技术领域
本发明涉及一种藏药锡金报春抗氧化提取物及其制备方法；本发明进一步涉及所述提取物的药物组合；本发明还涉及所述提取物在抗氧化药物或化妆品中的应用；属于中药领域。
背景技术
1956年，英国人Harman提出“自由基学说”，该学说认为自由基攻击生命大分子造成组织损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤恶性疾病的重大原因。随着人们对自由基研究的深入，这一学说也为越来越多的人接受。自由基是指“任何包含一个未成对电子的原子或原子团”，对人体健康影响极大。在生理情况下，氧处于较低水平，其产生和清除处于动态平衡，但在某些病理情况下，自由基过剩，导致机体损伤。自由基除本身对生物大分子（蛋白质、DNA）有损伤作用外，还会造成多不饱和脂肪酸的脂质过氧化( LPO) ，而LPO 反应的终产物是丙二醛(MDA)，从而使蛋白质、核酸、脑磷脂发生交联并丧失其活性。大量研究表明，与老化相关的疾病和基因的突变，如癌症、心血管疾病、风湿性关节炎、糖尿病、神经性疾病、衰老等都同自由基导致的损伤相关,清除了体内多余的自由基就能预防衰老和疾病。因此寻求利用人体易于吸收的、能清除体内过量自由基的外源抗氧化剂成为一个新的研究热点。然而，随着合成抗氧化剂日益突出的潜在毒性和致癌作用被人们排斥，从植物中寻找天然、高效、低毒的抗氧化剂就成为了目前抗氧化剂发展的一个必然趋势，同时也为现代医学和保健行业的指明了方向。
报春花科（Primulaceae）属双子叶植物纲五桠果亚纲的一科，多年生或一年生草本，约22属800种，广布全球，主产于北半球温带；中国产12 属约500 种，全国各地都有分布。该科植物种类多，药理作用广泛，主要有降低小鼠的血清尿酸水平，促进大鼠胆汁分泌，减少胆色素结石的成石率，免疫调节等功能，据报道其主要化学成分有黄酮类、萜类、甾醇类、有机酸类、醌类等。锡金报春(Primula Sikkimensdis Hook)，又名钟花报春花，属于报春花科报春花属植物, 是一种常见的藏药材, 以花入药, 是藏药“像志色保”原植物。花黄色, 钟状, 聚生于花葶顶端, 主产于西藏东部及南部、青海东南部、四川西部、云南西北部; 主要用于清热解毒, 心脉瘀阻、血脉不畅等疾病, 经几个藏医院的临床医生实践证明, 在治疗心脉瘀阻、血脉不畅方面, 疗效确切, 在甘孜藏族地区, 藏民们也广泛使用, 经过资源调查, 资源十分丰富。其化学成分未见报道，更未见到锡金报春及其有效部位抗氧化作用研究与应用方面的报道。我们对其总提物及不同溶剂极性部位进行了抗氧化活性的初步研究，活性实验表明：其总提物和某些极性部位具有良好抗氧化活性。
发明内容
本发明的目的之一是，提供一种锡金报春的抗氧化提取物及其制备方法。本发明的目的之二是，提供一种以所述提取物为有效成分的药物组合物。本发明的目的之三是，提供所述提取物在制备抗氧化及其相关药物和化妆品中的应用。
本发明比较了不同溶剂的萃取物的抗氧化活性，确定了具有抗氧化作用的提取物及其制备方法。
本发明所述锡金报春提取物选自从锡金报春醇提物中萃取得到的石油醚提取物（XJ-1）、氯仿提取物（XJ-2）、乙酸乙酯提取物（XJ-3）、正丁醇提取物（XJ-4）和水提取物（XJ-5）之一或其组合；优选从锡金报春醇提物中萃取得到的石油醚提取物（XJ-1）、氯仿提取物（XJ-2）、正丁醇提取物（XJ-4）或其组合；或者优选从锡金报春醇提物中萃取得到的乙酸乙酯提取物（XJ-3）、正丁醇提取物（XJ-4）或其组合。
本发明的提取物可以经过提取、浓缩、系列萃取得到，其制备方法包括以下步骤：
⑴ 取锡金报春全草粗粉， 用乙醇浸泡，超声波助溶提取，过滤，滤渣重复上述提取，过滤，合并提取液；
⑵ 将提取液减压浓缩得到浓缩液，再将浓缩液与水混合，得到稀释后的浓缩液。
⑶ 用不同极性溶剂石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇梯度萃取，每种溶剂重复
萃取，合并相同有机相，减压浓缩得到各溶剂的提取物。
所述方法优选包括以下步骤：⑴取锡金报春全草粗粉， 用30倍质量的不同浓度乙醇浸泡24 h，超声波助溶提取1 h，过滤，滤渣重复上述提取过程2次，过滤，合并三次提取液，其中所用乙醇优选60-90%乙醇。⑵将提取液减压浓缩至相对密度为1.10-1.24 mg/mL(55℃)，得到浓缩液，再将浓缩液与水按体积比1：1混合，得到稀释后的浓缩液；⑶用与稀释后浓缩液等体积的不同极性溶剂石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇梯度萃取，每种溶剂分别重复萃取2次，合并相同有机相，减压浓缩得到各溶剂的提取物。
本发明还提供以所述方法制备的各溶剂提取物的药物组合物。所述药物组合物是以本发明的提取物为有效成分，与药学上可接受的载体所组成，并以合适的药用制剂形式存在，这些制剂可以是片剂（优选糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、缓释片剂）、胶囊剂（优选硬胶囊剂、软胶囊剂、缓释胶囊剂）、口服液、合剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、粉针剂、冻干粉针剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴丸、滴丸剂、贴剂等。
本发明进一步提供了各种提取物在制备治疗和或预防氧化药物和化妆品中的应用。为此进行的抗氧化相关实验以清除DPPH自由基、羟基自由基为活性指标。实验结果表明，乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物具有明显体外清除DPPH脂性自由基的能力；石油醚提取物、氯仿提取物和正丁醇提取物具有较好清除羟基自由基，具有抗氧化作用，可用于制备抗氧化药物和化妆品。
具体实施方案：
实施例1：
各提取物的制备方法：
1）总提物提取
取锡金报春全草粗粉20 g， 用600 ml 90%乙醇浸泡24 h，超声波助溶提取1 h，过滤，滤渣重复上述提取过程2次，过滤，合并三次提取液。
2）浓缩
将提取液减压回收乙醇得浓缩液（相对密度为1.15g/mL, 55℃），再将浓缩液与水按体积比1：1混合，得到稀释后的浓缩液( 90 ml)。
3）梯度萃取
依次用石油醚(90 ml/次×3次)、氯仿(90 ml/次×3次)、乙酸乙酯(90 ml/次×3次)、正丁醇(90 ml/次×3次)萃取稀释后的浓缩液，合并相同有机相，减压浓缩，得到石油醚提取物（XJ-1, 0.33 g, 提取率: 1.65%）、氯仿提取物（XJ-2，0.16 g, 提取率: 0.8%）、乙酸乙酯提取物（XJ-3, 0.38 g, 提取率：1.9%）、正丁醇提取物（XJ-4，0.07 g， 提取率：0.35%）和水提取物（XJ-5，0.8 g，提取率：4%）。
实施例2：
各提取物的制备方法：
1）总提物提取
取锡金报春全草粗粉30 g， 用900 ml 65%乙醇浸泡24 h，超声波助溶提取1 h，过滤，滤渣重复上述提取过程2次，过滤，合并三次提取液。
2）浓缩
将提取液减压回收乙醇得浓缩液（相对密度为1.10g/ml, 55℃），再将浓缩液与水按体积比1：1混合，得到稀释后的浓缩液( 100 ml)。
3）梯度萃取
依次用石油醚(100 ml/次×3次)、氯仿(100 ml/次×3次)、乙酸乙酯(100 ml/次×3次)、正丁醇(100 ml/次×3次)萃取稀释后的浓缩液，合并相同有机相，减压浓缩，得到石油醚提取物（XJ-1, 0.36 g, 提取率: 1.20%）、氯仿提取物（XJ-2，0.05 g, 提取率: 0.17%）、乙酸乙酯提取物（XJ-3, 0.07 g, 提取率：0.23%）、正丁醇提取物（XJ-4，0.27 g， 提取率：0.90%）和水提取物（XJ-5，1.2 g，提取率：4.0%）。
实施例3：
清除DPPH自由基活性实验：
采用实施例1中所制备各极性部位进行活性实验。
抗氧化活性以清除DPPH自由基能力大小表示。根据预实验确定的实验条件，测定锡金报春不同样品清除脂性自由基DPPH的活性。取不同浓度样品溶液2.0 mL，加入2.0 mL 1.52×10-4 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液充分混匀，室温避光静置30 min 后，以溶剂为空白对照，517 nm处测吸光度A1；以同体积溶剂代替样品溶液做阴性对照，测定吸光度A2；以同体积无水乙醇代替DPPH溶液做空白组，测定吸光度A3。以VC为对照，每组做3个重复，求其平均值。按下式计算清除率：
样品对DPPH·的清除率(%)=[1-(A1-A3)/A2] ×100%
实施例4：
清除羟基自由基活性试验：
采用实施例1中所制备各极性部位进行活性实验。
抗氧化活性以清除羟基自由基能力大小表示。根据预实验确定的实验条件，测定锡金报春不同样品清除羟基自由基的活性。将1.5 mL 1.8 mol/L 水杨酸溶液与2.0 mL 1.8 mol/L FeSO4 溶液于试管中混匀后，加入1 mL 不同浓度样品溶液，然后加入0.1 mL 0.03% H2O2，摇匀，于37 ℃保温30 min，510 nm 处测得样品组吸光度Ai；同时将样品组中H2O2换成0.1 mL蒸馏水，测得样品参照组吸光度Aj；将样品组中样品换成1.0 mL溶剂，测得空白组吸光度A0。以VC为对照，每组做3个重复，求其平均值。按下式计算清除率：
·OH清除率(%) = [A0－(Ai－Aj)] /A0×100%
表1 锡金报春各部位体外清除DPPH自由基活性实验
注：IC50±s，n=3
表2 锡金报春各部位体外清除羟基自由基活性实验
结果表明，采用本发明工艺制备得到的石油醚提取物（XJ-1）、氯仿提取物（XJ-2）、乙酸乙酯提取物（XJ-3）、正丁醇提取物（XJ-4）具有良好抗氧化活性，其中石油醚提取物、氯仿提取物、正丁醇提取物具有良好清除羟基自由基能力，抗氧化力分别约为VC的5/6、1/4、3/4; 乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物具有良好清除DPPH自由基能力,抗氧化力分别为VC的1/11和1/7；其中石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物清除羟基自由基能力在浓度低于167 μg/mL时强于VC。