杜仲木脂素提取物在制备治疗肾间质纤维化药物中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103479711 A (43)申请公布日 2014.01.01 CN 103479711 A (21)申请号 201310423484.6 (22)申请日 2013.09.17 A61K 36/46(2006.01) A61P 13/12(2006.01) (71)申请人 欧阳冬生 地址 410078 湖南省长沙市开福区湘雅路 110 号中南大学临床药理研究所 (72)发明人 姜德建 严谨 郭成贤 李晓辉 冯晗 阳国平 周宏灏 欧阳冬生 (74)专利代理机构 长沙正奇专利事务所有限责 任公司 43113 代理人 卢宏 (54) 发明名称 杜仲木脂素提取物在制备治疗肾。

2、间质纤维化 药物中的应用 (57) 摘要 本发明涉及中药提取物用途领域， 具体提供 了杜仲木脂素提取物在制备治疗肾间质纤维化药 物中的应用。所述杜仲木脂素提取物中木脂素占 杜仲木脂素提取物总重量的 30%-90%， 且木脂素 中有效成分松脂醇二葡萄糖苷的含量占杜仲木脂 素提取物总重量的 1%-15%。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103479711 A CN 103479711 A 1/1 页 2 1. 杜仲木脂素提取物在制备。

3、治疗肾间质纤维化药物中的应用， 所述杜仲木脂素提取物 中木脂素占杜仲木脂素提取物总重量的 30%-90%， 且木脂素中有效成分松脂醇二葡萄糖苷 的含量占杜仲木脂素提取物总重量的 1%-15%。 2. 根据权利要求 1 所述应用， 其特征是， 所述木脂素中有效成分松脂醇二葡萄糖苷的 含量占杜仲木脂素提取物总重量的 3%-7.5%。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述应用， 其特征是， 所述杜仲木脂素提取物是以杜仲为原料， 通过质量浓度为 40%-95% 的醇提， 提取液过滤， 浓缩， 将浓缩液通过大孔树脂柱， 依次用水， 质量浓度为15%-25%的甲醇或乙醇， 质量浓度为45%-55%的甲醇或。

4、乙醇溶液洗脱， 收集质量 浓度为 45%-55% 的醇洗脱液， 浓缩， 干燥， 得到杜仲木脂素提取物粉末。 4. 根据权利要求 4 所述应用， 其特征是， 所述杜仲木脂素提取物的制备方法为 ： a) 杜仲皮去外皮后， 切段， 用质量浓度为 40%-95% 的乙醇溶液回流提取 2-3 次， 每次 1-2h， 提取液减压浓缩至 0.5-1.5 倍药材量体积 ； b) 将浓缩后的药液通过大孔吸附树脂柱进行有效成分富集， 依次用水， 质量浓度为 15%-25% 的甲醇或乙醇， 质量浓度为 45%-55% 的甲醇或乙醇溶液洗脱 ； c) 收集质量浓度为 45%-55% 的甲醇或乙醇洗脱液， 浓缩， 干燥。

5、得杜仲木脂素提取物粉 末。 5.根据权利要求4所述应用， 其特征是， 收集步骤b中的水洗脱液， 浓缩， 干燥， 粉碎， 粉 末用甲醇溶解， 弃去不溶物， 回收甲醇并干燥得环烯醚萜类物质。 6.根据权利要求4所述应用， 其特征是， 步骤b中所述大孔吸附树脂柱为HP系列树脂、 D101 树脂或者 AB-8 树脂。 权 利 要 求 书 CN 103479711 A 2 1/5 页 3 杜仲木脂素提取物在制备治疗肾间质纤维化药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于中药提取物用途领域， 具体涉及杜仲木脂素提取物的新用途。 背景技术 0002 肾脏纤维化是一种病理生理改变， 是肾脏的功能由健康到损伤，。

6、 再到损坏， 直至功 能丧失的渐进过程。其结果是肾脏功能进行性不可逆转的损害， 给人类健康带来巨大的威 胁。肾间质纤维化是各种原因所致肾脏疾病进展至终末期肾功能衰竭的共同病理特征。大 量临床病理资料表明， 各种原因引起的慢性肾功能损伤与肾间质纤维化的严重程度较肾小 球病变更为密切。因此， 为了减缓和逆转慢性肾脏疾病的进程， 改善肾脏功能， 发现和找到 治疗肾纤维化的有效药物对于指导临床治疗、 改善肾病患者生活质量具有重要意义。 0003 杜仲为杜仲科植物杜仲的干燥树皮， 是中国名贵滋补药材。具补肝肾、 强筋骨、 降 血压、 安胎等诸多功效， 它是中国特有药材， 其药用历史悠久， 在临床有着广泛。

7、的应用。 杜仲 具有补肝肾， 强筋骨， 清除体内垃圾， 加强人体细胞物质代谢， 防止肌肉骨骼老化， 平衡人体 血压， 分解体内胆固醇， 降低体内脂肪， 恢复血管弹性， 利尿清热， 广谱抗菌， 兴奋中枢神经， 提高白血球数量， 增强人体免疫力等显著功效。杜仲的有效成分主要有木脂素、 环烯醚萜 类、 黄酮类、 有机酸、 醇、 微量元素、 维生素等等， 木脂素是杜仲中含量最多的成分之一。 杜仲 木脂素具有降血压、 抗脂质过氧化、 保护中枢神经系统等药理作用。 0004 目前国内外对杜仲木脂素提取物的药理作用研究较少。申请号 ： 200710035744.7 公开了杜仲木脂素及其提取物在抗心血管重塑上。

8、的应用， 杜仲木脂素提取物的新用途有待 进一步研究。 发明内容 0005 本发明的目的旨在提供一种杜仲木脂素提取物的新用途。 我们研究发现杜仲木脂 素提取物对肾间质纤维化具有防治作用， 可用于制备治疗肾间质纤维化的药物。 0006 为实现上述目的， 本发明的技术方案是 ： 0007 杜仲木脂素提取物在制备治疗肾间质纤维化药物中的应用， 所述杜仲木脂素提取 物中木脂素占杜仲木脂素提取物总重量的 30%-90%， 且木脂素中有效成分松脂醇二葡萄糖 苷的含量占杜仲木脂素提取物总重量的 1%-15%。 0008 所述木脂素中有效成分松脂醇二葡萄糖苷的含量优选占杜仲木脂素提取物总重 量的 3%-7.5%。

9、。 0009 所述杜仲木脂素提取物优选是以杜仲为原料， 通过质量浓度为 40%-95% 的醇提， 提取液过滤， 浓缩， 将浓缩液通过大孔树脂柱， 依次用水， 质量浓度为 15%-25% 的甲醇或乙 醇， 质量浓度为 45%-55% 的甲醇或乙醇溶液洗脱， 收集质量浓度为 45%-55% 的醇洗脱液， 浓 缩， 干燥， 得到杜仲木脂素提取物粉末。 0010 所述杜仲木脂素提取物更优选的制备方法为 ： 0011 a) 杜仲皮去外皮后， 切段， 用质量浓度为 40%-95% 的乙醇溶液回流提取 2-3 次， 每 说 明 书 CN 103479711 A 3 2/5 页 4 次 1-2h， 提取液减压。

10、浓缩至 0.5-1.5 倍药材量体积 ； 0012 b) 将浓缩后的药液通过大孔吸附树脂柱进行有效成分富集， 依次用水， 质量浓度 为 15%-25% 的甲醇或乙醇， 质量浓度为 45%-55% 的甲醇或乙醇溶液洗脱 ； 0013 c) 收集质量浓度为 45%-55% 的甲醇或乙醇洗脱液， 浓缩， 干燥得杜仲木脂素提取 物粉末。 0014 收集步骤 b 中的水洗脱液， 浓缩， 干燥， 粉碎， 粉末用甲醇溶解， 弃去不溶物， 回收 甲醇并干燥得环烯醚萜类物质。 0015 步骤 b 中所述大孔吸附树脂柱为 HP 系列树脂、 D101 树脂或者 AB-8 树脂。 0016 本发明的杜仲木脂素提取物也。

11、可以是专利申请号 200710035744.7 公开的杜仲木 脂素提取物。 0017 下面对本发明做进一步解释和说明。 0018 所述的杜仲木脂素提取物可以通过采用选自粉碎、 压榨、 煅烧、 研磨、 过筛、 渗漉、 萃取、 水提、 醇提、 水沉、 醇沉、 酯提、 酮提、 层析、 过滤等方法得到。 以该提取物为活性物质可 制成药物制剂， 所述提取物可以是浸膏形式的物质， 可以是干浸膏也可以是流浸膏， 可以是 粉末状物质， 根据制剂的不同需要制成不同的状态。 0019 本发明还提杜仲木脂素提取物经过加工制备的适合服用的任何单位剂量形式的 药物制剂， 这些药物制剂选自以下剂型 ： 片剂、 糖衣片剂、。

12、 薄膜衣片剂、 肠溶衣片剂、 胶囊剂、 硬胶囊剂、 软胶囊剂、 口服液、 口含剂、 颗粒剂、 冲剂、 丸剂、 散剂、 膏剂、 丹剂、 混悬剂、 粉剂、 溶液剂、 栓剂、 软膏剂、 硬膏剂、 霜剂、 喷雾剂、 滴剂、 贴剂， 需要时可以制成缓释制剂、 肠溶制 剂。 0020 本发明的杜仲木脂素提取物， 在制备成药物制剂时可加入药物可接受的载体， 所 述药物可接受的载体选自 ： 抗氧剂、 鳌合剂表面活性剂填充剂崩解剂润湿剂分散剂润滑剂 溶剂缓释材料肠溶材料 pH 调节剂、 矫味剂、 色素等， 常用的载体如 ： 甘露糖醇、 右旋糖苷、 乳 糖、 葡萄糖、 山梨醇、 甘露醇、 木糖醇、 氯化钠、 硅衍。

13、生物、 纤维素及纤维素衍生物、 亚硫酸钠、 焦亚硫酸钠、 藻酸盐、 明胶、 聚乙烯吡咯烷酮、 甘油、 吐温 80、 琼脂、 碳酸钙、 碳酸氢钙、 聚乙二 醇、 环糊精、 - 环糊精、 磷脂类材料、 高岭土、 滑石粉、 硬脂酸钙、 硬脂酸镁等。 0021 本发明的杜仲木脂素提取物的药物制剂， 是通过将杜仲原料经过提取或其他方式 加工， 制成药物活性物质， 随后， 以该活性物质为原料， 需要时加入药物可接受的载体， 按照 制剂学的常规技术制成药物制剂。 附图说明 0022 图 1 是假手术组大鼠肾脏 HE 染色后的普通光镜检查图 （编号 ： 1M12） ； HE 染 色， 200 ； 肾小球。肾小。

14、管形态正常， 间质未见血管充血， 炎症细胞浸润等变化。 0023 图 2 是模型组大鼠肾脏 HE 染色后的普通光镜检查图 （编号 ： 2M11） 。HE 染 色， 200。肾小球。肾小管结构消失， 间质大量纤维组织增生， 并伴有大量炎症细胞浸润。 0024 图 3 是杜仲木脂素低剂量组大鼠肾脏 HE 染色后的普通光镜检查图 （编号 ： 3M06） 。 HE 染色， 200。肾小管上皮细胞变性坏死， 部分小管扩张， 间质大量纤维组织增生， 并伴有 大量炎症细胞浸润。 0025 图 4 是杜仲木脂素中剂量组大鼠肾脏 HE 染色后的普通光镜检查图 （编号 ： 4M02） 。 说 明 书 CN 103。

15、479711 A 4 3/5 页 5 HE 染色， 200。肾小管上皮细胞变性坏死， 部分小管扩张， 间质少量纤维组织增生， 并伴有 少量炎症细胞浸润。 0026 图 5 是杜仲木脂素高剂量组大鼠肾脏 HE 染色后的普通光镜检查图 （编号 ： 5M05） 。 HE 染色， 200。肾小管上皮细胞变性坏死， 部分小管扩张， 间质少量纤维组织增生， 并伴有 少量炎症细胞浸润。 0027 图 6 是氟非尼酮阳性对照组大鼠肾脏 HE 染色后的普通光镜检查图 （编号 ： 6M02） 。 HE 染色， 200。肾小管上皮细胞变性坏死， 间质少量纤维组织增生， 并伴有少量炎症细胞 浸润。 具体实施方式 00。

16、28 下面通过实施例对本发明做进一步的解释和说明， 实施例中所述百分含量均为质 量百分含量。 0029 实施例 1 杜仲木脂素提取物的制备 0030 取杜仲树皮 （去外皮） 2Kg， 用 8L65% 乙醇回流提取两次， 每次 1h， 过滤， 合并两次提 取液浓缩至 800ml。用 D101 大孔树脂拌样上样 （大孔树脂柱体积 3L） ， 水洗 3 倍柱体积， 1% 氨水继续洗 3 倍柱体积， 再水洗至中性。用 20% 乙醇洗脱 2 倍柱体积， 用 45% 乙醇洗 2.5 倍 柱体积。45% 乙醇洗脱液浓缩至 600ml。洗脱液浓缩后干燥成粉末。用松脂醇二葡萄糖苷 作为对照， 杜仲木脂素提取物经。

17、紫外检测木脂素成分含量为 85， 经 HPLC 检测松脂醇二葡 萄糖苷含量为 12.5%。 0031 实施例 2 杜仲木脂素提取物的制备 0032 杜仲皮 （去外皮） 粉碎后， 加 60乙醇 9L 回流提取 1h， 过滤， 滤渣再加 60乙醇 7L 提取 1h， 过滤， 合并两次提取液， 浓缩至无醇味， 得浓缩液约 3L。浓缩液经 AB-8 大孔吸附树 脂柱， 先用5L水洗脱， 再用7L60乙醇洗脱， 收集60乙醇洗脱液， 浓缩至150ml， 缓慢加到 450ml 水中， 过滤， 浓缩， 得干燥固体粉末。用松脂醇二葡萄糖苷作为对照， 杜仲木脂素提取 物经紫外检测木脂素成分含量为 51， 经 H。

18、PLC 检测松脂醇二葡萄糖苷含量为 3.5%。 0033 实施例 3 0034 将实施例 1 和实施例 2 所得到的杜仲木脂素提取物用于实施例 3 的对肾间质纤维 化的保护实验研究。 0035 1. 实验方法 0036 1.1 剂量设计和分组 0037 实验分为假手术组、 模型组、 杜仲木脂素提取物低剂量组 （150mg/kg） 、 中剂量组 （300mg/kg） 、 高剂量组 （600mg/kg） 以及氟非尼酮阳性对照组 （500mg/kg） 。 0038 表 1 试验分组和剂量设计 0039 说 明 书 CN 103479711 A 5 4/5 页 6 0040 1.2 实验步骤 0041。

19、 雄性SD大鼠60只， 体重250300g， 手术结扎组采用单侧输尿管结扎， 方法如下 ： 按 2mL/kg 腹腔注射 2% 戊巴比妥钠麻醉大鼠， 无菌条件于腹部左侧肾脏位置切口约 1.5cm， 将肾脏轻轻挤出， 用眼科镊轻轻剥离左侧输尿管周围组织， 暴露输尿管， 用灭菌缝合线结扎 输尿管， 另取 12 只大鼠作为假手术组， 手术方式相同， 将肾脏轻轻挤出后分离左侧输尿管 但不结扎。以上动物手术完成后， 依次缝合肌肉、 皮肤， 创口周围注射 10 万 U 青霉素以防感 染。在术后第 3 天对 60 只结扎组大鼠进行眼眶采血， 分离血清， 检测血清肌酐及尿素氮含 量， 结果显示手术结扎组血清肌酐。

20、及尿素氮含量升高， 根据指标结果将手术结扎组随机分 为5组， 每组12只， 分别为模型组、 杜仲木脂素提取物低、 中、 高剂量组以及氟非尼酮阳性对 照组。每日实验前将杜仲木脂素提取物用蒸馏水、 氟非尼酮用 0.5%CMC-Na 按剂量配制成相 应浓度， 现配现用， 按 10mL/kg 灌胃给药， 1 次 / 日， 连续 15 天。假手术组及模型组给予等体 积的蒸馏水。末次给药后按 2mL/kg 腹腔注射 2% 戊巴比妥钠麻醉大鼠并安乐死后， 解剖取 肾组织固定， 石蜡包埋， 进行组织病理检查。 0042 1.3 检测指标 0043 肾脏形态观察 ： 分别取大鼠肾脏置于 10% 中性福尔马林液中。

21、固定， 常规脱水、 包 埋、 切片、 HE 染色， 进行病理组织学检查。病理积分标准 ： 对肾小管间质损伤进行评分， 每个 标本随机选择不重复 10 个视野， 包括皮质、 髓质、 皮髓交界处， 包括 6 项具体指标 ：（1） 肾 小管扩张 ；（2） 肾小管萎缩 ；（3） 肾小管上皮细胞空泡形成 ；（4） 肾小管上皮细胞空泡形成 ； （5） 肾间质纤维化 ；（6） 肾间质炎症细胞浸润， 即肾间质局灶型炎细胞浸润为轻度损害 ； 弥 漫性散在的炎症细胞浸润为中度损害 ； 弥漫性密集的炎症细胞浸润为重度损害。对每一个 项目按照病理损害的程度分为 0 分 ： 正常 ； 1 分 ： 轻度损害 （病变小于 。

22、20%） ； 2 分 ： 中度损害 （病变 20% 40%） ； 3 分 ： 重度损害 （病变大于 40%） 。 0044 1.4 统计方法 ： 0045 采用 SPSS16.0 进行统计分析， 统计学意义的水平设定为 P0.05。采用均数 标 准差用Leven s test方法检验正态性和方差齐性。 如果符合正态性和方差齐性， 用 单因素方差分析 （One-way ANOVA） 和 post Hoc LSD 进行统计分析 ； 如果不符合正态性和方 差不齐， 则用 Kruskal-Wallis 检验。如果 Kruskal-Wallis 检验有统计学意义 （P0.05） ， 则 用 Dunnet。

23、t s Test（非参数方法） 进行比较分析。评价时考虑统计学差异和生物学意义。 说 明 书 CN 103479711 A 6 5/5 页 7 0046 2 实验结果 0047 杜仲木脂素提取物对肾脏病理学的影响 0048 如表 2 及图 1-6 所示， 与正常对照比较， 模型组大鼠肾脏出现肾小管扩张、 萎缩， 肾小管上皮细胞坏死， 肾间质纤维化以及弥漫性密集的炎症细胞浸润。从平均病理积分统 计结果可以看出， 模型组病理积分显著高于假手术组， 提示肾纤维化模型造模成功。给药 15 天后， 杜仲木脂素提取物高剂量组以及氟非尼酮阳性对照组与模型组相比均出现显著差 异， 肾间质纤维化情况有所好转。 。

24、0049 表 2 杜仲木脂素提取物对肾间质纤维化病理学的影响 0050 0051 注 ： 与假手术组比较， +P0.01， 与模型组比较，*P0.05。 0052 3 实验小结 0053 上述结果表明， 杜仲木脂素提取物高剂量组能显著改善肾间质纤维化模型的肾小 管扩张、 萎缩， 肾间质炎症细胞浸润等症状， 对肾间质纤维化有一定的改善作用。 说 明 书 CN 103479711 A 7 1/3 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103479711 A 8 2/3 页 9 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103479711 A 9 3/3 页 10 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103479711 A 10 。