技术领域
本发明涉及设计用于治疗或管控HIV/AIDS的组合物的用途。本发明的方法包括施用包含有效量的双膦酸盐的制剂以抑制单核细胞和/或巨噬细胞活性和/或降低炎症和/或减少HIV储库。组合物的使用可以补充抗病毒疗法，诸如高活性抗逆转录病毒疗法(HAART)。
技术背景
人免疫缺陷病毒感染/获得性免疫缺陷综合征(HIV/AIDS)是由人免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的人免疫系统的疾病。自从其在1980年代初发现以来，AIDS已变为流行病且引起超过2500万例死亡。目前全球约3500万人携带HIV/AIDS生活，迫切需要该疾病的有效、可负担、长期的治疗和管控。
HIV可感染各种免疫细胞，其中CD4+T细胞和单核细胞/巨噬细胞是主要目标。HIV首先通过病毒包膜与细胞膜的融合且将HIV衣壳释放至细胞中而攻击目标细胞。在受感染细胞内，HIV的单链RNA基因组被逆转录为双链病毒DNA，并且病毒DNA被整合至受感染细胞的基因组中。然后，受感染细胞的细胞机制被劫持以产生RNA基因组以及病毒的蛋白组分，其在受感染细胞内装配成未成熟的HIV病毒粒子。在细胞表面最终装配之后，未成熟的HIV病毒粒子从受感染细胞的细胞膜出芽，并且在蛋白酶切割的最后步骤之后，释放所得成熟病毒粒子，完成复制循环。HIV在感染之后的前2-4周快速复制，导致循环CD4+T细胞数量的显著下降。在调动仍然大部分完整的免疫系统以对抗HIV复制后，病毒水平受到控制，并且CD4+T细胞计数稳定，使得HIV感染进入临床潜伏，并且潜伏可持续约三年至超过20年。随着HIV侵蚀免疫系统，CD4+T细胞的水平最终下降至报警水平，并且HIV感染进展为AIDS。AIDS患者经常由于其免疫系统的崩溃而死于机会性感染。HIV也可损害神经系统，在感染早期通过受感染免疫细胞进入脑部，并进一步传播至中枢神经系统(CNS)驻留的免疫细胞，诸如小胶质细胞和星形胶质细胞。这些感染可损害脑部和脊髓并引起症状诸如混乱和健忘，行为改变，头痛，进行性无力和手臂和腿部的感觉丧失。
AIV/AIDS的主流治疗是高度活性的抗逆转录病毒疗法(HAART)，其使用包括多种类型的抗病毒剂的化合物的组合(或“混合物(cocktail)”)。受感染个体中的病毒产生主要是涉及具有游离病毒和病毒产生细胞的快速更新的活化的CD4+T细胞的连续轮次的重新感染和复制的动态过程的结果。这些抗病毒混合物抑制HIV复制周期的步骤，包括进入、逆转录、整合、装配和释放。因此，HAART暂停HIV复制周期，引起未成熟的HIV病毒粒子和宿主细胞的消耗，导致HIV感染的遏制。
然而，目前的抗病毒疗法无法根除HIV感染，因为其它HIV感染的细胞，包括静息记忆CD4+T细胞和单核细胞/巨噬细胞，具有长半衰期，因此充当病毒储库。HAART还具有高成本、不利的毒性作用、药物相互作用和耐药性的缺点。这些不良反应有时使得有必要引入结构化治疗中断(“TI”或药物假期)或完全停止治疗。耐药性是HAART中的重要问题：HIVRNA的逆转录易于出错，导致将突变引入病毒基因组。持续的抗病毒药物施用为耐药性突变病毒株提供了天然选择。存在这样的理论：TI可允许更“适合的”野生型药物敏感的病毒的生长超过不太“适合的”耐药突变株。由于该额外原因，经常推荐以结构化方式中断抗病毒疗法。然而，血浆病毒载量(VL)的反弹和CD4+T细胞计数的下降在TI期间是常见的，由此否定HAART治疗的效果。在HIV储库中隔绝的病毒粒子，特别是耐药性病毒粒子，在TI期间不再被抑制，并且可以成熟并被释放。这被认为是TI期间治疗挫折以及当随后重新引入时HAART频繁提供的不太有效的抑制的原因。
受感染的静息记忆CD4+T细胞、单核细胞和巨噬细胞是HIV的储库，包括耐药性毒株。此外，单核细胞产生细胞因子，例如TNFα，其在其它受感染细胞(例如CD4+T细胞)中诱导HIV复制。受感染的活化巨噬细胞能够触发未感染的T细胞的细胞凋亡，并保护HIV感染的T细胞免于细胞凋亡。因此，单核细胞和巨噬细胞提供了准备在TI期间复制的病毒池，并且它们的生理活性进一步放大HIV感染对免疫系统的损害。一些研究已靶向单核细胞和巨噬细胞作为HIV/AIDS的治疗，然而，这些方法的治疗效力已受限制。
测试通过选择性单采血液成分术(apheresis)清除循环单核细胞的效果的临床研究产生了混合结果。选择性单采血液成分术涉及将HIV感染的接受HAART的患者的血液通过体外装置以去除循环单核细胞和粒细胞。在一项研究中，在HAART治疗期间的单采血液成分术与对照相比不影响血浆HIV-1RNA载量，但在3-4次单采血液成分术期间之后降低TNFα水平且增加CD4+T细胞计数。(Beretta,A.等人,J.Biol.Regulators and Homeostatic Agents 14,27-31(2000).)在另一项研究中，在TI的前5周期间进行单核细胞和粒细胞的选择性单采血液成分术。在重新引入HAART后，单采血液成分术组表现出CD4+T细胞计数的增加。HAART重新引入未能抑制大多数、但不是所有对照组中的病毒反弹，而大部分单采血液成分术组表现出病毒学抑制。在一些单采血液成分术组中观察到高达52％的单核细胞HIV病毒载量的降低，但在其它中观察到与对照相当的增强。(Hasson,H.等人,J.Med.Virol.79,1640-49(2007).)这些有限的结果可能是由于以下事实负责：单采血液成分术导致循环单核细胞仅30％的平均降低，并且循环单核细胞代表全身单核细胞/巨噬细胞池的一小部分。这样的方法的另一个限制在于单采血液成分术是侵入性和耗时的住院患者程序，其可对患者造成显著负担。
其他研究人员还在HIV动物模型中测试了巨噬细胞抑制药物，并且在HAART停止之后看到对病毒载量对照和CD4+T细胞反弹的阳性效应。为了实现巨噬细胞的特异和有效的靶向，将药物装载于红细胞血影(爆发的红血细胞)中。(参见Cervasi,B.等人,J.Viol.80,10335-45(2006)；Serafini,S.等人,Antirivial Res.81,93-102(2009).)然而，红细胞血影难以制备和储存，使它们不是以大量需求递送药物的理想选择。此外，红细胞血影因为固有的渗漏和消除红血细胞的正常生理过程而迅速释放其内容物。所得升高的血浆药物浓度导致毒理学问题。(参见Lanao,J.M.等人,J.Drug Targeting 15(1),21-36(2007).)
因为科学家仍未找到可靠的治愈或有效的HIV疫苗，所以至关重要的是减缓HIV感染的进展并尽可能长地维持临床潜伏。因此，本领域需要一种安全且有效的方法来抑制HIV/AIDS患者中的病毒复制以补充HAART，特别是在TI期间。此外，期望这样的方法易于施用，并且具有大量产生的潜能以满足大量HIV/AIDS群体的需求。
本发明提供了特异性靶向单核细胞和巨噬细胞、HIV潜伏储库、预防或延缓HIV病毒载量的反弹的优点。预期该配方改善TI安全性并延长TI的长度。考虑到HAART对HIV/AIDS患者和公共卫生系统的身体和财务负担，高度期望更安全和更长的TI用于长期管控疾病。与现有技术相比，作为HIV/AIDS抗病毒疗法的辅助疗法，本发明的制剂易于施用，非侵入性，易于储存和分配，并且适于大量生产。
发明内容
本发明涉及用于治疗或管控HIV/AIDS的药物组合物的用途，特别是在TI期间或在抗病毒疗法停止之后补充和维持抗病毒疗法的效果的用途。本发明的方法包括在设计以抑制吞噬细胞的活性和/或减少吞噬细胞的数量的制剂中施用有效量的一种或多种治疗剂。这样的吞噬细胞包括，但不限于，巨噬细胞和单核细胞。治疗剂优选包括双膦酸盐。这样的根据本发明的施用目的在于在抗病毒疗法和TI期间抑制或消耗HIV储库(包括潜伏储库)，以及帮助增加外周CD4+T细胞的水平，以便防止或延缓病毒的反弹，特别是当适用TI时。
具体而言，本发明涉及通过向有需要的个体施用有效量的包含任选地与其它治疗剂组合的双膦酸盐的制剂而消耗HIV储库(即单核细胞/巨噬细胞)的数量和/或抑制其功能，用于治疗或管控HIV/AIDS的方法。
双膦酸盐(以前称为二膦酸盐)是特征在于两个碳-磷酸(C-P)键的化合物。它们是内源性无机焦磷酸盐的类似物，其参与骨形成和再吸收的调节。如果两个键位于同一碳原子上(P-C-P)，则它们被称为偕双膦酸盐，且术语双膦酸盐通常用于偕双膦酸盐和非偕双膦酸盐。双膦酸盐和焦磷酸盐有时可以一起形成聚合链。在临床环境中，双膦酸盐主要用作骨吸收和异位钙化的有效抑制剂；最近，正在探索它们在其它领域的临床适应症，并且已经显示脂质体包裹的双膦酸盐治疗心血管病况，包括再狭窄。参见，例如，美国专利号6,719,998。
该方法中使用的制剂可以包含包封的、包埋的或微粒状的双膦酸盐。该制剂包含具有允许该制剂主要或仅经由吞噬作用进入细胞的特性的颗粒，因此预期该制剂特异性靶向吞噬细胞。不受理论所束缚，一旦被靶向的吞噬细胞、巨噬细胞和单核细胞吞噬，双膦酸盐就被释放至吞噬细胞中，并抑制其功能和/或消耗其数量。
在一个实施方案中，该方法中使用的制剂包含包封于适当尺寸的脂质体中的双膦酸盐。脂质体包封的双膦酸盐，凭借其允许该制剂主要或仅通过吞噬作用摄取的特性，诸如脂质体的大小、电荷、电导率和脂质组成，特异性靶向单核细胞和/或巨噬细胞。一旦被吞噬细胞摄取，脂质体包封的双膦酸盐就在细胞内释放，以抑制单核细胞和/或巨噬细胞的活性和/或杀死单核细胞和/或巨噬细胞。
在另一个实施方案中，所述方法使用包含包埋在具有适于吞噬摄取的粒径的载体中的双膦酸盐的制剂。包埋载体还可以具有使其成为巨噬细胞和/或单核细胞的吞噬目标的电荷或表面特性。
在又另一个实施方案中，所述方法使用包含微粒形式的双膦酸盐的制剂，所述微粒具有适于吞噬摄取的大小。
在一个实施方案中，所述制剂在抗病毒疗法期间施用。在另一个实施方案中，所述制剂在TI期间施用。在又另一个实施方案中，所述制剂在抗病毒疗法期间和TI期间均施用。在又另一个实施方案中，所述制剂在即将停止抗病毒疗法之前施用。所述抗病毒疗法可以是HAART。
本发明的优点包括特异性靶向单核细胞和巨噬细胞、HIV储库，以及预防或延缓HIV病毒载量的反弹。预期该配方改善TI安全性并延长TI周期。考虑到HAART对HIV/AIDS患者和公共卫生系统两者的身体和财务负担，高度期望更安全和更长的TI用于长期管控该疾病。与现有技术相比，作为HIV/AIDS抗病毒治疗的辅助疗法，本发明的制剂易于施用，非侵入性，易于储存和分配，并且适于大量生产。
附图说明
图1A-1B示出经7天向食蟹猴施用单次剂量的0.1mg/kg脂质体阿仑膦酸盐与媒介物对照相比对外周CD4+计数的影响。图1A示出单核细胞的绝对频率；图1B示出单核细胞的相对频率。
图2A-2D示出在脂质体阿仑膦酸盐的不同剂量方案之后不同时间的恒河猴中的血清化学。图2A显示血清白蛋白的浓度；图2B显示丙氨酸转氨酶的浓度；图2C显示碱性磷酸酶的浓度；图2D显示总胆红素。
图3A-3B示出使用流式细胞术染色组测量的施用单次1mg/kg剂量的脂质体阿仑膦酸盐与媒介物对照相比对恒河猴中的单核细胞频率(图3A)和单核细胞亚群频率(图3B)的影响。
图4A-4D示出经7天施用单次1mg/kg剂量的脂质体阿仑膦酸盐与媒介物对照相比对恒河猴的全血中的单核细胞和三种单核细胞亚群的绝对计数和频率的影响。图4A:全血；图4B:CD14+CD16-；图4C:CD14+CD16+；图4D:CD14-CD16+。
图5A-5E示出用于鉴定组织和骨髓中的巨噬细胞的设门方法。
图6A-6C示出来自恒河猴中的各种组织的代表性组织驻留的巨噬细胞和骨髓髓样前体染色。
图7A-7C示出在脂质体阿仑膦酸盐治疗前后在恒河猴的组织和骨髓中的巨噬细胞和髓样前体的频率。图7A：骨髓；图7B：肝脏；图7C：结肠。
图8A-8C示出脂质体阿仑膦酸盐对非人灵长类模型中的单核细胞治疗的影响。图8A显示通过CD45染色相比侧向散射概况评价的全血中的单核细胞频率；图8B显示绝对单核细胞计数；图8C显示使用BrdU之后的单核细胞更新。
图9示出施用脂质体双膦酸盐阿仑膦酸盐1mg/kg与媒介物对照相比对SHIV感染的恒河猴的病毒载量的影响。
图10示出施用1mg/kg脂质体阿仑膦酸盐与媒介物对照相比对SHIV感染的恒河猴中的外周CD4+计数的影响。
注意的是提供附图作为本发明的示例性理解，且示意性地示出本发明的特定实施方案。技术人员将容易地认识到同样在本发明的范围内的其它类似实例。附图不旨在限制如所附权利要求中限定的本发明的范围。
具体实施方式
单核细胞和巨噬细胞易受HIV感染，并且感染的单核细胞和巨噬细胞具有整合至其基因组中的病毒DNA。因为单核细胞和巨噬细胞具有长寿命并且不频繁循环，所以它们在抗病毒疗法期间充当HIV的储库，庇护未成熟的HIV病毒粒子，该HIV病毒粒子可以在抗病毒疗法中断后释放。单核细胞和巨噬细胞也分泌各种趋化因子，该趋化因子促进HIV感染的进一步传播。
本发明提供药物制剂，该药物制剂用于在抗病毒疗法期间和/或之后的一段时间通过减少或抑制单核细胞/巨噬细胞活性和/或消除或减少单核细胞/巨噬细胞的量来治疗HIV感染。本发明的方法包括在被单核细胞和/或巨噬细胞选择性摄取的制剂中施用有效量的双膦酸盐。考虑施用以补充抗病毒疗法，诸如HAART，以便在抗病毒疗法的中断期间预防或延缓病毒载量的反弹和增加CD4+T细胞计数。预期这可以允许延长TI周期，由此延缓重新引入抗病毒疗法的需求。
在一个实施方案中，在抗病毒疗法期间施用制剂以起始单核细胞/巨噬细胞抑制作用，在TI期间持续并持续直到疗法停止。期望该制剂的HIV抑制作用在TI期间持续，因此该制剂可以在抗病毒疗法中断之前的短时段内施用，例如在抗病毒疗法中断之前约3天、或约5天、或约7天、或约10天内施用。在另一个实施方案中，所述制剂在TI期间施用。在又另一个实施方案中，所述制剂在抗病毒疗法期间和TI期间均施用。在抗病毒疗法期间和/或在TI期间多次施用该制剂以达到有效量并持续期望时间段维持HIV抑制效果在本发明的范围内。
使用本发明的制剂，例如包封的、包埋的或微粒状双膦酸盐，选择性灭活作为重要的HIV储库的单核细胞和/或巨噬细胞和/或消耗作为重要的HIV储库的单核细胞和/或巨噬细胞的数量。因为其特定大小和/或其它物理化学特性，该制剂将主要或仅通过吞噬作用进入细胞。因此，本发明的制剂特异性靶向吞噬细胞，诸如单核细胞和巨噬细胞。一旦在吞噬细胞内，双膦酸盐就被释放，并抑制、灭活、丧失能力、杀死和/或消耗单核细胞和/或巨噬细胞。
如本文所使用的术语“吞噬作用”是指进入吞噬细胞的优选方式，并且是本领域众所周知的。然而，该术语应当理解为还涵盖也可以实现相同效果的内吞作用的其它形式。具体而言，应当理解，本发明的方法和组合物还涵盖胞饮作用、受体介导的内吞作用和用于从胞外吸收/内化物质的其它细胞方式。
双膦酸盐
该制剂中使用的治疗剂是双膦酸盐或其类似物。如本文所使用的术语双膦酸盐表示偕双磷酸盐和非偕双磷酸盐。该治疗剂在其范围内还涵盖双膦酸盐或焦磷酸盐的聚合链，具体地由最多达40个双膦酸盐单体组成的这样的链。在一个实施方案中，所述双膦酸盐具有下式(I)：
其中R1是H、OH或卤素原子；且R2是卤素；直链或支链的C1-C10烷基或C2-C10烯基，所述直链或支链的C1-C10烷基或C2-C10烯基任选地被杂芳基或杂环基C1-C10烷基氨基或C3-C8环烷基氨基取代，其中氨基是伯氨基、仲氨基或叔氨基；-NHY，其中Y是氢、C3-C8环烷基、芳基或杂芳基；或R2是-SZ，其中Z是氯取代的苯基或吡啶基。
根据本发明可以使用的其它双膦酸盐包括，但不限于，氯膦酸盐、替鲁膦酸盐、3-(N,N-二甲基氨基)-1-羟基丙烷-1,1-二膦酸，即二甲基-APD；1-羟基-亚乙基-1,1-双膦酸，即，依替膦酸盐；1-羟基-3(甲基戊基氨基)-亚丙基-双膦酸，(伊班膦酸)，即，伊班膦酸盐；6-氨基-1-羟基己烷-1,1-二膦酸，即，氨基-己基-BP；3-(N-甲基-N-戊基氨基)-1-羟基丙烷-1,1-二膦酸，即，甲基-戊基-APD；1-羟基-2-(咪唑-1-基)乙烷-1,1-二膦酸,即，唑来膦酸；1-羟基-2-(3-吡啶基)乙烷-1,1-二膦酸(利塞膦酸)，即，利塞膦酸盐；3-[N-(2-苯基硫代乙基)-N-甲基氨基]-1-羟基丙烷-1,1-双膦酸；1-羟基-3-(吡咯烷-1-基)丙烷-1,1-双膦酸，1-(N-苯基氨基硫代羰基)甲烷-1,1-二膦酸,即，FR 78844(Fujisawa)；5-苯甲酰基-3,4-二氢-2H-吡唑-3,3-二膦酸四乙酯，即，U81581(Upjohn)；和1-羟基-2-咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)乙烷-1,1-二膦酸，即，YM529，或其类似物。上述双膦酸盐中的一些的化学式描述于美国专利号6,719,998(其通过引用并入本文)中。
在一个具体实施方案中，双膦酸盐是阿仑膦酸盐或其类似物。在这样的实施方案中，式I具有R1＝OH和R2＝(CH2)3-NH3。
阿仑膦酸盐是提供良好的治疗窗口[17,21,22]的第二代含氮双膦酸盐。通常，含氮双膦酸盐包含特别在本发明中有用的优选的双膦酸盐亚类。这样的双膦酸盐可以基于其模拟阿仑膦酸盐的生物活性的能力来选择。这包括，例如：一旦在这样的细胞内就抑制吞噬细胞活性(例如，巨噬细胞和成纤维细胞)的体外活性；抑制从巨噬细胞分泌IL-1和/或IL-6和/或TNF-α；和体内活性，例如受测制剂消耗动物模型或人体中的血液单核细胞或使动物模型或人体中的血液单核细胞丧失能力或治疗HIV/AIDS的能力。
制剂、药物组合物和施用途径
本发明的制剂可以制备为具有适于仅仅或主要通过吞噬作用细胞内化、由此为吞噬细胞诸如巨噬细胞和单核细胞赋予特异性的粒径。优选制备含有根据本发明的双膦酸盐的制剂，使得所述制剂具有将仅仅或主要通过吞噬作用内化的粒径，即优选大于0.03微米。例如，这样的制剂可以具有这样的粒径，例如约0.03-1.0微米、或约0.1-0.3微米、或约0.1-0.18微米、或约0.07-0.5微米、或约0.07-0.15微米的平均直径。在施用于有需要的患者之前，可以使用本领域已知的任何方法来确定制剂颗粒的大小。例如，可以使用利用激光散射的Nicomp Submicron Particle Sizer(型号370,Nicomp,Santa Barbara,Calif.)。
可以使用本领域已知的任何方法将双膦酸盐掺入可以仅仅或主要通过吞噬作用摄入细胞的制剂中。该制剂可以隔离双膦酸盐足够时间以增强向目标位点的递送。该制剂可以具有影响或增强吞噬作用的电荷或表面特性。此外，当在目标位点处的目标细胞(例如，单核细胞和/或巨噬细胞)内时，该制剂可以排出双膦酸盐。
在一个实施方案中，双膦酸盐被包封。包封形式意指具有充当治疗剂的屏障的结构的包封物，诸如例如聚合物或脂质递送系统。在一个实施方案中，包封剂是脂质体。脂质体包含包封双膦酸盐的脂质成分，并且脂质体可以是单一脂质层或可以是多层的。所述脂质体可以是带正电荷的，中性的或带负电荷的。在一个优选实施方案中，所述脂质体是带负电荷的。根据本发明的合适的脂质体优选是无毒脂质体，诸如例如由磷脂酰-胆碱、磷酸甘油和胆固醇制备的脂质体。在一个实施方案中，所述脂质成分可包括，例如，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)和胆固醇(chol)。例如，所述脂质体可以包含3:1:2摩尔比的DSPC:DSPG:chol。双膦酸盐的质量与脂质成分的质量的比率，称为药物:脂质比，可以为约1:5至1:8(以重量计)，或约1:6至1:7(以重量计)。在某些实施方案中，可以使用，诸如，例如，DSPC、DSPG和胆固醇中包封的阿仑膦酸钠，可以使用药物:脂质质量比为1:5.7–等于对于阿仑膦酸钠的约1:3摩尔比。作为另一个实例，在相同脂质成分中包封氯膦酸二钠，可以使用约1:5.4的质量比，其等于1:3摩尔比。其它双膦酸盐和其它脂质组合的摩尔比的确定在本领域的技术之内。
该制剂的脂质体具有允许主要经由吞噬作用摄取的特定特征，包括大小、电荷、pH、电导率和重量摩尔渗透压浓度。使用的脂质体的直径可以在适合于通过单核细胞或巨噬细胞的吞噬作用的大小范围内，例如，0.03-1.0微米的范围内，或者该直径可以具有在如本文所述范围内的大小或大小范围。例如，在一个实施方案中，所述脂质体可以具有约0.08±0.005微米的直径。所述脂质体的电导率可以为，例如约13.5-17.5ms/cm。所述脂质体的外部重量摩尔渗透压浓度可以与人体的重量摩尔渗透压浓度匹配，并且内部重量摩尔渗透压浓度可以更低，因为更低的重量摩尔渗透压浓度可以增强制剂的稳定性。因此，例如，内部重量摩尔渗透压浓度可以为约340-440osmol/kg。所述脂质体和/或脂质体制剂的内部pH可以为约6.9。
脂质体可以通过本领域已知的任何方法制备(参见，例如，J.,等人,J.DRUG TARGET,2:299-308(1994)；J.,等人,CALCIF.TISSUE INT.,53:139-145(1993)；Lasic,D..,LIPOSOMES TECHNOLOGY INC.,Elsevier,第3章,第63-105页(1993)；Winterhalter,M,Lasic,D.D.,CHEM.PHYS.LIPIDS,54(1-3):35-43(1993年9月)；Epstein-Barash,H.,等人,J.CONTROLLED RELEASE,146:182-195(2010)；Epstein,H.等人,AAPS J,10:505-515(2008)；美国专利号7,008,645；美国专利公开号2010/0015213；美国专利公开号2004/0266734；美国专利申请系列号13/804,707)；其中所有都以其整体通过引用并入本文)。在一种这样的方法中，脂质体被形成为液态晶体双层的堆叠，该液态晶体双层被水化成水化的液态片材，该液态片材在振动期间脱离并自行闭合以形成大的多层囊泡(MLV)(称为薄脂质膜水化技术)。一旦形成这些颗粒，可以使用声能(超声处理)或机械能(挤出)降低这些颗粒的大小。超声处理通常产生小的单层囊泡(SUV)；并且脂质挤出(在高压下(最高达500psi)迫使脂质悬浮液通过一系列聚碳酸酯过滤器(通常为0.8、0.4、0.2和0.1微米膜))产生具有接近所用过滤器的孔径的直径的颗粒。
基本均匀的脂质体可以通过低压方法制备，如美国专利公开号2004/0266734和共同未决的美国专利申请系列号13/804,707(其两者均通过引用并入本文)中所述。简言之，例如，所述治疗剂可以与预选的脂质混合以形成囊泡，所述囊泡可以在单阶段中通过具有单一预选大小的过滤器挤出，随后超滤。该方法可以产生具有约0.03-0.5微米、约0.07-0.12微米、约0.07-0.15微米、约0.1-0.18微米和约0.1-0.3微米的粒径的脂质体。
在一个实施方案中，所述脂质体可以如下制备：(1)混合双膦酸盐和预选的脂质以形成多层囊泡(MLV)，(2)产生最终大小的囊泡，和(3)纯化和选择双膦酸盐负载的脂质体。在步骤(1)中，通常将双膦酸盐溶解于水中，同时将精确称重的脂质成分溶解于溶剂(诸如氯仿:甲醇(9:1)、乙醇:叔丁醇(1:1)或乙醇:叔丁醇:水(77:77:6v/v/v))中。然后将双膦酸盐溶液混入脂质溶液中，并且可以采用温和加热以帮助混合。该过程导致双膦酸盐有效包封于MLV中，所述MLV大小不均匀且大于期望的最终大小。在步骤(2)中，使用机械方法来减小囊泡的大小并使囊泡具有均匀大小和形状。本领域已知的方法包括超声处理和挤出。可以通过施加压力并迫使脂质-药物混合物通过具有递减孔径的一系列过滤器来挤出脂质体。或者，可以通过共同未决的美国专利申请13/804,707中描述的方法使用单级过滤和单一孔大小过滤器在低压下挤出脂质体。该方法可以节省操作成本和时间，并且可以相比于多级、高压挤出增加产率。在步骤(3)中，将适当包封的双膦酸盐与未包封的双膦酸盐、溶剂和脂质分离。该步骤的示例性方法包括通过凝胶柱的凝胶过滤和通过膜的超滤。
在另一个实施方案中，将双膦酸盐包埋于载体中，即具有期望特性(例如，具有在0.03-1.0微米范围内的粒径)的包埋剂中。包埋的双膦酸盐包括包埋、包封和/或吸附于载体中、分散于载体基质中、吸附或连接于载体表面上或任何这些形式的组合的双膦酸盐。在具体实施方案中，所述包埋剂(或载体)是微粒、纳米颗粒、纳米球、微球、微胶囊或纳米胶囊(参见，例如，M.Donbrow:Microencapsulation and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy,CRC Press,Boca Raton,Fla.,347,1991)。术语“载体”包括聚合和非聚合的制剂。在一个具体实施方案中，所述包埋剂是纳米颗粒。所述纳米颗粒可以是球形、非球形或聚合颗粒。所述治疗剂可以包埋于纳米颗粒中，均匀或不均匀地分散于聚合物基质中，吸附于表面上，或者以任何这些形式的组合。在一个优选实施方案中，用于制造纳米颗粒的聚合物是生物相容的和可生物降解的，诸如聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)聚合物(PLGA)。然而，可用于制造纳米颗粒的额外聚合物包括，但不限于，PLA(聚乳酸)及其共聚物，聚酐类，聚烷基氰基丙烯酸酯类(诸如聚异丁基氰基丙烯酸酯)，聚乙二醇类，聚环氧乙烷类及其衍生物，壳聚糖，白蛋白，明胶等。包埋的双膦酸盐可以具有例如0.03-1.0微米的大小范围内的粒径，或者粒径可以具有如本文所述的适合于由单核细胞或巨噬细胞吞噬的该范围内的大小或大小范围，例如约0.03-1.0微米、或约0.1-0.3微米、或约0.1-0.18微米、或约0.07-0.5微米、或约0.07-0.15微米的平均直径。
在另一个实施方案中，所述双膦酸盐为微粒形式，该微粒各自具有期望特性。微粒形式包括未包封或包埋的任何不溶性悬浮或分散的微粒形式。微粒形式的双膦酸盐可以是悬浮或分散的胶体、聚集物、絮凝物、不溶性盐、不溶性复合物和聚合链的形式。这样的微粒不溶于它们储存/施用的流体(例如，盐水或水)中以及它们提供其治疗效果的流体(例如，血液或血清)中。通常，“不溶性”是指一(1)份微粒状化合物于超过一万(10,000)份溶剂中的溶解度。可以使用本领域已知制备微粒或聚集物的任何方法。微粒状双膦酸盐可以具有例如0.03-1.0微米的大小范围内的粒径，或者粒径可以具有如本文所述的适合于由单核细胞或巨噬细胞吞噬的该范围内的大小或大小范围，例如约0.03-1.0微米、或约0.1-0.3微米、或约0.1-0.18微米、或约0.07-0.5微米、或约0.07-0.15微米的平均直径。
尽管本发明的每种制剂被设计为吞噬作用的目标，但除单核细胞和巨噬细胞以外的吞噬细胞，诸如例如嗜中性粒细胞，可以吞噬颗粒，但将不受影响或影响较小，因为双磷酸盐的活性对于单核细胞和巨噬细胞是相对排他的。由于脂质体制剂的特定物理化学特性，非吞噬细胞相对地不能摄取该制剂。
在被单核细胞/巨噬细胞摄取之后，预期双膦酸盐对单核细胞/巨噬细胞具有持续的抑制的活性。这种持续活性足以调节单核细胞/巨噬细胞的炎性作用。因此，不需要药剂的延迟释放以维持抑制。因此，通过抑制单核细胞/巨噬细胞，诸如例如通过使用包封的药剂来治疗某些疾病的方法，优选为系统性疗法，因为所述制剂靶向循环单核细胞和组织驻留的巨噬细胞两者。取决于制剂中的特定双膦酸盐，吞噬性单核细胞或巨噬细胞可不同响应。例如，阿伦膦酸盐包封的脂质体可引起细胞凋亡，而氯膦酸盐包封的脂质体可引起坏死。
用于本发明方法中的制剂可以以用于施用的各种药物形式提供，这取决于每个患者特异性的各种因素(例如，患者的病症的严重度和类型，年龄，体重，反应，和过去病史)，制剂中的治疗剂的数量和类型，制剂的类型(例如，包封的，包埋的，微粒状的，等)，组合物的形式(例如，液体、半液体或固体形式)，和/或施用途径(例如，口服，静脉内，肌肉内，动脉内，髓内，鞘内，心室内，经皮，皮下，腹膜内，鼻内，肠内，局部，舌下，阴道，或直肠方式)。本发明的组合物中可以包括药物载体、媒介物、赋形剂或稀释剂，包括，但不限于，水，盐水溶液，缓冲盐水溶液，油类(例如，石油，动物油，植物油或合成油)，淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明胶，麦芽，稻米，面粉，白垩，硅胶，硬脂酸钠，单硬脂酸甘油酯，滑石，氯化钠，干燥脱脂乳，甘油，丙二醇，乙二醇，乙醇，右旋糖等。所述组合物，如果需要，也可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、散剂、缓释制剂等的形式。
适合于不经肠胃施用的制剂可以在水溶液中制备，优选在生理相容的缓冲液诸如Hanks氏溶液、Ringer氏溶液或生理缓冲盐水中制备。水性注射悬浮液可以含有增加混悬液的粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。此外，活性化合物的混悬液可被制备为适当的油性注射混悬液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油诸如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，诸如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。任选地，混悬液也可含有合适的稳定剂或增加化合物的溶解度以制备高度浓缩的溶液的试剂。
双膦酸盐可以以任何形式提供，例如，包括其盐，其盐的溶剂化物和其水合物。因此，例如，当包封时，双膦酸盐可以是固体或在溶液中，并且固体可以是溶剂化物或水合物。
制剂的施用
本发明意在涵盖在一个或多个剂量的方案中施用含有有效量的一种或多种双膦酸盐的制剂，以治疗或管控HIV/AIDS。使用的剂量数量将是实现期望效果所必需的，例如1、3、5、8或10，每天一次，b.i.d.，q.i.d.，或作为连续输注经一段时间连续。本发明的制剂可以与其它药物组合施用。术语“组合”不限于在完全相同的时间施用药物，而且意味着本发明的制剂和其它药物以一定顺序和在一定时间间隔内施用于患者，以至于它们可以一起作用以提供比如果它们以其它方式施用时更大的益处。例如，本发明的制剂和其它药物可以同时施用或在不同时间点以任何顺序依次施用；然而，如果不同时施用，则它们应当在时间上足够接近地施用，以便提供期望的治疗效果。本发明制剂的每次施用，无论是否与其它药物组合，可以分开、以任何适当形式和通过任何合适途径进行，所述途径有效地将治疗剂转运至适当或期望的作用部位。本发明的制剂的优选的施用方式包括静脉内(i.v.)和动脉内(i.a.)施用。其它合适的施用方式包括肌肉内(i.m.)、皮下(s.c.)和腹膜内(i.p.)以及口服(经口)。这样的施用可以是大剂量注射或输注。另一种施用方式可以通过血管周围递送。也可以根据本发明使用任何上述施用途径的组合。
当施用时，期望制剂以一定剂量和时间施用，所述剂量和时间使得单核细胞/巨噬细胞抑制作用持续整个随后的TI。在一个实施方案中，在TI之前不久的期间，例如，抗病毒疗法结束之前约3至约10天期间，施用制剂至少一次。在另一个实施方案中，所述制剂可以在抗病毒疗法期间施用多次。在又另一个实施方案中，所述制剂可以在TI期间施用，在刚刚先前的抗病毒疗法期间有或没有TI前施用。由于HIV/AIDS的管控是长期努力并且可以包括由TI并列的多种抗病毒疗法，因此根据本发明涵盖在适当时间点与抗病毒疗法方案和TI结合的多轮根据本发明的单核细胞/巨噬细胞抑制治疗。
术语“有效量”表示制剂中双膦酸盐的量，其有效抑制或降低单核细胞/巨噬细胞的活性以延长活性病毒粒子的再度出现和/或有效消除或减少循环单核细胞/巨噬细胞的数量。考虑制剂中的双膦酸盐的有效量提供长期治疗以补充HIV/AIDS的管控中的抗病毒疗法。优选的是，制剂中双膦酸盐的有效量持续一定时段抑制和/或消耗单核细胞/巨噬细胞，所述时段为约一周，约两周，优选≥一个月，更优选≥两个月，仍更优选≥三个月，最优选最长达或长于六个月。技术人员可以通过将制剂施用于有需要的个体(或这样的个体的动物模型)并监测不同时间点的抑制/消耗水平来经验性地确定有效期。也可以将抑制时间与适当期望临床效果(例如HIV病毒载量的抑制和/或CD4+T细胞水平的增加)关联。
制剂中双膦酸盐的有效量可取决于几个因素，包括，但不限于：患者的性别、年龄和体重；制剂的施用方式；用于包封或包埋双膦酸盐的载体的类型(例如，其是快速释放双膦酸盐的载体还是经一段时间释放双膦酸盐的载体)；治疗方案(例如，制剂是每几天施用一次，每几周施用一次还是每次抗病毒疗法施用一次)；HIV/AIDS的状态，包括在施用制剂前后的受治疗个体的病毒的毒株、病毒载量和CD4+T细胞计数；在抗病毒混合物中使用的药物的类型和量；患者的耐药性；患者的基因型，因为患者的基因型涉及HIV/AIDS易感性；抗病毒疗法的持续时间；TI的持续时间。技术人员，通过常规实验，可以基于上述因素或其它相关因素和本文的描述确定有效量。
用于人使用的本发明制剂的双膦酸盐的示例性、非限制性剂量考虑为，例如，约1.5ng/kg至约10mg/kg体重、或约15ng/kg至约15微克/kg体重、或约0.15mg/kg至约15微克/kg体重、或约0.15mg/kg至约1.5mg/kg体重。因此，例如，患者可接受约0.1微克至约1mg、例如约0.1微克、或约1微克、或约10微克、或约100微克或约1mg范围内的剂量。也可以使用其它剂量，这取决于使用的具体双膦酸盐、具体的制剂和剂量方案，这可以由技术人员容易地确定。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于确定用于人使用的制剂的剂量范围。制剂中的双膦酸盐的剂量优选导致包括ED50的循环浓度的范围，其毒性很少或没有毒性。特定患者的剂量将取决于采用的具体制剂、利用的施用途径和患者的状况或特征。对于本发明方法中使用的任何制剂，可以最初从细胞培养实验估计有效剂量。可以配制剂量，以便在动物模型中实现循环血浆浓度范围，其包括如细胞培养物中所测定的IC50(即，实现症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)。这样的信息可以用于更准确地确定人体中的有用剂量。血浆中的水平可以，例如，通过高效液相色谱法来测量。人的有效剂量可以经由临床试验进一步确定。
治疗效用的表征
在一个实施方案中，抑制或降低单核细胞/巨噬细胞活性和/或消除或减少单核细胞/巨噬细胞数量的期望治疗结果是持续足够时间段的HIV病毒载量的抑制和/或CD4+T细胞的增加。足够时间段可以是整个TI时段。在某些情况下，足够时段可以比整个TI时段更长或更短。
本发明的治疗方法的毒性和效力可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，所述标准药学程序例如用于测定LD50(对50％群体致死的剂量)，无可观察的不良反应水平(NOAEL)和ED50(50％群体中的治疗有效剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且其可以被表示为比率LD50/ED50或NOAEL/ED50。表现出大治疗指数的制剂是优选的。尽管可以使用表现出毒性副作用的制剂，但应当注意设计将这样的制剂的药剂靶向至目标细胞的部位的递送系统，以便使对未受影响的细胞的潜在损害最小化，由此减少副作用。此外，这样的制剂的药物载体应该设计成控制药物释放，使得释放的药物的水平不超过任何毒性限值。
本发明方法的方案和组合物优选在用于人体之前针对期望治疗活性进行体外测试，然后体内测试。这样的体外测定的一个实例是单核细胞和/或巨噬细胞的体外细胞培养试验，使单核细胞和/或巨噬细胞在培养物中生长并暴露于或以其它方式施用于细胞，并观察该试验对细胞的影响，例如，抑制或降低活性和/或完全或部分的细胞死亡。单核细胞/巨噬细胞可以获得自建立的细胞系或最近作为原代细胞系分离自个体。本领域中标准的许多试验可用于测量该制剂对单核细胞/巨噬细胞的活性，例如，通过定量趋化因子诸如巨噬细胞化学诱导蛋白-1(MCP-1)、白介素1β(IL-1B)、组织坏死因子α(TNF-α)和巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)的水平。本领域中的许多试验可用于评价单核细胞/巨噬细胞的存活和/或生长；例如通过测量3H-胸苷掺入，通过直接细胞计数，通过检测已知基因诸如原癌基因(例如，fos，myc)或细胞周期标志物的转录活性的变化来测定细胞增殖；可以通过台盼蓝染色来评价细胞活力。
本文引用的所有公开的文章、书籍、参考手册和摘要的内容在此以其整体通过引用并入，以更完全描述本发明所述领域的状态。
实施例
本文所述的以下实施例意在示出和例举实施本发明的各个方面，而不意在以任何方式限制本发明。
脂质体阿仑膦酸盐(LA)可以，例如，根据以下中描述的方法来制备：Epstein-Barash,H.,等人,J.CONTROLLED RELEASE,146:182-195(2010)；Epstein,H.等人,AAPS J,10:505-515(2008)；和美国专利申请系列号13/804,707。更具体地，为了实施例2-7的目的，根据美国专利申请系列号13/804,707(其在本文中作为实施例1再现)制备LA。
实施例1-脂质体阿仑膦酸盐制备
产生包封于含有胆固醇、DSPC和DSPG的脂质体中且分散于磷酸盐缓冲盐水溶液中的1升批次的脂质体阿伦膦酸盐。为了临床便利，脂质体阿伦膦酸盐可以以两种浓度(5mg/ml和0.5mg/ml)提供为无菌带白色的脂质体分散体。可以进一步配制这些浓度以获得任何特定体积的期望量的治疗剂。脂质成分由胆固醇、DSPC和DSPG构成。分散体还含有磷酸盐缓冲盐水溶液用于pH控制、输注适用性和用于维持等渗性。将最终产物中至少96％的药物包封于脂质体中。为了施用，用盐水媒介物稀释小瓶的内容物(或者根据需要，其部分)，然后作为输注施用。在一个特定临床前实施例中，将适当质量的LA(由体重确定)在室温1X PBS中稀释至20ml的最终体积，并以4ml/分钟通过静脉内(隐静脉)或腹膜内注射施用。
包括制造方法中使用的组分的量和质量的批次配方及其在每1升批次基础上的量呈现于下表1中。
表1–用于IV输注的脂质体阿伦膦酸盐，用于1升的批次配方
表1的1升批次中产生的用于IV输注的脂质体阿伦膦酸盐的含量和定量组成概述于下表2中。注意，在该批次中，DSPC:DSPG:胆固醇的摩尔比为3:1:2。此外，药物:脂质比率被计算为约1:5.7±1.5w:w。
表2–用于IV输注的脂质体阿伦膦酸盐的组成
实际上通过本文描述的制造方法产生的用于IV输注的脂质体阿伦膦酸盐制剂呈现于下表3中。
表3–用于5mg/ml剂量形式的规格
0.5mg/ml剂量强度可以通过与上述5mg/ml剂量强度相同的方法制造。仅(下述)最后标准化步骤在形成用于施用的不同最终制剂浓度中不同。0.5mg/ml的浓度用于以下实施例。本领域技术人员理解可以根据本方法制造其它剂量。
治疗剂溶液(阿伦膦酸盐溶液)和脂质溶液如下制备：
阿伦膦酸盐溶液.称取NaOH(6.8-8.0g)并将其在70±3℃的温度下以600±150RPM溶解于850ml注射用水(WFI)中。通过目视检查确认完全溶解。在70±3℃的温度以600±150RPM搅拌，将阿伦膦酸钠(68至80.75g)溶解于NaOH溶液中。通过目视检查验证完全溶解(即，澄清溶液)，验证电导率和pH测量值(pH＝6.8±0.3。电导率＝18.0±1ms/cm)。
脂质溶液.称取包含30g DSPC(37.9毫摩尔)、10g DSPG(12.5毫摩尔)和10g胆固醇(25.8毫摩尔)(DSPC/DSPG/胆固醇；3/1/2mol/mol/mol)的脂质并在加热的磁力搅拌器上在70±3℃将其溶解于250ml烧杯中的160ml叔丁醇/EtOH/H2O(77/77/6,v/v/v)中，形成浓度为312mg/ml的脂质溶液。一旦温度在限值内就形成澄清的黄色溶液。
MLV制剂.将脂质溶液添加至阿伦膦酸盐溶液(1份药物；5.3份脂质)，同时以600+150RPM混合并维持温度70±3℃。至少5分钟之后，添加100ml WFI(10％总体积)以在挤出之前降低溶剂浓度。将制剂再混合10分钟。
挤出.通过装配有一个0.14μm陶瓷膜或两个聚碳酸酯膜(例如，0.2预过滤器和0.1μm膜)的1.2L加热不锈钢挤出机在压力＝90±15psi且温度＝68±5℃下将所述制剂进行挤出以降低囊泡的大小并改善囊泡均匀性。该过程需要12-18轮以得到80-100nm的囊泡。将挤出通过物实时取样以验证超滤之前的囊泡大小。脂质体制剂大小使用Malvern Nano ZS分析仪(接受限值：95±20nm)来分析。还分析挤出样品的需氧细菌计数(生物负载控制)。接受限值为<100CFU/ml。
超滤和透析.首先，在进行超滤之前使制剂冷却至<45℃。在具有500K中空纤维膜的Amersham QuixStand系统上进行超滤。使用不超过25psi的入口压力浓缩制剂。在达到最小体积后，用10倍初始体积(～7L)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液透析所述制剂。通过将145mM NaCl、13mM Na2HPO4和7mM NaH2PO4溶解于10L WFI中来制备PBS溶液。PBS具有约6.9的pH和约16.9ms/cm的电导率。将PBS过滤通过0.2μm过滤器。通过测量经透析制剂的pH和电导率来标记透析终点。将所述制剂从超滤系统排出，不超过120％的初始体积(～1.2升)。取样品用于常规分析和需氧细菌计数(生物负载控制)。接受限值为<1,000CFU/ml。
在透析结束时，将所述制剂过滤通过0.2μm过滤器以维持生物负载控制。将含有所述制剂的压力容器连接至无菌0.2μm过滤器(Sartorius Sartobran P)。将过滤器预装配至无菌接收罐。通过对压力容器施加5-30psi的压力进行过滤。取样品用于常规分析和需氧细菌计数(生物负载控制)。接受限值为<100CFU/ml。
最终标准化.分析所述制剂的脂质体的大小、脂质/治疗剂组成，药物和游离治疗剂含量(通过HPLC)。本实施例中的预期产率为含有约6mg/ml包封阿伦膦酸盐和35mg/ml脂质的1升制剂。基于阿伦膦酸盐浓度的结果，计算所需稀释度以得到约1升的5mg/ml或0.5mg/ml的最终制剂浓度。为了产生5mg/ml制剂，用如上文所述的约100ml PBS稀释约900ml超滤之后的脂质体阿伦膦酸盐。此外，为了产生0.5mg/ml制剂，对于0.5mg/ml浓度，用约900ml PBS稀释约100ml超滤后的脂质体阿伦膦酸盐。取样品以确定得到的阿伦膦酸盐浓度。
产生标准制剂浓度之后，将含有所述制剂的瓶子连接至位于100级房间或无菌生物学罩中的两个连续的无菌0.2μm过滤器(Sartorius Sartobran P)。将过滤器预装配至预先除菌的一次性接收袋或瓶。通过蠕动泵或加压氮气进行过滤。压力应当不超过10psi。当结束过滤时，测试过滤器的完整性。
上述实施例中产生的用于IV输注的脂质体阿伦膦酸盐具有许多期望特性，例如(i)至少阿伦膦酸盐和脂质在5℃(范围2-8℃)的三年稳定性；(ii)80±5的平均囊泡直径，没有微粒状物质；(iii)最高达5mg/ml(范围0.1–5.0mg/ml)的阿伦膦酸钠的浓度；(iv)大于或等于96％的阿伦膦酸盐包封率；(v)3/1/2mol/mol/mol的二硬脂酰磷脂酰胆碱/二硬脂酰磷脂酰甘油/胆固醇(DSPC/DSPG/CHOL)的脂质组成；(vi)270-340osmol/kg的生理学重量摩尔渗透压浓度；(vii)与水相似的粘度，即在20℃下约1.0mPa s的动力学粘度；(viii)pH6.8(范围6.8-7.0)；(ix)根据美国或者欧洲药典的赋形剂质量的全世界接受度；(x)符合在USP 24-NF 19中公开的用于无菌性和热原的USP指南；(xi)与盐水、输注套件和注射器的相容性(可用性)；和(xii)与过滤器、不锈钢和玻璃的相容性(工艺)。
实施例2
非人灵长类中的脂质体阿仑膦酸盐消耗的单核细胞。在食蟹猴中测试LA消耗单核细胞的能力。具体地，用单次0.1mg/kg i.v.剂量的LA(LA 1和LA 2)处理两只食蟹猴。然后通过流式细胞术评价全血中的CD14+单核细胞的绝对和相对频率，直到注射后7天(d.p.i.)。结果呈现于图1A-1B中。接受0.1mg/kg of LA i.v.的食蟹猴显示到1d.p.i.的CD14+单核细胞频率降低～50％。然而，如图1A-1B中所示，该消耗是短暂的，因为CD14+单核细胞频率到2d.p.i.返回至基线水平。因此，显示LA对于非人灵长类中的单核细胞消耗是有效的。
血液处理.将全血收集至EDTA处理管(BD Biosciences,San Jose,CA)中。使用500μl等分试样用Horiba/ABX Pentra 60C+(Horiba,Irvine,CA)来评价全血细胞计数(CBC)。
单核细胞/巨噬细胞的流式细胞术分析。设计并优化11色流式细胞术染色组用于分析恒河猴的血液和组织中的单核细胞/巨噬细胞，如表4中所示。
表4.设计用于流式细胞术的单核细胞/巨噬细胞染色组。
将100μl全血或1x 106总组织细胞在1x PBS中洗涤两次，然后在室温下表面染色30分钟。然后将全血和脾在1ml FACSLyse中孵育10分钟，以830x g离心4分钟，并在补充有10％胎牛血清的1x PBS(FACS缓冲液)中洗涤三次。其它组织细胞在1x PBS中洗涤一次，并在2％多聚甲醛中固定。对于细胞内染色，将固定的细胞在含有1mg/ml皂苷的FACS缓冲液(皂苷缓冲液)中洗涤两次，并在室温下染色1小时。对于核内染色(BrdU和Ki-67)，将固定的细胞在皂苷缓冲液和2X BD FACSPerm的1:1混合物中洗涤两次，然后在皂苷缓冲液中洗涤一次，并在室温下在0.5mg/ml DNA酶I存在的情况下染色1小时。染色之后，将样品在皂苷缓冲液中洗涤两次，然后在BD-LSRII(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)上运行。使用FlowJo版本9.6.4(TreeStar,Ashland,OR)分析流式细胞术数据。通过使用荧光减一(FMO)对照管针对适当荧光团设置所有阳性设门。
实施例3
脂质体阿仑膦酸盐在非人灵长类得到良好耐受。在非人灵长类模型中检查LA治疗的安全性。在四只恒河猴(每只接受两种不同的LA-治疗方案之一)中监测肝功能的四种关键读数(白蛋白、丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶和胆红素)的血清浓度。图2A-2D示出接受重复低剂量(每天0.1mg/kg i.v.，持续一周；Rh22618和Rh28450)或单一高剂量(10mg/kg i.v.；Rh28438和Rh29054)的LA的恒河猴的血清化学分析。虚线代表基于俄勒冈国家灵长类研究中心(Oregon National Primate Research Center)的恒河猴群体统计的白蛋白、丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶和总胆红素血清浓度的预期范围。在第0、3和7天对接受LA的重复低剂量注射的动物的血清化学进行取样。在尸检前两天跟踪接受LA的单一高剂量注射的动物的血清化学。
如图2A-D中所示出，重复低剂量LA施用揭示肝功能无变化，而单一高剂量导致肝功能的扰动。具体地，基线测量和LA后测量之间的比较揭示接受重复低剂量LA的动物中的血清化学无不利变化(Rh22618和Rh28450)。所有值都落入预期范围内，除了Rh28450中的碱性磷酸酶，其在基线处高(图2C)。与接受每日低剂量LA的动物相比，接受单一高剂量LA的动物(Rh28438和Rh29054)表现出降低的白蛋白血清浓度(图2A)，与升高的丙氨酸转氨酶浓度一致(图2B)，尽管丙氨酸转氨酶浓度在预期值内。白蛋白和丙氨酸转氨酶血清浓度的这些变化指示肝脏运用，可能是由于肝脏库普弗细胞的消耗(参见下文)。尽管有这些发现，但在高剂量动物和接受LA的任何动物中都没有观察到LA治疗的不利临床副作用，无论剂量或频率如何。重要的是注意到，0.1mg/kg的LA i.v.足以消耗单核细胞(图1A-B)，并且该剂量的LA在恒河猴中是安全的，甚至在重复每日注射后(图2A-D)。因此，LA在有效剂量得到良好耐受，并且构成了非人灵长类中的单核细胞消耗的可行的新技术。
恒河猴圈养于俄勒冈国家灵长类研究中心。俄勒冈健康科学大学机构动物护理和使用委员会(The Oregon Health&Science University Institutional Animal Care and Use Committee)审查并批准了所有研究方案，所述研究方案是根据针对实验动物的护理和使用的美国卫生和人类服务部的指南。
实施例4
以替代剂量和途径的LA治疗在另一非人灵长类模型中产生单核细胞消耗。观察到LA施用的不同剂量和途径在恒河猴中产生相比于对照更大的单核细胞消耗，如图3A-B中所示出。三只恒河猴(Rh24937、Rh28034和Rh28099)用1mg/kg LAi.v.和腹膜内(i.p.)注射，并在1d.p.i.使用上述流式细胞术染色组监测单核细胞的频率。两只对照恒河猴(Rh26118和Rh26144)接受磷酸盐缓冲盐水注射，其体积和途径与LA治疗的动物相同。单核细胞群体与淋巴细胞和粒细胞的区别在于不同的CD45平均荧光强度(MFI)相比侧向散射概况(图3A)。
图3A示出使用表4中记载的流式细胞术染色组测量的向恒河猴给予单一1mg/kg剂量的LA(与对照相比)之后一天的单核细胞的频率。具体地，图3A示出通过CD45MFI相比侧向散射概况的流式细胞术分析测定的LA治疗前后的全血中的单核细胞的频率。LA治疗之后，在1d.p.i.观察到单核细胞频率的大幅降低，其中Rh28034中的消耗特别显著(基线：8.22％；1d.p.i.：1.78％)。相反，对照动物中的单核细胞频率在1d.p.i.保持稳定(图3A)。
为了进一步评价LA治疗的恒河猴中观察到的单核细胞消耗，评估单核细胞亚群以确定哪些最受影响。在LA治疗前后，在总单核细胞池中比较三种先前描述的单核细胞亚群(经典CD14+CD16-、中间CD14+CD16+和非经典CD14-CD16+)[24]的频率。结果示出于图3B中。具体地，图3B示出使用表4中记载的流式细胞术染色组测量的向恒河猴给予单一1mg/kg剂量的LA(与对照相比)之后一天的单核细胞亚群的频率。具体地，图3B示出通过CD14+相比CD16+染色的流式细胞术分析测定的LA治疗前后的全血中的单核细胞亚群的频率。当比较治疗前后的单核细胞亚群频率时，观察到显著的动物-动物间差异。重要的是，LA治疗的恒河猴在1d.p.i.表现出几乎所有CD14-CD16+单核细胞的消耗，而对照恒河猴在1d.p.i.维持类似的单核细胞亚群频率，支持观察到的总体单核细胞消耗的缺乏(图3A-B)。
为了测定消耗的持续时间，监测单核细胞的绝对计数和频率，直到7d.p.i.。结果示出于图4A-D中，其中空心符号代表LA治疗的动物，而实心符号代表对照动物。图4A-D的最上面一行示出LA治疗前后的全血中的绝对单核细胞计数。通过评价CD14+和/或CD16+单核细胞的频率并将该值与总体白细胞计数(CD45+细胞)进行比较来计算绝对单核细胞计数。图4A-D的最下面一行示出通过流式细胞术评价的LA治疗前后的全血中的单核细胞的频率。与显示LA治疗之后单核细胞频率大幅降低的数据一致，每微升血液的单核细胞的绝对计数也显示在1d.p.i.的显著下降(图4A，最下面)。这在Rh28034和Rh28099中最显著，其中绝对单核细胞计数分别降低87％和84％。有趣的是，绝对单核细胞计数也揭示LA治疗之后CD14+CD16+单核细胞的保留。这与CD14+CD16-和CD14-CD16+群体中观察到的单核细胞计数的大幅下降形成鲜明对比(图4A-D，最上面一行)。这些LA治疗的恒河猴中观察到的单核细胞消耗是高度短暂的，这类似于在用单一0.1mg/kg剂量的LA i.v.治疗的食蟹猴中观察到的单核细胞消耗(图1A-B；图4A-D，最下面一行)。因此，LA治疗可以在恒河猴中安全地诱导单核细胞的显著、但高度瞬时的消耗。
实施例5
LA治疗降低组织驻留的巨噬细胞的频率并增加骨髓单核细胞的频率。如上所示，脂质体阿仑膦酸盐在非人灵长类模型中一致地消耗组织驻留的巨噬细胞并诱导骨髓单核细胞生成。为了确定LA施用之后观察到的非人灵长类组群中的一致单核细胞消耗(图1A-B；图4A-D)是否与组织驻留的巨噬细胞和骨髓单核细胞的频率降低相平行，收集各种组织并使用11色流式细胞术染色组(实施例2，表4)使用设门程序评价巨噬细胞/单核细胞频率。在LA治疗前后通过下述组织处理方法从六只恒河猴收集支气管肺泡灌洗液(BAL)、结肠活检样品、肝脏活检样品和骨髓穿刺物。图5A-E示出用于鉴定组织(定义为MAC387+和/或CD163+)和骨髓(定义为CD163+)中的巨噬细胞的设门策略，如结肠组织所代表。
在LA治疗之后，在BAL中未观察到肺泡巨噬细胞的频率变化(数据未显示)。图6A-C示出来自Rh28450和Rh29724的代表性组织驻留的巨噬细胞和骨髓髓样前体染色。更具体地，图6A-C(图4B)显示在LA治疗前后来自骨髓穿刺物、肝脏和结肠的MAC387相比CD163染色的比较实施例。MAC387是识别钙结合骨髓相关蛋白MRP14的抗体，所述MRP14表达于组织驻留的巨噬细胞中[25-27]。该染色组在这些组织中鉴定了三种不同的巨噬细胞群体：MAC387+CD163-、MAC387+CD163+和MAC387-CD163+。通常，如图6A-B中所示，发现MAC387-CD163+巨噬细胞的频率低于MAC387+CD163-和MAC387+CD163+巨噬细胞。为了进一步评估这三种组织巨噬细胞群体，检查它们的CD68(一种还在组织驻留的巨噬细胞中表达的糖蛋白[26,28,29])的表达。具体地，将LA治疗前后的来自Rh29724的结肠的MAC387+CD163-和MAC387+CD163+群体中的CD68表达与MAC387-CD163+的CD68表达(阴影)进行比较。图6C示出LA治疗前后来自Rh29724的结肠的三个群体的CD68表达在两个时间点具有相似的染色概况。图6C还显示MAC387+CD163-和MAC387+CD163+巨噬细胞两者均表达CD68，其中后者群体显示最高表达，证实了我们的流式细胞术组能够鉴定组织巨噬细胞。因此，本文首次显示使用三种先前描述的巨噬细胞标志物在非人灵长类的LA治疗之后消耗组织驻留的巨噬细胞。
延伸分析以确定LA治疗对骨髓中的单核细胞消耗的有效性。因为血液单核细胞在从骨髓移出之后表达MAC387和CD163，所以在六只恒河猴中在LA治疗前后检查骨髓中表达这些标志物的细胞的频率。以类似的方式，在肝脏和结肠中评价组织巨噬细胞消耗。图7A描绘LA治疗前后骨髓中的CD163+细胞的频率。图7B描绘在LA治疗前后肝脏中的组织驻留的巨噬细胞频率(与基线的百分比变化)。图7C描绘LA治疗前后结肠中的组织驻留的巨噬细胞的频率。
当定义为MAC387+和/或CD163+时，骨髓抽吸物的染色揭示单核细胞的总频率的改变很小(数据未显示)。然而，鉴于骨髓中的粒细胞也可以表达MAC387，进行单独分析以将骨髓单核细胞定义为CD163+[25]。观察到骨髓中单核细胞前体产生的显著增加，如图7A中所示出。具体地，该分析揭示施用LA之后骨髓单核细胞频率的显著增加(p＝0.031)(图7A)。尽管最初假设是LA治疗会消耗骨髓单核细胞，但该发现并不令人惊讶，因为组织巨噬细胞的SIV相关的消耗已经显示增加骨髓更新，其开始于从骨髓释放单核细胞[30]。然而，不能排除在检查的最早时间点(1d.p.i.)之前在骨髓中发生单核细胞减少的可能性。
如图7B-C中所示出，LA治疗降低组织驻留的巨噬细胞频率。图7B揭示肝脏中的显著减少。图7C显示五只恒河猴中的四只具有结肠巨噬细胞减少，尽管这不是显著的由于一只动物表现出结肠巨噬细胞频率的增加。具体地，在研究的六只动物中的五只中，在LA治疗之后，肝脏中的巨噬细胞频率降低>45％(p＝0.031；图4D，左小图)。图7A-C的显著性检验都是Wilcoxon符号秩。鉴于库普弗(Kupffer)细胞构成人体中80-90％的组织巨噬细胞，该结果突出了LA在组织巨噬细胞消耗中的有效性[31]。重要的是注意到，肝脏中大多数消耗的巨噬细胞是MAC387+CD163-(图7B，数据未显示)。在结肠中观察到相同的趋势，其中在五只动物中的四只中，总巨噬细胞频率降低>45％(Rh22618由于不可检测的LA前巨噬细胞频率而被排除)(p＝0.625)。然而，在结肠中，消耗在三个巨噬细胞群体中更均匀地分布(图7C，数据未显示)。令人惊讶地，动物之一(Rh27508)显示结肠中巨噬细胞频率的大幅增加。然而，该动物还表现出上述骨髓中CD163+单核细胞的扩增，绝对单核细胞计数减少>80％，且肝脏中巨噬细胞频率减少>50％，提供了LA治疗的直接效应的充分证据(图7B-C)。因此，不能排除结肠巨噬细胞频率的增加是该动物中LA相关的消耗之后的差异骨髓细胞更新动力学的结果的可能性。
组织处理.通过70μm过滤器过滤支气管肺泡灌洗液。通过以830xg离心4分钟将骨髓沉淀，然后在含有2mM EDTA的1x PBS中重悬浮并剧烈振荡以分散大细胞团块。将细胞在含有10％胎牛血清(R10)(Hyclone Laboratories,Logan,UT)的RPMI-1640中洗涤两次。用解剖刀将淋巴结和脾脏切块，然后通过70μm细胞过滤器捣碎。用R10重复冲洗过滤器以获得单细胞悬浮液。将结肠和肝脏切成5mm3片，并将这些片中的约25-30片置于含有25ml补充有3％胎牛血清(R3)的RPMI-1640的50ml锥形瓶中。以200μM的最终浓度添加二硫苏糖醇，并将组织在室温下以225rpm振荡15分钟。使组织沉降，并吸出含有DTT的R3，并用含有5mM EDTA的R3替换。将组织在37℃下以225rpm振荡30分钟，并收集含有细胞的上清液并通过细胞过滤器。再次添加含有EDTA的R3，振荡组织，并收集细胞。将组织在1x Hank氏平衡盐溶液中洗涤两次以去除过量EDTA，然后悬浮于含有0.1mg/ml胶原酶(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和0.1mg/ml DNA酶I(Roche,Indianapolis,IN)的R3中。将组织在37℃下以225rpm振荡45分钟，并收集含有细胞的上清液并通过70μm细胞过滤器。再次添加含有胶原酶和DNA酶I的R3，振荡组织，并收集细胞。将从EDTA和胶原酶消化步骤收集的细胞碎片合并(全部组织)，并重悬浮于30％等渗percoll(GE Healthcare,Buckinghamshire,UK)中。然后将细胞在60％/40％percoll梯度上分层，并以500x g旋转，其中制动关闭。收集来自界面下部的单核细胞，并在R10中洗涤。
实施例6
5’-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)揭示LA治疗后的单核细胞更新。如上面数据所示出，在LA治疗之后一致地检测单核细胞，但该数据无法区分单核细胞是从骨髓新迁移的细胞还是仅仅是来自原始细胞池的剩余物。CD163+骨髓单核细胞的频率增加表明血液单核细胞更新在LA治疗之后加剧。为了提供单核细胞更新的更详细的表征、支持消耗结果且允许更好地计算总血液单核细胞消耗，设计和执行LA治疗，其与BrdU施用串联，以确定该非人灵长类模型中的单核细胞更新的水平。
BrdU是在S期期间掺入正在分裂细胞的DNA的合成胸腺嘧啶类似物，并且可以通过细胞内抗体染色来检测[32,33]。骨髓中正在分裂的单核细胞前体在作为单核细胞释放至血液中之前掺入BrdU。从骨髓释放之后，单核细胞和组织驻留的巨噬细胞很少分裂，使BrdU成为骨髓细胞更新的可靠标志物[30]。
为了评价单核细胞更新，两只恒河猴Rh28438和Rh29054接受10mg/kg LA(i.v.)连同60mg/kg BrdU(i.v.)。对照动物Rh31577接受磷酸盐缓冲盐水连同相同60mg/kg剂量的BrdU。将BrdU以10mg/ml悬浮于HBSS(Hank氏平衡盐溶液)(HyClone Laboratories,Logan,UT)中。以2-3ml/分钟的速率静脉内(隐静脉)注射BrdU 60mg/kg。图8A-C揭示LA治疗之后的单核细胞消耗和高单核细胞更新。LA治疗消耗了大多数血液单核细胞，这基于：通过CD45染色相比侧向散射概况评价的频率(图8A)和绝对单核细胞计数(图8B)。BrdU染色(图8C)揭示在CD14+CD16-(经典)和CD14+CD16-(中间)单核细胞群体中LA治疗之后高水平的单核细胞更新。显示的值表明BrdU染色阳性的总CD14+CD16-(经典)和CD14+CD16+(中间)群体的百分比。为了测定LA治疗之后单核细胞更新的水平，用10mg/kg LA(i.v.)连同60mg/kg BrdU(i.v.)注射两只恒河猴(Rh28438和Rh29054)，并监测BrdU+和BrdU-单核细胞的频率，直到2d.p.i.。对照动物Rh31577接受磷酸盐缓冲盐水连同相同60mg/kg剂量的BrdU。如图8A中所示出，Rh28438和Rh29054中的LA治疗再次导致到1d.p.i.的单核细胞频率的显著降低。出乎意料地，对照动物Rh31577还表现出单核细胞频率的下降，尽管程度较小。
为了证实Rh31577确实是适当的对照，鉴于该动物中观察到的单核细胞频率的减少(图8A)，在所有三只恒河猴中在LA治疗前后评价绝对单核细胞计数。如所预期，在LA治疗的动物中观察到单核细胞计数的大幅减少，而在磷酸盐缓冲盐水注射之后，Rh31577中的单核细胞计数保持不变，如图8B中所示出。
最后，通过将LA治疗的动物与对照进行比较来监测来自骨髓(BrdU+)的单核细胞的迁移(图8C)。有趣的是观察到，在1d.p.i.，与对照动物相比，LA治疗的动物中的CD14+CD16-BrdU+单核细胞的频率较高，其中Rh28438中超过一半的CD14+CD16-单核细胞为BrdU染色阳性(图8C，左小图)。图8C还显示，在1d.p.i.，LA治疗的动物中≥10％的CD14+CD16+单核细胞对BrdU染色阳性，与对照动物Rh31577(其在1d.p.i.没有CD14+CD16+BrdU+单核细胞)形成鲜明对比。急性炎症导致单核细胞更新增加，因为单核细胞进入受影响的组织以分化成巨噬细胞[34]。在猿猴免疫缺陷病毒(SIV)感染的恒河猴的情况下，单核细胞更新是进展为AIDS的强烈预测因子[30]。类似地，高水平的单核细胞更新与恒河猴中SIV诱导的脑炎的严重度相关[35]。值得注意的是，我们在LA治疗的动物中在1d.p.i.观察到的单核细胞更新水平类似于或大于在SIV感染的恒河猴中所见的那些，包括严重脑炎的快速进展者[30,35]。因此，LA治疗增加血液单核细胞更新，该发现支持增加的骨髓单核细胞生成和血液单核细胞消耗数据。此外，这些血液单核细胞更新水平与晚期SIV感染相当，其中观察到单核细胞的显著更新。
LA对单核细胞和巨噬细胞的影响的概述
因此，首次显示LA是非人灵长类模型中单核细胞和组织巨噬细胞消耗的安全且有效的方式。重要的是，此处首次表明选择性单核细胞亚群消耗，其中CD14+CD16-和CD14-CD16+单核细胞与CD14+CD16+亚群相比表现出强烈消耗。LA的施用一致地降低肝脏和结肠中的绝对单核细胞计数和组织巨噬细胞频率。该消耗与骨髓中单核细胞生成的显著增加相关，该发现得到如通过DNA BrdU掺入所测量的血液中增加的单核细胞更新所支持，。
LA-介导的单核细胞消耗在检查的所有非人灵长类中是高度短暂的，并且该发现完全支持先前用兔、大鼠和人的工作，其中单核细胞的LA消耗也是瞬时的。重要的是，已经显示瞬时单核细胞消耗触发显著和持续的抗炎效应，由通过LA治疗之后再狭窄和子宫内膜异位的发生率降低所例举[23,36,37]。因此，对非人灵长类施用LA的有用性可以延伸远远超过单核细胞消耗的时间范围。
与肝脏和结肠相比，在LA治疗之后，在肺中没有检测到肺泡巨噬细胞的消耗。该差异的原因不清楚，但不受理论束缚，可能取决于LA在肺中的生物分布或巨噬细胞靶向。鉴于肺中大量的巨噬细胞(肺免疫细胞的约70％)，可能在i.v.或i.p.注射之后到达肺的LA的质量不足以消耗可检测数量的细胞[38]。此外，鉴于将经由血液携带少量离开肝脏的LA，系统性LA施用(i.v.和i.p.)可以抑制肺的粘膜表面的肺泡巨噬细胞的消耗。该LA会遇到并潜在地靶向替代的肺组织巨噬细胞，诸如间质巨噬细胞。
在恒河猴的组织中观察到两种主要的巨噬细胞群体：MAC387+CD163+和MAC387+CD163-。然而，在人中，MAC387+巨噬细胞已被表征为M1样的，且CD163+巨噬细胞已被表征为M2样的，其在相同细胞上很少或没有共表达这些标志物。支持MAC387+CD163+组织巨噬细胞的这种鉴定，恒河猴中的最近研究全面表征了不同群体的肺驻留的巨噬细胞表达的标志物，其显示血液单核细胞和间质巨噬细胞共表达高水平的MAC387和CD163[38]。该细胞群体的功能分析揭示MAC387+CD163+间质巨噬细胞响应于经典巨噬细胞激活信号(IFNγ和LPS)。因此，MAC387+CD163+似乎定义巨噬细胞的M1样群体，尽管解剖位置可能影响这些标志物的表达，因为MAC387+CD163+巨噬细胞在恒河猴脑组织中是罕见的[26]。
本文进行的分析通过设计11色流式细胞染色组来辅助，所述11色流式细胞染色组被分别普遍应用于血液和组织的对单核细胞和巨噬细胞的鉴定。参见上文实施例2，表4。研究已大量依赖于巨噬细胞细胞系，诸如U937和体外单核细胞衍生的巨噬细胞，该体外单核细胞衍生的巨噬细胞可能不会真正重现组织驻留的巨噬细胞的复杂性[42-44]。通过流式细胞术评估组织驻留的巨噬细胞提供了分选活细胞的优势，这是传统免疫组织化学和免疫荧光染色技术不能提供的技术。鉴于巨噬细胞在生理过程中的许多作用，对巨噬细胞直接离体进行功能测定的能力牵涉于多个研究领域中。
非人灵长类提供了人生物学的强大模型。此处，通过首次显示可以通过施用LA实验性地消耗单核细胞和巨噬细胞来推进非人灵长类模型。鉴于通过消耗非人灵长类中的T细胞、B细胞和NK细胞获得的科学见解[8-13]，据信本文所述的技术进一步加强了非人灵长类模型，并为血液单核细胞和组织巨噬细胞的许多生理过程的研究提供了独特途径。
实施例7-HIV/AIDS治疗方案
在动物模型中评估脂质体阿仑膦酸盐对HAART停止之后的血浆病毒载量和外周CD4+T细胞计数的影响。具体地，在AIDS的印度恒河猴模型中测试LA减少或消耗HIV储库的能力。恒河猴已经广泛用于AIDS研究，并且该物种是HIV/AIDS的最佳表征的非人灵长类模型之一。(参见Pereira,L.E.等人,Immunodeficiency,Ch.15,可得自http://dx.doi.org/10.5772/53556.)用杂合猿猴人免疫缺陷病毒(SHIV)感染两只恒河猴，且纵向随访血浆病毒载量和外周CD4+T细胞计数。本研究中使用的SHIV，SHIV DH12克隆7，系统性消耗CD4+T细胞，然后开始在巨噬细胞中复制，这类似于人中HIV感染的晚期慢性阶段。如图9和10中所示，当病毒开始在巨噬细胞中复制时，动物接受HAART以抑制从SHIV感染后接近于8周开始的病毒复制。
遵循实施例1中所述的方法制备LA。
为了测试根据本发明的制剂在HAART期间的效果，一只动物以静脉内接受1mg/kg体重的剂量的LA，而作为对照的另一只动物接受磷酸盐缓冲盐水(PBS)的i.v.注射。该施用的时机由图9和10中的箭头表示。在该施用之后，HAART再继续1.5周，直到接近于感染后第15周，以便在由于这些细胞的LA介导的消耗导致的巨噬细胞隔室的循环期间保护目标细胞。从感染直至感染后约第20周，定期监测两只动物的血浆病毒载量和外周CD4+T细胞计数。
通过测量每mL血浆的病毒RNA拷贝数来评估血浆病毒载量(“VL”)，即血液中正在复制的HIV的量。该测量是HIV/AIDS研究中的常规测定，并且遵循Friedrich,T.C.等人,“Subdominant CD8+T-cell responses are involved in durable control of AIDS virus replication.”J.VIROLOGY,81(7):3465-76(2007)中描述的方法进行。
图9示出与接受安慰剂(i.v.PBS)对照的SHIV感染的恒河猴相比，静脉内注射的LA对SHIV感染的恒河猴的VL的影响。VL表示为每mL血浆的病毒RNA拷贝数。阴影区域表示HAART疗法的持续时间，且箭头指向施用脂质体阿仑膦酸盐的时间点。具体而言，图9示出在整个研究过程中病毒载量的动力学和幅度。两只动物在HAART停止后的第一周内经历正在复制的病毒的增加，但LA治疗的动物与对照动物相比表现出血浆病毒载量的一致的1-2log减少，直到感染后至少第20周。
外周CD4+T细胞的数量反映了HIV/AIDS的严重性，其中较低计数对应于较高的HIV复制和对免疫系统的更多损害。外周CD4+T细胞计数可以在HIV/AIDS研究中的常规测定中测量，并且在本实施例中遵循Friedrich,T.C.等人,“Subdominant CD8+T-cell responses are involved in durable control of AIDS virus replication.”J.VIROLOGY,81(7):3465-76(2007)中描述的方法测量。
图10示出与接受安慰剂i.v.PBS(对照)的SHIV感染的恒河猴相比，静脉内注射的LA对SHIV感染的恒河猴的外周CD4+T细胞计数的影响。CD4+T细胞计数表示为每μL血液中CD4+T细胞的数量。阴影区域表示HAART疗法的持续时间，且箭头指向施用脂质体阿仑膦酸盐的时间点。具体而言，图10示出在整个研究过程中CD4+T细胞计数的变化。两只动物中的CD4+T细胞在SHIV感染之后迅速减少，并且在两周之后几乎耗尽。两只动物在抗病毒疗法开始之后具有外周CD4+T细胞计数的有限增加。如图10中所示，LA治疗的动物在LA施用之后经历外周CD4+T细胞计数的显著反弹，并且所述反弹持续至少约5周。未用LA治疗的对照动物在整个研究中维持最低水平的外周CD4+T细胞。
本领域普通技术人员应当理解，在不背离本发明的精神或范围的情况下，可以对本文通过实施方案的方式具体显示和描述的内容进行许多变化、添加、修改和其它应用。因此，通过下面权利要求限定的本发明的范围意欲包括所有可预见的变化、添加、修改或应用。
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