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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811018777.5 (22)申请日 2018.09.03 (71)申请人 辽宁何氏医学院 地址 110163 辽宁省沈阳市浑南区泗水街 66号 申请人 沈阳眼产业技术研究院有限公司 (72)发明人 张东蕾 袁振丽 何向东 何伟 (74)专利代理机构 沈阳杰克知识产权代理有限 公司 21207 代理人 金春华 (51)Int.Cl. A61K 36/185(2006.01) A61P 27/02(2006.01) A61P 9/10(2006.01) (54)发明名称 蒺。
2、藜在制备预防和治疗视网膜损伤性疾病 药物中的应用 (57)摘要 本发明公开了蒺藜在制备预防和治疗视网 膜损伤性疾病药物中的应用。 本发明通过观察蒺 藜对过氧化氢(H2O2)诱导的氧化应激损伤人视 网膜色素上皮细胞的保护作用， 以及观察蒺藜对 视网膜色素上皮细胞在H2O2处理后与细胞凋亡 相关分子的表达变化， 探讨了蒺藜对氧化损伤的 视网膜色素上皮细胞的抗凋亡作用及其分子作 用机制， 为将来利用蒺藜预防和治疗视网膜色素 上皮细胞损伤相关眼病提供了理论依据。 权利要求书1页 说明书5页 附图4页 CN 108938687 A 2018.12.07 CN 108938687 A 1.蒺藜在制备预防和。
3、治疗视网膜损伤性疾病药物中的应用。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述的视网膜损伤性疾病是由视网膜色素 上皮细胞氧化应激损伤引起的视网膜损伤性疾病。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述的视网膜损伤性疾病包括年龄相关性 黄斑变性疾病、 视网膜色素变性疾病和脉络膜视网膜病变疾病。 4.根据权利要求1、 2或3所述的应用， 其特征在于， 蒺藜醇提取物在制备预防和治疗视 网膜损伤性疾病药物中的应用。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述的醇为乙醇。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 蒺藜乙醇提取物的制备方法包括如下步 骤： 按料液比1g:10-。
4、20mL， 取蒺藜和乙醇， 于75-85下回流提取1-2h， 过滤， 滤液经大孔吸 附树脂柱， 依次用水和乙醇洗脱， 水洗脱溶液弃掉， 收集乙醇洗脱溶液， 并通过减压回收乙 醇， 得蒺藜乙醇提取物。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 回流提取用乙醇的体积百分浓度为70， 洗脱用乙醇的体积百分浓度为95。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108938687 A 2 蒺藜在制备预防和治疗视网膜损伤性疾病药物中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种天然中药醇提取物的药理作用及其分子作用机制， 特别涉及蒺藜 醇提取物作为未来用于预防和治疗视网膜损伤性疾病的候选保健品或新药研发。
5、， 为眼科相 关疾病的预防和临床治疗开拓新的方法和思路。 背景技术 0002 视网膜色素上皮细胞(RPE)具有复杂的生物学功能， 为感觉层视网膜的外层细胞 提供营养、 吞噬和消化光感受器细胞外节盘膜， 维持新陈代谢等重要功能。 RPE与脉络膜最 内层的玻璃膜(Bruch膜)粘连极紧密， 与脉络膜毛细血管层共同组成一个统一的功能单位， 即RPE-玻璃膜-脉络膜毛细血管复合体， 对维持光感受器微环境有重要作用。 RPE细胞的损 伤可引起该复合体的损害， 进一步引起很多眼底病的发生， 如年龄相关性黄斑变性， 视网膜 色素变性和各种脉络膜视网膜病变等。 0003 年龄相关性黄斑变性(age-relat。
6、ed macular degeneration,AMD)是一种随着年 龄增长发病率逐渐升高的眼部退行性病变， 能造成进行性的、 不可逆的中心视力丧失。 在发 达国家中， AMD己经成为老龄人口视力丧失的主要原因， 大型的流行病学调查显示， 西方国 家43岁以上人群中AMD的患病率为1.7-15.6。 世界卫生组织的调查报告表明， 全球盲人 中大约有8.7为AMD导致的不可逆盲。 全世界大约有3000万AMD患者， 每年大约有50万人因 AMD而致盲。 在我国， 由于老龄化进程加快， AMD患者也逐年增多， 在部分地区， 50岁以上人群 中AMD的患病率可以达到15.5以上， 而且患病率和致盲率。
7、随年龄增加而增加。 随着社会经 济水平和医疗事业的发展， 白内障和角膜病等可逆性致盲性眼病己经得到了有效地控制， 但是AMD作为一种不可逆的致盲性眼病， 其发病率逐年上升， 己经成为了一项不可忽视的公 共卫生问题。 0004 氧化应激是多种AMD的危险因素中可能的共同作用机制。 AMD是与年龄相伴随的疾 病， 随着年龄增长， 衰老细胞中产生过多的活性氧产物， 造成机体氧化系统与抗氧化系统之 间的不平衡， 从而造成组织损伤和功能缺失。 环境因素如紫外线照射增多、 吸烟等也是与 AMD相关的危险因素， 这两者都己被证明可以造成活性氧的增多， 从而造成视网膜组织的氧 化应激。 其他因素如抗氧化维生素。
8、摄入不足以及肥胖等也可以造成视网膜组织氧化应激水 平的增加， 相关的临床试验结果则证实了抗氧化维生素与AMD的关系。 综上所述， 氧化应激 是AMD的重要发病机制之一。 0005 AMD是一种退行性改变的致盲疾病， 虽然进展缓慢， 但一旦发展成渗出型AMD(湿性 AMD)则可在短期内对视力造成极大的损害。 因此， 当前对渗出型AMD的治疗主要是针对脉络 膜新生血管(CNV)。 视网膜光凝术是一种最早用于治疗AMD的方法， 此外还有经瞳孔温热疗 法(Transpupillary thermotherapy,TTT)、 光动力疗法(Photodynamic therapy， PDT)、 手 术治疗。
9、和近年来成为研究热点的抗血管内皮生长因子(VEGF)药物治疗。 虽然这些治疗均取 得一定效果， 但黄斑区位置特殊， 多数治疗只能针对已形成的CNV， 并且费用昂贵， 因此寻找 另一种可预防AMD的发生、 可逆转AMD的发展、 价格经济和副作用少的新疗法变得很必要。 说 明 书 1/5 页 3 CN 108938687 A 3 0006 蒺藜(Tribulus terrestris)又称白蒺藜、 刺蒺藜， 系蒺藜科(zygophyllaceae)蒺 藜属植物， 具平肝解郁、 活血祛风、 祛痰止咳、 明目、 利尿、 止痒之功效， 临床用于治疗头痛、 头晕、 气管炎、 目赤多泪、 高血压、 皮肤瘙痒。
10、和风疹等症， 在治疗心脑血管性疾病方药的组方 中应用颇多。 最近， 以蒺藜有效成分为主的制剂有心脑舒通、 Tribestan、 Vitanone和 Tribusaponin等， 在防治心脑血管疾病、 抗衰老和治疗性功能减退症等方面均显示出良好 疗效。 0007 蒺藜的有效成分主要分为4类： 1、 生物碱类分离出3种生物碱， 即哈尔满(harman)、 哈尔明(harmine)和哈尔醇(harm01)。 2、 黄酮类所含黄酮类化合物的苷元主要为槲皮素 (Quercetin)、 山奈酚(Kaempfer01)及异鼠李素(Isorhamnetin)。 3、 皂苷类的主要有效成分 有延龄草苷、 薯蓣二。
11、葡萄糖苷、 薯蓣素、 纤细薯蓣苷、 原薯蓣苷、 原纤细薯蓣苷、 蒺藜苷F、 新 海柯皂苷和Tribulosin等皂苷和薯蓣皂苷元、 罗斯考皂苷元、 绿莲皂苷元、 3一脱氧薯蓣皂 苷元、 海柯皂苷元等。 4、 其他有效成分甾醇类主要含谷甾醇、 豆甾醇和菜油甾醇。 0008 关于蒺藜对氧化应激状态下的视网膜色素上皮细胞的影响国内外尚未有相关报 道， 蒺藜是否有可能通过减少视网膜色素上皮细胞的氧化应激损伤来延缓AMD的发生和发 展， 还有待于研究。 发明内容 0009 本发明的目的就是通过证实蒺藜对于氧化应激状态下的视网膜色素上皮细胞的 保护作用， 为开发蒺藜未知的生物活性及将来的临床治疗作用提供新。
12、的理论支持。 0010 本发明采用的技术方案是： 蒺藜在制备预防和治疗视网膜损伤性疾病药物中的应 用。 0011 进一步的， 所述的视网膜损伤性疾病是由视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤引起 的视网膜损伤性疾病。 0012 进一步的， 所述的视网膜损伤性疾病包括年龄相关性黄斑变性疾病、 视网膜色素 变性疾病和脉络膜视网膜病变疾病。 0013 进一步的， 蒺藜醇提取物在制备预防和治疗视网膜损伤性疾病药物中的应用。 0014 进一步的， 所述的醇为乙醇。 0015 进一步的， 蒺藜乙醇提取物的制备方法包括如下步骤： 按料液比1g:10-20mL， 取蒺 藜和乙醇， 于75-85下回流提取1-2h， 过。
13、滤， 滤液经大孔吸附树脂柱， 依次用水和乙醇洗 脱， 水洗脱溶液弃掉， 收集乙醇洗脱溶液， 并通过减压回收乙醇， 得蒺藜乙醇提取物。 0016 进一步的， 回流提取用乙醇的体积百分浓度为70， 洗脱用乙醇的体积百分浓度 为95 0017 本发明的有益效果是： 本发明公开了蒺藜(tribulus terrestris)对视网膜色素 上皮细胞(retinal pigment epithelium， RPE)氧化应激损伤具有保护作用的新的药理作 用。 本发明通过观察蒺藜乙醇提取物对过氧化氢(H2O2)诱导的氧化应激损伤人视网膜色素 上皮细胞(ARPE-19)的保护作用， 以及观察蒺藜提取物对视网膜色。
14、素上皮细胞在H2O2处理后 与细胞凋亡相关分子的表达变化， 探讨了蒺藜乙醇提取物对氧化损伤的视网膜色素上皮细 胞的抗凋亡作用及其分子作用机制， 为将来利用蒺藜预防和治疗视网膜色素上皮细胞损伤 相关眼病(例如， 年龄相关性黄斑变性、 视网膜色素变性和脉络膜视网膜病变等)提供理论 说 明 书 2/5 页 4 CN 108938687 A 4 依据。 附图说明 0018 图1A是视网膜细胞ARPE-19中， 采用MTT法检测不同浓度H2O2作用24小时的结果图。 0019 图1B是视网膜细胞ARPE-19中， 采用MTT法检测不同浓度蒺藜乙醇提取物作用24小 时的结果图。 0020 图1C是视网膜细。
15、胞ARPE-19中， 采用MTT法检测不同浓度蒺藜乙醇提取物与过氧化 氢共同作用的结果图。 0021 图2A是视网膜细胞ARPE-19中， 正常对照组， H2O2模型组， 100ug/ml蒺藜乙醇提取物 +H2O2干预组， 200ug/ml蒺藜乙醇提取物+H2O2干预组， 采用流式PI-Anexin V染色图。 0022 图2B为正常对照组， H2O2模型组， 100ug/ml蒺藜乙醇提取物+H2O2干预组， 200ug/ml 蒺藜乙醇提取物+H2O2干预组， 对过氧化氢诱导凋亡细胞百分率的数据统计图。 0023 图3A是视网膜细胞ARPE-19中， 正常对照组， H2O2模型组， 100ug。
16、/ml蒺藜乙醇提取物 +H2O2干预组， 200ug/ml蒺藜乙醇提取物+H2O2干预组， 采用流式DGFH-DA染色图。 0024 图3B为正常对照组， H2O2模型组， 100ug/ml蒺藜乙醇提取物+H2O2干预组， 200ug/ml 蒺藜乙醇提取物+H2O2干预组对过氧化氢诱导凋亡细胞百分率的数据统计图。 0025 图4为正常对照组， H2O2模型组， 100ug/ml蒺藜乙醇提取物+H2O2干预组， 200ug/ml 蒺藜乙醇提取物+H2O2干预组， SOD检测结果显示图。 具体实施方式 0026 实施例1蒺藜乙醇提取物的制备 0027 方法： 按料液比1g:10mL， 取蒺藜20g。
17、和200mL 70乙醇， 80下回流提取， 过滤， 取 滤液， 共提取2次每次1.5h， 合并滤液， 将滤液经大孔吸附树脂柱， 然后依次用水洗脱和95 乙醇洗脱， 水洗脱溶液弃掉， 收集95乙醇洗脱溶液， 并通过减压回收乙醇， 得到蒺藜乙醇 提取物1.36g。 0028 实施例2 0029 MTT检测检测方法为： 接种细胞： 用含10胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬 液， 以每孔1000个细胞接种到96孔板， 每孔体积100ul。 24h后根据实验目的对细胞进行H2O2 建模或蒺藜给药处理。 呈色： 每孔加MTS溶液20ul.继续孵育24h。 比色： 选择490nm波长， 在 酶联免疫监测仪上。
18、测定各孔光吸收值， 记录结果， 以时间为横坐标， 吸光值为纵坐标绘制细 胞生长曲线。 0030 按下述公式计算抑制率： 0031 0032 流式细胞术检测方法为： 将处于生长对数期的细胞消化、 离心， 制成单细胞悬液， 以细胞密度为1104/mL接种在6孔板中， 每组设3个复孔， 置于375CO2培养箱中孵育 24h。 待细胞融合至80时， 把细胞分正常组、 H2O2组和蒺藜干预组共3组， 每3个复孔， 弃掉原 培养基， H2O2组和蒺藜干预组分别加入含H2O2的培养基， 正常组仅予以更换完全培养基， 置 说 明 书 3/5 页 5 CN 108938687 A 5 于375CO2培养箱中培养。
19、24h。 吸除原培养基， 蒺藜干预组加入含最佳药物浓度蒺藜的培 养基， 正常组和H2O2组继续予更换完全培养基， 继续放入375CO2培养箱中孵育24h。 倒置 显微镜下观察细胞形态变化并拍照。 按照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书操作， 将各组细 胞消化离心， 用1.5ml EP管收集， 每管加入200 l Binding Buffer悬浮细胞液， 每管加入10 l Annexin V-FITC和10 l PI吹打混匀， 室温下避光反应15min， 流式细胞仪上机检测， 记 录结果。 0033 (一)H2O2诱导视网膜相胞ARPE-19损伤模型的建立 0034 ARPE-19细。
20、胞传代培养， 按照2105cell/ml滴板， 100ul/孔。 24h后不同浓度H2O2 (500 M， 600 M， 700 M， 800 M， 900 M,1000 M， 1100 M)分别作用ARPE-19细胞24， 每组6复孔 以保证实验数据的稳定性和准确性， 观察H2O2对细胞的损伤程度。 呈色： 每孔加MTT溶液 20ul， 继续孵育2-4h。 比色： 选择490nm波长， 在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值， 记录 结果， 以不同浓度H2O2为横坐标， 吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 MTT法检测细胞存活率 在50左右时的H2O2浓度做为氧化损伤模型的造模浓度。 0035 如。
21、图1A所示， 当H2O2浓度在1000 M时细胞存活率为54.15， 所以1000 M H2O2确定 为后续实验的氧化损伤模型的造模浓度。 0036 (二)蒺藜乙醇提取物对氧化应激损伤的视网膜相关细胞ARPE-19的抗凋亡作用 0037 1、 检测蒺藜乙醇提取物对ARPE-19细胞的增殖及毒性作用 0038 不同浓度的蒺藜乙醇提取物(0ug/ml， 5ug/ml， 10ug/ml， 25ug/ml， 50ug/ml， 100ug/ ml， 150ug/ml， 200ug/ml)分别作用于ARPE-19细胞， 每组6复孔以保证实验数据的稳定性和 准确性， 观察药物对细胞的增殖作用。 0039 如。
22、图1B所示， 不同浓度的蒺藜乙醇提取物处理ARPE-19人视网膜色素上皮细胞24h 后， 各实验组ARPE-19细胞的相对细胞活力(cell viability)与对照组相比差异无统计学 意义； 说明0-200ug/ml浓度的蒺藜乙醇提取物对ARPE-19人视网膜色素上皮细胞没有表现 出毒性作用。 0040 2、 检测蒺藜乙醇提取物对ARPE-19细胞的抗凋亡作用 0041 实验分7组： 正常对照组， H2O2模型组， 不同蒺藜乙醇提取物(25ug/ml， 50ug/ml， 100ug/ml， 200ug/ml， 400ug/ml)+H2O2干预组。 利用1000 M H2O2对ARPE-19。
23、细胞进行造模， 造 模后安全范围内不同浓度药物作用细胞， 通过MTT方法检测各组间细胞存活率， 检测蒺藜乙 醇提取物对ARPE-19细胞的抗氧化损伤保护作用情况。 0042 如图1C所示， 各实验组的相对细胞活力H2O2建模组低于对照组(P0.01)， 100/ 200ug/ml的蒺藜保护组高于H2O2建模组(P0.01)； 说明H2O2能够诱导ARPE-19人视网膜色 素上皮细胞氧化应激损伤， 而蒺藜具有保护H2O2诱导的ARPE-19人视网膜色素上皮细胞的氧 化应激损伤的作用。 0043 3、 利用流式细胞术对各实验组的细胞凋亡情况进行定量分析 0044 正常对照组， H2O2模型组， 蒺。
24、藜乙醇提取物(100ug/ml)+H2O2干预组， 蒺藜乙醇提取 物(200ug/ml)+H2O2干预组， 各实验组细胞消化处理后进行PI和Annectin V-FITC染色， 流式 细胞仪分析每个实验组ARPE-19细胞的凋亡率。 0045 结果如图2A和图2B所示， 各实验组细胞凋亡率， 正常对照组为5.73， H2O2建模组 为31.05， 蒺藜乙醇提取物浓度为100 g/ml的保护组为20.18， 蒺藜乙醇提取物浓度为 说 明 书 4/5 页 6 CN 108938687 A 6 200 g/ml的保护组为18.5。 结果显示建模组的细胞凋亡率高于正常对照组的凋亡率(P 0.001)，。
25、 蒺藜乙醇提取物保护组的细胞凋亡率低于H2O2建模组的凋亡率(P0.01)； 说明 H2O2能够诱导ARPE-19人视网膜色上皮细胞凋亡， 蒺藜乙醇提取物具有抗ARPE-19人视网膜 色素上皮细胞凋亡作用。 0046 4、 测定各实验组的活性氧自由基(reactive oxygen species， ROS)和超氧化物歧 化酶(Superoxide Dismutase， SOD)变化情况 0047 方法： 按照南京建成生物工程研究所-活性氧(ROS)测试盒说明书进行操作。 按照 南京建成生物工程研究所-超氧化物歧化酶(SOD)测试盒说明书进行操作。 0048 本实验通过DCHF-1和WST-1。
26、法对细胞内的ROS和SOD的表达进行检测。 当机体受到 有害刺激时， 活性氧(ROS)的产生超出了体内清除的界限， 氧化和抗氧化系统失衡， 造成组 织损伤。 超氧化物歧化酶(SOD)是细胞中重要的抗氧化酶， 它能清除氧自由基， 保护细胞免 受氧化损伤， 超氧化物歧化酶(SOD)活性水平能反映细胞抗氧化能力。 因此， SOD、 ROS水平可 以反映体内氧自由基的活性， 间接反映细胞氧化损伤程度。 0049 实验分4组： 正常对照组， H2O2模型组， 蒺藜乙醇提取物(100ug/ml)+H2O2干预组、 蒺 藜乙醇提取物(200ug/ml)+H2O2干预组。 0050 如图3A和图3B的ROS检。
27、测结果显示： 各实验组的荧光强度的mean值， 正常对照组为 9.4， H2O2建模组为282.73， 蒺藜乙醇提取物浓度为100 g/ml的保护组为94.37， 蒺藜乙醇提 取物浓度为200 g/ml的保护组为15.32。 与对照组比较， H2O2建模组细胞的ROS水平明显增 高， 而蒺藜乙醇提取物保护组的ROS水平与H2O2建模组相比明显降低(P0.01)。 0051 如图4的SOD检测结果显示： 正常对照组为35.80， H2O2建模组为20.59， 蒺藜乙醇提 取物浓度为100 g/ml的保护组为24.71， 蒺藜乙醇提取物浓度为200 g/ml的保护组为 24.87。 与对照组比较，。
28、 H2O2建模组细胞的SOD水平下降， 而蒺藜乙醇提取物保护组的SOD水平 与H2O2建模组相比明显升高(P0.01)。 0052 可见， 蒺藜乙醇提取物对H2O2诱导的氧化应激损伤ARPE-19人视网膜色素上皮细胞 具有抗凋亡保护作用。 说 明 书 5/5 页 7 CN 108938687 A 7 图1A 图1B 图1C 说 明 书 附 图 1/4 页 8 CN 108938687 A 8 图2A 说 明 书 附 图 2/4 页 9 CN 108938687 A 9 图2B 图3A 说 明 书 附 图 3/4 页 10 CN 108938687 A 10 图3B 图4 说 明 书 附 图 4/4 页 11 CN 108938687 A 11 。