一种角蛋白纳米粒及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510853244.9 (22)申请日 2015.11.30 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105343870 A (43)申请公布日 2016.02.24 (73)专利权人 江苏邦泽生物医药技术股份有限 公司 地址 214174 江苏省无锡市惠山大道1699 号惠山生命科技产业园C3楼0109室 (72)发明人 王伯初 郝石磊 王驹 罗甜甜 祝连彩 赵志斌 秦松柏 王丹丹 (74)专利代理机构 上海科律专利代理事务所 (特殊普通合伙) 31290 代理人。

2、 金碎平 袁亚军 (51)Int.Cl. A61K 38/17(2006.01) A61K 9/14(2006.01) A61K 47/42(2017.01) A61P 7/04(2006.01) (56)对比文件 CN 104784744 A,2015.07.22, CN 104722334 A,2015.06.24, CN 102083310 A,2011.06.01, CN 103804468 A,2014.05.21, S. Saravanan等.Chitosan scaffolds containing chicken feather keratin nanoparticles. I。

3、nternational Journal of Biological Macromolecules .2013, (第62期), 审查员 田颖 (54)发明名称 一种角蛋白纳米粒及其制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种角蛋白纳米粒及其制备 方法， 所述角蛋白纳米粒的平均粒径为105 150nm， 包括如下制备步骤： (1)配制分散溶液： 配 制pH23的稀醋酸溶液或pH13的稀盐酸溶液， 备用； (2)配制质量浓度为0.51.25的角蛋 白水溶液： 向角蛋白提取物中加入去离子水搅拌 溶解； (3)纳米混悬液的制备： 向所述配制好的预 定量分散溶液中， 将所述角蛋白水溶液滴注进 去， 在滴注。

4、的同时， 将所述分散溶液进行超声分 散， 得到角蛋白纳米混悬液； (4)将所述步骤(3) 所得混悬液高速离心， 离心后倾倒离心上清液， 离心沉淀干燥后所得粉末结块经研磨即得角蛋 白纳米粒。 本发明方法简单易行且制得的角蛋白 纳米粒形貌均一， 可用于药物载体或止血材料， 具有较好的体外凝血及体内止血效果。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 105343870 B 2018.10.26 CN 105343870 B 1.一种角蛋白纳米粒的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤： （1） 配制分散溶液： 配制pH23的稀醋酸溶液或pH13的稀盐酸溶液， 备用； （2） 配制质量浓度为0.5。

5、%1.25%的角蛋白水溶液： 向角蛋白提取物中加入去离子水搅 拌溶解； （3） 纳米混悬液的制备： 向20100mL配制好的分散溶液中， 通过恒流泵以0.050.2mL/ min的恒定速率将角蛋白水溶液滴注进去， 最终纳米混悬液中角蛋白含量为1mg/mL， 滴注同 时， 分散溶液在冰浴条件下以300400W的功率进行超声分散； （4） 将所述步骤 （3） 所得混悬液高速离心， 离心后倾倒离心上清液， 离心沉淀干燥后所 得粉末结块经研磨即得角蛋白纳米粒。 2.如权利要求1所述的角蛋白纳米粒的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （1） 中分散溶 液为pH2.5的稀醋酸溶液。 3.如权利要求1所述的。

6、角蛋白纳米粒的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中向角蛋 白提取物中加入去离子水， 常温下搅拌半小时至完全溶解。 4.如权利要求1或3所述的角蛋白纳米粒的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中采用 磁力搅拌。 5.如权利要求1所述的角蛋白纳米粒的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中所述角 蛋白水溶液的质量浓度为1%。 6.如权利要求1所述的角蛋白纳米粒的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （3） 中所述恒 流泵的注射速率为0.2mL/min， 所述超声功率为350W。 7.如权利要求1所述的角蛋白纳米粒的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （4） 为： 将所述 步骤。

7、 （3） 所得混悬液高速离心， 离心转速为1000012000r/m、 离心时间2030min、 离心恒温4 ， 离心后倾倒离心上清液， 离心沉淀经-40预冻12小时后冷冻干燥24小时， 干燥所得粉 末结块经研磨即得角蛋白纳米粒。 8.如权利要求1所述的角蛋白纳米粒的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中所述角 蛋白提取物的提取方法为化学氧化法或还原法， 所用的氧化剂为过氧乙酸， 还原剂为硫代 乙醇酸。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105343870 B 2 一种角蛋白纳米粒及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及一种角蛋白纳米粒及其制备方。

8、法。 背景技术 0002 近年来， 随着科技的不断进步和医疗行业的不断发展， 人们对止血方法和止血材 料也有了新的认识。 目前市场上用于止血的材料有很多， 如矿物类材料沸石粉， 虽具有较好 的止血效果但无法吸收和降解， 只能用于外伤紧急止血； 及有的合成类止血材料因生物相 容性欠佳等具有一定的使用局限性。 0003 血余炭早在 本草纲目 中就有记载， 古时候人们将其用于创伤出血， 引起具有止 血消瘀、 利尿生肌及抗菌之功效， 而血余炭是人头发的煅烧碳化物， 其主要有效成分是角蛋 白。 角蛋白是一种结构蛋白， 广泛存在于头发、 羊毛、 羽毛等中， 不仅来源广泛， 而且具有较 好的生物相容性， 同。

9、时有研究表明角蛋白在体内具有生物可降解性。 因此， 角蛋白作为一种 天然蛋白质材料受到人们的广泛关注与重视。 0004 角蛋白因其特殊的分子结构， 当其与组织及体液接触时可充当一种配体， 与机体 细胞受体特异性结合， 从而发挥一系列的生理作用。 可吸收粉剂止血材料因其制备简单， 使 用方便， 不仅可用于体外创伤出血， 而且可用于体内手术出血， 加之纳米粉具有极高的表面 积及很强的细胞渗透性， 与体液接触时可提供更多与机体细胞相互作用的位点， 故纳米止 血粉末逐渐受到人们的青睐。 此外， 基于上述优点， 角蛋白纳米粒也可用作为药物载体， 与 其他功能性药物进行复方， 可实现较高的药物包封率， 提。

10、高药物生物利用度。 当前研究中直 接使用角蛋白提取物进行止血实验， 而角蛋白纳米粒由于其较大的比表面积， 可更快速与 血液接触， 缩短血液凝固时间， 因此， 有必要提供一种角蛋白纳米粒的制备方法。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是提供一种角蛋白纳米粒及其制备方法， 该方法简单 易行且制得的角蛋白纳米粒形貌均一， 平均粒径为105150nm， 可用于药物载体或止血材 料。 0006 本发明为解决上述技术问题是提供一种角蛋白纳米粒， 所述角蛋白纳米粒的平均 粒径为105150nm。 0007 本发明为解决上述技术问题而采用的另一技术方案是提供一种角蛋白纳米粒的 制备方法， 包括如下步。

11、骤： (1)配制分散溶液： 配制pH23的稀醋酸溶液或pH13的稀盐酸 溶液， 备用； (2)配制质量浓度为0.51.25的角蛋白水溶液： 向角蛋白提取物中加入去 离子水搅拌溶解； (3)纳米混悬液的制备： 向所述配制好的预定量分散溶液中， 将所述角蛋 白水溶液滴注进去， 在滴注的同时， 将所述分散溶液进行超声分散， 得到角蛋白纳米混悬 液； (4)将所述步骤(3)所得混悬液高速离心， 离心后倾倒离心上清液， 离心沉淀干燥后所得 粉末结块经研磨即得角蛋白纳米粒。 0008 进一步地， 所述步骤(1)中分散溶液为pH2.5的稀醋酸溶液。 说 明 书 1/5 页 3 CN 105343870 B 。

12、3 0009 进一步地， 所述步骤(2)中向角蛋白提取物中加入去离子水， 常温下搅拌半小时至 完全溶解。 0010 进一步地， 所述步骤(2)中采用磁力搅拌。 0011 进一步地， 所述步骤(2)中所述角蛋白水溶液的质量浓度为1。 0012 进一步地， 所述步骤(3)中纳米混悬液的制备步骤为： 向20100mL配制好的分散 溶液中， 通过恒流泵以0.050.2mL/min的恒定速率将角蛋白水溶液滴注进去， 最终纳米混 悬液中角蛋白含量为1mg/mL， 滴注同时， 分散溶液在冰浴条件下以300400W的功率进行超 声分散。 0013 进一步地， 所述步骤(3)中所述恒流泵的注射速率为0.2mL/。

13、min， 所述超声功率为 350W。 0014 进一步地， 所述步骤(4)为： 将所述步骤(3)所得混悬液高速离心， 离心转速为 1000012000r/m、 离心时间2030min、 离心恒温4， 离心后倾倒离心上清液， 离心沉淀 经-40预冻12小时后冷冻干燥24小时， 干燥所得粉末结块经研磨即得角蛋白纳米粒。 0015 进一步地， 所述步骤(4)中高速离心条件为： 在4下以12000rpm离心20min。 0016 进一步地， 所述步骤(2)中所述角蛋白提取物的提取方法为化学氧化法或还原法， 所用的氧化剂为过氧乙酸， 还原剂为硫代乙醇酸。 0017 本发明对比现有技术有如下的有益效果： 。

14、本发明提供的角蛋白纳米粒及其制备方 法， 选择了合适的沉淀溶剂， 筛选出了较优的制备条件， 采用此方法制备的角蛋白纳米粒形 貌均一， 平均粒径为105150nm； 制备过程中无任何有毒或有机试剂的使用， 绿色环保； 制 备的角蛋白纳米粒可用作药物载体或止血材料等， 丰富了角蛋白生物材料的剂型， 扩大了 其应用范围， 从而提高了角蛋白的利用率。 角蛋白纳米粒体外凝血试验和大鼠尾部及肝脏 创伤模型止血试验表明， 纳米颗粒具有较好的体外凝血及体内止血效果， 能显著缩短止血 时间、 减少血液流失， 并且与角蛋白提取物相比具有明显的优势。 附图说明 0018 图1为角蛋白纳米粒和角蛋白提取物的红外吸收光。

15、谱图， 图中： a为不同实施例制 得的角蛋白纳米粒混合后试验的红外吸收光谱图； b为角蛋白提取物的红外吸收光谱图。 0019 图2为角蛋白体外凝血试验结果图(*表示显著p0.05； *表示极显著， p0.01)。 0020 图3为角蛋白在大鼠出血模型止血试验结果图， 其中， A为不同止血剂型对出血量 的影响； B为不同止血剂型对出血时间的影响(*表示显著p0.05； *表示极显著， p 0.01)。 具体实施方式 0021 下面通过具体实施方式对本发明进行进一步说明。 0022 本发明提供的角蛋白纳米粒， 平均粒径为105150nm， 制备步骤如下： 0023 (1)配制分散溶液： 配制pH2。

16、3的稀醋酸溶液或pH13的稀盐酸溶液， 备用； 0024 (2)配制质量浓度为0.51.25的角蛋白水溶液： 向角蛋白提取物中加入去离 子水， 常温下搅拌半小时至完全溶解； 0025 (3)纳米混悬液的制备： 向20100mL配制好的分散溶液中， 通过恒流泵以0.05 说 明 书 2/5 页 4 CN 105343870 B 4 0.2mL/min的恒定速率将角蛋白水溶液滴注进去， 最终纳米混悬液中角蛋白含量为1mg/mL， 滴注同时， 分散溶液在冰浴条件下以300400W的功率进行超声分散； 0026 (4)将步骤(3)所得混悬液高速离心， 离心转速为1000012000r/m、 离心时间2。

17、0 30min、 离心恒温4， 离心后倾倒离心上清液， 离心沉淀经-40预冻12小时后冷冻干燥24 小时， 干燥所得粉末结块经研磨即得角蛋白纳米粒。 0027 步骤(1)中的分散溶液作用是使角蛋白在酸性溶剂中沉淀析出， 分散溶液pH不能 过高， 否则会使角蛋白在沉淀剂中不能完全沉淀析出； 同时， 分散溶液的用量应该适宜， 若 用量过小角蛋白纳米颗粒会发生聚沉， 若用量过多则会影响纳米颗粒的收集效率。 0028 步骤(2)中所述角蛋白提取物的提取方法为化学氧化法或还原法， 所用的氧化剂 为过氧乙酸， 还原剂为硫代乙醇酸。 角蛋白水溶液的浓度应适宜， 若浓度过大会使角蛋白不 能完全沉淀， 而是部分。

18、溶于分散溶液中； 若浓度过小则会影响纳米粒的制备效率。 0029 步骤(3)中超声的目的是将分散溶液中沉淀析出的角蛋白在超声作用下均匀分散 成纳米颗粒， 形成纳米混悬液； 使用恒流泵的目的是将角蛋白水溶液以恒定的速率滴注进 分散溶液中， 并且滴注的速率不能过快， 否则将不能完全沉淀或不能均匀分散， 若滴注速率 过慢则影响制备效率； 超声功率过小会使溶液分散不充分， 功率过大会导致产热过多， 甚至 使角蛋白材料过热变性。 0030 实施例1 0031 一种角蛋白纳米粒的制备方法： 0032 (1)取冰醋酸于烧杯中， 加去离子水稀释至pH为2.0， 制得分散溶液备用； 0033 (2)称取角蛋白提。

19、取物75mg， 在磁力搅拌下溶于15mL去离子水中， 配制成质量浓度 为0.5的角蛋白水溶液； 0034 (3)取步骤(1)中制得的分散溶液20mL于25mL烧杯中， 在冰浴条件下以300W的功率 超声分散， 同时， 取步骤(2)中制得的角蛋白溶液5mL， 通过恒流泵以0.05mL/min的速率注射 入分散溶液中， 角蛋白溶液注射完后即停止超声， 得到角蛋白纳米混悬液， 相同条件下重复 3次； 0035 (4)将上述纳米混悬液在4下以10000rpm离心30min后， 倾倒离心上清液， 离心沉 淀盛于玻璃圆盘中， 经-40预冻12小时后冷冻干燥24小时， 干燥所得粉末结块经研磨即得 所述角蛋白。

20、纳米粒。 0036 实施例2 0037 一种角蛋白纳米粒的制备方法： 0038 (1)取盐酸于烧杯中， 加去离子水稀释至pH为1.0， 制得分散溶液备用； 0039 (2)称取角蛋白提取物187.5mg， 在磁力搅拌下溶于25mL去离子水中， 配制成质量 浓度为0.75的角蛋白水溶液； 0040 (3)取步骤(1)中制得的分散溶液40mL于50mL烧杯中， 在冰浴条件下以400W的功率 超声分散， 同时， 取步骤(2)中制得的角蛋白溶液8mL， 通过恒流泵以0.1mL/min的速率注射 入分散溶液中， 角蛋白溶液注射完后即停止超声， 得到角蛋白纳米混悬液， 相同条件下重复 3次； 0041 (。

21、4)将上述纳米混悬液在4下以11000rpm离心25min后， 倾倒离心上清液， 离心沉 淀盛于玻璃圆盘中， 经-40预冻12小时后冷冻干燥24小时， 干燥所得粉末结块经研磨即得 说 明 书 3/5 页 5 CN 105343870 B 5 所述角蛋白纳米粒。 0042 实施例3 0043 一种角蛋白纳米粒的制备方法： 0044 (1)取冰醋酸于烧杯中， 加去离子水稀释至pH为2.5， 制得分散溶液备用； 0045 (1)称取角蛋白提取物300mg， 在磁力搅拌下溶于30mL去离子水中， 配制成质量浓 度为1的角蛋白水溶液； 0046 (3)取步骤(1)中制得的分散溶液60mL于100mL烧杯。

22、中， 在冰浴条件下以350W的功 率超声分散， 同时， 取步骤(2)中制得的角蛋白溶液10mL， 通过恒流泵以0.2mL/min的速率注 射入分散溶液中， 角蛋白溶液注射完后即停止超声， 得到角蛋白纳米混悬液， 相同条件下重 复3次； 0047 (4)将上述纳米混悬液在4下以12000rpm离心20min后， 倾倒离心上清液， 离心沉 淀盛于玻璃圆盘中， 经-40预冻12小时后冷冻干燥24小时， 干燥所得粉末结块经研磨即得 所述角蛋白纳米粒。 0048 实施例4 0049 一种角蛋白纳米粒的制备方法： 0050 (1)取冰醋酸于烧杯中， 加去离子水稀释至pH为3.0， 制得分散溶液备用； 00。

23、51 (2)称取角蛋白提取物250mg， 在磁力搅拌下溶于20mL去离子水中， 配制成质量浓 度为1.25的角蛋白水溶液； 0052 (3)取步骤(1)中制得的分散溶液40mL于50mL烧杯中， 在冰浴条件下以400W的功率 超声分散， 同时， 取步骤(2)中制得的角蛋白溶液5mL， 通过恒流泵以0.2mL/min的速率注射 入分散溶液中， 角蛋白溶液注射完后即停止超声， 得到角蛋白纳米混悬液， 相同条件下重复 3次； 0053 (4)将上述纳米混悬液在4下以12000rpm离心20min后， 倾倒离心上清液， 离心沉 淀盛于玻璃圆盘中， 经-40预冻12小时后冷冻干燥24小时， 干燥所得粉末。

24、结块经研磨即得 所述角蛋白纳米粒。 0054 性能测试 0055 对实施例14制得的角蛋白纳米粒进行性能测试， 结果如表1所示： 0056 表1 角蛋白纳米粒性能测试结果 0057 粒径(nm) 电位(mv) 实施例1126.26.720.471.50 实施例2147.83.619.270.32 实施例3109.01.718.330.15 实施例4142.57.618.070.57 0058 由上表可见， 采用本发明的制备方法制得的角蛋白纳米粒具有较小且均匀的粒 径， 稳定性较好； 在制备过程中没有涉及有毒有害化学试剂， 角蛋白的化学结构没有发生改 变， 如图1所示。 0059 附例1： 00。

25、60 体外凝血试验： 试验分为角蛋白提取物组、 角蛋白纳米粒组和空白对照组三个组 说 明 书 4/5 页 6 CN 105343870 B 6 别， 每组实验重复3次， 其中角蛋白纳米粒按实施例3提供的制备方法制取。 每组各取2ml新 鲜家兔血液于玻璃试管， 角蛋白提取物组与角蛋白纳米粒组分别立即加50mg止血材料于试 管， 空白组不加， 37水浴， 每隔数秒取出观察血液凝固情况， 记录凝血时间。 结果如图2所 示。 0061 附例2： 0062 大鼠止血试验： 试验分为角蛋白提取物组、 角蛋白纳米粒组和空白对照组三个组 别， 其中角蛋白纳米粒按实施例3的制备方法制取， 每组随机选取3只SD大。

26、鼠进行平行试验。 每组实验大鼠分别进行尾部截肢和肝脏穿刺以创建动物出血模型， 出血后用止血材料进行 喷撒止血， 同时记录出血时间和出血量， 空白对照组不用任何止血材料。 结果如图3所示。 0063 角蛋白纳米粒体外凝血试验(附例1)和大鼠尾部及肝脏创伤模型止血试验(附例 2)表明， 纳米颗粒具有较好的体外凝血及体内止血效果， 能显著缩短止血时间、 减少血液流 失， 并且与角蛋白提取物相比具有明显的优势。 0064 虽然本发明已以较佳实施例揭示如上， 然其并非用以限定本发明， 在不背离本发 明精神和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改和替换， 均属于本发明的范 围。 说 明 书 5/5 页 7 CN 105343870 B 7 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 8 CN 105343870 B 8 图3 说 明 书 附 图 2/2 页 9 CN 105343870 B 9 。