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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810103392.2 (22)申请日 2018.02.01 (71)申请人 任碧琼 地址 410000 湖南省长沙市雨花区赤岭路 94号6栋404房 (72)发明人 任碧琼 罗书笛 邹国英 (74)专利代理机构 重庆市信立达专利代理事务 所(普通合伙) 50230 代理人 包晓静 (51)Int.Cl. A61K 31/12(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12N 5/09(2010.01) C12Q 1/02(2006.01) (54)发明名。
2、称 一种利用姜黄素抑制肝癌的新靶点及用途 (57)摘要 本发明属于医疗技术领域， 公开了一种利用 姜黄素抑制DAMP分子HSP70及TLR4信号抑制肝癌 的新靶点及用途， 通过细胞培养与细胞热应激模 型的建立， CCK-8试验， 划痕实验， Transwell迁移 实验， 流式细胞仪细胞周期分析， 流式细胞仪细 胞凋亡分析， Western blot分析， 酶联免疫吸附 试验等方法， 进行统计分析。 表明热应激显著增 加细胞外HSP70的水平和TLR4蛋白的表达， 显著 降低细胞内HSP70的表达； 姜黄素抑制人肝癌细 胞系HepG2细胞的增殖、 侵袭和转移， 促进细胞凋 亡， 使细胞阻滞于S。
3、期， 并显著降低热应激HepG2 细胞外HSP70(eHSP70)水平， 去除姜黄素后， eHSP70再次增加。 权利要求书1页 说明书6页 附图5页 CN 108324702 A 2018.07.27 CN 108324702 A 1.一种利用姜黄素抑制DAMP分子HSP70及TLR4信号抑制肝癌的新用途， 其特征在于， 所 述通过抑制DAMP分子HSP70及TLR4信号抑制肝癌的发生发展， 是姜黄素治疗肝癌的新靶点。 2.一种由权利要求1所述姜黄素通过抑制DAMP分子HSP70及TLR4信号抑制肝癌的新靶 点。 3.一种如权利要求1所述姜黄素通过抑制DAMP分子HSP70及TLR4信号抑制。
4、肝癌的发生 发展， 采用细胞培养技术并建立热应激细胞模型， 其特征在于， 细胞培养： 使用RPMI-1640完 全培养基培养HepG2细胞， 完全培养基成分含90的RPMI-1640培养基， 10胎牛血清， 100 单位/毫升的青/链霉素， 将细胞置于37， 5CO2的培养箱中培养； 待细胞生长至融合度 8090时， 0.25胰蛋白酶消化细胞， 进行1:21:3细胞传代； 热应激： 将HepG2细胞置 于43环境中加热80min， 为热耐受HepG2细胞； 用完全培养基稀释姜黄素， 姜黄素的处理浓 度为20 M100 M。 4.一种如权利要求3所述的细胞培养与热应激细胞模型建立方法， 其特征在。
5、于， 所述细 胞培养与热应激细胞模型的建立方法包括： 细胞培养： 使用RPMI-1640完全培养基培养HepG2细胞， 完全培养基含90的RPMI-1640 培养基， 10胎牛血清， 100单位/毫升的青/链霉素， 置于37， 5CO2的培养箱中培养； 待 细胞生长至融合度8090时， 0.25胰蛋白酶消化细胞， 进行1:21:3细胞传代； 热应 激： 将HepG2细胞置于43环境中加热80min， 为热耐受HepG2细胞； 用完全培养基稀释姜黄 素， 姜黄素的处理浓度为20 M100 M； CCK8实验： 将5104个/ml HepG2细胞接种于96孔板中， 用含10胎牛血清， 1抗生素 的。
6、RPMI 1640完全培养基， 置于375CO2的培养箱中培养24h； 采用浓度为20 M100 M的 姜黄素分别作用HepG2细胞24h、 48h、 72h后， 每孔加入10 L的CCK-8溶液， 置于培养箱中培养 1小时， 用酶标仪测定450nm处吸光度。 5.如权利要求4所述的细胞培养与热应激细胞模型建立方法， 其特征在于， 根据公式计 算细胞存活率()(实验组吸光度空白组吸光度)/(对照组吸光值空白组吸光度) 100。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108324702 A 2 一种利用姜黄素抑制肝癌的新靶点及用途 技术领域 0001 本发明属于医疗技术领域， 尤其涉及一种利。
7、用姜黄素抑制DAMP分子 HSP70及TLR4 信号抑制肝癌的新靶点及用途 背景技术 0002 姜黄素具有抗炎、 抗菌、 抗氧化、 抗肿瘤、 甚至抗神经变性等特性， 已被广泛报道。 姜黄素的作用机制尚不清楚， 尤其是在抑制肝癌方面。 然而， 活化的NF- B信号通路与肝癌 进展有关， HSP70可以与TLR4受体结合激活NF- B。 免疫学 “危险理论” 表明DAMPs与炎症、 自 身免疫性疾病、 肿瘤以及各种老化疾病相关， 细胞外HSP70是典型的DAMP分子， 能作为内源 性免疫刺激因子刺激免疫系统产生免疫应答。 许多与衰老有关的疾病都有着共同的起源和 特点， 如基因组改变， 端粒和表观遗。
8、传学异常， 炎症和免疫损伤， 因此， 关注 DAMPs将有可能 为疾病的研究提供一个新方向。 0003 综上所述， 现有技术存在的问题是： 有报道Curcumin能抑制肝癌的发生， 姜黄素通 过抑制DAMP分子eHSP70抑制TLR4信号， 从而抑制NF- B属于技术空白。 发明内容 0004 针对现有技术存在的问题， 本发明提供了一种利用姜黄素抑制DAMP分子 HSP70及 TLR4信号抑制肝癌的新靶点及用途。 0005 本发明是这样实现的， 一种通过抑制DAMP分子HSP70及TLR4信号抑制肝癌的姜黄 素新靶点及用途， 所述通过抑制DAMP分子HSP70及TLR4信号抑制肝癌的药物为姜黄。
9、素。 0006 本发明的另一目的在于提供一种由所述通过抑制DAMP分子HSP70及TLR4信号抑制 肝癌的抗肿瘤新途径新靶点。 0007 本发明的另一目的在于提供一种所述通过抑制DAMP分子HSP70及TLR4 信号抑制 肝癌的药物使用的细胞培养与热应激细胞模型， 所述细胞培养与热应激细胞模型为， 细胞 培养： 使用RPMI-1640完全培养基培养HepG2细胞， 完全培养基含90的RPMI-1640培养基， 10胎牛血清， 100单位/毫升的青/链霉素， 置于37， 5CO2的培养箱中培养； 待细胞生长 至融合度8090时， 用 0.25胰蛋白酶消化细胞， 进行1:21:3细胞传代； 热应激。
10、： 将 HepG2细胞置于 43环境中加热80min， 为热耐受HepG2细胞； 用完全培养基稀释姜黄素， 姜 黄素的处理浓度为20 M100 M； 0008 本发明的另一目的在于提供一种所述细胞培养与热应激细胞模型的建立方法， 所 述细胞培养与热应激细胞模型的建立方法包括： 0009 细胞培养： 使用RPMI-1640完全培养基培养HepG2细胞， 完全培养基中含 90的 RPMI-1640培养基， 10胎牛血清， 100单位/毫升的青/链霉素， 置于37 ， 5CO2的培养箱 中培养； 待细胞生长至融合度8090时， 用0.25胰蛋白酶消化细胞， 进行1:21:3细 胞传代； 热应激： 将。
11、HepG2细胞置于43环境中加热80min， 为热耐受HepG2细胞； 用完全培养 基稀释姜黄素， 姜黄素的处理浓度为20 M100 M； 说 明 书 1/6 页 3 CN 108324702 A 3 0010 CCK8实验： 将5104个/ml HepG2细胞接种于96孔板中， 用含10胎牛血清， 1抗 生素的RPMI 1640完全培养基， 置于37， 5CO2的培养箱中培养24h； 分别采用浓度为20 M 100 M的姜黄素作用HepG2细胞24h、 48h、 72h后， 每孔加入10 L的CCK-8溶液， 置于培养箱 中培养1小时， 用酶标仪测定450nm吸光度。 0011 进一步， 根。
12、据公式计算细胞增殖率()(实验组吸光度空白组吸光度) /(对 照组吸光值空白组吸光度)100。 0012 本发明结果表明热应激显著增加了细胞外HSP70(eHsp70)的水平和TLR4 蛋白的 表达(P0.01)， 但显著降低细胞内HSP70的表达(P0.01)。 姜黄素抑制人肝癌HepG2细胞 系的增殖、 侵袭和转移， 促进细胞凋亡， 使细胞周期阻滞于S期， 并显著降低eHsp70水平及细 胞内HSP70和TLR4蛋白的表达； 去除姜黄素后， eHsp70再次增加。 总之， 本发明结果表明， 姜 黄素的抗肿瘤作用与抑制HSP70-TLR4信号相关。 另外， 本发明以前的研究发现姜黄素通过 降。
13、低大鼠血栓模型鼠血浆HSP70水平发挥抗炎作用， 因此， 推测姜黄素可能与HSP70 相互作 用； 本发明表明， 姜黄素抑制人肝癌HepG2细胞增殖、 侵袭和转移， 促进细胞凋亡， 使细胞周 期阻滞于S期， 减少细胞外HSP70水平和TLR4蛋白的表达。 姜黄素的抗肿瘤作用与抑制HSP70 和TLR4信号有关。 附图说明 0013 图1是本发明实施提供的细胞培养与热应激细胞模型的建立方法流程图。 0014 图2是本发明实施提供的姜黄素抑制增殖图。 0015 图3是本发明实施提供的姜黄素抑制创伤愈合试验中的迁移图。 0016 图4是本发明实施提供的姜黄素抑制Transwell小室迁移实验一)迁移。
14、图。 0017 图5是本发明实施提供的姜黄素停止细胞周期的S期， 促进细胞凋亡的作用图。 0018 图6是本发明实施提供的姜黄素促进细胞凋亡图。 0019 图7是本发明实施提供的姜黄素下调细胞内HSP70表达的HepG2细胞， 但有相反的 效果在hepg2tt细胞图。 0020 图8是本发明实施提供的姜黄素下调细胞外HSP70的浓度图。 具体实施方式 0021 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合实施例， 对本发明 进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于 限定本发明。 0022 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。。
15、 0023 如图1所示， 本发明实施例提供的细胞培养与热应激细胞模型的建立方法包括以 下步骤： 0024 S101： 使用RPMI-1640完全培养基培养HepG2细胞， 完全培养基中含90的RPMI- 1640培养基， 10胎牛血清， 100单位/毫升的青/链霉素， 置于37， 5CO2的培养箱中培 养； 待细胞生长至融合度8090时， 用0.25胰蛋白酶 (Gibco)消化细胞， 进行1:2 1:3细胞传代； 0025 S102： 热应激， 将HepG2细胞置于43环境中加热80min， 为热耐受HepG2 细胞； 用 说 明 书 2/6 页 4 CN 108324702 A 4 完全培养。
16、基稀释姜黄素， 姜黄素的处理浓度为20 M100 M。 0026 下面结合实验对本发明的应用效果作详细的描述。 0027 1、 实验步骤： 0028 1.1细胞培养与热应激细胞模型的建立； 0029 HepG2细胞(细胞系来自高加索地区， 一位15岁的白人的肝癌组织中使用的肝癌细 胞代谢合适虽然源于肝母细胞瘤的组织学类型)是从湘雅学院中心实验室， 中南大学， 采用 RPMI-1640完全培养基培养HepG2细胞， 完全培养基中含RPMI-1640(Gibco)， 10胎牛血清 (P20-3302-FBS)和100单位/毫升青霉素/链霉素， 置于37， 5CO2的培养箱中培养。 待细 胞生长至融。
17、合度8090时， 用0.25胰蛋白酶(Gibco)消化细胞， 进行1:21:3细胞传 代。 热应激， 将 HepG2细胞置于43环境中加热80min， 命名为HepG2tt(热耐受HepG2细胞)。 用完全培养基稀释姜黄素(Sigma)， 姜黄素的处理浓度为20 M100 M； 0030 1.2CCK-8法； 0031 CCK8实验： 将5104个/ml HepG2细胞接种于96孔板(Corning)中， 用含10胎牛 血清， 1抗生素的RPMI 1640完全培养基， 置于37 5CO2的培养箱中培养24h； 分别采用 浓度为20 M100 M的姜黄素作用HepG2细胞24h、 48h、 72。
18、h后， 每孔加入10 l的CCK-8溶液 (Dojindo)， 置于培养箱中培养1小时， 用酶标仪(addcare)测定450nm吸光度。 根据公式计算 细胞增殖率()(实验组吸光度空白组吸光度)/(对照组吸光值空白组吸光度) 100。 0032 1.3划痕实验； 0033 将培养瓶中的细胞接种至六孔板， 37 5CO2培养细胞至融合度达100。 用10 L移液枪吸头进行细胞划痕。 划痕结束后， 弃去旧培养基， PBS冲洗， 加入含姜黄素的完全培 养基(姜黄素终浓度分别为50 M和80 M)， 37， 5CO2培养， 倒置显微镜下观察0小时、 24小 时和48小时后的划痕宽度变化。 0034 。
19、1.4Transwell迁移实验； 0035 将培养瓶中的细胞消化， 调整细胞浓度至1105个/ml， 取100200ul的细胞悬液 接种于Transwell小室(孔径8 m)的上室中， 下室中分别加入600 l含 10血清的完全培养 基、 含10血清和50 M姜黄素的完全培养基、 含10血清和80 M姜黄素的完全培养基， 37 ， 5CO2培养24h。 24h后， 用棉签擦去上室中没有穿膜的细胞。 将膜置于甲醇中固定 20min， 0.1的结晶紫室温染色 15min。 高倍显微镜下(Olympus CKX41)随机观察5个视野 并进行细胞计数。 1.5流式细胞仪细胞周期分析； 0036 流式。
20、细胞仪检测姜黄素对细胞周期分布的影响。 简而言之， 将HepG2细胞接种于培 养瓶， 分别用50 M和80 M的姜黄素处理细胞24h， 24h后消化细胞并制成细胞悬液， 用75的 乙醇4固定细胞过夜。 取出固定的细胞， PBS 清洗12次去除乙醇。 加入碘化丙啶(PI),4 避光染色30min， 转至流式细胞仪(Becton Dickinson)分析PI荧光直方图上各细胞周期 的百分率。 0037 1.6流式细胞仪细胞凋亡分析； 0038 HepG2细胞接种于培养瓶， 分别用50 M和80 M的姜黄素处理细胞24h， 用不含EDTA 的胰酶消化(Gibco)细胞， PBS清洗2次， 收集约11。
21、05个细胞， 加入500 l的Binding buffer 悬浮细胞。 加入Annexin V-FITC和PI染色。 转至流式细胞仪检测凋亡细胞数。 说 明 书 3/6 页 5 CN 108324702 A 5 0039 1.7Westernblot分析； 0040 裂解液提取总蛋白并用BCA法定量。 取50 g蛋白质进行SDSPage凝胶电泳(凝胶浓 度为8和10)。 跑胶完成后， 将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF) 膜， 膜与抗体SPAG9(1: 2000， ab12331， Abcam)， HSP70(1:2000， 10995-1-ap， Proteintech)， TLR4(1:10。
22、00， 66350- 1-ig， Proteintech)和 肌动蛋白(1:4000， 60008-1-ig， Proteintech)4孵育过夜。 PBS洗 膜三次， 膜与辣根过氧化物酶抗小鼠/抗兔IgG(Proteintech)37孵育2h。 将膜与ECL发光 液孵育3min 后， 转至暗室曝光显影。 0041 1.8酶联免疫吸附试验； 0042 在用人热休克蛋白70ELISA试剂盒(cusabio)检测上清液HSP70的水平， 根据试剂 盒说明书操作。 0043 1.9统计分析。 0044 采用SPSS 17进行统计分析。 数据以均值和标准差表示。 分别采用双因素重复测量 方差分析和双因。
23、素方差分析进行统计学分析， 采用LSD-t检验和t检验进行多重比较。 统计 显著性水平为P0.05(双侧)。 0045 2、 结果 0046 2.1、 姜黄素抑制HepG2细胞增殖、 迁移和侵袭 0047 为了了解姜黄素对HepG2细胞增殖的影响， 采用CCK-8实验， 一种敏感的 WST-8染 料活细胞染色比色分析。 Curcumin抑制HepG2细胞增殖， 呈剂量和时间依赖性(f8.383， p 0.001)(表1和图2)。 0048 为了研究姜黄素对细胞迁移和侵袭的影响， 本发明进行了体外划痕试验。 如图2所 示， 与未经处理的细胞相比， 姜黄素处理过的细胞在经过24小时培养后， 迁移到。
24、划痕区的细 胞明显减少。 探讨热应激增加细胞外HSP70浓度， 会影响HepG2细胞的迁移能力， 本发明进行 了hepg2tt细胞的划痕实验。 如图3所示， 热应激细胞姜黄素处理组迁移明显慢于对照组。 0049 实验组细胞培养24、 48h后， 浓度依赖性不明显。 这些结果表明， 姜黄素是HepG2细 胞和hepg2tt细胞迁移和侵袭的重要抑制剂。 0050 Transwell小室迁移实验也表明， 姜黄素能抑制HepG2细胞的迁移。 80 M 姜黄素处 理组的穿膜细胞数明显少于50 M姜黄素处理组(图4)。 0051 2.2、 姜黄素促进HepG2细胞凋亡并阻滞细胞周期于S期 0052 应用流。
25、式细胞仪分析姜黄素对HepG2细胞周期和凋亡的影响。 与未经处理的HepG2 细胞相比， 80 M姜黄素处理的HepG2细胞S期细胞比例明显高于未经处理的细胞(图5A和B)。 50 M和80 M姜黄素处理组的细胞凋亡率明显高于未经处理组(图6A和B)。 0053 2.3、 姜黄素对HSP70和TLR4表达的影响 0054 免疫印迹分析结果表明， HepG2细胞同时表达HSP70和TLR4， 姜黄素能抑制HSP70和 TLR4的表达。 热应激能显著降低HSP70的表达和TLR4的表达。 对于hepg2tt细胞,姜黄素能显 著降低HSP70和TLR4的表达(图7A和B)。 TLR4 抑制剂TAK-。
26、242的作用不在本文的讨论。 0055 2.4、 姜黄素对HepG2TT细胞外HSP70的作用 0056 与HepG2细胞相比， 热应激HepG2细胞的细胞外HSP70浓度显著升高。 姜黄素明显降 低HepG2TT细胞外HSP70， 细胞内HSP70的变化与细胞外HSP70 相反， TLR4的表达变化与细胞 外HSP70变化一致。 除去姜黄素对HepG2TT作用后， 细胞外HSP70水平恢复(图8)。 说 明 书 4/6 页 6 CN 108324702 A 6 0057 3、 Curcumin是从中药姜黄中分离得到的一种多酚类化合物， 具有广泛的抗肿瘤、 抗炎、 抗氧化作用， 抗动脉粥样硬化。
27、和抗抑郁活性， 但姜黄素作用机制存在争议。 0058 本发明的研究证实姜黄素抑制HepG2细胞的增殖、 分化和迁移， 对HepG2 细胞的治 疗具有浓度依赖性。 姜黄素促进HepG2细胞的凋亡， 使细胞周期阻滞于S期。 0059 据文献报道， 肿瘤细胞能向细胞外环境中释放HSP70， 可在各类肿瘤患者的外周血 中检测到高水平的HSP70。 包括肝癌患者在内的癌症患者的血清中也检测到了高水平的 HSP70。 本发明还在肝癌患者癌组织中检测到HSP70和TLR4 的高表达。 本发明以前的研究表 明， 肝炎肝硬化患者和肝癌患者血清HSP70水平均高于正常人。 这些结果表明， DAMP分子 HSP70。
28、与炎症和癌症的病理过程有关。 0060 本发明发现HepG2细胞分泌HSP70， TLR4在HepG2细胞表面表达。 与未处理HepG2细 胞相比， 热应激增加HepG2细胞外HSP70的水平， 同时降低细胞内HSP70水平， 说明热应激可 使HepG2细胞释放HSP70。 与未处理细胞相比， 热应激HepG2细胞TLR4含量显著降低。 更重要 的是， 姜黄素与HepG2细胞共培养显著减少细胞外HSP70的水平及TLR4在细胞中的表达， 并 呈浓度依赖关系。 NF-kB通路在肿瘤的发生发展中起着重要作用。 TLR4是细胞外HSP70的受 体， 因此抑制这种相互作用可间接抑制NF-kB活化。 0。
29、061 总之， 本发明的结果表明， HSP70-TLR4信号通路的激活可被姜黄素抑制， 姜黄素抗 肿瘤作用与HSP70-TLR4信号的抑制相关， 因此本发明推测姜黄素通过降低细胞外HSP70水 平抑制TLR4在肿瘤细胞的表达， 从而抑制TLR4信号启动NF- B通路。 本发明为姜黄素抗肝癌 机制的研究提供了一个新的方向， 并提出HSP70-TLR4途径可能是肝癌治疗的一个潜在靶 点， 姜黄素在肝癌治疗中的作用值得进一步研究。 0062 注： 图2中： 姜黄素对HepG2细胞增殖的影响呈浓度依赖性， 20 M的增殖率明显高于 其他三种浓度， 且浓度越高， 抑制作用越强。 0063 图3中： 24。
30、小时后HepG2细胞划痕实验的代表性照片。 用50或80 M姜黄素进行处理 与未经处理的细胞。 B)0小时HepG2细胞划痕宽度减去24小时划痕宽度与0小时划痕宽度的 比值。 (C)热应激HepG2细胞24小时和48小时划痕实验的代表性照片。 D)0小时HepG2TT细胞 划痕宽度减去24h与0h 划痕宽度的比值。 E)0小时HepG2TT细胞划痕宽度减去48h划痕宽度 与0h 划痕宽度的比值。 24h和48h处理后， 与未处理组相比， 姜黄素处理组HepG2TT 细胞迁 移显著降低p0.01， P0.001。 0064 图4中： 未处理HepG2细胞、 50 M姜黄素处理HepG2细胞、 8。
31、0 M姜黄素处理HepG2细胞 的Transwell实验代表性图片。 B)每视野穿膜迁移的细胞数(967.681.71， 226.630.14， 19.23.22)。 *p0.01， *0.001。 0065 图5中： 一)流式细胞仪检测未处理HepG2细胞(左)和50 M姜黄素处理组(中)和80 M姜黄素处理组(右)。 80 M姜黄素处理组处于S期的细胞明显高于未经处理组。 B)S期细胞百 分比。 0066 图6中： 一)未处理HepG2细胞(左)、 50 M姜黄素处理(中)和80 M姜黄素处理(右)， Annexin V-FITC和PI染色。 B)凋亡细胞百分率有显著性差异。 *0.001。
32、。 0067 图7中： 姜黄素抑制HepG2细胞TLR4的表达。 a和b)有/无姜黄素作用下， HepG2细胞 和HepG2TT细胞内HSP70和TLR4表达DE免疫印迹检测及定量分析。 *p0.01， *0.001。 0068 图8中： 细胞外HSP70水平测定。 A)HepG2细胞上清液及HepG2TT细胞上清液中HSP70 说 明 书 5/6 页 7 CN 108324702 A 7 水平； B)HepG2TT细胞与姜黄素共培养以及去除姜黄素作用后， 细胞上清液中HSP70浓度。 *p 0.01， *0.001。 0069 以上所述仅为本发明的实施例子而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神 和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 6/6 页 8 CN 108324702 A 8 图1 图2 说 明 书 附 图 1/5 页 9 CN 108324702 A 9 图3 说 明 书 附 图 2/5 页 10 CN 108324702 A 10 图4 图5 说 明 书 附 图 3/5 页 11 CN 108324702 A 11 图6 图7 说 明 书 附 图 4/5 页 12 CN 108324702 A 12 图8 说 明 书 附 图 5/5 页 13 CN 108324702 A 13 。