鼠毒素作为粘膜免疫佐剂的应用及含有该佐剂的鼠疫菌粘膜疫苗.pdf

《鼠毒素作为粘膜免疫佐剂的应用及含有该佐剂的鼠疫菌粘膜疫苗.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《鼠毒素作为粘膜免疫佐剂的应用及含有该佐剂的鼠疫菌粘膜疫苗.pdf（15页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710256330.0 (22)申请日 2017.04.19 (71)申请人 中国人民解放军军事医学科学院微 生物流行病研究所 地址 100071 北京市丰台区东大街20号五 所 (72)发明人 王效义 杨慧盈 杨文慧 周亚洲 范艳晓 冯娜 周冬生 杨瑞馥 (74)专利代理机构 北京尚诚知识产权代理有限 公司 11322 代理人 鲁兵 (51)Int.Cl. A61K 39/39(2006.01) A61K 39/02(2006.01) A61P 31/04(2006.01。

2、) (54)发明名称 鼠毒素作为粘膜免疫佐剂的应用及含有该 佐剂的鼠疫菌粘膜疫苗 (57)摘要 本发明公开了一种鼠毒素的新用途， 即作为 粘膜免疫佐剂的应用。 将含有鼠毒素粘膜免疫佐 剂的鼠疫菌粘膜疫苗通过滴鼻的方式免疫BALB/ c小鼠， 能显著提高血清中针对鼠疫菌保护抗原 产生的IgG和IgA抗体水平， 同时也能提高肺灌洗 液中的IgA抗体水平， 表明鼠毒素粘膜免疫佐剂 是一种能显著提高粘膜免疫应答效果的粘膜免 疫佐剂。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图3页 CN 107158372 A 2017.09.15 CN 107158372 A 1.鼠毒素在制备粘膜免疫佐剂中的应用。。

3、 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于： 所述鼠毒素为天然鼠毒素或重组表达的鼠 毒素。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于： 所述天然鼠毒素来源于鼠疫菌培养物， 用 高效液相色谱法提取得到。 4.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于： 所述重组表达的鼠毒素为用大肠杆菌重组 表达的鼠毒素。 5.根据权利要求1-4任一所述的应用， 其特征在于： 用鼠毒素制备粘膜免疫佐剂， 方法 为： 将鼠毒素50-80加热0.5-3h时间使其灭活， 灭活的鼠毒素即可直接作为粘膜免疫佐剂 使用； 所述鼠毒素的灭活条件优选为： 56加热1小时。 6.用权利要求5所述方法制备的鼠毒素粘膜免疫佐剂。 7.。

4、鼠疫菌粘膜疫苗， 能实现粘膜免疫应答， 包含鼠疫菌保护性抗原和权利要求6所述的 鼠毒素粘膜免疫佐剂， 或鼠疫菌保护性抗原和灭活后的权利要求1至4任一中提到的鼠毒 素。 8.根据权利要求7所述鼠疫菌粘膜疫苗， 其特征在于： 所述鼠疫菌保护性抗原包括但不 限于F1(荚膜抗原)、 LcrV(V-抗原)、 YscF和YopD。 9.根据权利要求7或8所述鼠疫菌粘膜疫苗， 其特征在于： 所述鼠疫菌保护性抗原为F1， 所述鼠疫菌粘膜疫苗是将灭活后鼠毒素或鼠毒素粘膜免疫佐剂与F1混合得到， 每20重量份 F1中灭活后鼠毒素或所述鼠毒素粘膜免疫佐剂的加入量大于或等于5重量份。 10.根据权利要求9所述鼠疫菌粘。

5、膜疫苗， 其特征在于： 每20重量份F1中灭活后鼠毒素 或所述鼠毒素粘膜免疫佐剂的加入量为5-20重量份。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107158372 A 2 鼠毒素作为粘膜免疫佐剂的应用及含有该佐剂的鼠疫菌粘膜 疫苗 技术领域 0001 本发明属于动物免疫领域中鼠疫菌粘膜疫苗的免疫佐剂， 特别是涉及鼠毒素作为 粘膜免疫佐剂的应用及含有该佐剂的鼠疫菌粘膜疫苗。 背景技术 0002 鼠疫是由鼠疫菌(Yersinia pestis)引起的烈性传染病。 近年来， 世界鼠疫疫情呈 上升趋势， 2000年世界卫生组织将鼠疫列为重新抬头的传染病(WHO.human plague in 1。

6、998and 1999.weekly epidemiological record 2000； 75:338-43.)。 另外， 鼠疫菌是一种 标准的生物战剂和生物恐怖剂， 美国已将鼠疫菌列为恐怖分子最有可能使用的6种生物剂 之一。 1994年印度发生的腺鼠疫流行和2005年发生的刚果肺鼠疫流行引起了各国政府的高 度重视(Campbell GL,Hughes JM.Plague in India:a new warning from an old nemesis.Ann Intern Med 1995Jan 15； 122(2):151-3.WHO.Plague in the Democrat。

7、ic Republic of the Congo.who site 2005.)。 我国是鼠疫疫情最严重的国家之一， 至今没有 任何种类的鼠疫疫苗进入临床试验阶段， 显然鼠疫疫苗的研究迫在眉睫。 0003 由于鼠疫灭活疫苗仅对腺鼠疫具有一定的保护作用， 而且保护时间短， 因此这类 疫苗不适合于大规模的预防接种。 美军在越战中曾使用的USP灭活疫苗于1999年也停止生 产(Russell P,Eley SM,Hibbs SE,Manchee RJ,Stagg AJ,Titball RW.A comparison of Plague vaccine,USP and EV76vaccine indu。

8、ced protection against Yersinia pestis in a murine model.Vaccine 1995Nov； 13(16):1551-6.)。 鼠疫菌EV76疫苗株是最好的减 毒活疫苗， 能提供早期的保护作用， 但有时副作用严重。 重组亚单位疫苗和DNA疫苗能够克 服传统疫苗的许多缺陷， 不含有感染性组分， 无致病性， 而且对腺鼠疫和肺鼠疫具有一定的 免疫保护作用。 0004 目前， 在鼠疫菌中发现的保护性抗原包括F1(荚膜抗原)、 LcrV(V-抗原)、 YscF和 YopD。 F1抗原由鼠疫菌pMT1质粒上的F1操纵子编码， 以多聚体的形式在细胞表面形。

9、成荚膜， F1抗体通过阻断F1蛋白的抗吞噬作用从而具有免疫保护作用(Du Y,Rosqvist R,Forsberg A .Role of fraction 1antigen of Yersinia pestis in inhibition of phagocytosis.Infect Immun 2002Mar； 70(3):1453-60.)。 LcrV、 YscF和YopD由鼠疫菌pCD1 质粒编码， 通过III型分泌系统(T3SS)分泌与转运(Cornelis GR.Molecular and cell biology aspects of plague.Proc Natl Acad 。

10、Sci U S A 2000Aug 1； 97(16):8778- 83.)。 LcrV是一种多功能蛋白， 与鼠疫菌的抗吞噬能力有关， 具有免疫保护和免疫抑制作用 (Pettersson J,Holmstrom A,Hill J,Leary S,Frithz-Lindsten E,von Euler-Matell A,et al.The V-antigen of Yersinia is surface exposed before target cell contact and involved in virulence protein translocation.Mol Microbiol 。

11、1999Jun； 32(5):961-76.)。 YscF是鼠疫菌III型分泌系统分泌的针状表面蛋白， 最近发现对 鼠疫具有较好的免疫保护作用。 YopD也是III型分泌系统分泌的表面蛋白， 参与III型分泌 说 明 书 1/8 页 3 CN 107158372 A 3 系统转运过程， 免疫保护作用不明显。 0005 肺鼠疫的早期症状类似于呼吸系统疾病， 而且病程发展迅速， 是致死性最强的鼠 疫。 生物战和生物恐怖常采用气溶胶的方式进行攻击， 因此研究针对肺鼠疫有效的疫苗是 极其重要的(Leona Nicole Calhoun Y-MK.salmonella-based plague vacc。

12、ines for bioterrorism.J Microbiol Immunol Infect 2006； 39:92-7.)。 为了有效地预防肺鼠疫， 一般认为疫苗必须经粘膜途径免疫才最有效。 因为微生物感染粘膜的过程包括粘附、 定居、 侵入、 释放毒素。 粘膜免疫接种的目的就是诱导局部产生免疫应答,阻止上述感染过程发 生。 粘膜免疫不但可在粘膜部位引起局部免疫应答， 也可有效地诱导全身性系统免疫反应。 其次， 由于粘膜淋巴细胞的归巢性， 在一个粘膜部位激活的部分淋巴细胞可以通过淋巴液 进入血液循环迁移到远处， 将免疫应答扩散到其它粘膜部位， 因此， 在一个粘膜部位接种疫 苗即可预防其它粘。

13、膜感染。 所以， 为了引起肺部粘膜保护反应， 必须经粘膜途径免疫， 粘膜 疫苗对于肺鼠疫免疫保护具有很好的效果， 而皮下、 肌肉注射是以氢氧化铝为佐剂， 注射免 疫诱导主要以系统免疫IgG为主， 均不能诱导有效的局部粘膜免疫应答(P.B.History of oral tolerance and mucosal immunity.Ann N Y Acad Sci 1996； 778:1-27.)。 虽然粘膜 疫苗具有很多优点,但是单纯将疫苗接种到粘膜表面效果并不理想。 因此， 用于粘膜接种的 疫苗常需与佐剂混合才能提高粘膜保护效果。 0006 鼠毒素是由鼠疫菌产生的一种对小鼠、 大鼠强毒， 但。

14、对豚鼠以上大动物低毒的毒 素。 过去一直认为鼠毒素是一种胞内毒素， 但近来的研究发现鼠毒素具有分泌到胞外的特 性， 因此鼠毒素既是一种胞内毒素也是一种分泌性毒素。 从鼠疫菌培养物种中提取纯化的 鼠毒素， 腹腔注射小白鼠的LD50(按每公斤体重计算)大约是10-185 g(Hinnebusch J, Cherepanov P,Du Y,Rudolph A,Dixon JD,Schwan T,et al.Murine toxin of Yersinia pestis shows phospholipase D activity but is not required for virulence i。

15、n mice.Int J Med Microbiol 2000Oct； 290(4-5):483-7.)， 而静脉途径的LD50大约是10 g (Ajl SJ,Rust J,Jr.,Hunter D,Woebke J,Bent DF.Preparation of serologically homogeneous plague murine toxin and its reactions with physical,chemical and enzymatic agents.J Immunol 1958 Jun； 80(6):435-40.)。 最近， 研究人员实现了鼠毒素 在大肠杆菌中的重组。

16、表达。 用大肠杆菌重组表达的鼠毒素分别腹腔、 静脉、 肌肉和皮下注射 小白鼠， 测得的LD50分别是50、 25.6、 160和89 g(Fan Y,Zhou Y,Feng N,Wang Q,Tian G,Wu X,et al.Recombinant murine toxin from Yersinia pestis shows high toxicity and b-adrenergic blocking activity in mice Microbes and Infection 2016； 18:329- 35.)。 由此可见， 重组表达的鼠毒素具有与天然鼠毒素相当的毒力， 为鼠毒素毒。

17、力的研究提 供了便利条件。 鼠毒素是一种细菌毒素， 与其它细菌毒素相比， 鼠毒素与某些毒素的毒力相 当， 如化脓性链球菌溶血素等； 许多细菌毒素的毒力比鼠毒素强， 如嗜水气单胞菌菌溶素 等 ； 某些细菌毒素的 毒力比鼠 毒素的 毒力弱 ， 如蜡样芽孢杆菌肠毒素等 (Gill DM.Bacterial Toxins:a Table of Lethal Amounts.Microbiological Reviews 1982； 46 (1):86-94.)。 0007 粘膜是机体抵抗感染的第一道防线， 粘膜相关淋巴组织则是机体最大的淋巴器官 系统， 可对外来物质产生相应的应答。 粘膜免疫可以诱导局。

18、部粘膜产生分泌性IgA、 IgM和 IgG等保护性抗体， 并可诱导其它部位的粘膜也产生IgA， 这是粘膜免疫保护作用的主要机 说 明 书 2/8 页 4 CN 107158372 A 4 制。 目前， 粘膜免疫反应的机制还不完全清楚， 但粘膜免疫佐剂能显著提高免疫反应强度的 特性使其成为感染免疫和疫苗领域的一个研究热点。 粘膜免疫佐剂的种类多种多样， 但无 共同特征， 因此无法判断一种物质是否具有粘膜免疫佐剂的特性。 目前， 人们通过动物实验 已开发出多种粘膜佐剂， 其中有相当一部分具有良好的免疫佐剂活性。 发明内容 0008 本发明的第一个目的是提供一种鼠毒素的新用途。 0009 本发明所提。

19、供的鼠毒素的新用途是鼠毒素可以用于制备能显著提高粘膜免疫应 答强度的粘膜免疫佐剂。 0010 所述鼠毒素可为天然鼠毒素或重组表达的鼠毒素。 鼠毒素基因的GenBank号为 X92727， 其序列如序列表中序列1所示。 0011 所述天然鼠毒素来源于鼠疫菌培养物， 提取方法为高效液相色谱法(Matthew C.Seguin,Daniel N.Harrison,James E.Williams.A rapid and safe procedure for preparing the murine toxins of the plague bacillus(yersinia pestis)Toxic。

20、on 1987； 25(9):989-994.)。 0012 所述重组表达的鼠毒素可为用大肠杆菌重组表达的鼠毒素。 方法为常规原核表达 方法。 0013 所述用鼠毒素制备粘膜免疫佐剂的方法为： 将鼠毒素50-80加热0.5-3h使其灭 活， 灭活的鼠毒素即可直接作为粘膜免疫佐剂使用。 0014 所述鼠毒素的灭活条件优选为： 56加热1小时。 0015 本发明所提供的鼠毒素粘膜免疫佐剂在制备鼠疫菌粘膜疫苗中的应用也属于本 发明。 鼠疫菌粘膜疫苗的制备方法， 是将鼠毒素粘膜免疫佐剂与鼠疫菌保护性抗原混合， 得 到鼠疫菌粘膜疫苗。 0016 本发明的第二个目的是提供一种鼠疫菌粘膜疫苗。 0017 本。

21、发明提出的鼠疫菌粘膜疫苗， 能实现粘膜免疫应答， 包含鼠疫菌保护性抗原和 所述鼠毒素粘膜免疫佐剂， 或包含鼠疫菌保护性抗原和任何灭活后的鼠毒素。 0018 这里， 所述保护性抗原包括但不限于F1(荚膜抗原)、 LcrV(V-抗原)、 YscF和YopD。 0019 具体的一种鼠疫菌粘膜疫苗， 所述鼠疫菌保护性抗原为F1， 将灭活后鼠毒素或所 述鼠毒素粘膜免疫佐剂与F1混合得到， 每20重量份F1中灭活后鼠毒素或所述鼠毒素粘膜免 疫佐剂的加入量大于或等于5重量份即可。 作为鼠疫菌粘膜疫苗的具体组配， 每20重量份F1 中灭活后鼠毒素或所述鼠毒素粘膜免疫佐剂的加入量为5-20重量份。 0020 所。

22、述鼠疫菌保护性抗原F1是从鼠疫菌中提取、 纯化的， 提取、 纯化方法为饱和硫酸 铵沉淀结合分子筛过滤的方法(Wang T,Qi Z,Wu B,Zhu Z,Yang Y,Cui B,et al.A new purification strategy for fraction 1capsular antigen and its efficacy against Yersinia pestis virulent strain challenge.Protein Expr Purif 2008Sep； 61(1):7- 12.)， 具体方法为： 将鼠疫菌EV76疫苗株接种BHI-xy培养基， 37培养。

23、24h， 然后转接种到含 无菌玻璃珠的BHI-xy培养基中， 37再培养72h， 离心收集上清， 上清用不同饱和度(饱和度 依次为40、 25和5)的硫酸铵分步沉淀后， 用Sephacryl S-200HR柱过滤得到天然F1抗 原。 说 明 书 3/8 页 5 CN 107158372 A 5 0021 本发明所提供的鼠疫菌粘膜疫苗可通过滴鼻的方式进行免疫， 免疫剂量为250- 1000 g/kg体重， 免疫时间为3-6周。 免疫剂量和免疫时间可根据实际情况进行调整。 0022 本发明提供了一种鼠毒素的新用途， 即作为粘膜免疫佐剂的应用。 将含有鼠毒素 粘膜免疫佐剂的鼠疫菌粘膜疫苗通过滴鼻的方。

24、式免疫BALB/c小鼠， 然后分离血清和肺灌洗 液， 通过ELISA测定IgG和IgA抗体水平， 检测结果表明鼠毒素粘膜免疫佐剂能显著提高血清 中针对鼠疫菌保护性抗原(例如F1)产生的IgG和IgA抗体水平， 同时也能提高肺灌洗液中的 IgA抗体水平， 表明鼠毒素粘膜免疫佐剂是一种能显著提高粘膜免疫应答效果的针对鼠疫 菌保护性抗原的粘膜免疫佐剂。 0023 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。 附图说明 0024 图1为用大肠杆菌表达的重组鼠毒素的12SDS-PAGE电泳图谱(A幅)和WB鉴定图 谱(B幅)； 0025 图2为纯化的重组鼠毒素的12SDS-PAGE电泳图谱(A幅)和WB。

25、鉴定图谱(B幅)； 0026 图3为含有鼠毒素粘膜免疫佐剂的鼠疫菌粘膜疫苗免疫小鼠的血清IgG抗体滴度 的ELISA测定结果； 0027 图4为含有鼠毒素粘膜免疫佐剂的鼠疫菌粘膜疫苗免疫小鼠的血清IgA抗体滴度 的ELISA测定结果； 0028 图5为含有鼠毒素粘膜免疫佐剂的鼠疫菌粘膜疫苗免疫小鼠的肺冲洗液IgA抗体 滴度的ELISA测定结果。 具体实施方式 0029 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法 ， 具体步骤可参见 ： Molecular Cloning:A Laboratory Manual (Sambrook， J.， Russell， David W.， Molecul。

26、ar Cloning:A Laboratory Manual， 3rd edition， 2001， NY， Cold Spring Harbor)。 0030 所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W， 单位g/100g)百分比浓度、 质 量/体积(W/V， 单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V， 单位mL/100mL)百分比浓度。 0031 实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达 到具体公开的目的， 不应成为对本发明生物材料来源的限制。 事实上， 所用到的生物材料的 来源是广泛的， 任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施。

27、例中的提 示替换使用。 0032 实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施， 给出了详细的实施方式和具体的 操作过程， 实施例将有助于理解本发明， 但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。 0033 实施例1、 制备鼠毒素粘膜免疫佐剂 0034 1、 获得重组鼠毒素 0035 参照文献(Fan Y,Zhou Y,Feng N,Wang Q,Tian G,Wu X,et al.Recombinant murine toxin from Yersinia pestis shows high toxicity and b-adrenergic blocking activity in mice.Mi。

28、crobes and Infection 2016； 18:329-35.)中记载的方法 说 明 书 4/8 页 6 CN 107158372 A 6 用大肠杆菌重组表达鼠毒素， 表达方法包括以下步骤： 0036 1)PCR扩增鼠毒素基因： 根据已知的鼠毒素基因(GenBank号： X92727)设计PCR扩增 引物 ， 引物序列为F ： 5 -CATGCATATGGGATGCTTCAAATAGATAATG-3 和R ： 5 - CCCCTCGAGATTTGGGCTTAATTTTGG-3 ， 再以鼠疫菌基因组DNA为模板， 在引物F和R的引导下 PCR扩增鼠毒素基因， PCR反应体系为： DN。

29、A模板(20ng)1 L， 上下游引物(5 M)各1 L， dNTP(10 M)3 L， 10buffer 3 L， Taq DNA聚合酶(5U/ L)0.2 L， 加无菌去离子水至总体积30 L， PCR反应条件为： 95预变性5min； 94变性40sec， 56退火40sec， 72延伸1min， 30个循 环； 最后72延伸10min。 PCR反应结束后， 对PCR扩增产物进行1琼脂糖凝胶电泳检测， 经 扩增获得了1764bp的目的基因， 与预期结果相符， 回收并纯化该目的基因， 测序， 测序结果 表明获得了序列正确的鼠毒素基因， 其核苷酸序列如序列表中序列1所示。 0037 2)构建。

30、鼠毒素的重组表达载体： 用Nde I酶和XhoI酶对步骤1)获得的鼠毒素基因 进行双酶切， 回收并纯化1764bp的双酶切鼠毒素基因片段， 用Nde I酶和Xho I酶对pET28a 载体(购自Novagen公司)进行双酶切， 回收并纯化5000bp的双酶切pET28a载体片段， 将双酶 切鼠毒素基因片段与双酶切pET28a载体片段进行连接， 连接体系为： 载体1 L， 目的片段4 L， T4DNA酶和10缓冲液各1 L， 加无菌去离子水至10 L， 连接条件为4连接过夜(6-12小 时)。 将连接产物转化大肠杆菌E.coli.BL21感受态细胞， 筛选阳性克隆， 提质粒， 测序， 测序 结果。

31、表明获得了序列及连接位置均正确的携带鼠毒素基因的重组表达载体， 命名为 pET28a-ymt。 0038 3)用大肠杆菌表达鼠毒素： 将步骤2)构建的鼠毒素重组表达载体pET28a-ymt转化 大肠杆菌BL21感受态细胞， 筛选阳性克隆。 将阳性单菌落接种于10mL LB液体培养基(含羧 苄青霉素200ug/mL， 卡那霉素30ug/mL和四环素25ug/mL)中， 在37、 250rpm条件下培养过 夜(6-12小时)。 将10mL过夜培养物转接至1L LB液体培养基(含羧苄青霉素200ug/mL， 卡那 霉素30ug/mL和四环素25ug/mL)中， 在37、 250rpm条件下培养至OD。

32、6000.6(约4小时)。 加 入IPTG至终浓度为0.1mM(加入1M IPTG溶液100ul)， 在23、 250rpm条件下继续培养过夜， 培养结束后， 6000rmp离心5分钟收获细菌。 将细菌沉淀重悬于40mL 10mM TrisHCl(pH 8.0)中， 冰浴中超声破碎(功率300W， 每次5秒， 间隔5秒， 共50次)， 在4、 12000rpm下离心30 分钟， 收集上清。 取离心前、 后样品进行12SDS-PAGE电泳和WB鉴定， 鉴定蛋白可溶性， 鉴定 结果如图1所示(A： SDS-PAGE电泳结果； B： WB鉴定结果。 泳道M为低分子量蛋白质标准， 泳道1 为沉淀中的鼠。

33、毒素蛋白， 泳道2为上清中的鼠毒素蛋白)， 鉴定结果表明： 经IPTG诱导表达 后， 获得了分子量为67kDa的鼠毒素重组蛋白， 与预期结果一致， 并主要以可溶的形式表达。 0039 4)纯化鼠毒素： 纯化重组表达的鼠毒素， 方法为镍柱亲和层析(Seema Mukhija and Bernhard Erni.Purification by Ni2+Affinity Chromatography,and Functional Reconstitution of the Transporter for N-Acetylglucosamine of Escherichia coli.Journal 。

34、of biological chemistry 1996,271(25):14819-14824.)， 对纯化的重组 鼠毒素进行12SDS-PAGE电泳和WB鉴定， 鉴定结果如图2所示(A： SDS-PAGE电泳结果； B： WB 鉴定结果。 泳道M为低分子量蛋白质标准， 泳道1为含50mM咪唑的PS洗脱获得的鼠毒素蛋白， 泳道2为含100mM咪唑的PS洗脱获得的鼠毒素蛋白， 泳道3为含200mM咪唑的PS洗脱获得的鼠 毒素蛋白)， 鉴定表明获得了分子量为67kDa的纯化的重组鼠毒素。 0040 2、 鼠毒素的灭活 说 明 书 5/8 页 7 CN 107158372 A 7 0041 将鼠毒。

35、素56加热1小时(50-80加热0.5-3时间均可)使其灭活， 灭活的目的是 降低鼠毒素对免疫动物的毒力而保留佐剂活性， 灭活的鼠毒素即可直接作为粘膜免疫佐剂 使用。 0042 实施例2： 制备含有鼠毒素粘膜免疫佐剂的鼠疫菌粘膜疫苗 0043 1、 获得鼠疫菌保护性抗原F1 0044 参照文献(Wang T,Qi Z,Wu B,Zhu Z,Yang Y,Cui B,et al.A new purification strategy for fraction 1capsular antigen and its efficacy against Yersinia pestis virulent s。

36、train challenge.Protein Expr Purif 2008Sep； 61(1):7-12.)中记 载的方法用从鼠疫菌中提取、 纯化鼠疫菌保护性抗原F1， 提取、 纯化方法包括以下步骤： 将 鼠疫菌EV76疫苗株(购自兰州生物制品研究所)接种BHI-xy培养基(购自Difco Laboratories,Subsidiary of Becton,Dickinsonand Company)， 37培养24h， 然后转接 种到含无菌玻璃珠的BHI-xy培养基中， 37再培养72h， 离心收集上清， 上清用不同饱和度 (饱和度依次为40、 25、 5)的硫酸铵分步沉淀后， 用Seph。

37、acryl S-200HR柱(购自 Amersham Biosciences)过滤得到天然F1抗原。 0045 2、 制备含有鼠毒素粘膜免疫佐剂的鼠疫菌粘膜疫苗及其免疫应答效果检测 0046 1)鼠疫菌粘膜疫苗及对照的组成 0047 F1抗原(20 g， 10 L)+灭活鼠毒素(1 g， 10 L) 0048 F1抗原(20 g， 10 L)+灭活鼠毒素(5 g， 10 L) 0049 F1抗原(20 g， 10 L)+灭活鼠毒素(10 g， 10 L) 0050 F1抗原(20 g， 10 L)+灭活鼠毒素(15 g， 10 L) 0051 F1抗原(20 g， 10 L)+灭活鼠毒素(20。

38、 g， 10 L) 0052 F1抗原(20 g， 20 L) 0053 灭活鼠毒素(20 g， 20 L) 0054 空白对照组(20 L生理盐水) 0055 将上述-组疫苗分别命名为F1+Y(20+1 g),F1+Y(20+5 g)， F1+Y(20+10 g)， F1 +Y(20+15 g)， F1+Y(20+20 g)， F1(20 g)， Y(20 g)， S(20 l)。 0056 2)制备鼠疫菌粘膜疫苗 0057 将鼠疫菌F1抗原用去离子水稀释成2 g/ l,分别取10 l稀释后的F1抗原与10 l含 不同量(见步骤1， 混合比例为20(F1):1-20(Y)的灭活鼠毒素(实施例。

39、1得到的鼠毒素粘膜 免疫佐剂)混合， 得到配比如(1)-(5)的鼠疫菌粘膜疫苗。 分别取20 l含20 g的F1抗原和20 l灭活鼠毒素作为对照。 取20 L生理盐水作为空白对照。 0058 3)免疫动物 0059 将6-8周雌性BALB/c小鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)随机分为8组， 其中 包括7个鼠疫菌粘膜疫苗组和1个空白对照组， 每组包含10只小鼠。 各组动物免疫前用戊巴 比妥麻醉， 分别滴鼻免疫小鼠， 免疫剂量为20 L/只小鼠， 空白对照组免疫生理盐水。 每隔1 周免疫一次， 共免疫3次， 免疫方法同上。 0060 4)血清IgG和IgA抗体滴度的ELISA测定 0061 初。

40、次免疫后第4周小鼠尾静脉采血， 4冰箱放置过夜(8-12小时)， 分离血清备用。 将制备的F1抗原用PBS稀释至终浓度500ng/mL， 每孔加100 L， 置4过夜， 包被酶联板。 每孔 说 明 书 6/8 页 8 CN 107158372 A 8 加200 L干酪素溶液(0.1)封闭酶联板， 置37孵箱后2小时， 取出， 拍干。 将各实验组动物 血清(一抗)分别用0.05干酪素溶液稀释， 以正常小鼠血清为阴性对照。 每孔加入1:500稀 释的实验动物血清100 L， 然后， 置37孵箱内湿盒中30分钟， 取出酶联板用洗液洗5次， 拍 干。 然后， 加入用0.05干酪素溶液配制的、 辣根过氧。

41、化物酶标记的羊抗鼠IgG或辣根过氧 化物酶标记的羊抗鼠IgA(二抗)， 置37湿盒中20分钟， 加底物TMB液(50 L/孔)， 37置湿 盒中10min， 取出直接加入终止液(50 L/孔)， 用酶联仪测定各孔OD450值。 抗体滴度以OD450值 的平均值SD表示。 0062 检测结果如图3和图4(纵坐标为OD值)所示， 可以看出， 与未添加鼠毒素粘膜免疫 佐剂的鼠疫菌粘膜疫苗F1抗原(20 g， 20 L)相比， F1抗原(20 g， 10 L)+灭活鼠毒素(5 g， 10 L)、 F1抗原(20 g， 10 L)+灭活鼠毒素(10 g， 10 L)、 F1抗原(20 g， 10 L)+。

42、灭活鼠 毒素(15 g， 10 L)和F1抗原(20 g， 10 L)+灭活鼠毒素(20 g， 10 L)各添加鼠毒素粘膜免 疫佐剂的鼠疫菌粘膜疫苗均引起血清IgG和IgA抗体水平的显著提高， 但F1抗原(20 g， 10 L)+灭活鼠毒素(1 g， 10 L)鼠疫菌粘膜疫苗产生的各抗体水平与不加佐剂的疫苗F1抗 原(20 g， 20 L)相当。 然而， 在、 、 和疫苗之间抗体水平无显著差异。 0063 检测结果表明， 鼠毒素粘膜免疫佐剂能显著提高F1抗原粘膜免疫应答的效果， 但 鼠毒素的加入量应高于1 g， 而5 g或以上加入量能显著提高F1抗原粘膜免疫应答的效果， 但过多加入鼠毒素量也无。

43、意义。 0064 5)肺灌洗液IgA抗体滴度的ELISA测定 0065 初次免疫后第4周， 腹腔注射1戊巴比妥溶液100 l， 麻醉后剪开颈部皮肤， 充分 暴露气管， 沿气管上端剪一楔形口， 用1mL生理盐水冲洗肺泡， 反复抽吸3次， 收集冲洗液， 离 心， 收集上清。 肺冲洗液IgA抗体滴度测定方法同血清抗体滴度测定方法， 所不同的是二抗 为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgA。 0066 检测结果如图5所示(纵坐标为OD值)， 可以看出， 与未添加鼠毒素粘膜免疫佐剂的 鼠疫菌粘膜疫苗F1抗原(20 g， 20 L)相比， F1抗原(20 g， 10 L)+灭活鼠毒素(5 g， 10 L)、 F。

44、1抗原(20 g， 10 L)+灭活鼠毒素(10 g， 10 L)、 F1抗原(20 g， 10 L)+灭活鼠毒素 (15 g， 10 L)和F1抗原(20 g， 10 L)+灭活鼠毒素(20 g， 10 L)各添加鼠毒素粘膜免疫佐 剂的鼠疫菌粘膜疫苗均引起肺灌洗液IgA抗体水平的显著提高， 但F1抗原(20 g， 10 L)+ 灭活鼠毒素(1 g， 10 L)鼠疫菌粘膜疫苗产生的各抗体水平与不加佐剂的疫苗F1抗原(20 g， 20 L)相当。 然而， 在、 、 和疫苗之间抗体水平无显著差异。 0067 检测结果表明， 鼠毒素粘膜免疫佐剂能显著提高F1抗原粘膜免疫应答的效果， 但 鼠毒素的加入。

45、量应高于1 g， 而5 g或以上加入量能显著提高F1抗原粘膜免疫应答的效果， 但过多加入鼠毒素量也无意义。 0068 实施例3： 制备含有鼠毒素粘膜免疫佐剂的鼠疫菌粘膜疫苗 0069 分别用其它鼠疫菌保护性抗原LcrV(V-抗原)、 YscF和YopD替代实施例2中的F1(荚 膜抗原)， 其它制备鼠疫菌粘膜疫苗与验证其针对不同抗原粘膜免疫应答效果的方法相同。 结果显示： LcrV中加入鼠毒素粘膜免疫佐剂制备的鼠疫菌粘膜疫苗能显著提高LcrV抗原粘 膜免疫应答的效果， YscF中加入鼠毒素粘膜免疫佐剂制备的鼠疫菌粘膜疫苗能显著提高 YscF抗原粘膜免疫应答的效果， YopD中加入鼠毒素粘膜免疫佐。

46、剂制备的鼠疫菌粘膜疫苗能 显著提高YopD抗原粘膜免疫应答的效果。 说 明 书 7/8 页 9 CN 107158372 A 9 0070 以上实施例验证了将含有鼠毒素粘膜免疫佐剂的鼠疫菌粘膜疫苗通过滴鼻的方 式免疫BALB/c小鼠， 然后分离血清和肺灌洗液， 通过ELISA测定IgG和IgA抗体水平， 检测结 果表明鼠毒素粘膜免疫佐剂能显著提高血清中针对鼠疫菌保护性抗原产生的IgG和IgA抗 体水平， 同时也能提高肺灌洗液中的IgA抗体水平， 表明鼠毒素粘膜免疫佐剂是一种能显著 提高粘膜免疫应答效果的针对鼠疫菌保护性抗原的粘膜免疫佐剂。 说 明 书 8/8 页 10 CN 107158372。

47、 A 10 序列表 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 鼠毒素作为粘膜免疫佐剂的应用及含有该佐剂的鼠疫菌粘膜疫苗 CGCNB175051W 1 1 1764 DNA 鼠毒素基因 1 atgcttcaaa tagataatgt cattaataat attggaaact actttcatca tctaagtaac 60 attaattata tacgacttct ggataccccc catgcttggg gagccccatt tggtaaagaa 120 atcatgcagc aatcttactt acggcaagag gagtttgcag gggcaatgac tgaagtactg 180 cggaattcgc gttatcgctg tgatatatca tcacttaata gccccgatgc agagtggcga 240 aaagtgattt ttaaggccat tgatgaatcc 。