《银杏内酯组合物的医药用途.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《银杏内酯组合物的医药用途.pdf（8页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711190358.5 (22)申请日 2017.11.24 (71)申请人 江苏康缘药业股份有限公司 地址 222047 江苏省连云港市经济技术开 发区江宁工业城 (72)发明人 萧伟 杨昊 王振中 刘秋 许治良 周军 周建明 章晨峰 胡晗绯 (74)专利代理机构 北京律和信知识产权代理事 务所(普通合伙) 11446 代理人 刘国伟 王月春 (51)Int.Cl. A61K 31/365(2006.01) A61P 21/00(2006.01) (54)发明名称 银杏内。
2、酯组合物的医药用途 (57)摘要 本发明提供了银杏内酯组合物在制备治疗 肌萎缩性侧索硬化药物中的应用。 通过TDP-25的 稳定转染细胞模型和Wobbler大鼠模型， 证实了 本发明提出的银杏内酯组合物对TDP-25蛋白具 有抑制作用， 且不同剂量银杏内酯组合物均能显 著延缓Wobbler大鼠发病， 延长存活期。 两种模型 均表明， 银杏内酯组合物对肌萎缩性侧索硬化症 均有较好的疗效。 权利要求书1页 说明书6页 CN 108096243 A 2018.06.01 CN 108096243 A 1.一种银杏内酯组合物在制备治疗肌萎缩性侧索硬化药物中的应用。 2.根据权利要求1所述的应用， 所述。
3、银杏内酯组合物包括银杏内酯A、 B、 K， 其特征在于， 以重量比计， 银杏内酯A： 银杏内酯B： 银杏内酯K比例为(2040)： (5075):(0.25)。 3.根据权利要求1所述的应用， 所述银杏内酯组合物包括银杏内酯A、 B、 K， 其特征在于， 以重量比计， 银杏内酯A： 银杏内酯B： 银杏内酯K比例为(2035)： (5070):(0.54)。 4.根据权利要求1所述的应用， 所述银杏内酯组合物包括银杏内酯A、 B、 K， 其特征在于， 以重量比计， 银杏内酯A： 银杏内酯B： 银杏内酯K比例为(2030)： (5065):(0.84)。 5.根据权利要求1-4任一所述的应用， 其。
4、特征在于， 所述肌萎缩性侧索硬化包括肌肉衰 弱和萎缩、 舌肌萎缩、 语音不清、 吞咽困难或全身性麻痹。 6.根据权利要求1-4任一所述的应用， 其特征在于， 所述治疗肌萎缩性侧索硬化药物选 自口服给药剂型、 注射给药剂型或外用给药制剂。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 所述口服给药剂型的剂量为0.2-0.8mg/ kg/d。 8.一种银杏内酯组合物在制备治疗基于TDP-25蛋白过表达引起的神经细胞退行性疾 病药物中的应用。 9.根据权利要求8所述的应用， 所述银杏内酯组合物包括银杏内酯A、 B、 K， 其特征在于， 以重量比计， 银杏内酯A： 银杏内酯B： 银杏内酯K比例为(20。
5、40)： (5075):(0.25)。 10.根据权利要求8-9任一所述的应用， 其特征在于， 所述TDP-25蛋白过表达引起的神 经细胞退行性疾病药物选自口服给药剂型、 注射给药剂型或外用给药制剂。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108096243 A 2 银杏内酯组合物的医药用途 技术领域 0001 本发明属于涉及医药技术领域， 特别是涉及银杏内酯组合物在治疗/预防肌萎缩 性侧索硬化中的应用。 背景技术 0002 肌萎缩性侧索硬化(amyotrophiclateralsclerosis， ALS)为肌肉萎缩症的一种。 该疾病不影响人的心智， 它主要导致肌肉衰弱和萎缩。 发病晚期。
6、会导致舌肌萎缩、 语音不清 和吞咽困难以及全身性麻痹。 该病发病年龄为30-50岁， 1-5年后常因呼吸困难而导致死亡。 通常说， 异常磷酸化的神经丝在脊髓前角运动神经元聚集被认为可能是ALS的重要病理特 征之一。 神经丝属于细胞骨架蛋白， 一般情况下， 神经丝在神经元胞浆内以非磷酸化形式存 在， 而轴索内的神经丝以磷酸化形式存在， 对维持轴索的直径等有重要作用。 异常磷酸化的 神经丝的可以抑制神经丝蛋白的降解， 导致其在核周异常聚集， 最终引起神经元变性、 死 亡。 0003 最近， 在肌萎缩侧索硬化患者的脑组织中发现了分子量约为43kDa的TARDNA结合 蛋白(TDP-43)阳性包涵体。。
7、 TDP-43是一种保守的， 广泛表达的核蛋白， 由1号染色体上 TARDBP基因编码。 病理状态下， TDP-43从细胞核向细胞质聚集， TDP-43功能与机理的发现丰 富了我们关于ALS发病机制的理解。 进一步的研究还发现， ALS患者是以胞质内聚集不溶性 的、 过度磷酸化的、 泛素化的和蛋白水解裂开的C端片段在受累的脑和脊髓区域堆积为特 征。 尤其是25kDa的TDP-43蛋白C末端片段(TDP-25)在受累的脑区域聚集提示它可能涉及疾 病的发病机制。 研究表明， TDP-25过度表达足以引起TDP-43的错误定位和TDP-43在胞质内 的异常积累。 因此， 科学家们建立了TDP-25的。
8、稳定转染细胞系， 其可以稳定过表达TDP-25， 在体外模拟肌萎缩侧索硬化症在细胞水平的病理变化， 从而作为肌萎缩侧索硬化症研究的 细胞模型。 此外， 有研究表明， 表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对稳转TDP-25和TDP-43基 因的NSC34细胞(鼠神经元细胞)活力具有显著的抑制作用。 0004 在ALS动物模型方面， 研究最多的是自然发病的动物模型， 即： Wobbler大鼠模型。 Wobbler大鼠之所以作为ALS的模型研究， 是由于常染色体突变隐性遗传导致脊髓神经元退 行性改变， 这与ALS神经元受损和临床表现具有相似性。 Wobbler大鼠表现为选择性的脊髓 运动神经元受损，。
9、 出现空泡样变性， 肌肉出现失神经性萎缩， 氨基酸和过氧化物的代谢异 常， 临床表现上累及动物的前肢肌肉， 出现行走摇晃和前爪无力， 渐到前爪瘫痪， 电生理研 究显示动物前肢失神经表现。 Wobbler大鼠模型因其神经元变性的特点， 适合于研究ALS疾 病神经元变性的发病机制。 0005 此外， 多年来尽管有许多关于ALS疾病的药物研究， 利鲁唑仍是惟一被FDA批准应 用于治疗ALS的药物， 但其也只能有限地延长病人的生存期。 因此， 关于ALS疾病的药物仍有 待开发。 近年来， 中药抗肌萎缩侧索硬化症的研究逐渐引起人们的关注， 而且由于很多中药 组分属于天然提取药物， 具有副作用小等优点。 。
10、有鉴于此， 本发明希望能从传统中药中寻找 到ALS疾病治疗的新方案。 说 明 书 1/6 页 3 CN 108096243 A 3 发明内容 0006 本发明以在两种模型上进行验证的方式对银杏内酯组合物进行研究， 旨在得到一 种具有治疗或预防肌萎缩性侧索硬化的银杏内酯组合物。 0007 由此， 本发明提出了银杏内酯组合物在制备治疗或预防肌萎缩性侧索硬化药物中 的应用。 其中， 所述肌萎缩性侧索硬化包括肌肉衰弱和萎缩， 或者舌肌萎缩、 语音不清、 吞咽 困难以及全身性麻痹等。 0008 具体地， 该银杏内酯组合物包括银杏内酯A、 B、 K， 其中， 以重量比计， 银杏内酯A： 银 杏内酯B： 银。
11、杏内酯K(2040)： (5075):(0.25)。 0009 进一步地， 以重量比计， 银杏内酯A： 银杏内酯B： 银杏内酯K(2035)： (5070): (0.54)。 更进一步， 以重量比计， 银杏内酯A： 银杏内酯B： 银杏内酯K(2030)： (50 65):(0.84)。 0010 具体地， 所述治疗或预防肌萎缩性侧索硬化药物中， 银杏内酯组合物注射治疗有 效量为0.2-0.8mg/kg/d。 0011 本发明还提出了一种制备治疗或预防TDP-25蛋白过表达引起的神经细胞退行性 疾病药物中的应用。 其中， TDP-25蛋白过表达是指25kDa的TDP-43蛋白C末端片段在受累的 。
12、脑区域聚集。 受累的脑区域包括： 层运动区， 脑干运动神经元以及脊髓运动神经元。 0012 具体地， 银杏内酯组合物可以使用各种药学上可接受的辅料制备成口服给药剂 型、 注射给药剂型、 外用给药制剂。 0013 进一步地， 银杏内酯组合物可以制备成胶囊剂、 片剂、 粉针剂、 透皮剂等等。 0014 本发明通过TDP-25的稳定转染细胞模型和Wobbler大鼠模型， 证实了本发明提出 的银杏内酯组合物对TDP-25蛋白具有抑制作用， 且不同剂量银杏内酯组合物均能显著延缓 Wobbler大鼠发病， 延长存活期， 该作用与临床上常用于缓解肌萎缩侧索硬化症的阳性对照 药利鲁唑的药效相似。 由此， 两种。
13、模型均表明， 银杏内酯组合物对肌萎缩性侧索硬化症均有 较好的疗效。 具体实施方式 0015 为了进一步说明本发明， 以下结合实施例对本发明提供的银杏内酯组合物在制备 预防和/或治疗ALS药物中的应用进行详细描述， 但不能将其理解为对本发明保护范围的限 定。 0016 需要注意的是， 如未注明具体条件者， 均按照常规条件或制造商建议的条件进行， 所用原料药或辅料， 以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市购获得的常 规产品。 除非另外说明， 否则所有的百分数、 比率、 比例或份数按重量计。 0017 除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。 。
14、此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用与本发明。 0018 银杏内酯类化合物对稳转TDP-25的NSC34细胞活力的抑制作用 0019 1、 实验材料 0020 1.1药物及试剂 0021 原料银杏内酯A(GA)、 银杏内酯B(GB)、 银杏内酯K(GK)以及银杏内酯组合物1-4由 说 明 书 2/6 页 4 CN 108096243 A 4 江苏康缘药业股份有限公司自制， 具体如下； 0022 0023 0024 鼠神经元细胞(NSC34细胞)， 购于美国ATCC细胞库。 pCI-neo载体和TDP-25由上海 生物工程技术有限公司合成并提供。 转染试剂lipofectami。
15、ne2000、 转染培养基Opti-MEM以 及筛选抗生素新霉素均购自于Invitrogen。 0025 DMEM培养基， 购自江苏凯基生物技术股份有限公司， 批号： 20151015， 细胞生长液 中含10胎牛血清、 1105U/L青霉素、 100mg/L链霉素。 MTS细胞增殖定量检测试剂盒， 购自 Promega公司， 批号00000657694。 0026 1.2主要耗材与仪器 0027 M2e型酶标仪， MolecularDevices； 0028 移液器， eppendorf公司； 0029 生物安全柜， 购自HealForce公司， 型号： HFsafe-1200； 0030 二。
16、氧化碳培养箱， 购自ThermoScientific公司， 型号： FormaSteri-Cycle371。 0031 2、 实验方法 0032 NSC34细胞在转染前一天， 用胰酶消化后接种在6孔板内， 待细胞汇合度达到80 左右时进行质粒转染。 转染步骤如下， 取2个无菌1.5ml离心管， 分别加入250ul的Opti-MEM。 说 明 书 3/6 页 5 CN 108096243 A 5 将10ullipofectamine2000加入一个离心管内， 轻轻混匀， 室温孵育5min。 将待转染的质粒 3ug加入另一个离心管中， 混匀； 孵育结束后将两个离心管混合在一起， 室温孵育20min。
17、； 将 待转染的细胞换成opti-MEM培养基。 孵育结束后将混合好的体系均匀加入待转染的细胞 中。 转染6h后换为含有新霉素的筛选培养基。 每2天换液一次， 待在显微镜下见到明显的单 克隆时即可挑选出来进行Western-blotting鉴定并进行实验。 0033 转染TDP-25基因的NSC34细胞用含10胎牛血清的DMEM培养基按1105个/ml浓 度接种96孔培养板， 每孔100 L。 用无血清DMEM培养基将银杏内酯类组合物配制成不同浓度 分别处理细胞， 设3个复孔， 同时设置正常组(不加药)和阳性对照组EGCG。 NSC34细胞于37 、 5CO2培养箱中培养48h。 加入100 。
18、LPBS溶液洗涤96孔2次， 加入用无血清DMEM培养基稀 释10倍的MTS试剂， 每孔100 L， 37、 5CO2培养箱中孵育2h， 酶标仪490nm测定吸光度(A)。 计算细胞生存率100A(正常组)-A(样品组)/A(正常组)， 并计算各银杏内酯类组合 物对NSC34细胞增殖的半数抑制浓度(IC50)。 0034 此外， 为了区分药物对细胞的抑制作用源于药理作用或是毒性作用， 关于银杏内 酯类化合物对转染空pCI-neo载体的NSC34细胞的毒性作用(TC50)也作了相应研究。 TC50和 IC50采用统计分析软件SPSS19.0进行计算。 实验结果如表1所示。 0035 表1银杏内酯。
19、抑制转染TDP-25基因NSC34细胞活力 0036 0037 0038 实验结果表明： 银杏内酯组合物中， YXNZ-1有较强的抑制转染TDP-25基因NSC34细 胞活力。 效果优于其他银杏内酯组合物及阳性对照药EGCG。 此外， 银杏内酯组合物对转染 TDP-25基因NSC34细胞无明显细胞毒性， 而EGCG具有一定的细胞毒性。 0039 银杏内酯类化合物组合使用对Wobbler大鼠的保护作用 说 明 书 4/6 页 6 CN 108096243 A 6 0040 1、 实验动物 0041 67周龄SPF级Wobbler大鼠(180220g)， 购自北京维通利华实验动物技术有限 公司， 。
20、饲养于独立通风系统中(温度： 2227， 湿度： 4050， 光暗周期： 12h/12h)， 喂以 灭菌的SPF级颗粒型鼠类饲料及灭菌水。 0042 2、 实验方法 0043 140只Wobbler大鼠随机分为14组： 安慰剂组(生理盐水， 含1羧甲基纤维素钠)、 阳性药组(每日10mg/kg利鲁唑)、 YXNZ-1-低剂量组(每日1.25mg/kg)、 YXNZ-1-中剂量组(每 日2.5mg/kg)、 YXNZ-1-高剂量组(每日5mg/kg)、 YXNZ-2-低剂量组(每日1.25mg/kg)、 YXNZ- 2-中剂量组(每日2.5mg/kg)、 YXNZ-2-高剂量组(每日5mg/kg。
21、)、 YXNZ-3-低剂量组(每日 1.25mg/kg)、 YXNZ-3-中剂量组(每日2.5mg/kg)、 YXNZ-3-高剂量组(每日5mg/kg)、 YXNZ-4- 低剂量组(每日1.25mg/kg)、 YXNZ-4-中剂量组(每日2.5mg/kg)、 YXNZ-4-高剂量组(每日 5mg/kg)。 阳性药组(原料)以及各组合物在含1羧甲基纤维素钠的生理盐水中混悬， 每日 灌胃给药， 连续给药10周。 每日观察大鼠行为状态， 按照如下标准进行： 5分： 无运动功能障 碍； 4分： 将大鼠悬吊时出现后肢伸展异常或震颤； 3分： 后肢明显无力、 步态异常； 2分： 双后 肢完全瘫痪， 爬行仅。
22、靠前肢； 1分： 死亡； 连续观察22周。 (丁苯酞对家族性肌萎缩侧索硬化动 物模型的神经保护作用， 阴均涛)统计大鼠发病潜伏期(实验开始至首次出现4分所述症状 的天数)和生存期(实验开始至死亡的天数)， 结果见表2。 0044 表2银杏内酯组合使用延缓Wobbler大鼠发病和死亡(n10) 0045 0046 *P0.01， *P0.05与安慰剂组比较； 0047 实验结果表明： 研究表明银杏内酯组合物各个组分有效剂量均显著可显著延缓 Wobbler大鼠发病， 延长Wobbler大鼠生存时间。 其中， 银杏内酯类组合物YXNZ-1药效最优， 说 明 书 5/6 页 7 CN 108096243 A 7 结果与体外结果相似。 且银杏内酯组合物YXNZ-1高剂量组药效与阳性对照药利鲁唑作用相 当。 0048 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说 明 书 6/6 页 8 CN 108096243 A 8 。