技术领域
本发明涉及医学生物技术领域，具体地说，涉及一种多价免疫原 性组合物。
背景技术
甲型病毒性肝炎简称甲型肝炎，是由甲型肝炎病毒(甲肝病毒)引 起的一种急性传染病，粪-口传播是其主要传播途径。临床上表现为 起病急，有畏寒、发热、食欲减退、恶心、疲乏、肝肿大及肝功能异 常。部分病例出现黄疸，无症状感染病例较常见，一般不转为慢性和 病原携带状态。
甲型肝炎病毒属于微小核糖核酸病毒科，肝病毒属。病毒颗粒呈 球形，直径约为27nm，无囊膜，衣壳由32个壳粒组成，呈20面体立 体对称，每个壳粒具有四个多肽分别为病毒蛋白VP1、VP2、VP3和 VP4，基因组为单股正链RNA，其长度相当于7500个核苷酸左右。在 RNA的3′末端有多聚的腺苷序列，在5′末端以共价形式与病毒基因 组蛋白。根据病毒核苷酸序列分析，人甲肝病毒可以分为四个基因型， 但其抗原性相似，所以甲型肝炎病毒只有一个血清型。
脊髓灰质炎是由病毒感染人引起的高传染性疾病。脊髓灰质炎病 毒可以侵染人体神经系统，并可在数小时内导致病人肢体麻痹，造成 终身残疾。脊髓灰质炎可在所有年龄段人群中发生，但好发于小于5 岁的婴幼儿，因此该病又称为“小儿麻痹症”。
脊髓灰质炎病毒属于小核糖核酸病毒科的肠道病毒属。电子显微 镜下观察病毒呈小的圆球形，直径为24～30nm，呈圆形颗粒状。脊 髓灰质炎病毒含有单股正链RNA，被3个外壳蛋白包裹，分别为 VP1-3，另外一个VP4蛋白为内壳蛋白。脊髓灰质炎病毒按照血清型 分类可以分为I、II和III型，均可以致病。
到目前为止医学界还没有治疗脊髓灰质炎的特效药，仅能通过缓 解症状来治疗病人，比如通过物理疗法和服用止痉挛药来缓解肌肉麻 痹和紧张。但是脊髓灰质炎可以通过注射疫苗来达到良好的预防效 果。
灭活的脊髓灰质炎疫苗（IPV）最先由Salk博士在上世纪50年代 开发成功。1954年在美国进行了大规模临床试验，次年临床试验结果 证明疫苗具有良好的安全性和保护性，随后在美国开展了大规模接种 活动。另外一种减毒口服的脊髓灰质炎疫苗（OPV）由Sabin博士在 上世纪60年代开发成功，并迅速在世界范围内使用，为防治脊髓灰质 炎疫情贡献了坚实力量。
1988年世界卫生组织（WHO）启动了全球脊髓灰质炎消灭行动， 首先鼓励发展中国家在计划免疫中使用多价或单价的OPV，从而彻底 阻断自然界中野生脊髓灰质炎病毒在人群中的传染，随后使用灭活的 脊髓灰质炎疫苗逐步代替OPV，从而避免因服用减毒活疫苗带来的疫 苗衍生脊髓灰质炎病毒（VDPV）和脊髓灰质炎疫苗相关病例 （VADP）。此种灭活的脊髓灰质炎疫苗可分为两类：由野毒株制备的 灭活疫苗和由减毒株制备的灭活疫苗（sabin-IPV）。但是前者生产IPV 使用野毒株极大的限制了在发展中国家的推广使用，尤其是在消灭脊 髓灰质炎病毒后时代，WHO会更严格限制野毒株的使用，因此 sabin-IPV疫苗就成为代替OPV疫苗在发展中国家推广使用的一种新 产品。
甲肝疫苗和脊髓灰质炎疫苗同做为针对婴幼儿计划免疫的疫苗， 有广泛的受种人群，且接种群的年龄较相似。该两种疫苗均为多剂免 疫，受种人群需要多次接种，费时费力。因此，需要一种联合疫苗， 在不降低二者免疫效果的同时节省受种次数，节约时间和人力资源。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种含有 灭活甲肝抗原和灭活脊髓灰质炎病毒的多价免疫原性组合物。
为了实现本发明目的，本发明提供了一种多价免疫原性组合物， 所述多价免疫原性组合物包括灭活的甲肝抗原和灭活的脊髓灰质炎 病毒。
所述灭活的脊髓灰质炎病毒来自sabin株，包含sabin Ⅰ型、sabin Ⅱ型和sabinⅢ型。
所述免疫原性组合物含有灭活的甲肝抗原50-1000U单位/人份， sabin I型抗原1.5-20D单位/人份，sabin II型抗原2-40D单位/人份，sabin III型抗原5-70D单位/人份。
优选地，所述免疫原性组合物含有灭活的甲肝抗原100-600U单位 /人份，sabin I型抗原5-15D单位/人份，sabin II型抗原10-30D单位/人份， sabin III型抗原10-40D单位/人份。
进一步地，所述多价免疫原性组合物还可以含有纯化后的百日咳 抗原、白喉类毒素、破伤风类毒素、丝状血细胞凝集素、b型流感嗜 血杆菌多糖（hib）、脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖、乙肝抗原、肠道病毒 71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CA16）抗原的一种或两种以上。
上述抗原在多价免疫组合物中的抗原含量分别为：百日咳类毒 素：5-40ug/人份的；白喉类毒素：10-50lf/人份；破伤风类毒素：2.5-30lf/ 人份；丝状血细胞凝集素：5-40ug/人份；2.5-20ug/人份的菌毛抗原； b型流感嗜血杆菌：2.5-30ug/人份；乙肝抗原：5-40ug/人份；灭活EV71 抗原：300-1200U单位/人份；灭活CA16抗原：1000-8000U单位/人份。
优选地，所述多价免疫原性组合物还包含如下一种或多种抗原： 百日咳类毒素：20-35ug/人份；白喉类毒素：20-40lf/人份；破伤风类 毒素：8-20lf/人份；丝状血细胞凝集素：20-35ug/人份；5-15ug/人份 的菌毛抗原；b型流感嗜血杆菌：5-20ug/人份；乙肝抗原：15-30ug/ 人份；灭活EV71抗原：300-1000U单位/人份；灭活CA16抗原： 1000-6000U单位/人份。
所述多价免疫原性组合物还包含四种血清型的脑膜炎多糖抗原， 包括2.5-30ug/人份的A群脑膜炎多糖抗原，2.5-30ug/人份的C群脑 膜炎多糖抗原，2.5-30ug/人份的W群脑膜炎多糖抗原，2.5-30ug/人份 的Y群脑膜炎多糖抗原。
优选地，所述多价免疫原性组合物还包含四种血清型的脑膜炎多 糖抗原，包括5-20ug/人份的A群脑膜炎多糖抗原，5-20ug/人份的C 群脑膜炎多糖抗原，5-20ug/人份的W群脑膜炎多糖抗原，5-20ug/人 份的Y群脑膜炎多糖抗原。
进一步地，前述免疫原性组合物还可以包含生理可接受的载体， 包含可与b型流感嗜血杆菌多糖抗原缀合的生理可接受的载体蛋白， 如10-50ug/人份的破伤风类毒素载体，也可选自白喉类毒素、白喉 CRM197蛋白和脑膜炎外膜蛋白或任何已知的其它载体。该免疫原性 组合物还可能包含可与脑膜炎多糖抗原缀合的生理可接受的载体蛋 白，如30-200ug/人份的白喉类毒素载体，也可选自白喉类毒素，白喉 CRM197蛋白和脑膜炎外膜蛋白或任何已知的其它载体。
细菌多糖与载体蛋白的偶联方法使用公知技术，包括使用1-氰基 -4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐（CDAP）活化多糖抗原后与载体蛋白共 价连接，也包括使用还原胺化法处理多糖和载体蛋白的偶联，或者使 用溴化氰活化多糖后与载体蛋白偶联的方法。
进一步地，所述多价免疫原性组合物，其特征在于，所述多价免 疫原性组合物还可以包含佐剂。
优选地，所述佐剂为铝盐。
更为优选地，所述铝盐为磷酸铝或氢氧化铝，最优选为氢氧化铝。
进一步地，所述多价免疫原性组合物的剂型为喷雾剂、注射剂、 冻干剂、胶囊剂、片剂或丸剂。
本发明还提供了前述多价免疫原性组合物在制备预防或治疗甲 肝或脊髓灰质炎药物中的应用。
前述抗原的制备：
前述免疫原性组合物中甲肝抗原的制备方法是通过行业内成熟 的工艺技术制造的，包括甲肝病毒的培养、收获、纯化和灭活，其中 甲肝病毒培养的细胞基质可以选择人二倍体细胞如SV-1细胞或者传 代细胞如Vero细胞，培养方式可以选择细胞工厂或者生物反应器；甲 肝抗原的纯化可包括多级澄清过滤、浓缩和分子筛层析；甲肝抗原的 灭活使用甲醛，方法符合中国药典2010版相关要求和WHO对灭活甲 肝疫苗的指导原则中对灭活步骤的要求。
前述免疫原性组合物中脊灰抗原的制备方法是通过行业内成熟 的工艺技术制造的，包括三种血清型脊灰病毒的培养、收获、纯化和 灭活，其中脊灰病毒培养的细胞基质可以选择人二倍体细胞如2BS细 胞或者传代细胞如Vero细胞，培养方式可以选择细胞工厂或者生物反 应器；脊灰抗原的纯化可包括多级澄清过滤、浓缩、分子筛层析和离 子交换层析；脊灰抗原的灭活使用甲醛，方法符合WHO对灭活脊灰 疫苗指导原则中对灭活步骤的要求。
前述免疫原性组合物中肠道病毒抗原的制备针对EV71病毒和/或 者CA16病毒，通过对EV71或CA16病毒的培养、收获、灭活和纯化实 现，其中病毒培养的细胞基质可以选择人二倍体细胞如SV-1细胞或者 传代细胞如Vero细胞，培养方式可以选择细胞工厂或者生物反应器； 病毒抗原的灭活使用甲醛，方法参照灭活甲肝疫苗的相关要求。病毒 抗原的纯化可包括糖密度梯度离心、浓缩、酶切和分子筛层析。
前述免疫原性组合物中乙肝抗原的制备方法是通过行业内成熟 的工艺技术制造的，包括重组乙肝抗原的表达和纯化，其中重组乙肝 表达载体可以是汉逊酵母或者啤酒酵母，通过细菌发酵罐培养并表达 乙肝抗原；乙肝抗原的收获和纯化可包括研磨破菌、PEG沉淀、超滤 浓缩、分子筛层析、离子交换层析和离心脱盐。制备方法符合中国药 典2010版对乙肝抗原制备的相关要求。
前述免疫原性组合物中百日咳抗原的制备方法是通过行业内成 熟的工艺技术制造的，通过对百日咳菌的培养、收获和多组分纯化获 得，包括百日咳菌在发酵罐中的培养、针对百日咳类毒素、丝状红细 胞凝集素、百日咳外膜蛋白和百日咳菌毛的纯化。制备方法符合中国 药典2010版和WHO对百日咳抗原制备的相关要求。
前述免疫原性组合物中白喉抗原的制备方法是通过行业内成熟 的工艺技术制造的，通过对白喉菌的培养和纯化获得，包括白喉菌在 发酵罐中的培养、菌体经硫酸铵处理、三步层析、类毒素化处理和超 滤步骤纯化。制备方法符合中国药典2010版和WHO对白喉抗原制备 的相关要求。
前述免疫原性组合物中破伤风抗原的制备方法是通过行业内成 熟的工艺技术制造的，通过对破伤风菌的培养和纯化获得，包括破伤 风菌在发酵罐中的培养、菌体经硫酸铵处理、三步层析、类毒素化处 理和超滤步骤纯化。制备方法符合中国药典2010版和WHO对破伤风 抗原制备的相关要求。
前述免疫原性组合物中hib多糖蛋白缀合物的制备方法是通过行 业内成熟的工艺技术制造的，通过对hib菌的培养和纯化获得，包括 hib菌在发酵罐中的培养，对菌体进行福尔马林处理、离心浓缩和一 系列化学方法的处理获得纯化后的荚膜多糖，然后通过一种上述的生 理可接受载体蛋白，基于一种上述的多糖和载体蛋白的偶联方法获得 hib荚膜多糖结合物。制备方法符合中国药典2010版对hib抗原结合物 制备的相关要求。
前述免疫原性组合物中脑膜炎球菌A、C、W135和Y群抗原的制 备方法是通过行业内成熟的工艺技术制造的，通过分别对A、C、W135 和Y群的培养和纯化获得，包括脑膜炎球菌各血清型在发酵罐中的培 养、收获和甲醛灭活，对菌体进行去菌体、沉淀、解离、去核酸、沉 淀收集多糖、超滤膜过程去除杂蛋白和内毒素和沉淀收集多糖，然后 通过一种上述的生理可接受载体蛋白，基于一种上述的多糖和载体蛋 白的偶联方法获得多糖结合物。制备方法符合WHO对脑膜炎球菌抗 原结合物制备的相关要求。
多价免疫原性组合物的混合：将灭活的甲肝抗原原液和脊灰抗原 原液进行搅拌混合作为一种抗原混合物，将EV71抗原和/或CA16抗 原、乙肝抗原、多组分百日咳抗原、破伤风抗原、白喉抗原、hib抗 原和脑膜炎抗原按照不同价次需求与甲肝和脊灰抗原混合物进行搅 拌混合，并控制混合液的pH值在6-7之间。如果抗原混合物包含佐剂， 则把抗原与佐剂进行吸附后进行混合搅拌，并控制混合液的pH值在 6-7之间。
前述抗原的免疫原性：
评价多价抗原组合物的免疫原性通过动物体内实验进行。多价抗 原组合物中甲肝抗原的免疫原性通过恒河猴效价实验进行评价，同时 与灭活甲肝疫苗进行对比。选用体重在1.5～4.5kg的恒河猴按照7只每 组的规格进行肌肉注射免疫，其中5组为实验组，2组为对照组，免疫 后28天采血，采用ELISA法检测甲肝病毒抗体。此类效价实验按照中 国药典2010版要求进行。
多价抗原组合物中脊灰抗原的免疫原性通过大鼠效价实验进行 评价，同时与灭活脊灰单价疫苗进行对比。选用SD大鼠或者Wistar 大鼠按照10只每组的规格进行肌肉注射免疫，抗原混合物按照人用剂 量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原混合物。大鼠免疫后第3周加强 一次，免疫后第2周进行采血，用病毒回滴实验检测中和抗体效价。 此类中和实验按照中国药典2010版要求进行。
评价多价抗原组合物的免疫原性通过动物体内实验进行。多价抗 原组合物中EV71抗原和/或CA16抗原和脊灰抗原的免疫原性通过大 鼠效价实验进行评价，同时与灭活EV71疫苗和/或CA16疫苗和灭活脊 灰的单价疫苗进行对比。选用SD大鼠或者Wistar大鼠按照10只每组的 规格进行肌肉注射免疫，抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释， 共配成5组抗原混合物。大鼠免疫后第3周加强一次，免疫后第2周进 行采血，用病毒回滴实验检测中和抗体效价。此类中和实验按照中国 药典2010版要求进行。
多价抗原组合物中乙肝抗原的免疫原性通过BALB/c小鼠效价实 验进行评价，同时与单价重组乙肝疫苗进行对比。小鼠按照20只每组 的规格进行注射免疫，4-6周后采血，采用ELISA法测定乙肝抗体，计 算半数有效剂量ED50。ED50实验按照中国药典2010版要求进行。
多价抗原组合物中百日咳抗原的免疫原性通过BALB/c小鼠或者 NIH小鼠效价实验进行评价，同时与百白破联合疫苗进行对比。小鼠 按照20只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3 倍倍比稀释，共配成3组抗原混合物。小鼠免疫后14-16天进行百日咳 菌的攻毒实验，攻毒实验按照中国药典2010版要求进行。
多价抗原组合物中破伤风抗原的免疫原性通过BALB/c小鼠或者 NIH小鼠效价实验进行评价，同时与百白破联合疫苗进行对比。小鼠 按照20只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3 倍倍比稀释，共配成3组抗原混合物。小鼠免疫后4周进行破伤风毒素 的攻毒实验，攻毒实验按照中国药典2010版要求进行。
多价抗原组合物中白喉抗原的免疫原性通过250g～350g的豚鼠效 价实验进行评价，同时与百白破联合疫苗进行对比。豚鼠按照10只每 组的规格进行肌肉注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比 稀释，共配成3组抗原混合物。豚鼠免疫4周后进行白喉毒素的攻毒实 验，攻毒实验按照中国药典2010版要求进行。
多价抗原组合物中b型流感嗜血杆菌抗原的免疫原性通过 BALB/c小鼠或者NIH小鼠效价实验进行评价，同时与b型流感嗜血杆 菌结合疫苗进行对比。小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫。抗原 混合物按照每次2.5ug多糖的抗原混合物的注射量进行免疫。小鼠首 先进行0.85%氯化钠溶液注射，于第1、14天注射两次，与第21～28天 经眼眶静脉采血，用ELISA法测定hib的IgG抗体。效价实验按照中国 药典2010版要求进行。
多价抗原组合物中脑膜炎抗原的免疫原性通过BALB/c小鼠或者 NIH小鼠效价实验进行评价，同时与A、C、W135、Y群四价脑膜炎 结合疫苗进行对比。小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫。抗原混 合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原混合物。小鼠于 第1、14天注射两次，与第21～28天经眼眶静脉采血，用ELISA法测定 抗原各血清型的IgG抗体。同时选择SD怀孕大鼠按照相同分组原则进 行免疫，对乳鼠进行采血测定针对A群脑膜炎的IgG抗体。效价实验 按照WHO相关要求进行。
本发明将甲肝和脊髓灰质炎疫苗或同时还含其它疫苗结合起来， 以二联苗或更多联合疫苗的形式免疫受种人群，在不降低二者免疫效 果的同时节省受种次数，节约时间和人力资源。且本发明所述脊髓灰 质炎疫苗生产所用抗原为灭活的减毒株，和OPV相比能够避免毒株毒 力返祖的风险，对受种者和环境均具有很好的安全性。本发明所述联 合疫苗包含甲型肝炎和脊髓灰质炎疫苗，能够很好的预防由甲肝病毒 和脊髓灰质炎病毒引起的甲型肝炎和小儿麻痹症的发生。且本发明研 究表明，上述各抗原在免疫受种者后互相不干扰抗原性和免疫效果， 具有很好的免疫原性和安全性。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不 背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的 修改或替换，均属于本发明的范围。如下我们所采纳的实施例使用了 标准的技术，除非另有详细描述，为本领域技术人员众所周知且为常 规技术。实施例是例证性的，但并不限制本发明。
实施例1甲肝病毒的培养
甲肝病毒（TZ84株或者YN5株，来自北京科兴生物制品有限公 司），在10层细胞工厂2BS细胞中适应生长并连续传代，使用EMEM 培养基加10%新生牛血清（v/v），置37.5±1.0℃培养箱中培养5-7天 后，按照MOI0.05接种甲肝病毒，37.5±1.0℃下继续培养3-5天后收 获病毒液，经澄清过滤后用酶联免疫法检测病毒滴度值。甲肝病毒收 获液可在6-8LgCCID50/ml范围内。
实施例2甲肝抗原的纯化和灭活
将实施例1中描述的甲肝病毒收获液进行三级澄清过滤；将澄清 过滤后的料液进行超滤浓缩；然后将浓缩后的料液通过分子筛层析 柱，用0.1MPBS（pH7.2）缓冲液进行平衡，然后继续用0.1M PBS （pH7.2）洗脱，收集第1峰为病毒峰。将收集的病毒液通过0.22μm 过滤后用1:4000甲醛37℃灭活12-13天，最后经除菌过滤后获得疫 苗原液。
实施例3Sabin脊髓灰质炎病毒的培养
由美国ATCC提供的脊灰毒株sabin I型、sabin II型、sabin III 型，分别在10层细胞工厂Vero细胞中适应生长并连续传代，使用 MEM培养基加10%小牛血清（v/v），置37.5±1.0℃培养箱中培养3-5 天后换无血清M199培养基，按照MOI=0.01分别接sabin株I型、II 型和III型病毒，在32.5℃培养3-4天后收获病毒液，经澄清过滤后 用CCID50法检测病毒滴度值。以上三型脊灰病毒收获液可在 7-8LgCCID50/ml范围内。病毒收获液同时通过D抗原ELISA双抗夹 心检测法检测D抗原值。以上三型脊灰病毒收获液的D抗原含量在 20-120DU/ml范围内。
实施例4Sabin脊髓灰质炎病毒的纯化和灭活
将实施例3中描述的脊灰病毒收获液进行三级澄清过滤；将澄清 过滤后的料液进行两级超滤浓缩，第一级选用100KD聚醚砜类膜包 浓缩30-50倍，第二级选用100KD聚醚砜类膜包再浓缩5-10倍；然 后将浓缩后的料液通过分子筛层析柱，用0.08M PBS（pH7.0）缓冲 液进行平衡，然后继续用0.08M PBS（pH7.0）洗脱，收集第1峰为 病毒峰。将收集的病毒液加到用0.08M PBS（pH7.0）平衡好的装有 DEAE Sepharose Fast Flow的层析柱中，用0.08M PBS（pH7.0）洗脱， 收集第1洗脱峰为病毒峰。该病毒收集液通过0.22μm过滤后用 1:4000甲醛37℃灭活12-13天，最后经除菌过滤后获得抗原原液。
实施例5EV71病毒的培养
将EV71病毒株（保藏号为CGMCC No.3544），在10层细胞工 厂Vero细胞中适应生长并连续传代，使用MEM培养基加10%（v/v） 小牛血清，置37±1℃培养箱中培养5-7天后换MEM培养基加2%小 牛血清（v/v），按照MOI=0.001接种EV71病毒，于33±1℃培养15 天，每天观察细胞病变，当细胞病变达50%以上时，收获病毒液，经 澄清过滤后用CCID50法检测病毒滴度值。EV71病毒收获液可在 6-8LgCCID50/ml范围内。
实施例6EV71病毒的纯化和灭活
将实施例6中描述的EV71病毒收获液中加入甲醛溶液 （1:1000-1:10000）（v/v），使游离甲醛终浓度为100～200μg/ml，置36.5 ℃±1℃灭活13天，制得病毒灭活液。将灭活液在30000rpm的蔗糖密 度梯度离心6-12小时，收集病毒所在区带，经膜包超滤脱糖。随后 经分子筛层析，用0.01M PBS（pH7.0）缓冲液进行平衡，然后继续 用0.01M PBS（pH7.0）洗脱，收集病毒峰，最后经除菌过滤后获得 疫苗原液。
实施例7CA16病毒的培养
一株CA16病毒株，（保藏号为CGMCC No.5371），在10层细胞 工厂Vero细胞中适应生长并连续传代，使用MEM培养基加10%小 牛血清，置37±1℃培养箱中培养5-7天后换MEM培养基加2%小牛 血清，按照MOI=0.001接种CA16病毒，并在37±1℃培养箱中继续 培养，每天观察细胞病变，当细胞病变达50%以上时，收获病毒液， 经澄清过滤后用CCID50法检测病毒滴度值。CA16病毒收获液可在 6-8LgCCID50/ml范围内。
实施例8CA16抗原的纯化和灭活
从实施例7中获得的CA16病毒收获液加入1:1000-1:10000（v/v） 的甲醛溶液，使游离甲醛终浓度为100～200μg/ml，置36.5℃±1℃灭 活13天，制得病毒灭活液。将灭活液进行离心澄清处理后超滤浓缩 10-50倍。浓缩后料液加入PEG并使其终浓度达到5-15%，pH值在 5-7之间，混合后进行搅拌10-60分钟，然后于2-8℃沉淀8-24小时 后再离心7500-10000rpm约20-60分钟。将沉淀物用PBS缓冲液重溶 后获得溶液，再经蔗糖密度梯度离心并收集病毒区带后，再超滤脱糖 获得病毒液，然后上分子筛层析获得病毒层析液，最后经除菌过滤后 获得疫苗原液。
实施例9乙肝抗原的制备
采用培养汉逊酵母，购自ATCC No.26012，制备重组乙肝抗原 的方法，在摇瓶和细菌发酵罐中两级培养汉逊酵母后进行收获破菌， 可采用玻璃珠研磨法进行两次研磨破碎，然后进行PEG沉淀和超滤 浓缩，将浓缩液进行层析纯化，结合分子筛Sepharose CL-4B层析柱 和离子交换DEAE层析住进行，然后对纯化液进行氯化铯梯度离心处 理和脱盐处理获得纯化后的乙肝抗原，最后经除菌过滤后获得疫苗原 液。
实施例10百日咳菌的培养和抗原的制备
按照中国专利申请号为200780036247的公开专利中对百日咳菌 培养和抗原制备方法的描述，包括对百日咳菌的培养，对培养液进行 浓缩和离心分离，取上清液，再通过在上清液中加入缓冲液并进行两 步层析收集百日咳毒素液（PT）。该实施例还包括此专利对纤维状红 细胞凝集素的制备方法的描述，包括将百日咳菌体进行溶解，进行离 心分离后获取上清液，再通过在上清液中加入乙酸钙溶液并过滤收集 含丝状红细胞凝集素的液体（FHA），然后对滤液进行硫酸铵浓缩处 理，并进行密度梯度离心，收集含有目标抗原的部分。该实施例还包 括此专利对外膜蛋白的制备方法的描述，包括对从含纤维状红细胞凝 集素的液体中重新分离的菌体进行溶解、离心、取上清、加入缓冲液 过滤、层析纯化分离和过滤步骤处理。获得纯化后的外膜蛋白。该实 施例还包括此专利对菌毛制备方法的描述，包括将收集含外膜蛋白的 液体加入盐和缓冲液，过滤后得到含菌毛的滤液，再通过硫酸铵浓缩 后进行密度梯度离心获得纯化后的菌毛。
实施例11白喉菌的培养和类毒素的制备
按照中国专利申请号为200780036247的公开专利中对白喉菌培 养和类毒素制备方法的描述，包括对白喉菌的培养，对培养液进行硫 酸铵处理，取上清液进行过滤并进行三步层析纯化，包括苯基疏水层 析、DEAE离子交换层析和凝胶过滤层次方法，收集层析液获得纯化 毒素液，然后对毒素液进行类毒素化处理，包括加入定量的赖氨酸盐 酸盐，福尔马林并加热，最后用超滤法去除多余的福尔马林和赖氨酸 盐酸盐，获得类毒素液。
实施例12破伤风菌的培养和类毒素的制备
按照中国专利申请号为200780036247的公开专利中对破伤风培 养和类毒素制备方法的描述，包括对破伤风的培养，对培养液进行硫 酸铵处理，取上清液进行过滤并进行三步层析纯化，包括苯基疏水层 析、DEAE离子交换层析和凝胶过滤层次方法，收集层析液获得纯化 毒素液，然后对毒素液进行类毒素化处理，包括加入定量的福尔马林 等并加热处理，最后用超滤法去除多余的福尔马林，获得类毒素液。
实施例13流感嗜血杆菌的培养和多糖纯化
按照中国专利申请号为200810125160的公开专利中对b型流感 嗜血杆菌培养方法的描述，包括2次在固体培养基上的预培养和1次 液体培养基的预培养，然后在发酵罐中培养并收获。按照该专利中对 b型流感嗜血杆菌多糖纯化方法的描述，包括将收获液进行福尔马林 处理、离心收集抗原上清液并浓缩，随后进行一系列化学方法的处理， 获得纯化的b型流感嗜血杆菌多糖。
实施例14流感嗜血杆菌结合物的制备
按照中国专利申请号为200680023334.4的公开专利中对b型流 感嗜血杆菌和破伤风类毒素的共价结合方法的描述，包括加入溴化氢 对多糖进行活化处理，以及一系列化学方法将多糖和破伤风类毒素进 行偶联形成缀合物，再对缀合物进行层析纯化，获得流感嗜血杆菌结 合疫苗原液。
实施例15脑膜炎奈瑟菌的培养和多糖纯化
按照中国专利申请号为201110245718的公开专利中对脑膜炎球 菌A、C、W和Y135群培养方法的描述，包括细菌在传代培养、发 酵罐培养、收获和甲醛灭活。脑膜炎球菌纯化方法包括该专利中公开 的去菌体、沉淀、解离、去核酸、沉淀收集多糖、超滤膜过程去除杂 蛋白和内毒素、沉淀收集多糖。
实施例16脑膜炎奈瑟菌结合物的制备
按照中国专利申请号为200310119414的公开专利和A群和C群 脑膜炎多糖结合疫苗的WHO指导文件中对脑膜炎球菌结合物制备方 法的描述，包括将A群、C群、W群和Y群血清型的脑膜炎多糖分 别与溴化氰混合进行活化，加入已二酰肼，透析、加入等量白喉类毒 素、加入碳二亚胺、超滤浓缩、层析纯化、除菌过滤等步骤，获得各 型脑膜炎多糖蛋白缀合物。
实施例17甲肝和脊灰组合物的制备
将实施例2中制得的甲肝抗原原液与实施例4中制得的脊灰抗原 原液按一定浓度搅拌混合，获得联合疫苗组合物，确定pH值在6-7 的范围内。组合物抗原含量见表1：
实施例18含佐剂的甲肝和脊灰组合物的制备
将实施例2中所述的甲肝抗原原液和实施例4中所述的脊灰抗原 原液分别与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸 附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品，然后将含有佐剂的甲肝 抗原和脊灰抗原等体积混合搅拌，获得含铝佐剂的疫苗，确定pH值 在6-7的范围内。组合物抗原含量见表1：
表1甲肝和脊灰组合物抗原含量
实施例19甲肝、脊灰、EV71和/或CA16组合物的制备
将实施例2中制得的甲肝抗原原液、实施例4中制得的脊灰抗原 原液和实施例6中制得的EV71抗原原液和/或实施例8中制得的 CA16抗原原液按一定浓度搅拌混合，获得联合疫苗组合物，确定pH 值在6-7的范围内。含EV71抗原的组合物的抗原含量见表2，含CA16 抗原的组合物的抗原含量如表3所示。
实施例20含佐剂的甲肝、脊灰、EV71和/或CA16组合物的制备
将实施例2中所述的甲肝抗原原液、实施例4中的脊灰抗原原液 和实施例6中所述的EV71抗原原液和/或实施例8中所述的CA16抗 原原液分别与1.2mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌 吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品，然后将上述含佐剂的 抗原等体积混合搅拌，获得含铝佐剂的联合疫苗，确定pH值在6-7 的范围内。含EV71抗原的组合物的抗原含量见表2，含CA16抗原 的组合物的抗原含量如表3所示。
表2含EV71、脊灰、甲肝的联合疫苗中各抗原含量
表3含CA16、脊灰、甲肝的联合疫苗中各抗原含量
实施例21甲肝、脊灰、乙肝组合物的制备
将实施例2中制得的甲肝抗原原液、实施例4中制得的脊灰抗原 原液和实施例9中制得的乙肝抗原原液按一定浓度搅拌混合，获得多 价联合疫苗组合物，确定pH值在6-7的范围内。联合疫苗组合物中 各抗原含量见表4。
实施例22含佐剂的甲肝、脊灰、乙肝组合物的制备
将实施例2中所述的甲肝抗原原液、实施例4中所述的脊灰抗原 原液和实施例9中所述的乙肝抗原原液分别与1mg/ml的氢氧化铝溶 液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原 半成品，然后将上述含佐剂的抗原等体积混合搅拌，获得含铝佐剂的 联合疫苗组合物，确定pH值在6-7的范围内。联合疫苗组合物中各 抗原含量见表4。
表4甲肝、脊灰、乙肝组合物中抗原含量
实施例23甲肝、脊灰、百白破组合物的制备
将实施例10、11、12中制得的无细胞百日咳、白喉和破伤风抗 原混合制成百白破组分I；将实施例2中制得的甲肝抗原原液与实施 例4中制得的脊灰抗原原液按一定浓度搅拌混合制成组分II，再将组 分I和组分II混合成联合疫苗组合物，确定pH值在6-7的范围内。 联合疫苗组合物中各抗原含量见表5。
实施例24含佐剂的甲肝、脊灰、百白破组合物的制备
将实施例23中所述的组分I与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积 均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品； 将实施例2中所述的甲肝抗原原液和实施例4中所述脊灰抗原原液分 别与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5 分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品，然后将含佐剂的甲肝抗原和脊灰 抗原等体积混合，该混合液与含佐剂的组分I搅拌混合，获得含铝佐 剂的联合疫苗组合物，确定pH值在6-7的范围内。联合疫苗组合物 中各抗原含量见表5。
表5含甲肝、脊灰、百白破的多价联合疫苗组合物抗原含量
实施例25甲肝、脊灰、hib组合物的制备
将实施例14中制得的b型流感嗜血杆菌结合物抗原作为组分I； 将实施例2中制得的甲肝抗原原液与实施例4中制得的脊灰抗原原液 按一定浓度搅拌混合制成组分II，再将组分I和组分II混合成联合疫 苗组合物，确定pH值在6-7的范围内。联合疫苗组合物中各抗原含 量见表6。
实施例26含佐剂的甲肝、脊灰、hib的组合物制备
将实施例25中所述的组分I与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积 均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品； 将实施例2中所述的甲肝抗原原液和实施例4中所述的脊灰抗原原液 分别与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附 20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品，然后将含佐剂的甲肝抗原 和含佐剂的脊灰抗原等体积混合，该混合液与组分I搅拌混合，获得 含铝佐剂的联合疫苗组合物，确定pH值在6-7的范围内。联合疫苗 组合物中各抗原含量见表6。
表6含甲肝、脊灰、hib结合物的联合疫苗组合物抗原含量
实施例27甲肝、脊灰、四价脑膜炎抗原组合物的制备
将实施例16中制得的四价脑膜炎抗原（A、C、W135、Y）多糖 蛋白缀合物混合作为组分I；将实施例2中制得的甲肝抗原原液与实 施例4中制得的脊灰抗原原液按一定浓度搅拌混合制成组分II，再将 组分I和组分II混合成联合疫苗组合物，确定pH值在6-7的范围内。 联合疫苗组合物中各抗原含量见表7。
实施例28含佐剂的甲肝、脊灰、四价脑膜炎抗原组合物的制备
将实施例27中所述的组分I与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积 均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品； 将实施例2中所述的甲肝抗原原液和实施例4中所述的脊灰抗原原液 分别与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附 20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品，然后将含佐剂的甲肝抗原 和含佐剂的脊灰抗原等体积混合，该混合液与组分I搅拌混合，获得 含铝佐剂的甲肝、脊灰、四价脑膜炎抗原组合物，确定pH值在6-7 的范围内。联合疫苗组合物中各抗原含量见表7。
表7含甲肝、脊灰、四价脑膜炎的疫苗组合物的抗原含量
实施例29甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib组合 物的制备
将实施例10、11、12中制得的无细胞百日咳、白喉和破伤风抗 原混合制成百白破组分I；将实施例2中制得的甲肝抗原原液与实施 例4中制得的脊灰抗原原液与实施例6中制得的EV71抗原原液或实 施例8中制得的CA16抗原原液与实施例9中制得的乙肝抗原原液按 一定浓度搅拌混合制成组分II；将实施例14中制得的hib多糖结合 疫苗原液作为组分III，再将组分I、组分II和组分III混合成含甲肝、 脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib的疫苗组合物，确定 pH值在6-7的范围内。含EV71抗原的组合物中各抗原含量见表8， 含CA16抗原的组合物的抗原含量如表9所示。
实施例30含佐剂的甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、 hib组合物的制备
将实施例29中所述的组分I和组分III分别与0.5mg/ml的氢氧 化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂 的抗原半成品；将实施例2、4中所述的甲肝抗原原液和脊灰抗原原 液和实施例6中所述的EV71抗原原液和/或实施例8中所述CA16抗 原原液和实施例9中所述的乙肝抗原原液分别与0.5mg/ml的氢氧化 铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的 抗原半成品，然后将含佐剂的甲肝抗原、脊灰抗原、EV71抗原和/ 或CA16抗原和乙肝抗原等体积混合，该混合液与组分I和组分III 搅拌混合，获得含佐剂的甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百 白破、hib组合物，确定pH值在6-7的范围内。含EV71抗原的组合 物中各抗原含量见表8，含CA16抗原的组合物的抗原含量如表9所 示。
表8含甲肝、脊灰、EV71、乙肝、百白破、hib的疫苗组合物
表9含甲肝、脊灰、CA16、乙肝、百白破、hib的疫苗组合物
实施例31甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib、四 价脑膜炎抗原组合物的制备
将实施例10、11、12中制得的无细胞百日咳、白喉、破伤风抗 原混合制成百白破组分I；将实施例2中制得的甲肝抗原原液与实施 例4中制得的脊灰抗原原液与实施例6中制得的EV71抗原原液或实 施例8中制得的CA16抗原原液和实施例9中制得的乙肝抗原原液按 一定浓度搅拌混合制成组分II；将实施例14中制得的hib多糖结合 物原液作为组分III；将实施例16中制得的四价脑膜炎抗原多糖结合 物原液作为组分IV，再将组分I、组分II、组分III和组分IV混合成 含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎 抗原的联合疫苗组合物，确定pH值在6-7的范围内。含甲肝、脊灰、 EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎抗原的联合疫苗 组合物中各抗原含量见表10、11和12。
实施例32含佐剂的甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、 hib、四价脑膜炎抗原组合物的制备
将实施例31中所述的组分I、组分III和组分IV分别与0.5mg/ml 的磷酸铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝 佐剂的抗原半成品；将实施例2中所述的甲肝抗原原液、实施例4中 所述的脊灰抗原原液、实施例6中所述的EV71抗原原液或实施例8 中所述的CA16抗原原液和实施例9中所述的乙肝抗原原液分别与 0.5mg/ml的磷酸铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟， 制成含铝佐剂的抗原半成品，然后将上述含佐剂的甲肝抗原、脊灰抗 原、EV71抗原和/或CA16抗原和乙肝抗原等体积混合，该混合液与 组分I、组分III和组分IV搅拌混合，获得含铝佐剂的甲肝、脊灰、 EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎抗原联合疫苗组 合物，确定pH值在6-7的范围内。含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、 乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎抗原的联合疫苗组合物中各抗原含 量见表10、11和12。
表10含甲肝、脊灰、EV71、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎抗原的 组合物中各抗原含量
含CA16抗原的联合疫苗抗原含量见表11：
表11含甲肝、脊灰、CA16、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎抗原的 组合物中各抗原含量
表12含脊灰、甲肝、EV71、CA16、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎的联 合疫苗中各抗原含量
实施例33甲肝、脊灰组合物的免疫原性
通过对恒河猴免疫含甲肝和脊灰抗原的联合疫苗或者含结合了 佐剂的甲肝和脊灰抗原的联合疫苗来评估该抗原混合物中甲肝抗原 的免疫原性。选用恒河猴进行效价实验，同时与灭活甲肝疫苗进行对 比。选用体重在1.5～4.5kg的恒河猴按照7只每组的规格进行肌肉注 射免疫，其中5组为实验组，2组为对照组，免疫后28天采血，采 用ELISA法检测甲肝病毒抗体。结果显示各组恒河猴血清均有对甲 肝病毒的抗体效价，说明该混合物在恒河猴上具有良好的免疫原性， 同时显示该抗原混合物的免疫原性和灭活甲肝疫苗的免疫原性相当。
通过对SD大鼠免疫含甲肝和脊灰抗原的联合疫苗组合物或者含 结合了抗原佐剂的甲肝和脊灰抗原组合物来评估该抗原混合物中脊 灰抗原的免疫原性。大鼠按照10只每组的规格进行注射免疫。抗原 混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原混合物。选 择灭活脊灰疫苗作为对照组，大鼠免疫后第3周加强一次，免疫后第 2周进行采血，用病毒回滴实验检测中和抗体效价，采用ELISA法检 测血清阳转率。中和用病毒选用Sabin I、II和III型，各型的滴度为 100CCID50。阳性对照细胞选择Vero细胞。中和试验在36°C进行7 天，并观察细胞病变。结果显示各组大鼠血清均有对sabin I、II和III 型病毒的中和作用和血清阳转，说明该混合物在大鼠上具有良好的免 疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中灭活脊灰疫苗 的免疫原性相当。
实施例34甲肝、脊灰、EV71和/或CA16组合物的免疫原性
通过对恒河猴免疫含甲肝抗原、脊灰抗原、EV71和/或CA16抗 原的联合疫苗组合物或者含结合了佐剂的甲肝、脊灰抗原、EV71和/ 或CA16抗原的组合物来评估该抗原混合物中甲肝抗原的免疫原性。 选用恒河猴进行效价实验，同时与灭活甲肝疫苗进行对比。选用体重 在1.5～4.5kg的恒河猴按照7只每组的规格进行肌肉注射免疫，其中 5组为实验组，2组为对照组，免疫后28天采血，采用ELISA法检 测甲肝病毒抗体。结果显示各组恒河猴血清均有对甲肝病毒的抗体效 价和血清阳转，说明该混合物在恒河猴上具有良好的免疫原性，同时 显示该抗原混合物的免疫原性和灭活甲肝疫苗的免疫原性相当。
通过对SD大鼠免疫含甲肝、脊灰抗原、EV71和/或CA16抗原 的联合疫苗组合物或者含结合了佐剂的甲肝抗原、脊灰抗原、EV71 和/或CA16抗原的组合物来评估该抗原混合物中脊灰抗原、EV71抗 原和/或者CA16抗原的免疫原性。大鼠按照10只每组的规格进行注 射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗 原混合物。选择灭活脊灰疫苗、灭活EV71疫苗或灭活CA16疫苗作 为对照组，大鼠免疫后第3周加强一次，免疫后第2周进行采血，用 病毒回滴实验检测中和抗体效价和血清阳转。中和用病毒选用Sabin I、II和III型、EV71和CA16病毒株，各型的滴度为100CCID50。 阳性对照细胞选择Vero细胞。中和试验在36oC进行7天，并观察细 胞病变。结果显示各组大鼠血清均有对sabin I、II和III型病毒、EV71 病毒、CA16病毒的中和作用和血清阳转，说明该混合物在大鼠上具 有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中的 灭活脊灰疫苗、EV71疫苗和/或CA16疫苗的免疫原性相当。
实施例35甲肝、脊灰、乙肝组合物的免疫原性
通过对恒河猴免疫含甲肝、脊灰、乙肝抗原的联合疫苗组合物或 者含甲肝、脊灰、乙肝抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估该抗原混 合物中甲肝抗原的免疫原性。选用恒河猴进行效价实验，同时与灭活 甲肝疫苗进行对比。选用体重在1.5～4.5kg的恒河猴按照7只每组的 规格进行肌肉注射免疫，其中5组为实验组，2组为对照组，免疫后 28天采血，采用ELISA法检测甲肝病毒抗体。结果显示各组恒河猴 血清均有对甲肝病毒的抗体效价和血清阳转，说明该混合物在恒河猴 上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和灭活甲 肝疫苗的免疫原性相当。
通过对SD大鼠免疫含甲肝、脊灰和乙肝抗原的组合物或者含甲 肝、脊灰和乙肝抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中 脊灰的免疫原性。大鼠按照10只每组的规格进行注射免疫。抗原混 合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原混合物。选择 灭活脊灰疫苗作为对照组，大鼠免疫后第3周加强一次，免疫后第2 周进行采血，用病毒回滴实验检测中和抗体效价和血清阳转。中和用 病毒选用、Sabin I、II和III型，各型的滴度为100CCID50。阳性对 照细胞选择Vero细胞。中和试验在36°C进行7天，并观察细胞病变。 结果显示各组大鼠血清均有对sabin I、II和III型病毒的中和作用和 血清阳转，说明该抗原混合物在大鼠上具有良好的免疫原性，同时显 示该抗原混合物的免疫原性和对照组中灭活的脊灰疫苗的免疫原性 相当。
通过对BALB/c小鼠免疫含甲肝、脊灰和乙肝抗原的联合疫苗组 合物或者含甲肝、脊灰和乙肝抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对 抗原混合物中乙肝的免疫原性。选择重组乙肝疫苗作为对照组，小鼠 按照20只每组的规格进行注射免疫，4-6周后采血，采用ELISA法 测定乙肝抗体，计算半数有效剂量ED50。结果显示该抗原混合物符 合中国药典上对重组乙肝疫苗效价的相关规定，同时显示该抗原混合 物的免疫原性和对照组中重组乙肝疫苗的免疫原性相当。
实施例36甲肝、脊灰、百白破组合物的免疫原性
通过对恒河猴免疫含甲肝、脊灰、百白破抗原的联合疫苗组合物 或者含甲肝、脊灰、百白破抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估该抗 原混合物中甲肝抗原的免疫原性。选用恒河猴进行效价实验，同时与 灭活甲肝疫苗进行对比。选用体重在1.5～4.5kg的恒河猴按照7只每 组的规格进行肌肉注射免疫，其中5组为实验组，2组为对照组，免 疫后28天采血，采用ELISA法检测甲肝病毒抗体。结果显示各组恒 河猴血清均有对甲肝病毒的抗体效价和血清阳转，说明该混合物在恒 河猴上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和灭 活甲肝疫苗的免疫原性相当。
通过对SD大鼠免疫含甲肝、脊灰和百白破抗原的组合物或者含 甲肝、脊灰和百白破抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合 物中脊灰的免疫原性。大鼠按照10只每组的规格进行注射免疫。抗 原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原混合物。 选择灭活脊灰疫苗作为对照组，大鼠免疫后第3周加强一次，免疫后 第2周进行采血，用病毒回滴实验检测中和抗体效价和血清阳转。中 和用病毒选用Sabin I、II和III型，各型的滴度为100CCID50。阳性 对照细胞选择Vero细胞。中和试验在36°C进行7天，并观察细胞病 变。结果显示各组大鼠血清均有对sabin I、II和III型病毒的中和作 用和血清阳转，说明该抗原混合物在大鼠上具有良好的免疫原性，同 时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中灭活脊灰疫苗的免疫原 性相当。
通过对NIH小鼠免疫含甲肝、脊灰和百白破抗原的联合疫苗组 合物或者含甲肝、脊灰和百白破抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估 对抗原混合物中破伤风和百日咳菌的免疫原性。选择百白破联合疫苗 作为对照组，小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物 按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成3组抗原混合物。小鼠免疫 后14-16天进行百日咳菌的攻毒实验，结果显示该抗原混合物符合中 国药典上对百日咳菌效价的相关规定。小鼠免疫后4周进行破伤风毒 素的攻毒实验，结果显示该抗原混合物符合中国药典上对破伤风疫苗 效价的相关规定，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中百白 破联合疫苗中破伤风和百日咳抗原的免疫原性相当。
通过对250g～350g的豚鼠免疫含甲肝、脊灰和百白破抗原的五价 抗原混合物或者含甲肝、脊灰和百白破抗原和氢氧化铝佐剂的五价抗 原混合物来评估对抗原混合物中白喉菌的免疫原性。选择百白破联合 疫苗作为对照组，豚鼠按照10只每组的规格进行注射免疫。抗原混 合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成3组抗原混合物。豚鼠 免疫4周后进行白喉毒素的攻毒实验，结果显示该抗原混合物符合中 国药典上对白喉疫苗效价的相关规定，同时显示该抗原混合物的免疫 原性和对照组中百白破联合疫苗中白喉抗原的免疫原性相当。
实施例37甲肝、脊灰、hib组合物的免疫原性
通过对恒河猴免疫含甲肝、脊灰、hib结合物抗原的组合物或者 含甲肝、脊灰、hib结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估该抗 原混合物中甲肝抗原的免疫原性。选用恒河猴进行效价实验，同时与 灭活甲肝疫苗进行对比。选用体重在1.5～4.5kg的恒河猴按照7只每 组的规格进行肌肉注射免疫，其中5组为实验组，2组为对照组，免 疫后28天采血，采用ELISA法检测甲肝病毒抗体。结果显示各组恒 河猴血清均有对甲肝病毒的抗体效价和血清阳转，说明该混合物在恒 河猴上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和灭 活甲肝疫苗的免疫原性相当。
通过对SD大鼠免疫含甲肝、脊灰和hib结合物抗原的组合物或 者含甲肝、脊灰和hib结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对 抗原混合物中脊灰的免疫原性。大鼠按照10只每组的规格进行注射 免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原 混合物。选择灭活脊灰疫苗作为对照组，大鼠免疫后第3周加强一次， 免疫后第2周进行采血，用病毒回滴实验检测中和抗体效价和血清阳 转。中和用病毒选用Sabin I、II和III型，各型的滴度为100CCID50。 阳性对照细胞选择Vero细胞。中和试验在36°C进行7天，并观察细 胞病变。结果显示各组大鼠血清均有对sabin I、II和III型病毒的中 和作用和血清阳转，说明该抗原混合物在大鼠上具有良好的免疫原 性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中灭活脊灰疫苗的免 疫原性相当。
通过对NIH小鼠免疫含甲肝、脊灰和hib结合物抗原的联合疫苗 组合物或者含甲肝、脊灰和hib结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物 来评估对抗原混合物中b型流感嗜血杆菌的免疫原性。选择hib结合 疫苗作为对照组，小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫（含10只 对照/每组）。抗原混合物按照每次2.5ug多糖的抗原混合物的注射量 进行免疫。小鼠首先进行0.85%氯化钠溶液注射，于第1、14天注射 两次，与第21～28天经眼眶静脉采血，用ELISA法测定hib的IgG 抗体。结果显示该抗原混合物符合中国药典上对hib效价的相关规定， 同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组hib结合疫苗的免疫原性 相当。
实施例38甲肝、脊灰、脑膜炎抗原组合物的免疫原性
通过对恒河猴免疫含甲肝、脊灰、脑膜炎结合物抗原的联合疫苗 组合物或者含甲肝、脊灰、脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合 物来评估该抗原混合物中甲肝抗原的免疫原性。选用恒河猴进行效价 实验，同时与灭活甲肝疫苗进行对比。选用体重在1.5～4.5kg的恒河 猴按照7只每组的规格进行肌肉注射免疫，其中5组为实验组，2组 为对照组，免疫后28天采血，采用ELISA法检测甲肝病毒抗体。结 果显示各组恒河猴血清均有对甲肝病毒的抗体效价，说明该混合物在 恒河猴上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和 灭活甲肝疫苗的免疫原性相当。
通过对SD大鼠免疫含甲肝、脊灰和脑膜炎结合物抗原的组合物 或者含甲肝、脊灰和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评 估对抗原混合物中脊灰的免疫原性。选择灭活脊灰疫苗作为对照组， 大鼠按照10只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量 进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原混合物。大鼠免疫后第3周加强 一次，免疫后第2周进行采血，用病毒回滴实验检测中和抗体效价和 血清阳转。中和用病毒选用Sabin I、II和III型，各型的滴度为 100CCID50。阳性对照细胞选择Vero细胞。中和试验在36°C进行7 天，并观察细胞病变。结果显示各组大鼠血清均有对sabin I、II和III 型病毒的中和作用和血清阳转，说明该抗原混合物在大鼠上具有良好 的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中灭活脊灰 疫苗的免疫原性相当。
通过对NIH小鼠免疫含甲肝、脊灰和脑膜炎结合物抗原的组合 物或者含甲肝、脊灰和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来 评估对抗原混合物中脑膜炎抗原的免疫原性。选择四价脑膜炎结合疫 苗作为对照组，小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫（含10只对 照/每组）。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组 抗原混合物。小鼠于第1、14天注射两次，与第21～28天经眼眶静脉 采血，用ELISA法测定脑膜炎各血清型的IgG抗体。结果显示该抗 原混合物符合WHO相关指导文件对各血清型脑膜炎抗原临床前免疫 原性的相关规定。此外，选择SD怀孕大鼠按照相同分组原则进行免 疫，对乳鼠进行采血测定针对A群脑膜炎的IgG抗体，结果显示该 抗原混合物中A群脑膜炎抗原据有良好的免疫原性，同时显示该抗 原混合物的免疫原性和对照组中四价脑膜炎结合疫苗相应血清型的 免疫原性相当。
实施例39甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破和hib组合 物的免疫原性
通过对恒河猴免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百 白破、hib结合物、脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者含甲肝、 脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物、脑膜炎结合物 抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估该抗原混合物中甲肝抗原的免 疫原性。选用恒河猴进行效价实验，同时与灭活甲肝疫苗进行对比。 选用体重在1.5～4.5kg的恒河猴按照7只每组的规格进行肌肉注射免 疫，其中5组为实验组，2组为对照组，免疫后28天采血，采用ELISA 法检测甲肝病毒抗体。结果显示各组恒河猴血清均有对甲肝病毒的抗 体效价，说明该混合物在恒河猴上具有良好的免疫原性，同时显示该 抗原混合物的免疫原性和灭活甲肝疫苗的免疫原性相当。
通过对SD大鼠免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、 百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者含甲 肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结 合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中脊灰和 EV71抗原和/或者CA16抗原的免疫原性。选择灭活脊灰疫苗和灭活 EV71疫苗和/或灭活CA16疫苗作为对照组，大鼠按照10只每组的 规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共 配成5组抗原混合物。大鼠免疫后第3周加强一次，免疫后第2周进 行采血，用病毒回滴实验检测中和抗体效价。中和用病毒选用Sabin I、 II和III型、EV71病毒株或CA16病毒株，各型的滴度为100CCID50。 阳性对照细胞选择Vero细胞。中和试验在36°C进行7天，并观察细 胞病变。结果显示各组大鼠血清均有对sabin I、II和III型病毒、EV71 病毒、CA16病毒的中和作用，说明该抗原混合物在大鼠上具有良好 的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中的灭活脊 灰疫苗、EV71疫苗、CA16疫苗的免疫原性相当。
通过对BALB/c小鼠免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙 肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者 含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜 炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中乙肝 的免疫原性。选择重组乙肝疫苗作为对照组，小鼠按照20只每组的 规格进行注射免疫，4-6周后采血，采用ELISA法测定乙肝抗体，计 算半数有效剂量ED50。结果显示该抗原混合物符合中国药典上对重 组乙肝疫苗效价的相关规定。同时显示该抗原混合物的免疫原性和对 照组中重组乙肝疫苗的免疫原性相当。
通过对NIH小鼠免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、 百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者含甲 肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结 合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中破伤风和 百日咳菌的免疫原性。选择百白破联合疫苗作为对照组，小鼠按照 20只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍 倍比稀释，共配成3组抗原混合物。小鼠免疫后14-16天进行百日咳 菌的攻毒实验，结果显示该联合抗原混合物符合中国药典上对百日咳 菌效价的相关规定。小鼠免疫后4周进行破伤风毒素的攻毒实验，结 果显示该抗原混合物符合中国药典上对破伤风疫苗效价的相关规定， 同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中百白破联合疫苗中破 伤风和百日咳抗原的免疫原性相当。
通过对250g～350g的豚鼠免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、 乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的组合物或者含甲肝、 脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物 抗原和氢氧化铝佐剂的混合物来评估对抗原混合物中白喉菌的免疫 原性。选择百白破联合疫苗作为对照组，豚鼠按照10只每组的规格 进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成 3组抗原混合物。豚鼠免疫4周后进行白喉毒素的攻毒实验，结果显 示该抗原混合物符合中国药典上对白喉疫苗效价的相关规定，同时显 示该抗原混合物的免疫原性和对照组中百白破联合疫苗中白喉抗原 的免疫原性相当。
通过对NIH小鼠免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、 百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者含甲 肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结 合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中b型流感 嗜血杆菌的免疫原性。选择hib结合疫苗作为对照组，小鼠按照20 只每组的规格进行注射免疫（含10只对照/每组）。抗原混合物按照 每次2.5ug多糖的抗原混合物的注射量进行免疫。小鼠首先进行 0.85%氯化钠溶液注射，于第1、14天注射两次，与第21～28天经眼 眶静脉采血，用ELISA法测定hib的IgG抗体。结果显示该抗原混合 物符合中国药典上对hib效价的相关规定。同时显示该抗原混合物的 免疫原性和对照组中hib结合疫苗的免疫原性相当。
实施例40甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib、脑 膜炎抗原组合物的免疫原性
通过对恒河猴免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百 白破、hib结合物、脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者含甲肝、 脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物、脑膜炎结合物 抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估该抗原混合物中甲肝抗原的免 疫原性。选用恒河猴进行效价实验，同时与灭活甲肝疫苗进行对比。 选用体重在1.5～4.5kg的恒河猴按照7只每组的规格进行肌肉注射免 疫，其中5组为实验组，2组为对照组，免疫后28天采血，采用ELISA 法检测甲肝病毒抗体。结果显示各组恒河猴血清均有对甲肝病毒的抗 体效价，说明该混合物在恒河猴上具有良好的免疫原性，同时显示该 抗原混合物的免疫原性和灭活甲肝疫苗的免疫原性相当。
通过对SD大鼠免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、 百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者含甲 肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结 合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中脊灰和 EV71抗原和/或者CA16抗原的免疫原性。选择灭活脊灰疫苗和灭活 EV71疫苗和/或灭活CA16疫苗作为对照组，大鼠按照10只每组的 规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共 配成5组抗原混合物。大鼠免疫后第3周加强一次，免疫后第2周进 行采血，用病毒回滴实验检测中和抗体效价。中和用病毒选用Sabin I、 II和III型、EV71病毒株或CA16病毒株，各型的滴度为100CCID50。 阳性对照细胞选择Vero细胞。中和试验在36°C进行7天，并观察细 胞病变。结果显示各组大鼠血清均有对sabin I、II和III型病毒、EV71 病毒、CA16病毒的中和作用，说明该抗原混合物在大鼠上具有良好 的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中的灭活脊 灰疫苗、EV71疫苗、CA16疫苗的免疫原性相当。
通过对BALB/c小鼠免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙 肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者 含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜 炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中乙肝 的免疫原性。选择重组乙肝疫苗作为对照组，小鼠按照20只每组的 规格进行注射免疫，4-6周后采血，采用ELISA法测定乙肝抗体，计 算半数有效剂量ED50。结果显示该抗原混合物符合中国药典上对重 组乙肝疫苗效价的相关规定。同时显示该抗原混合物的免疫原性和对 照组中重组乙肝疫苗的免疫原性相当。
通过对NIH小鼠免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、 百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者含甲 肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结 合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中破伤风和 百日咳菌的免疫原性。选择百白破联合疫苗作为对照组，小鼠按照 20只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍 倍比稀释，共配成3组抗原混合物。小鼠免疫后14-16天进行百日咳 菌的攻毒实验，结果显示该联合抗原混合物符合中国药典上对百日咳 菌效价的相关规定。小鼠免疫后4周进行破伤风毒素的攻毒实验，结 果显示该抗原混合物符合中国药典上对破伤风疫苗效价的相关规定， 同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中百白破联合疫苗中破 伤风和百日咳抗原的免疫原性相当。
通过对250g～350g的豚鼠免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、 乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的组合物或者含甲肝、 脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物 抗原和氢氧化铝佐剂的混合物来评估对抗原混合物中白喉菌的免疫 原性。选择百白破联合疫苗作为对照组，豚鼠按照10只每组的规格 进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成 3组抗原混合物。豚鼠免疫4周后进行白喉毒素的攻毒实验，结果显 示该抗原混合物符合中国药典上对白喉疫苗效价的相关规定，同时显 示该抗原混合物的免疫原性和对照组中百白破联合疫苗中白喉抗原 的免疫原性相当。
通过对NIH小鼠免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、 百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者含甲 肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结 合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中b型流感 嗜血杆菌的免疫原性。选择hib结合疫苗作为对照组，小鼠按照20 只每组的规格进行注射免疫（含10只对照/每组）。抗原混合物按照 每次2.5ug多糖的抗原混合物的注射量进行免疫。小鼠首先进行 0.85%氯化钠溶液注射，于第1、14天注射两次，与第21～28天经眼 眶静脉采血，用ELISA法测定hib的IgG抗体。结果显示该抗原混合 物符合中国药典上对hib效价的相关规定。同时显示该抗原混合物的 免疫原性和对照组中hib结合疫苗的免疫原性相当。
通过对NIH小鼠免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、 百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的九联合疫苗组合物或者含 甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎 结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中脑膜炎 抗原的免疫原性。选择四价脑膜炎结合疫苗作为对照组，小鼠按照 20只每组的规格进行注射免疫（含10只对照/每组）。抗原混合物按 照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原混合物。小鼠于第1、 14天注射两次，与第21～28天经眼眶静脉采血，用ELISA法测定脑 膜炎各血清型的IgG抗体。结果显示该抗原混合物符合WHO相关指 导文件对各血清型脑膜炎抗原临床前免疫原性的相关规定。此外，选 择SD怀孕大鼠按照相同分组原则进行免疫，对乳鼠进行采血测定针 对A群脑膜炎的IgG抗体，结果显示该抗原混合物中A群脑膜炎抗 原据有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组 中四价脑膜炎结合疫苗各血清型的免疫原性相当。
表13含甲肝、脊灰抗原的不同组合物的免疫原性实验结果（血清阳转率%）
注：百日咳和脑膜炎抗原的免疫原性中血清阳转率为各组分的平均值。
组合物1：甲肝+脊灰
组合物2：甲肝+脊灰+乙肝+佐剂
组合物3：甲肝+脊灰+百白破
组合物4：甲肝+脊灰+hib
组合物5：甲肝+脊灰+脑膜炎
组合物6：甲肝+脊灰+EV71+乙肝+百白破+hib+佐剂
组合物7：甲肝+脊灰+EV71+乙肝+百白破+hib+脑膜炎
组合物8：甲肝+脊灰+EV71+CA16+乙肝+百白破+hib+脑膜炎
本发明包含但不限于上述组合物，其它组合物免疫原性实验结果 类似，不在此赘述。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。