聚酰胺胺型树枝状大分子包载MIR21基因抑制剂的制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103285407 A (43)申请公布日 2013.09.11 CN 103285407 A *CN103285407A* (21)申请号 201310232816.2 (22)申请日 2013.06.09 A61K 48/00(2006.01) A61K 31/7088(2006.01) A61K 47/34(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 天津大学 地址 300072 天津市南开区卫津路 92 号天 津大学 (72)发明人 孟玉斌 龙丽霞 任玉 原续波 康春生 (74)专利代理机构 天津市北洋有限责任专利代 理事务所 1。

2、2201 代理人 王丽 (54) 发明名称 聚酰胺-胺型树枝状大分子包载miR-21基因 抑制剂的制备方法 (57) 摘要 本发明为聚酰胺 - 胺型树枝状大分子包载 miR-21 基因抑制剂的制备方法 ； PAMAM 用 TE 缓冲 液 （10mmol/L,pH8.0Tris-HCl）稀释至 20mg/L 浓 度， as-miR-21（20mol/L） 1mmol/L 乙二胺四乙 酸稀释至50nM。 根据预先设计好的N/P 比将 50nM 的 as-miR-21 与 20mg/L 的 PAMAM 在 TE 缓冲液体 系中混合。 室温孵育20min后得到两者的复合物。 当 N/P 为 16:1-。

3、64:1 时， as-miR-21 能与 PAMAM 完 全结合， 形成稳定复合物， 且粒径均匀的 PAMAM 包 载 miR-21 抑制剂应用于恶性脑胶质瘤的临床体 内外研究， 成为治疗胶质瘤细胞的新方法。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103285407 A CN 103285407 A *CN103285407A* 1/1 页 2 1. 聚酰胺 - 胺型树枝状大分子包载 miR-21 基因抑制剂的制备方法， 其特征是步骤如。

4、 下 ： 1） PAMAM 用含 10mmol/L， pH8.0 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 (Tris-Hcl) 及 1mmol/L 乙二 胺四乙酸 （EDTA) 的 TE 缓冲液稀释至 20mg/L ； 2） 20mol/L 的 as-miR-21， 用 10mmol/L， pH8.0Tris-Hcl 及 1mmol/L 乙二胺四乙酸 （EDTA) 的 TE 缓冲液稀释至 50nM ； 3） 选用 N/P 比 64 ： 1-16:1 将 100pmol as-miR-21 与 PAMAM 在 TE 缓冲液体系中混合 ； 4） 室温孵育 20-30min 后得到两者的复合物 ； 其中， N/P 。

5、比是根据 PAMAM 中末端氨基正 电荷与 miR-21 中磷酸根负电荷的比值来计算的 ： 2.如权利要求1所述的方法， 其特征是所制备出的抑制剂粒径为80nm2nm， 粒径分布 均匀， 表面呈正电性。 权 利 要 求 书 CN 103285407 A 2 1/4 页 3 聚酰胺-胺型树枝状大分子包载miR-21基因抑制剂的制备 方法 技术领域 0001 本发明涉及纳米基因载体领域， 将基因治疗与先进纳米材料技术相结合， 以聚酰 胺 - 胺型树状大分子 PAMAM 为载体， 实现基因 miR-21 反义寡核苷酸 (As-miR-21) 的包载， 应用于恶性脑胶质瘤的临床治疗体内外研究。 背景技。

6、术 0002 基因治疗是当前研究的热点， 采用基因治疗方法可显著提高肿瘤细胞的抑制率。 基因治疗用于肿瘤抑制的前提是高效的基因转染， 因此， 基因载体的选择成为基因治疗的 关键因素。目前应用于基因治疗的载体主要有病毒载体 （viral vector） 和非病毒载体 （non-viral vector） 两种。病毒载体转染效率高且对大多数细胞都有靶向作用， 已被广泛 而有效地得到了应用。然而由于人体自身具有抗病毒的免疫系统， 使用病毒载体作为媒介 传递基因时就不得不面对宿主的免疫反应 ； 病毒载体含有可转录的病毒基因， 可能随机整 合于宿主基因组中而对人体造成伤害 ； 此外， 病毒载体目的基因容。

7、量小、 制备复杂及费用较 高等都限制了其应用。因此非病毒载体的研究愈来愈受到人们的重视。 0003 RNA 干涉 (RNA interference,RNAi) 是近几年发展的新技术。MicroRNA 即微小 RNA(microRNA ； miRNA)是指长度约1825nt的小型非编码RNA家族， 这些miRNA能够识别 特定的目标 mRNA, 并在转录后水平通过促进靶 mRNA 的降解和 / 或抑制翻译过程而发挥负 调控基因表达的过程。这些 miRNA 的作用遍及生命体的发生、 生长、 发育、 分化、 信号转导、 疾病和死亡的过程。 miRNA可在无脊椎动物的发育、 神经分化、 细胞增殖、 。

8、凋亡和脂肪代谢过 程中发挥调节作用。已有研究发现 miR-21 在胶质母细胞瘤标本和肿瘤细胞系中均出现过 表达， 而 miR-21 的反义寡聚核苷酸 （Antisense Oligonucleotide， ASON） 能在体外明显抑 制 A172、 U87、 LN229 和 LN308 的生长并诱导细胞出现凋亡。Ambion 研究报告显示， miR-21 在脑组织中表达水平很低或者缺， 组织芯片原位杂交结果表明6例正常脑组织miR-21表达 均为阴性。到目前为止， 包载 miRNA 高效低毒载体以及载体与基因的最佳复合比仍在探索 之中。 0004 因此本发明选用星型树枝状 PAMAM 纳米级高。

9、分子材料， 以其高转染率、 低毒性、 纳 米级尺寸的优势， 应用到生物治疗中。同时， 由于 miR-21 在胶质瘤细胞的高表达及抗凋亡 的生物学功能， 我们设计采用树形大分子载体PAMAM包载miR-21抑制剂基因治疗抗肿瘤治 疗方案， 利用 PAMAM 载体的安全性和有效性能将基因 miR-21 抑制剂输送至细胞中， 提高转 染效率， 降低细胞毒性。本发明方法简单， 适用性广， 在基因治疗和基因免疫中显示出非常 好的应用前景。发明中， 我们选用 G5-PAMAM 树形大分子包载 miR-21 抑制剂 （As-miR-21） 进 行基因治疗， 通过基础生物学研究手段， 实现PAMAM与As-m。

10、iR-21的有效包覆， 为肿瘤研究、 治疗及基因治疗提供了新的思路。 发明内容 说 明 书 CN 103285407 A 3 2/4 页 4 0005 本发明针对微小 RNA 即 miR-21 在胶质瘤细胞的高表达及抗凋亡的生物学功能， 设计用纳米级聚酰胺 - 胺型树枝状大分子载体包载基因抑制剂 (As-miR-21)， 我们选择用 PAMAM 树形大分子， 通过探索载体与基因不同配比 （N/P） ， 最终确定了最优方案， 成功制备 出符合转染条件且性能稳定， 粒径均匀的聚酰胺 - 胺型基因载体复合物， 为基因疗法抗肿 瘤研究提供了广阔的应用前景。 0006 本发明的技术方案如下 ： 0007。

11、 聚酰胺 - 胺型树枝状大分子 PAMAM 包载 miR-21 基因抑制剂的制备方法， 其步骤如 下 ： 0008 1） PAMAM 用含 10mmol/L， pH8.0 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 (Tris-Hcl) 及 1mmol/L 乙二胺四乙酸 （EDTA) 的 TE 缓冲液稀释至 20mg/L ； 0009 2） 20mol/L 的 as-miR-21， 用 10mmol/L， pH8.0Tris-Hcl 及 1mmol/L 乙二胺四乙 酸 （EDTA) 的 TE 缓冲液稀释至 50nM ； 0010 3） 选用 N/P 比 64 ： 1-16:1 将 100pmol as-miR-2。

12、1 与 PAMAM 在 TE 缓冲液体系中混 合 ； 0011 4） 室温孵育 20-30min 后得到两者的复合物 ； 其中， N/P 比是根据 PAMAM 中末端氨 基正电荷与 miR-21 中磷酸根负电荷的比值来计算的。 0012 0013 所制备出的抑制剂粒径为 80nm 本发明采用纳米级聚合物分子聚酰胺 - 胺型树状 大分子 （PAMAM） 为载体。包载抗肿瘤微小 RNA 抑制剂 as-miR-21 ； 由于载体表面含胺基， 带 正电， 基因表面含磷酸根基团， 带负电， 靠静电吸附将二者有力结合起来。通过包载基因的 最佳配比进行试验， 以第五代载体PAMAM包载基因miR-21。 最。

13、终实现了两者的有力包覆， 制 备出的基因载体复合物具有良好的稳定性， 且粒径在 80nm2nm， 呈球形。对细胞的毒性较 小。能够通过血脑屏障， 应用于恶性脑胶质瘤的临床体内外研究。 附图说明 0014 图 1PAMAM/as-miR-21 复合物的凝胶电泳结合图像。 0015 图 2PAMAM 和 PAMAM/as-miR-21(N/P=16) 复合物的透射电镜照片。 具体实施方式 0016 本发明实施例中所用的原料均为市购产品， 纯度为分析纯。 0017 本发明不同N/P比的PAMAM/as-miR-21复合物的凝胶电泳结合图像采用北京六一 厂普通电泳仪和美国 kodak 凝胶成像分析系统。

14、。 0018 本 发 明 制 备 的 PAMAM 和 PAMAM/as-miR-21 复 合 物 的 透 射 电 镜 照 片， 采 用 JEOL-100CXII 透射电子显微镜。 0019 本 发 明 制 备 的 PAMAM 和 PAMAM/as-miR-21 复 合 物 的 zeta 电 位 测 试 图 采 用 BI-90Plus 激光粒度仪 /Zeta 电位仪。 0020 实施例 1: 说 明 书 CN 103285407 A 4 3/4 页 5 0021 1） PAMAM 用 10mmol/L， pH8.0 的 Tris-HCl TE 缓冲液稀释至 20mg/L。 0022 2） 20m。

15、ol/L as-miR-21 用 1mmol/L 乙二胺四乙酸稀释至 50nmol/L。 0023 3） 根据预先设计好的 N/P 比 64:1， 由下述公式 0024 在 N/P=64:1 时， 取 100pmolAs-miR-21， 计算得需要的 PAMAM 的用量为 1nmol。PAMAM 的摩尔质量为为 28826g/mol， 因此计算可知 ： 需要取 PAMAM 溶液 1.44ml， As-miR-21 的溶液 2ml。 0025 将 1.44ml PAMAM 与 2ml as-miR-21 与 PAMAM 在 TE 缓冲液体系中混匀。 0026 4） 室温孵育 20min 后得到两。

16、者的复合物。 0027 PAMAM-as-miR-21 复合物制备好后， 通过琼脂糖凝胶电泳来考察 PAMAM 与 as-miR-21 的复合情况。取 0.1g 琼脂糖于锥形瓶中， 加入 25mL0.5TBE， 加热至琼脂糖完 全融化， 取出待冷至 60加入 1L 溴化乙锭溶液， 摇匀后缓缓倒入有机玻璃内槽， 待胶凝 固后， 取出梳子和封端的透明胶， 放在电泳槽内， 加入电泳缓冲液使液面略高于胶面 1mm。 PAMAM 与 as-miR-21 复合物室温孵育 20min 后， 加入 1/5 体积的加样缓冲液 （6loading dye） ， 短暂离心混合后上样至 4% 的琼脂糖凝胶， 每个点样。

17、孔中加 10L 复合物。开始电 泳， 电压 80V， 时间 0.5h。最后经紫外光照射下进行凝胶成像。由图可知， 通过带正电荷的 PAMAM， 带负电性的 as-miR-21 被有效包载， 形成稳定载体复合物， 不存在游离的基因。 0028 取 PAMAM/as-miR-21 溶液适量， 滴加至喷有碳膜的铜网之上， 空气中干燥制备观 测样品， 透射电子显微镜下观察复合物形貌， 并通过透射电镜尺寸计算标准测定复合物的 粒径大小。 0029 实施例 2: 0030 1)PAMAM 用 TE 缓冲液 10mmol/L,pH8.0Tris-HCl 稀释至 20mg/L。 0031 2） 20mol/L。

18、as-miR-21 用 1mmol/L 乙二胺四乙酸 （EDTA)） 稀释至 50nM。 0032 4） 根据预先设计好的 N/P 比 32:1， 由下述公式 0033 在 N/P=32:1 时， 取 100pmolAs-miR-21， 计算得需要的 PAMAM 的用量为 0.5nmol。PAMAM 的摩尔质量为为 28826g/mol， 因此计算可知 ： 需要取 PAMAM 溶液 0.72ml， As-miR-21 的溶液 2ml。 0034 将 0.72ml PAMAM 与 2ml as-miR-21 与 PAMAM 在 TE 缓冲液体系中混匀。 0035 4） 室温孵育 20min 后得。

19、到两者的复合物。 0036 PAMAM-as-miR-21 复合物制备好后， 通过琼脂糖凝胶电泳来考察 PAMAM 与 as-miR-21 的复合情况。取 0.1g 琼脂糖于锥形瓶中， 加入 25mL0.5TBE， 加热至琼脂糖完 全融化， 取出待冷至 60加入 1L 溴化乙锭溶液， 摇匀后缓缓倒入有机玻璃内槽， 待胶凝 固后， 取出梳子和封端的透明胶， 放在电泳槽内， 加入电泳缓冲液使液面略高于胶面 1mm。 PAMAM 与 as-miR-21 复合物室温孵育 20min 后， 加入 1/5 体积的加样缓冲液 （6loading dye） ， 短暂离心混合后上样至 4% 的琼脂糖凝胶， 每个。

20、点样孔中加 10L 复合物。开始电泳， 电压 80V， 时间 0.5h。最后经紫外光照射下进行凝胶成像。 0037 取 PAMAM/as-miR-21 溶液适量， 滴加至喷有碳膜的铜网之上， 空气中干燥制备观 说 明 书 CN 103285407 A 5 4/4 页 6 测样品， 透射电子显微镜下观察复合物形貌， 并通过透射电镜尺寸计算标准测定复合物的 粒径大小。 0038 实施例 3: 0039 1） PAMAM 用 10mmol/L,pH 为 8.0 的 Tris-HCl TE 缓冲液稀释至 20mg/L。 0040 2） 20mol/L as-miR-21 用乙二胺四乙酸稀释至 50nM。

21、。 0041 5） 根据预先设计好的 N/P 比 16:1， 由下述公式 0042 在 N/P=16:1 时， 取 100pmolAs-miR-21， 计算得需要的 PAMAM 的用量为 1nmol。PAMAM 的摩尔质量为为 28826g/mol， 因此计算可知 ： 需要取 PAMAM 溶液 0.36ml， As-miR-21 的溶液 2ml。 0043 将 0.36ml PAMAM 与 2ml as-miR-21 与 PAMAM 在 TE 缓冲液体系中混匀。 0044 4） 室温孵育 20min 后得到两者的复合物。 0045 PAMAM-as-miR-21 复合物制备好后， 通过琼脂糖凝。

22、胶电泳来考察 PAMAM 与 as-miR-21 的复合情况。取 0.1g 琼脂糖于锥形瓶中， 加入 25mL0.5TBE， 加热至琼脂糖完 全融化， 取出待冷至 60加入 1L 溴化乙锭溶液， 摇匀后缓缓倒入有机玻璃内槽， 待胶凝 固后， 取出梳子和封端的透明胶， 放在电泳槽内， 加入电泳缓冲液使液面略高于胶面 1mm。 PAMAM 与 as-miR-21 复合物室温孵育 20min 后， 加入 1/5 体积的加样缓冲液 （6loading dye） ， 短暂离心混合后上样至 4% 的琼脂糖凝胶， 每个点样孔中加 10L 复合物。开始电泳， 电压 80V， 时间 0.5h。最后经紫外光照射下。

23、进行凝胶成像。 0046 取 PAMAM/as-miR-21 溶液适量， 滴加至喷有碳膜的铜网之上， 空气中干燥制备观 测样品， 透射电子显微镜下观察复合物形貌， 并通过透射电镜尺寸计算标准测定复合物的 粒径大小。 0047 从琼脂糖凝胶电泳图中可以看出， 电荷比为 16:1 时， 复合物停留在上样孔处。随 着 PAMAM 比例的不断增加， as-miR-21 的负电荷被中和， 保留在点样孔内不再向正极迁移。 因此， 当电荷比大于 16:1 时， 复合物向负极移动 PAMAM 能与 RNA 抑制剂在电荷比 (N/P) 大 于 16:1 时完全结合形成稳定的复合物。 0048 由透射电镜图可知， PAMAM 为密实的实心球体， 粒子分布均匀， 粒径大小经过透射 电镜标准尺寸测量后得出其值在 80nm2nm ； 粒子分布均匀， 照片衬度很高， 粒子呈密实的 小球状 ； 0049 由上述电泳结合实验和透射电镜结果综合评判， 本发明所制得的聚酰胺 - 胺型树 枝状大分子 PAMAM 包载基因抑制剂 as-miR-21 后， 粒径分布均匀， 80nm2nm， 表面带正电 荷， 形成稳定复合物， 能够较好的应用于恶性脑胶质瘤临床治疗的体内外研究。 说 明 书 CN 103285407 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103285407 A 7 。