技术领域
本发明属于中药领域，涉及一种家禽胆转化物在制备抗胆汁淤积性肝病药物中的应用。
背景技术
胆汁淤积(cholestasis)是指胆汁流形成、分泌和排泄障碍，胆汁流不能正常流入十二指肠，而在肝脏中滞留、并进入血液循环的临床综合征。其大多数属肝内胆汁淤积，常见于多种慢性肝病中又称胆汁淤积性肝病。随着病情进展，肝内胆汁淤积可加重肝脏损害，严重者可导致肝衰竭甚至死亡。针对肝内胆汁淤积，临床治疗药物尚显不足，迫切需要研发新的治疗药物。
肝内胆汁淤积属中医“黄疸”范畴，中医在长期的临床实践中发现多种中药具有“退黄”的疗效，可以改善胆汁淤积，熊胆曾经是常用于治疗黄疸的中药，但药源受限，寻找新的天然替代药物非常必要。鸡胆等家禽类与熊胆相比，均为胆汁类天然产物。
CN103893210A公开了一种鸡胆提取组合物及其提取方法，按质量百分含量计，所述鸡胆提取组合物包括牛磺鹅去氧胆酸45-55％、其它胆酸10-15％、氨基酸5-15％、蛋白质23-28％、脂肪0.5-2％。该鸡胆提取组合物中牛磺鹅去氧胆酸的含量高，氨基酸的种类多、含量高，药效显著，另外，该鸡胆提取组合物的稳定性较高。此方法提供的鸡胆提取组合物，仅仅公开了对于消化系统、溶胆石作用和利胆作用，并没有公开其具有抗胆汁淤积的作用。
CN1682912公开了一种镇咳、祛痰、平喘、消炎的中药制剂，其特点是以鸡胆为原料，去皮取汁，得到含鹅去氧胆酸的鸡胆浸膏，然后通过药用环糊精包合，制成包括口服液、胶囊颗粒在内的制剂。本发明由于采用环糊精包合，可掩盖鸡胆原有的苦味及腥味，有利于患者特别是小孩服用，而且增加了鸡胆有效成分在水中的溶解度。此方法公开的也仅仅是鸡胆在镇咳消炎等方面的作用。
CN1102326公开了一种治疗小儿咳嗽的中成药，其有效成分主要为鸡胆汁、朱砂、冰片和石膏，按鸡胆汁0.8-1.3毫升；朱砂0.09-0.11克；冰片0.07-0.12克；石膏0.8-1.3克的配比配制而成，其优点是药源易得，成本低，对百日咳及小儿支气管炎引起的小儿咳嗽治疗效果好。此方法也并未公开鸡胆有任何关于抗胆汁淤积的作用。
因此，将鸡等家禽类的胆进行生物转化生成家禽胆转化物，研究其抗胆汁淤积性肝病的作用，具有明显的应用前景。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种家禽胆转化物在制备抗胆汁淤积性肝病药物中的应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种家禽胆转化物在制备抗胆汁淤积性肝病药物中的应用。
本发明提供的家禽胆转化物对胆汁淤积模型小鼠具有改善胆汁淤积和减轻肝损伤作用，能有效减降低模型小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆汁酸(TBA)、胆固醇和总胆红素(TBIL)水平，减轻肝组织损伤程度，具有抗胆汁淤积性肝病的作用，揭示了家禽胆转化物在制备抗胆汁淤积性肝病药物中的用途。
其中，小鼠胆汁淤积模型为萘异硫氰酸酯(ANIT)诱导得到的。
而目前，胆汁淤积性肝病的药物仅有熊去氧胆酸、多烯磷酯酰胆碱胶囊、腺苷蛋氨酸、苯巴比妥等少数药物，还未见其他类型的药物报道，并且，这些药物中，熊胆的药源有限，其他的药物昂贵，均有较大的限制。
此外，目前报道的鸡胆提取物等常用的家禽胆提取物，仅有止咳、祛痰等方面的应用，也没有报道在制备治疗肝病药物中的应用。
优选地，所述家禽胆转化物包括鸡胆转化物、鸭胆转化物或鹅胆转化物中的任意一种或至少两种的组合，优选为鸡胆转化物。
在本发明中，相比于其他家禽胆转化物，在抗胆汁淤积性作用方面，鸡胆转化物表现出更优异的效果。
优选地，所述抗胆汁淤积性肝病药物的剂型包括胶囊剂、片剂、滴丸剂、注射剂、气雾剂、栓剂、混悬剂、贴剂、散剂中的任意一种。
优选地，所述抗胆汁淤积性肝病药物的剂型包括药学上可接受的辅料。
优选地，所述辅料包括载体、稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。
在本发明中，家禽胆转化物一般可以单独制备成药物；也可以与常用的药用辅料进行搭配，联合应用，制备成合适的剂型用药。
例如，将家禽胆转化物与辅料制备成为胶囊剂，可以制备成为硬胶囊或者软胶囊，将核心的活性成分制备成粉状或者颗粒状填充进入胶囊中，可选地添加pH调节剂、渗透压调节剂等。
又如将家禽胆转化物制备成为片剂用药，可选地添加粘合剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、抗氧剂等等常用辅料；如粘合剂可以使用微晶纤维素、明胶、聚乙二醇等等；如崩解剂可以使用羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素，并且通常崩解剂的用量占总质量的百分比为2％～20％；表面活性剂可以是十二烷基硫酸钠与聚山梨醇酯80；润滑剂可以是如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌等等。片剂的制法可通过湿法压片或者干法压片。制备出的片剂可通过口服吞咽或舌下含服等方式进行给药。
此外，也可将家禽胆转化物制备成为气雾剂通过鼻内给予或者吸入给药，例如可通过加压容器、泵、喷雾器、雾化器等将家禽胆转化物转化为气雾形式，其中也可包含各种赋形剂、分散剂和粘合剂等，一并进行给药。
也可将家禽胆转化物制备成为注射剂，此注射剂可以是水溶性溶液，可含有赋形剂例如盐类、pH调节剂等。给药方式通常可以通过合适的胃肠外给予方式包括静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给予等方式。
在本发明中，可通过控释、缓释、延时、靶向等技术，将药物制备成可控释放或可控吸收的药物类型。
在本发明中，一般地优选将药物制备成为片剂，通过口服的方式直接进行给药。
在本发明中，也可将家禽胆转化物与其他药物联合制备成为药物组合物进行使用。例如，常见的有熊去氧胆酸、苯巴比妥或者其他中药柴胡、白芍、茵陈、丹参等。
优选地，所述家禽胆转化物包括以下质量百分比的组分：总胆酸15％～84％，例如可以是15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或84％，牛磺熊去氧胆酸10％～50％，例如可以是10％、20％、30％、40％或50％等，牛磺鹅去氧胆酸5％～40％，例如可以是5％、6％、10％、20％、30％或40％等，牛磺胆酸0.1％～10％，例如可以是0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％等，牛磺熊胆酸0.1％～10％，例如可以是0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％等。
优选地，所述家禽胆转化物包括以下质量百分比的组分：总胆酸37.2％，牛磺熊去氧胆酸29.4％，牛磺鹅去氧胆酸25.4％，牛磺胆酸4％，牛磺熊胆酸4％。
在本发明中，当家禽胆转化物的组分，控制在上述明确的配比含量时，其制备出的药物或药物组合物具有更优异的抗胆汁淤积性肝病的效果。
优选地，所述家禽胆转化物的制备方法包括以下步骤：
(1)将家禽胆粉用溶液溶解后离心得到滤渣和滤液；
(2)将步骤(1)得到的滤渣冷冻干燥保存；将滤液使用酶进行反应得到反应液；
(3)将步骤(2)得到的反应液冷冻干燥后与步骤(1)得到的滤渣进行混合得到家禽胆转化物。
在本发明中，通过此方法制备的家禽胆转化物具有明确的组分。该方法以及相应的组分测试，已在CN104382941A公开。
在本发明中，家禽胆粉一般包括水分、胆色素、维生素、胆固醇或脂肪酸等成分。
优选地，步骤(1)所述溶液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中的任意一种。
优选地，步骤(1)所述溶液的pH值为7～9，例如可以是7、8或9。
优选地，步骤(1)所述离心的时间为5～20min，例如可以是5min、7min、10min、12min、15min、18min、19min或20min。
优选地，步骤(1)所述离心的离心力为10000～12000g，例如可以是10000g、11000g、11110g、11600g或12000g。
优选地，步骤(2)所述酶为7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶。
优选地，步骤(2)所述酶还包括辅酶I或辅酶II。
在本发明中，酶反应时，需在酶反应器中进行，7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶以固定化的方式存在。
优选地，所述辅酶I或辅酶II与牛磺鹅去氧胆酸的摩尔比为1:2～4，例如可以是1:2、1:3或1:4。
在本发明中，辅酶I或辅酶II任选其一使用，并且需要控制添加量。
优选地，步骤(2)所述反应的时间为2～6h，例如可以是2h、3h、4h、5h或6h等。
优选地，步骤(2)所述反应的温度为20～30℃，例如可以是20℃、22℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等。
优选地，步骤(3)所述冷冻干燥的时间为40～60h，例如可以是40h、42h、45h、48h、50h、52h、53h、55h、58h或60h等。
优选地，所述家禽胆转化物的制备方法包括以下步骤：
(1)将家禽胆粉用pH值为7～9的缓冲溶液溶解后，在10000～12000g条件下离心5～20min，过滤分别得到滤渣和滤液；
(2)将步骤(1)得到的滤渣冷冻干燥保存；将滤液使用7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶，与辅酶I或辅酶II在20～30℃条件下进行反应2～6h得到反应液；
(3)将步骤(2)得到的反应液冷冻干燥40～60h后与步骤(1)得到的滤渣进行混合得到家禽胆转化物。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种家禽胆转化物的新用途，对胆汁淤积性肝病模型小鼠具有改善胆汁淤积和减轻肝损伤作用，能有效减降低模型小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆汁酸(TBA)、胆固醇和总胆红素(TBIL)水平，减轻肝组织损伤程度，具有抗胆汁淤积性肝病的作用，揭示了家禽胆转化物在制备抗胆汁淤积性肝病药物中的用途。
本发明提供的家禽胆转化物，尤其是鸡胆转化物，可对动物肝脏细胞器的损伤状态产生显著改善，具有非常高的药理活性，适宜开发作为抗胆汁淤积性肝病的药物。
附图说明
图1是本发明鸡胆转化物对正常对照组肝组织形态学影响的光学显微镜示意图。
图2是本发明鸡胆转化物对模型对照组肝组织形态学影响的光学显微镜示意图。
图3是本发明鸡胆转化物对熊去氧胆酸阳性对照组肝组织形态学影响的光学显微镜示意图。
图4是本发明鸡胆转化物对鸡胆转化物低给药量组肝组织形态学影响的光学显微镜示意图。
图5是本发明鸡胆转化物对鸡胆转化物中给药量组肝组织形态学影响的光学显微镜示意图。
图6是本发明鸡胆转化物对鸡胆转化物高给药量组织形态学影响的光学显微镜示意图。
图7是本发明鸡胆转化物对正常对照组肝组织超微形态的电子显微镜观察示意图。
图8是本发明鸡胆转化物对模型对照组肝组织超微形态的电子显微镜观察示意图。
图9是本发明鸡胆转化物对熊去氧胆酸阳性对照组肝组织超微形态的电子显微镜观察示意图。
图10是本发明鸡胆转化物对鸡胆转化物低给药量组肝组织超微形态的电子显微镜观察示意图。
图11是本发明鸡胆转化物对鸡胆转化物中给药量组肝组织超微形态的电子显微镜观察示意图。
图12是本发明鸡胆转化物对鸡胆转化物高给药量组肝组织超微形态的电子显微镜观察示意图。
其中，光学显微镜下，使用苏木精-伊红染色法进行染色，放大倍数为100倍；电子显微镜的放大倍数为6000倍。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例按照CN104382941A公开的制备方法制备鸡胆转化物
1、鸡胆粉的制备
鸡胆从屠宰场购买得到。首先确定胆的数量和重量。用75％酒精对鸡胆局部进行消毒，然后分别剖取胆汁。将取出的胆汁冷冻干燥48h，得到鸡胆粉，放置干燥器中保存备用。
2、鸡胆转化物的制备
(1)鸡胆粉的处理
配制20L pH值为7.0～9.0磷酸盐缓冲液(PBS)超声溶解140-150g鸡胆粉得鸡胆粉溶液，超声充分溶解；将鸡胆粉溶液在11000g条件下离心10min后，3-5次过滤，滤液作为禽畜胆粉处理液在4℃保存，备用；滤渣冷冻干燥，保存备用。
(2)固定化酶的制备
在1％的壳聚糖溶液中加入适量醋酸，磁力搅拌30min制得壳聚糖醋酸溶液。将上述溶液用高压注射泵注入到100mL 3％(w/v)的三聚磷酸钠溶液中固化1～2h，得到粒度均匀、形状规则的白色的壳聚糖球，然后过滤，用去离子水洗涤多次。将制备好的壳聚糖球放入盛有0.125％戊二醛水溶液的烧杯中，并置于37℃，170g下的摇床中，活化2～4h，即得活化壳聚糖微球。称取10g活化好的壳聚糖微球，装入小型层析柱，加入适量的7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶液，其中7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)来自于微生物，如撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense，DSM599/ATCC27555)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis ATCC25825)或产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens ATCC25986)。采用垂直混合方式结合4～6h，固定完毕，放出酶液，并用PBS缓冲液冲洗固定后酶柱3～5次。结果检测表明7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶的固定率大于90％。
(3)生物催化转化
在固定化酶柱中加入第(1)步制备好的鸡胆粉溶液处理后的滤液作为反应底物溶液，加入辅酶I，使辅酶I:TCDCA＝1:3(摩尔比)，在20～30℃下，反应2～6h。
(4)反应液的处理
将反应完毕后的反应液冷冻干燥48h，得固体反应产物。最后将在第(1)步得到的滤渣与反应产物混合均匀，即得鸡胆转化物。
实施例2
健康雄性C57BL/6J小鼠，体重20±2g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。小鼠随机分为正常对照组、模型对照组(患有胆汁淤积性肝病)、熊去氧胆酸阳性对照组、鸡胆转化物低、中、高剂量给药组(给药量分别为0.1g/kg、0.2g/kg、0.4g/kg)。阳性对照组按照115mg/kg灌胃给予熊去氧胆酸UDCA(溶于PBS)，正常对照组和模型对照组灌胃给予等容量生理盐水，鸡胆转化物低、中、高剂量给药组分别给予0.1g/kg、0.2g/kg及0.4g/kg鸡胆转化物(溶于生理盐水)灌胃给予每日1次，连续给药14天。试验第12天给药4h后，除正常对照组外，其余各组单次灌胃给予50mg/kgα-萘异硫氰酸酯(ANIT)。
试验第14天前一晚所有动物禁食不禁水12h，试验第14天给药4h后采集血清测定肝脏功能，摘取肝脏进行病理检测。结果如下表1(鸡胆转化物胆汁淤积小鼠ALT、AST、ALP活性的影响)和表2(鸡胆转化物胆汁淤积小鼠总胆汁酸TBA、总胆红素TBIL、直接胆红素DBIL活性的影响)所示：
表1
组别 N ALT(IU/L) AST(IU/L) ALP(IU/L) 正常组 10 30.30±3.97** 145.60±36.41** 586.60±49.65** 模型组 10 1761.60±233.29 3416.60±381.06 1118.50±146.43 熊去氧胆酸组 10 1165.70±162.05** 2162.80±468.87** 904.00±184.76** 转化物0.1g/kg 10 618.30±236.18** 757.30±272.46** 573.80±160.54** 转化物0.2g/kg 10 1033.50±205.00** 1237.60±303.00** 697.30±144.21** 转化物0.4g/kg 10 1582.70±341.91 1771.60±438.57** 986.10±152.53
注：*P<0.05，**P<0.01Vs模型组，N为小鼠只数。
表2
组别 N TBA(IU/L) TBIL(IU/L) DBIL(g/L) 正常组 10 4.49±0.76** 0.41±0.21** 0.43±0.20** 模型组 10 678.31±31.05 125.04±22.67 101.84±18.42 熊去氧胆酸组 10 316.67±82.11** 8.94±3.12** 6.87±2.34** 转化物0.1g/kg 10 183.22±106.12** 5.96±4.28** 4.30±3.30** 转化物0.2g/kg 10 344.47±130.60** 7.32±3.54** 5.80±2.83** 转化物0.4g/kg 10 491.71±62.18** 14.79±1.87** 12.04±1.38**
注：*P<0.05，**P<0.01Vs模型组，N为小鼠只数。
通过以上实验结果表明，与正常对照组相比，模型对照组动物血清ALT、AST、ALP和TBA、TBIL和DBIL显著性升高。提示ANIT诱导的小鼠胆汁淤积性肝损伤模型建立。与模型对照组相比，鸡胆转化物低、中、高剂量组和阳性对照组动物血清各指标降低，提示鸡胆转化物能够改善胆汁淤积、减轻肝损伤。
光镜下显示(如图1-图6所示)，与正常对照组(图1)相比，模型对照组(图2)出现明显的肝细胞肿胀与坏死、炎性细胞浸润；与模型组比较，鸡胆转化物低(图4)、中(图5)、高剂量组(图6)肝脏损伤明显改善，提示鸡胆转化物能够减轻肝损伤。
电镜下显示(如图7-图12所示)，正常对照组(图7)小鼠肝脏细胞器完整、清晰，与正常对照组相比，模型对照组(图8)小鼠肝脏胞浆溶解、内质网肿胀；与模型对照组相比，鸡胆转化物组(图10、图11和图12)动物肝脏细胞器损伤状态显著改善。
综上实验结果表明，本发明的家禽胆转化物，尤其是鸡胆转化物具有抗胆汁淤积性肝病的作用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的家禽胆转化物在制备抗胆汁淤积性肝病药物中的应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。