物配置 0028 EV71 病毒株为国际标准株 BrCr 株， 通过感染 RD 细胞进行扩增繁殖， 然后混匀、 分 装并储存在-70备用。 RD细胞和Vero细胞培养液均为含10胎牛血清的DMEM(GIBCO)培 养液。 病毒感染和细胞病变测定时使用含2胎牛血清的维持液。 5-(1， 1-二甲烯丙基)-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮用 DMSO 溶解。

17、为 10mM， 分装后储存在 -20备用。5-(1， 1- 二 甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮的钠盐是将 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二 羟基 -2- 甲氧基查尔酮在 NaOH 溶液中溶解， 并用 PBS 调节 PH 值至 8.0 所得。 0029 2.5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮抑制 EV71 病毒致细胞 病变的剂量依赖作用检测 0030 RD 细胞和 Vero 细胞在含 10胎牛血清的 DMEM 培养基 (GIBCO) 中， 于 37、 5 CO2 培养箱中培养。观察细胞生长状态良好， 培养至对数。

18、生长期后， 以 8000 10000 个细 胞 / 孔将细胞接种至 96 孔细胞培养板中， 次日 75 80长满。用 DMEM 稀释 5-(1， 1- 二 甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮至 20M 备用。将长满 75 80 RD 细胞或 Vero细胞的含10胎牛血清的DMEM培养基(GIBCO)的96孔板换成含2胎牛血清的维持 液， 并加入 EV71 病毒稀释液， 终浓度为 100TCID50/0.1ml， 37吸附 1h 后， 吸去病毒液， 把 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮分别设立 1.25、 2.5、 5、 10、 。

19、20M 五 说 明 书 CN 103405402 A 5 4/7 页 6 个浓度梯度加入 96 孔板内， 每个浓度设三个复孔， 并设立病毒感染对照组和正常细胞对照 组， 37培养 2d。利用 Cell Counting Kit-8(DoJinDo 产品 ) 方法在酶标仪 (BIO-RAD 产 品， 型号 ： Model680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)， 并以如下公式计算药物的病毒 抑制率 ： (OD 试验 -OD 病毒 )/(OD 细胞 -OD 病毒 )100。重复试验二次， 计算平均值。 0031 3.5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮。

20、对 RD 细胞的毒性作用 检测 0032 将 RD 细胞铺 96 孔细胞培养板， 次日 75 80长满。将长满 75 80的细胞换 成含 2胎牛血清的维持液备用。把 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔 酮分别设立5、 10、 20、 40、 80、 160M五个浓度梯度， 每个浓度设立三个复孔， 并设立RD细胞 阴性对照组， 37培养 2d， 镜下观察 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔 酮对细胞形态的影响。 利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD 产品， 型号。

21、 ： Model680) 上测定细胞病变程度 ( 以 OD450表示 )， 并计算半数毒性剂量 CC50。 0033 结果 ： 0034 1.5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮抑制 EV71 病毒致细胞 病变的剂量依赖作用 0035 如图 1， 2 所示， 无论在 RD 细胞还是 Vero 细胞， 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟 基 -2- 甲氧基查尔酮及其钠盐在 0-20M 范围内均可剂量依赖性的抑制 EV71 病毒的致细 胞病变作用， 其抑制 EV71 病毒感染致 CPE 的 IC50分别为 5.94M 和 10.56M。 0。

22、036 2.5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮对 RD 细胞的毒性作用 0037 把甘草查尔酮分别设立 5、 10、 20、 40、 80、 160M 六个浓度梯度进行药物毒性试 验， CCK8 检测结果显示甘草查尔酮对 RD 细胞的半数毒性剂量 CC50分别为 67.95M。 0038 结论 0039 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮在细胞水平具有显著的抗 EV71 病毒感染致病的作用。 0040 实施例二 0041 本实施例主要说明 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查。

23、尔酮在 RD 细胞和 Vero 细胞具有显著的抑制 EV71 病毒复制的作用。 0042 材料与方法 0043 1. 细胞、 病毒和药物配置 0044 同实施例 1。 0045 2.5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮对 EV71 病毒 RNA 的抑 制作用检测 0046 RD 细胞和 Vero 细胞在含 10胎牛血清的 DMEM 培养基 (GIBCO) 中， 于 37、 5 CO2 培养箱中培养。观察细胞生长状态良好， 培养至对数生长期后， 以 8000 10000 个细 胞 / 孔将细胞接种至 96 孔细胞培养板中， 次日 75 80长满。用 DME。

24、M 稀释 5-(1， 1- 二 甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮至 20M 备用。将长满 75 80 RD 细胞或 Vero细胞的含10胎牛血清的DMEM培养基(GIBCO)的96孔板换成含2胎牛血清的维持 液， 并加入 EV71 病毒稀释液， 终浓度为 100TCID50/0.1ml， 37吸附 1h 后， 吸去病毒液， 把 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮分别设立 1.25、 2.5、 5、 10、 20M 五 说 明 书 CN 103405402 A 6 5/7 页 7 个浓度梯度加入 96 孔板内， 每个浓度设三个复孔。

25、， 并设立病毒感染对照组和正常细胞对照 组， 37培养。在 24h 和 48h 分别收集细胞培养液， 应用病毒 RNA 提取试剂盒提取 EV71 病 毒 RNA。 0047 3. 荧光定量 PCR 检测 EV71 病毒 RNA 0048 定量检测 EV71RNA 的引物和探针序列分别为 ： EV71-1F ： 5 -CAA GTC TCA GTG CCA TTT AT-3 ； EV71-1R ： 5 -ATT CGG GCA TGC CCC ATA CT-3 ； EV71-Probe ： 5 -TCA CCT GCA AGCGCA TAC CAA TGGT-3 (5端 FAM 修饰， 3端 T。

26、AMRA 修饰 )。20L 反应体系包括 2Quant One Step Probe qRT-PCR Master mix10L， Hotmaster Taq polymerase(2.5U/ L)0.8L， Quant RTase(for one step)0.3L， 正反向引物各 0.5L， 探针 1L， RNA 模板 2L， RNase-free ddH2O 补至 20L， 混匀后将各反应管与标准品反应管一起放入 IQ5 荧光定量 PCR 仪 (BIO-RAD) 中进行反应， 反应条件为 ： 1) 反转录 150 30min ； 2) 起始模 板变性 192 3min ； 3) 扩增条件。

27、 ： 92 10s， 55 20s， 68 20s， 共 40 个循环。反应结束 后由电脑给出数据计算出定量结果。 0049 4.5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮对 EV71 病毒蛋白的抑 制作用检测 0050 RD 细胞和 Vero 细胞培养至对数生长期后， 传代至 10cm2皿中， 次日 75 80长 满。用 DMEM 稀释 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮至 20M 备用。 将长满 75 80 RD 细胞或 Vero 细胞的含 10胎牛血清的 DMEM 培养基 (GIBCO) 的 10cm2 换成含 。

28、2胎牛血清的维持液， 并加入 EV71 病毒稀释液， 终浓度为 100TCID50/0.1ml， 37 吸附 1h 后， 吸去病毒液， 把 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮分别设 立5、 10、 20M三个浓度梯度加入细胞， 并设立病毒感染对照组， 37培养48h， 应用RIPA裂 解液裂解收集细胞蛋白， 参照分子克隆Western免疫印迹检测方法检测VP1蛋白的表达， 用 GAPDH 蛋白的表达作对照。 0051 结果 0052 1.5- 0053 (1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮抑制了 EV71 病毒 RN。

29、A 水平 0054 结果见图 3， 图 4。由图中可见， 无论在 RD 细胞还是 Vero 细胞， 5-(1， 1- 二甲烯丙 基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮均剂量依赖性地抑制了 EV71 病毒 RNA 的复制。在 RD 细胞， 药物处理后 48h， 20M 的 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮可 使 EV71 病毒 RNA 的拷贝数从 5.71107降低至 6.55103。在 Vero 细胞， 药物处理后 48h， 20M 的 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮可使 EV71 病毒 RN。

30、A 的拷 贝数从 1.63108降低至 1.31107。 0055 2.5- 0056 (1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮抑制了 EV71 病毒蛋白水平 0057 结果见图 5， 图 6。由图中可见， 无论在 RD 细胞还是在 Vero 细胞， 5-(1， 1- 二甲烯 丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮均可剂量依赖性地抑制 EV71 病毒的 VP1 蛋白表达。 在 RD 细胞， 10M 的 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮即可完全抑制 EV71VP1 的蛋白水平。在 Vero 细胞， 200M。

31、 的 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲 氧基查尔酮可完全抑制 EV71VP1 的蛋白水平。 说 明 书 CN 103405402 A 7 6/7 页 8 0058 结论 0059 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮可剂量依赖性地抑制 EV71 病毒 RNA 的复制和病毒蛋白的表达。 0060 实施例三 0061 本实施例主要说明在 EV71 病毒感染小鼠模型， 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟 基 -2- 甲氧基查尔酮对小鼠的保护作用。 0062 材料与方法 0063 1.ICR 乳鼠、 病毒和药物。

32、 0064 动物为 7 日龄 ICR 乳鼠。病毒株为 BrCr 国际标准株。药物用 DMSO 溶解至 200mg/ ml， 给药时用 PBS 稀释至 2mg/ml。 0065 2. 实验分组 0066 共分为 3 个组 ： 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮 20mg/kg/ d 腹腔给药组、 EV71 病毒感染组、 正常生理盐水对照组。每组 12 只小鼠。 0067 3. 造模方法 0068 EV71 病毒用生理盐水稀释 10 倍后经腹腔途径感染乳小鼠， 每只小鼠 30l。 0069 4. 给药及观察 0070 感染后 4h 给药， 5-(1， 1-。

33、 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮 20mg/kg/ d 腹腔给药组， 腹腔注射给药， 每克小鼠 10l。以后连续给药 4 天， 每天 1 次。感染后每天 称量记录体重， 并记录死亡情况， 连续观察 14 天。计算存活率和平均存活天数。 0071 结果 0072 结果见图 7 和图 8。病毒感染组在感染后第三天开始出现精神萎靡、 活动减少、 后肢麻痹等症状， 于第 6 天开始出现死亡现象， 感染后第 14 天共计死亡 8 只， 死亡率为 66.67。感染后体重增长较正常对照组显著缓慢， 而 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟 基 -2- 甲氧基查尔酮。

34、给药组乳小鼠在感染后小鼠精神和活动状态无显著改变， 14 天内未出 现死亡现象， 体重增长较正常对照组缓慢， 但优于病毒感染对照。 病毒感染组平均存活天数 为 9.08 天， 给药组平均存活时间为 14 天。 0073 结论 0074 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮可以显著提高 EV71 病毒 感染小鼠的存活率， 延长平均存活时间， 缓解病毒感染引起的体重增长缓慢。 0075 实施例四 0076 本实施例主要说明在流感病毒感染小鼠模型， 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟 基 -2- 甲氧基查尔酮对小鼠的保护作用。 0077 材料。

35、与方法 0078 2.Balb/c 小鼠、 病毒和药物 0079 动物为 Balb/c 小鼠， 体重在 182g。病毒株为小鼠适应的流感病毒 A/FM/1/47 株。灌胃给药组用 0.5 CMCCNa 混悬至 2mg/ml ； 腹腔注射组用 DMSO 溶解至 200mg/ml， 给 药时用 PBS 稀释至 4mg/ml。 0080 2. 实验分组 0081 共分为 4 个组 ： 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮 20mg/kg/ 说 明 书 CN 103405402 A 8 7/7 页 9 d 腹腔给药组、 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4。

36、 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮 20mg/kg/d 灌胃给药 组、 流感病毒感染组、 正常生理盐水对照组。每组 10 只小鼠。 0082 5. 造模方法 0083 10戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后， 正常生理盐水组以生理盐水滴鼻， 其余各组以 20L 流感病毒 A/FM/1/47 稀释 104倍滴鼻。 0084 6. 给药及观察 0085 感染后4h给药， 5-(1， 1-二甲烯丙基)-4， 4 -二羟基-2-甲氧基查尔酮20mg/kg/d 腹腔给药组， 腹腔注射给药， 每只 100l ； 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基 查尔酮 20mg/kg/d 灌胃。

37、给药组， 灌胃给药， 每只 200l。以后连续给药 4 天， 每天 1 次。感 染后每天称量记录体重， 并记录死亡情况， 连续观察 14 天。计算存活率和平均存活天数。 0086 结果 0087 结果见图7。 病毒感染组在感染后第7天开始出现死亡， 至感染后11天全部死亡， 死亡率 100。而 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮灌胃给药组在感 染后第 8 天开始出现死亡， 第 14 天仍有 5 只存活， 死亡率为 50， 死亡保护率为 50； 腹腔 给药组在感染后第8天开始出现死亡， 第14天仍有6只存活， 死亡率为40， 死亡保护率为 60。病毒感染。

38、组平均存活天数为 7.6 天， 腹腔注射给药组平均存活时间为 11.6 天， 灌胃 给药组平均存活给药时间为 11.3 天。 0088 结论 0089 5-(1， 1- 二甲烯丙基 )-4， 4 - 二羟基 -2- 甲氧基查尔酮可以提高显著流感病毒感 染小鼠的存活率， 延长平均存活时间。 说 明 书 CN 103405402 A 9 1/4 页 10 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103405402 A 10 2/4 页 11 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103405402 A 11 3/4 页 12 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103405402 A 12 4/4 页 13 图 9 说 明 书 附 图 CN 103405402 A 13 。