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1、(10)授权公告号 CN 102512689 B (45)授权公告日 2014.08.20 CN 102512689 B (21)申请号 201110461144.3 (22)申请日 2006.10.17 2005-303497 2005.10.18 JP 200680038954.5 2006.10.17 A61K 47/48(2006.01) A61K 47/18(2006.01) A61K 47/28(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61K 9/127(2006.01) C12N 15/88(2006.01) (73)专利权人 大塚制药株式会社 地址 日本东京。
2、都 (72)发明人 丰福秀一 宫尾英男 佐藤正子 关口和生 (74)专利代理机构 北京市金杜律师事务所 11256 代理人 杨宏军 WO 00/27795 A1,2000.05.18, 权利要求 1-109. US 2003/0157030 A1,2003.08.21,权利要求 1-212. WO 2004/004758 A1,2004.01.15, 实施例 1. (54) 发明名称 核酸转运用载体组合物 (57) 摘要 本发明涉及一种核酸转运用载体组合物。本 发明的目的在于提供一种在将 siRNA 等核酸给予 来自动物的细胞或生物时能够保护核酸免于分解 并使其高效地转运至细胞内的、 低毒性的。
3、核酸转 运用载体组合物， 及含有该载体组合物和核酸的 核酸转运用组合物。本发明通过组合 (A) 具有甾 核的阳离子性脂质及 (B) 季铵盐型的阳离子性脂 质， 将其配合， 制备核酸转运用载体组合物。 另外， 混合该核酸转运用载体组合物和核酸来制备核酸 转运用组合物。 (30)优先权数据 (62)分案原申请数据 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张朝磊 权利要求书 2 页 说明书 12 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书12页 附图5页 (10)授权公告号 CN 102512689 B CN 102512689 B 1。
4、/2 页 2 1. 一种核酸转运用载体组合物， 其特征在于， 含有 (A) 具有胆固醇骨架的阳离子性脂 质、 及(B)季铵盐型的阳离子性脂质， 其中， 相对于100重量份(A)成分， 以10200重量份 的比例含有 (B) 成分， 所述季铵盐型的阳离子性脂质为选自下述物质中的至少一种 ： 二甲 基二(十八烷基)溴化铵盐、 二油酰基三甲基铵丙烷、 N-(1-(2， 3-双(油酰氧基)丙基)-N， N， N- 三甲基铵盐酸盐、 O， O - 二 ( 十二烷酰基 )-N-(a- 三甲基铵基乙酰基 ) 二乙醇胺盐酸 盐、 O， O - 二 ( 十四烷酰基 )-N-(a- 三甲基铵基乙酰基 ) 二乙醇胺。
5、盐酸盐、 p-w-(b- 羟基 乙基 ) 二甲基 - 铵基 - 癸基氧基 -p - 辛氧基偶氮苯溴化物盐、 及 O， O ， O” - 三 ( 十二烷 酰基 )-N-(w- 三甲基 - 铵基癸酰基 )- 三 ( 羟基甲基 ) 氨基甲烷溴化物盐。 2. 如权利要求 1 所述的核酸转运用载体组合物， 其中还含有 (C) 油性基材。 3. 如权利要求 1 所述的核酸转运用载体组合物， 其中， (A) 成分为 3-N-(N ， N - 二 甲基氨基乙烷 )- 氨基甲酰基 胆固醇、 及 / 或 3-N ， N ， N - 三甲基氨基乙烷 碘化胆 固醇。 4. 如权利要求 1 所述的核酸转运用载体组合物，。
6、 其中， 还含有 (D) 膜融合性脂质。 5. 如权利要求 1 所述的核酸转运用载体组合物， 其中， 相对于 100 重量份 (A) 成分， 以 30 150 重量份的比例含有 (B) 成分。 6. 如权利要求 2 所述的核酸转运用载体组合物， 其中， 相对于 100 重量份 (A) 成分及 (B) 成分的总量， 以 0.1 50 重量份的比例含有 (C) 成分。 7. 如权利要求 4 所述的核酸转运用载体组合物， 其中， 相对于 100 重量份 (A) 成分及 (B) 成分的总量， 以 1 500 重量份的比例含有 (D) 成分。 8. 如权利要求 1 所述的核酸转运用载体组合物， 所述组合。
7、物为 siRNA 转运用载体。 9. 一种核酸转运用组合物， 含有核酸及权利要求 1 至 8 中任一项所述的核酸转运用载 体组合物。 10. 如权利要求 9 所述的核酸转运用组合物， 其中， 核酸为 siRNA。 11. 一种核酸导入方法， 其特征在于， 通过使权利要求 9 所述的核酸转运用组合物与细 胞接触， 使核酸导入到细胞内， 所述细胞为培养细胞或从生物体中提取的细胞。 12. 含有 (A) 具有胆固醇骨架的阳离子性脂质及 (B) 季铵盐型的阳离子性脂质的组合 物在制备核酸转运用载体中的应用， 其中， 相对于 100 重量份 (A) 成分， 以 10 200 重量份 的比例含有 (B) 。
8、成分， 所述 (B) 季铵盐型的阳离子性脂质为选自下述物质中的至少一种 ： 二甲基二 ( 十八烷基 ) 溴化铵盐、 二油酰基三甲基铵丙烷、 N-(1-(2， 3- 双 ( 油酰氧基 ) 丙 基)-N， N， N-三甲基铵盐酸盐、 O， O -二(十二烷酰基)-N-(a-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺 盐酸盐、 O， O - 二 ( 十四烷酰基 )-N-(a- 三甲基铵基乙酰基 ) 二乙醇胺盐酸盐、 p-w-(b- 羟 基乙基 ) 二甲基 - 铵基 - 癸基氧基 -p - 辛氧基偶氮苯溴化物盐、 及 O， O ， O” - 三 ( 十二 烷酰基 )-N-(w- 三甲基 - 铵基癸酰基 )- 三 ( 。
9、羟基甲基 ) 氨基甲烷溴化物盐。 13. 如权利要求 12 所述的应用， 所述组合物还含有 (C) 油性基材。 14. 如权利要求 12 所述的应用， 其中， (A) 成分为 3-N-(N ， N - 二甲基氨基乙 烷 )- 氨基甲酰基 胆固醇、 及 / 或 3-N ， N ， N - 三甲基氨基乙烷 碘化胆固醇。 15. 如权利要求 12 所述的应用， 其中， 组合物还含有 (D) 膜融合性脂质。 16. 如权利要求 12 所述的应用， 其中， 组合物中相对于 100 重量份 (A) 成分， 以 30 150 重量份的比例含有 (B) 成分。 权 利 要 求 书 CN 102512689 B。
10、 2 2/2 页 3 17.如权利要求13所述的应用， 其中， 组合物中相对于100重量份(A)成分及(B)成分 的总量， 以 0.1 50 重量份的比例含有 (C) 成分。 18.如权利要求15所述的应用， 其中， 组合物中相对于100重量份(A)成分及(B)成分 的总量， 以 1 500 重量份的比例含有 (D) 成分。 19. 如权利要求 12 所述的应用， 所述核酸转运用载体为 siRNA 转运用载体。 权 利 要 求 书 CN 102512689 B 3 1/12 页 4 核酸转运用载体组合物 0001 本申请是申请日为 2006 年 10 月 17 日、 申请号为 20068003。
11、8954.5( 国际申请号为 PCT/JP2006/320617)、 发明名称为 “核酸转运用载体组合物” 的申请的分案申请。 技术领域 0002 本发明涉及一种在将核酸给予来自动物的细胞或生物时能够保护核酸不被分解 并将其高效率地转运至细胞内的、 低毒性且安全性高的核酸转运用载体组合物、 及核酸转 运用组合物。 背景技术 0003 近年， 随着生物技术的发展， 已经发现了多种在细胞内发挥生理活性功能的核酸。 例如， 已知 siRNA(small interfering RNA ： 小干扰 RNA) 可引起存在于细胞内的靶基因的 mRNA 分解， 阻碍靶基因表达 (RNA interferen。
12、ce ： RNA 干涉 )。由此 RNA 干涉产生的阻碍靶 基因表达的功能导致特定基因或基因组的异常表达， 在减轻所患疾病症状乃至治疗方面是 有用的， 故人们期待将 siRNA 开发用作治疗药。但是， 为了将以 siRNA 为首的核酸用作治疗 药等， 重要的是使 siRNA 在靶细胞内发挥功能， 因此， 确立使核酸有效地转运至靶细胞内的 技术必不可少。 0004 作为将外来性核酸分子或基因转运至细胞内的技术， 包括逆转录病毒、 腺病毒及 疱疹病毒等在内的多种病毒被用于人难治性疾病的治疗。 但是， 由于存在感染性、 免疫反应 性、 生产率等问题， 在治疗中有难度。 因此， 人们正在开发一种能克服。
13、来自病毒的问题、 且可 用于将核酸分子转运至细胞内的非病毒性载体。 0005 目前为止， 作为促进 siRNA 等核酸向细胞内转运的非病毒性核酸转运用载体， 例 如， 专利文献 1 中公开了特定结构的阳离子性脂质。但是， 专利文献 1 中公开的阳离子性脂 质， 具有在给予培养细胞或生物体时呈现毒性的缺点。另外， 专利文献 2 中， 作为毒性较低、 可将 siRNA 转运至细胞内的载体组合物， 公开了含有两亲性化合物及聚阳离子的组合物。 但是， 即使是专利文献 2 中公开的组合物， 在将充分量的 siRNA 导入细胞内时， 其对细胞的 毒性方面依然存在问题。 0006 以上述现有技术为背景， 人。
14、们期待开发出低毒性、 能够使以 siRNA 为代表的核酸 高效率地转运到细胞内的核酸转运用载体组合物。 0007 专利文献 1 ： 特表 2002-529439 号公报 0008 专利文献 2 ： 特表 2005-508394 号公报 发明内容 0009 因此， 本发明的目的在于解决上述现有技术中存在的问题。 具体而言， 本发明的目 的在于提供一种在将 siRNA 等核酸给予来自动物的细胞或生物时能够保护核酸不被分解 并将其高效率地转运至细胞内的、 低毒性且高安全性的核酸转运用载体组合物、 及含有该 载体组合物和核酸的核酸转运用组合物。 说 明 书 CN 102512689 B 4 2/12 。
15、页 5 0010 本发明人等为了解决上述问题进行了潜心研究， 发现组合含有 (A) 具有甾核的阳 离子性脂质、 及 (B) 季铵盐型的阳离子性脂质的组合物， 毒性低且能够保护核酸不被分解 并使其高效率地转运至细胞内， 作为核酸转运用载体是有用的。 本发明是基于上述发现， 通 过进一步反复研究而完成的。 0011 即， 本发明提供下述方案的发明 ： 0012 项 1. 一种核酸转运用载体组合物， 其特征在于， 含有 (A) 具有甾核的阳离子性脂 质、 及 (B) 季铵盐型的阳离子性脂质。 0013 项 2. 如项 1 所述的核酸转运用载体组合物， 其中还含有 (C) 油性基材。 0014 项 3。
16、. 如项 1 所述的核酸转运用载体组合物， 其中， (A) 成分为 3-N-(N ， N - 二 甲基氨基乙烷 )- 氨基甲酰基 胆固醇、 及 / 或 3-N ， N ， N - 三甲基氨基乙烷 碘化胆 固醇。 0015 项4.如项1所述的核酸转运用载体组合物， 其中， (B)成分为选自二甲基二(十八 烷基 ) 溴化铵盐、 二油酰基三甲基铵丙烷、 及 N-(1-(2， 3- 双 ( 油酰氧基 ) 丙基 )-N， N， N- 三 甲基铵盐酸盐中的至少 1 种。 0016 项 5. 如项 1 所述的核酸转运用载体组合物， 其中， 相对于 100 重量份 (A) 成分， 以 10 200 重量份的比。
17、例含有 (B) 成分。 0017 项 6. 如项 1 所述的核酸转运用载体组合物， 其中， 所述组合物为 siRNA 转运用载 体。 0018 项 7. 一种核酸转运用组合物， 其中含有核酸及项 1 至 5 中任一项所述的核酸转运 用载体组合物。 0019 项 8. 如项 7 所述的核酸转运用组合物， 其中， 核酸为 siRNA。 0020 项 9. 一种核酸导入方法， 其特征在于， 通过使项 7 所述的核酸转运用组合物与细 胞接触， 使核酸导入到细胞内。 0021 项 10.(A) 具有甾核的阳离子性脂质及 (B) 季铵盐型的阳离子性脂质的组合在制 造核酸转运用载体组合物中的用途。 0022。
18、 根据本发明的核酸转运用载体组合物及核酸转运用组合物， 可以得到下述优异的 效果。 0023 (1) 能够有效率地将核酸转运至细胞内， 使核酸在细胞内有效地发挥功能。 0024 (2) 能够抑制核酸在生物体内或培养液中分解。 0025 (3) 毒性低、 安全性高。 0026 所以， 上述核酸转运用载体组合物及核酸转运用组合物可以用于通过导入核酸进 行的各种疾病的治疗， 特别是对用低分子化合物等难于治疗的难治性疾病的治疗有效。 0027 另外， 本发明的核酸转运用组合物可以进行冻干处理， 因此， 也具有可在冻干状态 下保存的优点。 附图说明 0028 图 1 是表示在试验例 1 中使用各种受试试。
19、样处理细胞后， 通过荧光显微镜观察 来自细胞中的核酸的荧光像的结果的图。 0029 图 2 是表示在试验例 2 中使用各种受试试样处理细胞后， 测定细胞的荧光素酶 说 明 书 CN 102512689 B 5 3/12 页 6 活性的结果的图。 0030 图 3 是表示在试验例 3 中测定大鼠的肺中脑啡肽酶 (NEP) 活性的结果的图。 0031 图 4 是表示在试验例 4 中使用各种受试试样处理后的活细胞数的测定结果的 图。 0032 图 5 是表示在试验例 5 中将大鼠的肺组织切片用苏木精 - 伊红染色的结果的 图。图中， 苏木精将核核糖体等染成蓝绿色， 伊红将细胞质纤维红细胞染成红色。 。
20、具体实施方式 0033 以下， 详细地说明本发明。 0034 核酸转运用载体 0035 本发明的核酸转运用载体组合物的特征在于， 含有 (A) 具有甾核的阳离子性脂 质、 及 (B) 季铵盐型的阳离子性脂质。 0036 本发明的核酸转运用载体组合物可以作为用于将核酸转运(导入)至细胞内的核 酸载体使用。 0037 本发明的核酸转运用载体组合物适用的核酸， 只要是必需转运至细胞内的核酸即 可， 对其种类或结构没有特殊的限定。作为该核酸的具体例， 可以举出 siRNA、 mRNA、 tRNA、 rRNA、 cDNA、 miRNA( 微 RNA)、 核酶、 反义寡核苷酸、 诱饵寡核苷酸、 质粒 DN。
21、A、 肽核酸、 三链形 成性寡核苷酸 (Triplex Forming Oligonucleotide， TFO)、 基因等。其中， 本发明的核酸转 运用载体组合物在将 siRNA 向细胞内转运方面特别有用。本发明的核酸转运用载体适用的 核酸， 可以是来自人、 动物、 植物、 细菌、 病毒等的核酸， 另外， 也可以是通过化学合成制造的 核酸。 进而， 上述核酸可以是单链、 双链、 三链中的任一种， 并且对其分子量也没有特殊的限 定。另外， 本发明中， 核酸可以为被化学、 酶或肽修饰的核酸。本发明中， 核酸可以单独使用 1 种， 也可以 2 种以上适当地组合使用。 0038 本发明的核酸转运用载。
22、体组合物中使用的具有甾核的阳离子性脂质 ( 以下， 有 时也表示为 “(A) 成分” )， 是指具有甾核 ( 环戊烷多氢菲环 ； C17H28)、 显示阳离子性的脂质。 作为本发明中使用的具有甾核的阳离子性脂质， 只要是药理学上允许的脂质即可， 没有特 殊的限制， 作为具体例， 可以举出 3-N-(N ， N - 二甲基氨基乙烷 )- 氨基甲酰基 胆 固醇 (DC-Chol)、 3-N ， N ， N - 三甲基氨基乙烷 碘化胆固醇 (TC-Chol)、 (N ， N- 双 胍乙基氨基乙烷 ) 氨基甲酰 - 胆固醇 (bis(guanidinium)-tren-cholesterol)(BGT。
23、C)、 N- 胆甾烯基氧基羰基 -3， 7- 二氮杂壬烷 -1， 9- 二胺、 - 丙氨酸 - 二乙醇胺 - 胆固醇、 N4- 精胺胆固醇氨基甲酸酯 (GL-67 ； N4-spermine cholesteryl carbamate)、 NN4-3- 氨基 丙基亚精胺 胆固醇氨基甲酸酯 (GL-78 ； NN4-3-aminopropylspermidinecholesteryl carbamate)、 N4- 精胺胆固醇甲酰胺 (GL-90 ； N4-spermine cholesteryl carboxamide)、 N1， N8- 双 ( 精氨酸甲酰胺 )-N4- 亚精胺胆固醇氨基甲酸。
24、酯 (GL-95 ； N1， N8-Bis(argininc carboxamide)-N4-spermidine cholesteryl carbamate)、 N-N1， N4， N8- 三 (3- 氨 基 丙 基 ) 亚精胺 胆固醇氨基甲酸酯 (GL-96 ； N-N1， N4， N8-Tris(3-aminopropyl)spermidine cholesteryl carbamate) 等胆固醇衍生物 ( 具有胆固醇骨架的阳离子性脂质 ) ； 角鲨胺 (Squalamine)、 3a， 7a， 12a- 三 (3- 氨基丙氧基 )-5- 胆烷 -24-(N， N- 双 (3- 氨基丙。
25、基 ) 胺 (3a， 7a， 12a-Tris(3-aminopropoxy)-5-cholan-24-(N， N-bis(3-aminopropyl)amine)、 说 明 书 CN 102512689 B 6 4/12 页 7 3a， 7a， 12a- 三 (3- 氨基丙氧基 )-5- 胆烷 -24-(N-(N-(3- 氨基丙基 )-3- 氨基丙基 )- 胺 (3a， 7a， 12a-Tris(3-aminopropoxy)-5b-cholan-24-(N-(N-(3-aminopropyl)-3-aminop ropyl)-amine)、 3a， 7a， 12a- 三 (3- 叠氮基丙氧。
26、基 )-5- 胆烷 -24-(N， N- 双 (2- 氰基乙 基 ) 胺 )(3a， 7a， 12a-Tris(3-azidopropoxy)-5b-cholan-24-(N， N-bis(2-cyanoethyl) amine)、 3a， 7a， 12a- 三 (3- 叠氮基丙氧基 )-5- 胆烷 -24-(N-( 苄基氧基羰基 )-N-( 羟 基丙基 )- 胺 )(3a， 7a， 12a-Tris(3-azidopropoxy)-5b-cholan-24-(N-(benzyloxycarbon yl)-N-(3-hydroxypropyl)-amine) 等甾族化合物结合的阳离子性脂质 ；。
27、 伞状精胺复合体 (Umbrella-spermine conjugates)等胆酸结合的阳离子性脂质 ； 甾醇糖苷结合的阳离子性 脂质 ； 甾类皂苷结合的阳离子性脂质等。上述具有甾核的阳离子性单纯脂质可以单独使用 1 种， 或任意组合 2 种以上使用。 0039 作为具有甾核的阳离子性脂质， 优选举出胆固醇衍生物 ( 具有胆固醇骨架的阳 离子性脂质 )， 更优选举出 3-N-(N ， N - 二甲基氨基乙烷 )- 氨基甲酰基 胆固醇、 及 3-N ， N ， N - 三甲基氨基乙烷 碘化胆固醇 (TC-Chol)。 0040 作为本发明的核酸转运用载体组合物中使用的季铵盐型阳离子性脂质 ( 。
28、以下， 有 时也表示为 “(B) 成分” )， 只要在药理学上允许即可， 没有特殊限制。作为其具体例， 可以举 出二甲基二 ( 十八烷基 ) 溴化铵盐 (DDAB)、 1， 2- 二肉豆蔻酰基 -3- 三甲基铵丙烷、 1， 2- 二 油酰基 -3- 三甲基铵丙烷 (DOTAP)、 1， 2- 二油酰基 -3- 三甲基铵丙烷甲基硫酸盐、 1， 2- 二 棕榈酰基 -3- 三甲基铵丙烷、 1， 2- 二硬脂酰基 -3- 三甲基铵丙烷、 N-(1-(2， 3- 双 ( 油酰氧 基 ) 丙基 )-N， N， N- 三甲基铵盐酸盐 (DOTMA)、 二肉豆蔻酰基氧基丙基二甲基羟基乙基溴化 铵盐 (DMR。
29、IE)、 二油酰氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵 (DORIE)、 二甲基二 ( 十二烷基 ) 溴 化铵、 N-(a- 三甲基铵基乙酰基 )- 二 ( 十二烷基 )-D- 谷氨酰胺盐酸盐、 N-(a- 三甲基铵基 乙酰基 )-O， O - 双 -(1H， 1H， 2H， 2H- 全氟癸烷基 )-L- 谷氨酰胺盐酸盐、 O， O - 二 ( 十二 烷酰基 )-N-(a- 三甲基铵基乙酰基 ) 二乙醇胺盐酸盐、 甲基烯丙基二 ( 十二烷基 ) 溴化 铵、 N-p-(w- 三甲基铵基丁基氧基 )- 苯甲酰基 - 二 ( 十二烷基 )-L- 谷氨酰胺盐酸盐、 9-(w- 三甲基铵基丁基 )-3， 6- 双。
30、 ( 十二烷酰基 ) 咔唑溴化物、 二甲基二 ( 十八烷基 ) 铵盐 酸盐、 N-w- 三甲基铵基癸酰基 - 二 ( 十六烷基 )-D- 谷氨酰胺溴化物、 N-p-(w- 三甲基铵 基己基氧基 )- 苯甲酰基 - 二 ( 十四烷基 )-L- 谷氨酰胺溴化物、 p-(w- 三甲基铵基癸基氧 基 )-p - 辛氧基偶氮苯溴化物盐 (MC-1-0810)、 p-w-(b- 羟基乙基 ) 二甲基 - 铵基 - 癸基 氧基 -p - 辛氧基偶氮苯溴化物盐 (MC-3-0810)、 O， O ， O” - 三 ( 十二烷酰基 )-N-(w- 三 甲基 - 铵基癸酰基 )- 三 ( 羟基甲基 ) 氨基甲烷溴。
31、化物盐 (TC-1-12)、 1， 2- 二月桂基 - 甘 油 -3- 乙基磷酸胆碱、 1， 2- 二肉豆蔻酰基 - 甘油 -3- 乙基磷酸胆碱、 1， 2- 二棕榈酰基 - 甘 油 -3- 乙基磷酸胆碱、 1， 2- 二硬脂酰基 - 甘油 -3- 乙基磷酸胆碱、 1， 2- 二油酰基 - 甘 油 -3- 乙基磷酸胆碱、 1- 棕榈酰基 -2- 油酰基 - 甘油 -3- 乙基磷酸胆碱等。上述季铵盐型 阳离子性脂质可以单独使用 1 种， 也可以任意组合 2 种以上使用。 0041 上述季铵盐型阳离子性脂质中， 优选举出二甲基二(十八烷基)溴化铵盐(DDAB)、 二油酰基三甲基铵丙烷 (DOTAP。
32、)、 N-(1-(2， 3- 双 ( 油酰氧基 ) 丙基 )-N， N， N- 三甲基铵盐酸 盐(DOTMA)、 O， O -二(十二烷酰基)-N-(a-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺盐酸盐(DC-6-12， n 12 ； 及 DC-6-14， n 14)、 p-w-(b- 羟基乙基 ) 二甲基 - 铵基 - 癸基氧基 -p - 辛氧 基偶氮苯溴化物盐 (MC-3-0810)、 及 O， O ， O” - 三 ( 十二烷酰基 )-N-(w- 三甲基 - 铵基癸酰 说 明 书 CN 102512689 B 7 5/12 页 8 基 )- 三 ( 羟基甲基 ) 氨基甲烷溴化物盐 (TC-1-12)， 。
33、更优选举出二甲基二 ( 十八烷基 ) 溴 化铵盐 (DDAB)、 二油酰基三甲基铵丙烷 (DOTAP)、 N-(1-(2， 3- 双 ( 油酰氧基 ) 丙基 )-N， N， N- 三甲基铵盐酸盐 (DOTMA)。 0042 另外， 本发明的核酸转运用载体组合物中， 对(A)成分和(B)成分的配合比率没有 特殊的限制， 从将核酸有效地转运至细胞内的观点考虑， 相对于100重量份(A)成分， (B)成 分为 10 200 重量份， 优选为 30 150 重量份， 更优选为 75 125 重量份。另外， 相对于 本发明的核酸转运用载体的总量， (A)成分和(B)成分的总量例如可以为10100重量， 。
34、优选为 20 80 重量， 更优选为 40 70 重量。 0043 本发明的核酸转运用载体组合物， 除上述(A)及(B)成分之外， 还可以含有油性基 剂 ( 以下， 有时也称为 (C) 成分 )。配合油性基剂， 利用其特性， 由此能够控制核酸转运用 载体组合物的核酸导入效率。例如通过配合油性基剂调整核酸转运用载体组合物的比重， 可以控制细胞和核酸转运用载体组合物的接触性， 改善体外的导入效率。 另外， 例如通过配 合具有温度感受性功能的油剂作为油性基剂， 能够在规定的温度条件下使核酸载体的芯破 碎， 诱发细胞表面的波动， 提高核酸的导入效率。进而， 例如通过配合具有外部刺激破碎性 的油剂作为油。
35、性基剂， 可以通过外部刺激使核酸载体组合物的芯破碎， 诱发细胞表面的波 动， 提高核酸的导入效率。 0044 作为本发明的核酸转运用载体组合物中配合的油性基材， 例如可以举出， 全氟化 碳、 全氟戊烷、 溴代全氟辛烷、 全氟己烷、 全氟三丁基胺、 大豆油、 精制大豆油、 氢化大豆油、 大豆油非皂化物、 角鲨烯、 蓖麻油、 丁香油、 三油酸脱水山梨糖醇酯、 松节油、 红花油、 红花油 脂肪酸、 油酸、 棕榈油、 菜子油、 杂醇油、 橄榄油、 亚麻仁油、 芝麻油、 叶绿素油、 巴豆油、 佛手 油、 雪松油、 橙油、 茴香油、 桉树油、 玉米油、 熏衣草油、 马郁兰油、 柠檬油、 棉籽油、 椰子油、。
36、 蛋 黄油、 玫瑰花油、 松油、 杏仁油、 花生油、 山茶油、 白樟油、 春黄菊油、 桂皮油、 薄荷油、 酯化玉 米油、 生姜油、 罗马春黄菊油、 蛇油、 留兰香油 (spearmintoil)、 向日葵油、 可可脂、 小麦胚 芽油、 氧化锌油、 氢化油、 氢化植物油、 轻质液体石蜡、 液体石蜡、 中链脂肪酸三甘油酯、 貂油 (minkoil)、 苦橙油、 聚氧乙烯蓖麻油、 聚氧乙烯氢化蓖麻油、 聚氧乙烯氢化蓖麻油 10、 聚氧 乙烯氢化蓖麻油 100、 聚氧乙烯氢化蓖麻油 20、 聚氧乙烯氢化蓖麻油 40、 聚氧乙烯氢化蓖麻 油 5、 聚氧乙烯氢化蓖麻油 50、 聚氧乙烯氢化蓖麻油 60、 。
37、聚氧基 35 蓖麻油、 操作油等。上述 油性基剂中， 全氟戊烷具有温度感受性， 具有在 29.5下通过沸腾气化的特性。另外， 全氟 己烷、 溴代全氟辛烷、 及全氟三丁基胺具有下述特性， 即具有外部刺激破碎性， 在由超声波 照射产生的刺激等来自外部的刺激作用下， 使载体组合物的芯产生空腔， 使其破碎。 0045 含有该油性基剂时， 作为该油性基剂的比例， 只要不妨碍本发明的效果即可， 没有 特殊的限制， 例如可以为下述比例， 即相对于 100 重量份上述 (A) 成分及 (B) 成分的总量， 该油性基材为 0.1 50 重量份， 优选为 1 30 重量份， 更优选为 5 20 重量份。 0046。
38、 进而， 本发明的核酸转运用载体组合物中根据需要也可以含有膜融合性脂质 ( 辅 助脂质 )。通过含有上述膜融合性脂质， 能够进一步提高核酸向细胞内的转运效率。作为 上述膜融合性脂质， 例如可以举出， 二油酰基磷脂酰乙醇胺、 二油酰基磷脂酰胆碱、 反式磷 脂酰基磷脂酰基乙醇胺、 1， 2- 双 (10， 12- 二十三烷二酰基 )- 磷酸乙醇胺、 1， 2- 二反油酰基 磷酸乙醇胺、 1， 2- 二 ( 十六烷基 ) 磷酸乙醇胺、 1， 2- 二己酰基磷酸乙醇胺、 1， 2- 二月桂酰 基磷酸乙醇胺、 1， 2- 二亚油酰基磷酸乙醇胺、 1， 2- 二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺、 1， 2- 二油酰 。
39、说 明 书 CN 102512689 B 8 6/12 页 9 基磷酸乙醇胺、 1， 2- 二棕榈油酰基磷酸乙醇胺、 1， 2- 二棕榈酰基磷酸乙醇胺、 1， 2- 二植烷 酰磷酸乙醇胺、 1， 2- 二硬脂酰基磷酸乙醇胺、 1- 棕榈酰基 -2- 油酰基磷酸乙醇胺、 1- 棕榈 酰基 -2-(10， 12- 二十三烷二酰基 ) 磷酸乙醇胺、 1， 2- 二油酰基磷酸乙醇胺 -N- 己酰胺、 1， 2- 二棕榈酰基磷酸乙醇胺 -N- 己酰胺、 N， N- 二甲基 -1， 2- 二油酰基磷酸乙醇胺、 N， N- 二 甲基 -1， 2- 二棕榈酰基磷酸乙醇胺、 N- 十二烷酰基 -1， 2- 二棕。
40、榈酰基磷酸乙醇胺、 N- 十二 烷酰基 -1， 2- 二油酰基磷酸乙醇胺、 1， 2- 二油酰基磷酸乙醇胺 -N- 十二烷基胺、 1， 2- 二棕 榈酰基磷酸乙醇胺 -N- 十二烷基胺、 1， 2- 二油酰基磷酸乙醇胺 -N- 戊二酰、 1， 2- 二棕榈酰 基磷酸乙醇胺 -N- 戊二酰、 1， 2- 二油酰基磷酸乙醇胺 -N- 乳糖、 1， 2- 二油酰基磷酸乙醇 胺-N-4(p-马来酰亚胺甲基)环己烷-羧酸盐、 二棕榈酰磷酸乙醇胺-N-4(p-马来酰亚胺 甲基 ) 环己烷 - 羧酸盐、 1， 2- 二棕榈酰基磷酸乙醇胺 -N-4(p- 马来酰亚胺苯基 ) 丁酰胺、 1， 2-二油酰基磷酸乙。
41、醇胺-N-4(p-马来酰亚胺苯基)丁酸盐、 N-甲基-1， 2-二油酰基磷 酸乙醇胺、 N- 甲基 - 二棕榈酰基磷酸乙醇胺、 1， 2- 二油酰基磷酸乙醇胺 -N-3-(2- 吡啶二 硫 ) 丙酸盐、 1， 2- 二棕榈酰基磷酸乙醇胺 -N-3-(2- 吡啶二硫 ) 丙酸盐、 N-( 琥珀酰 )-1， 2- 二油酰基磷酸乙醇胺、 N-( 琥珀酰 )-1， 2- 二棕榈酰基磷酸乙醇胺等。其中， 在本发明的 核酸转运用载体组合物中优选使用二油酰基磷脂酰乙醇胺。 0047 含有该膜融合性脂质时， 作为该膜融合性脂质的比例， 只要不妨碍本发明的效果 即可， 没有特殊的限制， 可以举出下述比例， 即相。
42、对于 100 重量份上述 (A) 成分及 (B) 成分 的总量， 该膜融合性脂质为 1 500 重量份， 优选为 10 250 重量份， 更优选为 25 100 重量份。 0048 根据使用形态， 本发明的核酸转运用载体组合物可以含有等渗剂、 赋形剂、 稀释 剂、 增稠剂、 稳定剂、 缓冲剂、 保存剂等各种添加剂。上述添加剂的配合量， 可以根据核酸转 运用载体的使用形态适当地设定。 0049 本发明的核酸转运用载体组合物通过混合上述 (A) 成分、 (B) 成分、 及根据需要混 合其他成分而制造。 0050 核酸转运用组合物 0051 本发明的核酸转运用组合物是含有上述核酸转运用载体组合物和核。
43、酸的组合物， 在该核酸转运用组合物中， 核酸与核酸转运用载体组合物的配合成分通过离子键或疏水键 形成复合体， 提高核酸向细胞内的转运率。 0052 本发明的核酸转运用组合物通过混合上述核酸转运用载体组合物和核酸， 或以任 意顺序混合核酸及上述核酸转运用载体组合物的配合成分而进行制造。 0053 本发明的核酸转运用组合物中， 作为核酸和核酸转运用载体组合物的配合比率， 根据使用的核酸或核酸转运用载体的种类或为核酸转运对象的细胞的种类等而不同， 例 如， 可以举出以下比例， 即相对于 100 重量份核酸转运用载体组合物中所含的 (A) 及 (B) 成 分的总量， 核酸为 0.1 300 重量份， 。
44、优选为 1 100 重量份， 更优选为 2.5 50 重量份。 0054 另外， 作为核酸转运用组合物中所含的(A)及(B)成分的总量， 相对于该组合物的 总量， 例如可以举出 10 90 重量， 优选为 30 80 重量， 更优选为 50 70 重量。 0055 根据使用形态， 本发明的核酸转运用组合物可以含有等渗剂、 赋形剂、 稀释剂、 增 稠剂、 稳定剂、 缓冲剂、 保存剂等多种添加剂。上述添加剂的配合量可以根据核酸转运用组 合物的使用形态适当地设定。 说 明 书 CN 102512689 B 9 7/12 页 10 0056 本发明中， 作为核酸被转运的细胞， 可以举出培养细胞、 从生。
45、物体中提取的细胞 ( 包含株化的细胞 )、 生物体内存在的细胞等。 0057 作为本发明的核酸转运用组合物的使用状态， 只要能使该核酸转运用组合物与作 为核酸导入对象的细胞接触即可， 没有特殊限制。例如， 向生物体内的细胞中转运核酸时， 例如可以举出向组织中直接注入 ； 向静脉、 皮下、 肌肉、 腹腔、 眼内、 消化器官内、 牙内等注 射 ； 从鼻腔、 口腔、 肺等吸入给予 ； 口服给予 ； 通过皮肤的透皮给予 ； 及通过口腔粘膜、 阴道 粘膜、 眼粘膜、 直肠粘膜、 子宫粘膜的经粘膜给予等。 另外， 在向培养细胞或从生物体提取的 细胞中转运核酸的情况下， 可以举出将核酸转运用组合物预先添加到。
46、培养基中， 在该状态 下培养细胞的方法。 需要说明的是， 向培养细胞或从生物体提取的细胞中转运核酸时， 即使 在血清存在下也可以将核酸转运至细胞内。 0058 实施例 0059 以下， 根据实施例等详细地说明本发明， 但本发明并不限定于此。 0060 实施例 1 0061 制备下述组成的核酸转运用载体组合物。 0062 0063 实施例 2 0064 首先， 制备下述组成的含核酸的液体。 0065 siRNA 2pmol 0066 OPTI-MEM 培养基 (Invitrongen 社制 ) 适量 0067 总量 50l 0068 然后， 将50l上述所得的核酸转运用载体组合物和50l含有核酸。
47、的液体混合， 在室温下培养 20 分钟， 由此制备 siRNA 转运用组合物。 0069 实施例 3 0070 制备下述组成的核酸转运用载体组合物。 0071 说 明 书 CN 102512689 B 10 8/12 页 11 0072 实施例 4 0073 制备下述组成的核酸转运用载体组合物。 0074 0075 试验例 1 0076 为了评价实施例 2 的 siRNA 转运用组合物向细胞内的 siRNA 转运性， 以 A549 细胞 ( 来自人肺癌的细胞株 ； 日本制药社制 ) 为模型细胞进行以下试验。需要说明的 是， 在本试验中， siRNA 使用荧光标记的 GL3-siRNA( 靶向萤。
48、火虫荧光素酶的 siRNA ； Dharmacon 社， Boulder， CO， USA ；有意义 ： 5 -CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT， 反义 ： 5 -UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT)。 0077 首先， 使用 DMEM 培养基 (Dulbecco-Minimum Essential Medium)， 将 A549 细胞调 整至浓度为 1.2105个 /ml， 接种上述细胞， 使 24- 孔培养板中每 1 孔加入 6.0104个细 胞。接下来向各孔中添加 500l 表 1 所示的受试试样， 在 37、 5 CO2条件下培养 24 小 时。然后使用荧光显微镜 (Olympus IX 71 fluorescence microscope ； Olympus， Tokyo， 日 本 ) 观察来自细胞中的核酸的荧光像， 评价向细胞内的 siRNA 转运性。 0078 表 1 0079 说 明 书 CN 102512689 B 11 9/12 页 12 0080 所得结果如图 1 所示。仅添加 siRNA 。